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1 최 종 연구보고서 유전자크로닝을이용한면역기능강화 유산균생균제개발 Development of probiotics that can enhance immune systems of animals using gene cloning techniques 연구기관 천안연암대학 전남대학교 농림수산식품부

2 제출문 농림수산식품부장관귀하 본보고서를 유전자크로닝을이용한면역기능강화유산균생균제개발 제의최종보고서로제출합니다. 과 2008년 4월 24일 주관연구기관명: 천안연암대학 총괄연구책임자: 한동운 세부연구책임자: 김광식 연구원: 윤미라 연구원: 곽기정 협동연구기관명: 전남대학교 협동연구책임자: 이봉주 연구원: 정복기 연구원: 조선주

3 요약문 Ⅰ. 제 목 유전자크로닝을이용한면역기능강화유산균생균제개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 1. 연구개발의목적돼지에서설사증은생산성저하의주요원인으로양돈산업에심각한피해룰주고있다. 따라서이러한설사증을치료하기위해다양한항생제가상시로사용되고있어국내에서도항생제오남용과그로인한내성균의출현이급증하는등부작용이커지고있다. 항생제를대체할수있는대체항생제에대한연구가절실하다. 유산균은사료를통해쉽게동물에섭취될수있고장에정착하여생존할수있기때문에살아있는유전자운반체로로서신개념의동물용생균제개발에매우좋은재료로활용되고있다. 또한분자유전학적의발전에따라유산균의유전학적연구가많이진행되어유산균주에대한재조합도활성화되고있다. 최근에는유전자클로닝기법을이용하여새로운유전자를유산균에삽입하여새로운형질을발현하도록하는연구가시도되고있다. 본연구에서는생균제로주로사용되는유산균인 Bacillus subtilis 에는돼지의면역기능을증강시킬수있는 porcine IL-2 유전자를 Lactobacillus acidophilus 균주에는 porcine IFN-r 유전자를각각 cloning 하여표면에서이러한 IL-2와 IFN-r 가분비되는면역기능강화생균주를개발하고돼지에면역기능강화생균제를일정기간급여한후면역기능증강효과를규명하고면역기능강화생균제의급여후돼지의면역기능증강으로항병력이증가되었는가를확인하였다. 2. 연구개발의필요성 2005년말부터 EU 는가축의성장촉진(GPAs : Growth-promoting antibiotics) 용항생제사용을금지하도록규제하고있다. 양계, 양돈및수생물사육업자들은 대부분 GPAs에의존하고있기때문에성장촉진용항생제의금지는국내축산업계 에커다란충격을주게될것이다. EU에서는 FP6(6th framework programme) 의일 - 1 -

4 환으로순수한식물사료나, 건강에해로운항생제가포함되는사료를대체하는천연 적대안을지지하는 REPLACE 를추진하고있다. 이에따라국내에서도항생제대체 천연물질에대한관심과생균제개발에대한요구가점차거세지고있으며천연물질 에대한관심이증폭되고있다. 국내에서는최근까지도축산에서가축사료에항생제를첨가함으로인해서병원균 의성장을억제시키고가축의성장을촉진시켜생산성의향상을추구하고있다. 하 지만이러한항생제의사용으로인한내성균출현과식육내의항생제잔류문제등 은국민위생에도심각한영향을미치고있다. 따라서최근전세계적으로항생제사 용에대한규제가강화되면서그대안으로비항생제적생물학적방법에의한생균제 가항생제대체물질로부각되면서생균제에관한다양한연구가진행되고있다. 생 균제는숙주의장내미생물균총의균형을유지시켜숙주동물에게이로운영향을미 칠수있는살아있는미생물사료첨가제로서유익한미생물의장내우점을유도하 여동물의건강을증진시키고동물의성장을촉진시킬수있다고알려져있다. 생균 제의사료첨가는자돈의설사를방지하며장내효소의활성을증가시켜사료내영 양소의이용율을향상시킬수있다고보고되었다. 또한분뇨내악취의원인으로알 려진암모니아가스의양을줄인다고알려져있다. 현재까지의생균제에대한연구들은성장촉진효과및유해가스감소에초점이 맞추어져있었다. 하지만생균제를이용하여면역증강효과를높일수있다면동물의 항병력이강화되어동물의건강을증진시킬수있을뿐만아니라항생제의사용을 줄일수있을것이다. 주로면역에관여하는싸이토카인인 interleukin-2 (IL-2) 의주 작용은세포독성 T 세포, B 세포, NK세포및단핵구를활성화시키므로서염증과감염 에대해서중요한면역반응역할을한다고알려져있다. 또한 IFN-r는 macrophage 및 NK cell 을활성시킨다. 따라서생균제에 IFN-r 와 IL-2를클로닝하여만든면역 증강생균제의투여는동물체내에서여러면역세포들의면역기능을강화시켜다양한 병원체에대한저항력을증강시킬수있을것이다. 이러한면역기능강화생균제가개발되면면역증강에의해여러질병들을예방할 수있게되어사료첨가및치료용항생제의사용이줄어들게될것이다. 더불어그 에따른인력및경비절감으로막대한생산성을추구할수있다. 또한항생제등항 균제의오 남용에따른식육중항생제잔류등축산물안전성에관한문제를해결 하는데도움이될것이다. 현재많은축산농가에서생균제를사용하는주된이유는 생산성과분뇨의악취를줄여주는데있다. 그러나면역기능강화생균제가개발보급 - 2 -

5 되면분뇨의악취감소뿐만아니라동물의면역기능강화를통한건강한가축의사육을통해축산업의생산성이향상되어축산농가에게경제적이익을극대화시켜주고날로위축되어가는국내축산업의경쟁력을제고하고농민의축산의욕을고취시키고천연영농을촉진시켜향후우리축산업의발전방향인친환경축산의기반을구축하는데크게기여할것으로기대한다. Ⅲ. 연구개발내용및범위 - 면역자극유도물질을분비하는생균제개발하고개발된생균제의면역기능강화 효과를규명하기위해돼지의 IL-2 유전자를 plasmid에 cloning 하여우수생균제균 주인 Lactobacillus acidophilus 균주에삽입하여돼지용 다. IL-2 발현생균제를개발하였 면역기능강화변이생균주의제조확인검사를위하여 PCR 및 Southern blot를실 시하여 IL-2 gene 의존재여부를확인하였다. 면역기능강화변이생균주의 IL-2 cytokine 발현및분비여부를 anti-il-2 단클론 항체를이용하여 Western blot 방법및 ELISA 방법으로검사하였다. 돼지의 IFN-r 유전자를 plasmid에 cloning하여 Lactobacillus acidophilus 균주에각각 삽입하여돼지용 IFN-r 발현생균제를개발하였다. 면역기능강화변이생균주의제조확인검사를위하여 PCR 및 Southern blot를실 시하여 IFN-r gene 의존재여부를확인하였다. 면역기능강화변이생균주의 IFN-r protein 발현및분비여부를 anti-ifn-r 단클론 항체를이용하여 Western blot 방법및 ELISA 방법으로검사하였다. 면역기능증강효과를규명하기위하여돼지에면역기능강화생균제를급여한그룹 과일반생균제를급여한그룹의세포성면역과체액성면역효과를검토하였다. 면역능력향상효과를규명하기위하여말초혈액과비장에서 T cell 과 B cell을 분리하여유세포분석기를이용하여 CD4 T cells, CD8 T cells 및 B cells 의분포율 을비교분석하였다. 돼지에개발된면역기능강화생균제를급여한후돼지의백신에대한면역증강효 과를검토하였다. 백신을접종하고그백신에대한항체가생성정도를 생균제투여후의자돈에서의면역증강효과를검토하였다. ELISA 방법으로측정하여 - 3 -

6 개발우수생균주선발과면역기능강화생균제투여동물의항병력을알아보기위 하여살모넬라감염증에대한항병성을검토하였다. 이균들의내열성, ph 내성및내담즙성등을검사하여비교한후최종선발된균 주들을변이생균주를제조하는데사용할수있도록하였다. 제조한면역기능강화 Lactobacillus acidophilus 균주를대량증식할수있는증식조 건을확립하였다. 면역기능강화생균제를급여한돼지에서면역기능증강으로항병력이증가되었는 가를확인하기위한인공감염실험을실시하였다. 돼지의소화기계의병원성세균인 Salmonella sp. 를이용하여인공감염시킨후 질병발생정도와억제효과를조사하였다. 다. 인공감염후육안적인임상증상및설사발생정도등을조사하였다. 인공감염후분비되는분변내총세균수및병원성살모넬라의수를측정하였 인공감염후변화된장관내의부검소견및병리학적소견을비교분석하였다. 인공감염후세포성면역반응을측정하기위하여말초혈액내의면역물질을측정 하였다. 면역기능강화생균제의생산성및친환경효과를확인하였다. 항생제대체효과를규명하기위하여면역기능강화생균제를급여하여사료내항 생제무처리구와항생제처리구로나누어사양시험을실시하였다 사양시험에서는증체량, 사료섭취량, 사료요구율등사양성적을조사하였다. 면역기능강화생균제의친환경효과검토를위하여돼지의분변내암모니아태질 소함량을측정하였다

7 Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의 1. 연구개발결과 돼지의 cytokine IFN-r와 IL-2를발현하는 Lactobacillus acidophillus를성공적으 로개발하였다. 돼지에면역증강생균제를급여한후 면역증강효과를검사한결과혈액내면역세 포의변화와혈청내스트레스지표에는유의적인차이는없었다. 돼지에면역증강생균제를급여한후혈액내 T-cell의분포와백신접종후항체가 변화에서도약간증가하는경향이있었지만유의적인차이는없었다. 돼지에면역증강생균제를급여한후분변내의암모니아농도는감소하는경향이있 었다. 돼지에면역증강생균제를급여한후 Salmonella를이용하여공격접종을실시하 여그방어효과를측정한결과분변에서살모넬라의검출율이감소하는경향을보였 다. 돼지에면역증강생균제를급여한후 Salmonella를이용하여공격접종을실시하여 그방어효과를측정한결과장간막임파절의육안적소견에서개선되는효과를보였다 살모넬라투여후설사를보이는자돈과개발생균제를급여한그룹의자돈을그 룹별로감염 1주와 2주째에각각 1두씩부검한결과살모넬라균단독투여군에서는 장벽의충출혈과궤양소견이나타났으나생균제투여군에서는약한정도의충혈소 견이관찰되었을뿐궤양과출혈소견은나타나지않아생균제의투여가장벽의보 호효과를보이는것으로나타났다. 개발생균제의자돈에서의대장균감염증에대한항병효과를알아보기위하여자돈 에대장균을감염시키고생균제를급여하면서대장균감염증에대한방어효과를검 토하였다. 대장균인공감염자돈들은감염 2일째부터심한설사를보이기시작하였 고지속적으로설사를보이면서폐사하기시작하였으나, 생균제를급여한그룹에서 는대장균만투여한그룹에비하여폐사율이유의하게감소하였고평균증체율에있 어서도유의적인차이는아니지만체중증가량이보다높게나타나질병의방어효 과는물론생산성의향상에도기여할것으로판단되었다. 생균제첨가에의한돼지의사양시험결과는생균제처리구에서비처리구보다 일당증체량, 일당사료섭취량및사료효율에있어서증가하는것으로나타났 다. 돼지에면역증강생균제를급여한후면역증강효과를검사한결과혈액내면역세 포의변화와혈청내스트레스지표에는유의적인차이는없었다. 돼지에면역증강생 - 5 -

8 균제를급여한후혈액내 T- cell의분포와백신접종후항체가변화에서도약간증 가하는경향이있었지만유의적인차이는보이지않았다. 그러나돼지에면역증강 생균제를급여한후분변내의암모니아와아민의농도가감소하였고일일증체량의 증가가관찰되었고사료요구율에서좋은효과를보이는것으로나타났다. 돼지에면역증강생균제를급여한후 Salmonella를이용하여공격접종을실시하 여그방어효과를측정한결과분변에서살모넬라의검출율이감소하였고장간막임 파절의종대가감소하여살모넬라병변이개선되는효과를보였다. 돼지에면역증강생균제를급여한후 측정한결과장간막임파절에서 추는것으로나타났다. salmonella Salmonella를공격접종하여그방어효과를 분리율이감소하여살모넬라감염률을낮 이상의결과를종합해보면면역증강생균제를급여한돼지에서면역증강효과를 측정한결과약간증가하는경향이있었지만유의적인차이는없었다. 하지만살모 넬라를공격접종한결과분변내의살모넬라분리율과장간막임파절에서의살모넬라 분리율이현저히감소하였다. 따라서면역증강생균제는돼지의설사질병에효과가 있는것으로판단되며이를이용하여바이러스성설사에서의효과등이연구되어야 할필요가있다. 2. 연구결과의활용 본연구에서개발된 2종의면역증강생균제에대한기술특허를출원하였고국내 학술지에 2 편의논문을개제하였다. 또한개발된 2종의생균제의균주기탁과균주 를특허출원하였고기술이전을통한대량생산에대한내용과농가보급방안등 을기업과협의중에있다. 개발된면역증강생균제가돼지의세균성설사질병에좋은효과를보이는것으 로판단되나 바이러스성질병에대한예방효과를검토하지못해이에대한연구가 보완되어야할것으로사료된다. 한편, 개발된생균제의상업화를위해서는저렴한가격의판매가중요한데생균 제의대량생산에드는비용과판매예상수익의차이가있어기업에서이윤추구에 문제가발생하고있다. 따라서저렴한가격에농가에보급이어려워농가에서부담 을줄이고사용할수있도록대량생산시설의확보를위한다른지원방안이요구 된다고하겠다

9 SUMMARY ( 영문요약문) Annual antibiotics consumption is estimated approximately 30 tons considering total annual consumption of food additive. Consumption of antibiotics is partly decreasing due to the problems caused by remains from live stock and antibiotics resistance bacteria. Meanwhile the total world consumption is expanding along with increase in live stocks as a result of promotion of growth of youngster and constraining of bad bacteria and inhibiting parasite. Antibiotics have been used to control infectious diseases in animals such as diarrhea and pneumonia in swine and dogs for long times. However, there was no guideline to control abuse and misuse in the use of the antibiotics. Now, there was not much of choice to use antibiotics since lots of antibiotics-resistant bacteria had been appeared due to abuse or misuse of the antibiotics. Therefore, alternatives including Lactobacillus have been required to control the diseases. Lactobacillus has been focused as live vector because the bacteria can propagate in the intestine after feeding. Also, researches on the Lactobacillus such as genetics have been done by the development of several techniques in molecular biology. Recently, techniques on the transformation and expression with the bacteria have been developed. Probiotics had been defined as the live bacteria which can give a benefit to the host by changing the microflora in intestine. Recently, several Lactobacillus have been used for the puropose in swine industry. Also, the bacteria must have several properties such as resistance to gastric acid and bile salt, ability to adhere and propargate in the small intestine to use as probiotics. In addition to those factors, cost to produce and use should not be expensive. Cytokines are small molecules that can control immune respones by activation of immune cells against the stimuli including the bacterial infection. Attempts have been made to use the cytokines as the indicator of early infection, adjuvants in vaccine and other studies. Economic loss in Korean swine industry can estimate about two hundred billions due to diseases. Similar economic loss have been reported in several different countries even though there were some different depending on the size - 7 -

10 of farmes, degree of sanitation, knoweledge on the swine technology, etc.. Therefore, several attempts have been made to decrease the economic loss. Lactobacillus as a probiotics is already proven as GRAS (Generally Recognized As Safe) in safety and has been used as a feed additive and animal medicine in animal industry to improve the productivity. if the bacteria can produce some molecules that may improve the immune responses and enhance the prevention of the diseases, the bacteria would be more attractive as a probiotics. Also, it will be increase the economical benefit to the farmers in animal industry. Korean swine industry obtains high technology among Asian countries. Meanwhile, it has many problems such as high dependency in imported feed and breeding pigs and most recently environmental concern has been raised. It is desperately needed to develop new technologies which can provide with high productivity aiming at high value added and as a way of giving hope and encouragement to those who work in live stock industry. It is well known that the young weaning pig is abruptly subjected to a radical change in diet coupled with the waning of maternally derived serum immunoglobulins and the withdrawal of the locally protective elements of milk. It usually resulted in the onset of the syndrome of postweaning diarrhoea, characterized by villus atrophy, malabsorption due to enterocyte immaturity and bacterial overgrowth and To date, nothing is known about any in vivo function of IL-2 on the innate immune responses in newly weaned piglets. In the present study, we investigated the potential effects of IL-2 on the CD4 +, CD8 + T lymphocytes subpopulations percent (in PBMCs), IFN-γ and IL-2 production in serum, PBMCs proliferation. This paper reports for the first time the in vivo immunostimulatory effects of IFN-γ and IL-2 on the innate immune responses in newly weaned piglets. According to the research conducted by National Dairy Board, public health is endangered by abusing and misusing of insecticide, herbicide and the antibiotics which causes antibiotics-resistance bacteria. For that reason, it is more in need to develop alternative methods in live stock industry which increase feeding efficiency while constraint the use of antibiotics. Korea is no exception under the rule of trade liberalization of WTO and in turn, it is unavoidable to restrict the - 8 -

11 use of antibiotics in domestic live stock market. Considering the current situation in live stock industry as described the above, this research can contribute to live stock industry by proving Lactobacillus expressing IFN-r and IL-2, as a probiotics can prevent animal diseases. Isolation and preparation of immune cells from swine and isolation of total RNA from the cells and generation of cdna. Cloning and characterization of Pig IFN-r and Pig IL-2 from swine. Preparation of vector to express the cloned genes in Lactobacillus. Production of transformants expressing the Pig IFN-r and IL-2. Development of transformation technology in Lactobacillus. Transformation of the cloned Pig IFN-r and IL-2 into the Lactobacillus. Expression and charaterization of the Pig IFN-r and IL-2 in Lactobacillus. Application of the Lactobacillus expressing Pig IFN-r and IL-2 to animals. Animal experiment of the Lactobacillus expressing Pig IFN-r and IL-2 in swine. Examine the immune responses after administration. Animal experiment of the Lactobacillus expressing Pig IFN-r and IL-2 in swine. Examine the immune responses after adminstration. Surveillance of diseases after administration. To study the immune response induced by 120 piglets of both sexes of mixed genetic background, 2 months of age and free of PED virus, were purchased in a rural farm in the Chonan city and kept in the farm of the Yonam college in controlled sanitary conditions to prevent infections. Sera from pigs immunized with PED virus were processed to measure specific antibodies by ELISA. To reduce unspecific binding of sera pig components, an enriched Ig fraction of the sera was precipitated by ammonium sulphate, chromatographed and rediluted in 0.15 M PBS before assessment of serum antibody levels by ELISA. Preparation of techniques to express the cloned genes in Lactobacillus. Establishing foundations to express useful immune-activating substances and proteins based on this study of Lactobacillus expressing canine Pig IFN-r and IL-2. Presenting possibilities to produce Lactobacillus expressing these various substances in large quantities at low cost

12 However, recently food additive market is under various restrictions for antibiotics which promotes growth of youngsters and prevents diseases. Internationally, the use of antibiotics as food additives is prohibited and Korea is not an exception. Besides, the current trend concerning the safety of meat helps to bring probiotics into attention. Thus, efficacy of Lactobacillus expressing Pig IFN-r and IL-2 proven by this study enhances animal hygiene and public hygiene as new probiotics. Also, it will be considered to be a huge contributor of livestock industry thanks to currently raising well-being trend. Development of Lactobacillus expressing Pig IFN-r and IL-2 which enhances immune function and bioavailability will substitute antibiotics for probiotics and make use of nutritional food additive. Therefore, this product is expected to have international competitiveness

13 CONTENTS Chapter 1. Intoroduction of the project Chapter 2. Status and problems in related technology in domestic and overseas Chapter 3. Contents of the project and its results Section 1. Development and effect of a recombinant pig INF-r and IL-2 gene into Lactobacillus Section 2. Effects of INF-r and IL-2 gene cloned probiotics on the immune system of pig Section 3. Clinical efficacy test for pig INF-r and IL-2 gene cloned probiotics on pig with salmonella Section 4. Effects of pig INF-r and IL-2 gene cloned probiotics on pig against pathogens Section 5. Clinical efficacy test for pig INF-r and IL-2 gene cloned probiotics on pig Chapter 4. Accomplishment and subsequent contributions Accomplishment Subsequent contributions

14 Chapter 5. Application of the results Chapter 6. International trend and scientific information Chapter 7. Reference

15 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 제 2 장국내외기술개발현황 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절면역기능강화생균제개발및면역증강효과규명 1. 연구재료및방법 연구결과및고찰 제 2 절면역강화생균제의면역증강효과및항병력효과 규명 연구방법 연구결과및고찰 제 3 절면역증강생균제의 Salmonella에대한항병력 증강효과규멍 연구방법 연구결과및고찰 제 4 절생균주투여동물의항병력효과 연구방법 연구결과및고찰

16 제 5 절생균제의사양효과및친환경축산물생산 연구방법 연구결과및고찰 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 제 1 절. 목표달성도 절. 관련분야에의기여도 제 5 장연구개발결과의활용계획 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장참고문헌

17 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절. 연구개발의필요성 가. 연구개발의목적돼지에서설사증은생산성저하의주요원인으로양돈산업에심각한피해룰주고있다. 따라서이러한설사증을치료하기위해다양한항생제가상시로사용되고있어국내에서도항생제오남용과그로인한내성균의출현이급증하는등부작용이커지고있다. 항생제를대체할수있는대체항생제에대한연구가절실하다. 유산균은사료를통해쉽게동물에섭취될수있고장에정착하여생존할수있기때문에살아있는유전자운반체로로서신개념의동물용생균제개발에매우좋은재료로활용되고있다. 또한분자유전학적의발전에따라유산균의유전학적연구가많이진행되어유산균주에대한재조합도활성화되고있다. 최근에는유전자클로닝기법을이용하여새로운유전자를유산균에삽입하여새로운형질을발현하도록하는연구가시도되고있다. 본연구에서는생균제로주로사용되는유산균인 Bacillus subtilis 에는돼지의면역기능을증강시킬수있는 porcine IL-2 유전자를 Lactobacillus acidophilus 균주에는 porcine IFN-r 유전자를각각 cloning 하여표면에서이러한 IL-2와 IFN-r 가분비되는면역기능강화생균주를개발하고돼지에면역기능강화생균제를일정기간급여한후면역기능증강효과를규명하고면역기능강화생균제의급여후돼지의면역기능증강으로항병력이증가되었는가를확인하였다. 나. 연구개발의필요성 2005년말부터 EU 는가축의성장촉진(GPAs : Growth-promoting antibiotics) 용항생제사용을금지하도록규제하고있다. 양계, 양돈및수생물사육업자들은 대부분 GPAs에의존하고있기때문에성장촉진용항생제의금지는국내축산업계 에커다란충격을주게될것이다. EU에서는 FP6(6th framework programme) 의일 환으로순수한식물사료나, 건강에해로운항생제가포함되는사료를대체하는천연 적대안을지지하는 REPLACE 를추진하고있다. 이에따라국내에서도항생제대체 천연물질에대한관심과생균제개발에대한요구가점차거세지고있으며천연물질

18 에대한관심이증폭되고있다. 국내에서는최근까지도축산에서가축사료에항생제를첨가함으로인해서병원균 의성장을억제시키고가축의성장을촉진시켜생산성의향상을추구하고있다. 하 지만이러한항생제의사용으로인한내성균출현과식육내의항생제잔류문제등 은국민위생에도심각한영향을미치고있다. 따라서최근전세계적으로항생제사 용에대한규제가강화되면서그대안으로비항생제적생물학적방법에의한생균제 가항생제대체물질로부각되면서생균제에관한다양한연구가진행되고있다. 생 균제는숙주의장내미생물균총의균형을유지시켜숙주동물에게이로운영향을미 칠수있는살아있는미생물사료첨가제로서유익한미생물의장내우점을유도하 여동물의건강을증진시키고동물의성장을촉진시킬수있다고알려져있다. 생균 제의사료첨가는자돈의설사를방지하며장내효소의활성을증가시켜사료내영 양소의이용율을향상시킬수있다고보고되었다. 또한분뇨내악취의원인으로알 려진암모니아가스의양을줄인다고알려져있다. 현재까지의생균제에대한연구들은성장촉진효과및유해가스감소에초점이 맞추어져있었다. 하지만생균제를이용하여면역증강효과를높일수있다면동물의 항병력이강화되어동물의건강을증진시킬수있을뿐만아니라항생제의사용을 줄일수있을것이다. 주로면역에관여하는싸이토카인인 interleukin-2 (IL-2) 의주 작용은세포독성 T 세포, B 세포, NK세포및단핵구를활성화시키므로서염증과감염 에대해서중요한면역반응역할을한다고알려져있다. 또한 IFN-r는 macrophage 및 NK cell 을활성시킨다. 따라서생균제에 IFN-r 와 IL-2를클로닝하여만든면역 증강생균제의투여는동물체내에서여러면역세포들의면역기능을강화시켜다양한 병원체에대한저항력을증강시킬수있을것이다. 이러한면역기능강화생균제가개발되면면역증강에의해여러질병들을예방할 수있게되어사료첨가및치료용항생제의사용이줄어들게될것이다. 더불어그 에따른인력및경비절감으로막대한생산성을추구할수있다. 또한항생제등항 균제의오 남용에따른식육중항생제잔류등축산물안전성에관한문제를해결 하는데도움이될것이다. 현재많은축산농가에서생균제를사용하는주된이유는 생산성과분뇨의악취를줄여주는데있다. 그러나면역기능강화생균제가개발보급 되면분뇨의악취감소뿐만아니라동물의면역기능강화를통한건강한가축의사 육을통해축산업의생산성이향상되어축산농가에게경제적이익을극대화시켜주 고날로위축되어가는국내축산업의경쟁력을제고하고농민의축산의욕을고취시

19 키고천연영농을촉진시켜향후우리축산업의발전방향인친환경축산의기반을구 축하는데크게기여할것으로기대한다

20 제 2 장. 국내외기술개발현황 생균제(probiotics) 는항생제의대체물질로서숙주의장내미생물균총의균형을 유지시켜숙주동물에게이로운영향을미칠수있는살아있는미생물사료첨가제 로서유익한미생물의장내우점을유도하여동물의건강을증진시키고동물의성장 을촉진시킬수있다고알려졌다(Fuller, 1989). 이유자돈에서이유시갑작스런사 료및환경의변화에서오는스트레스로장내미생물균총의급격한변화로인해심 각한설사가있다고알려져있다(Hale과 Newton, 1979; Pollman 등, 1980). 생균제의 사용이설사방지와더불어자돈의생산성을증진시키는효과가있으며 (Pollman 등, 1980; Collington 등, 1988; 장등, 2000). 생균제의사료내첨가가자돈뿐만아니 라육성 비육돈에서도성장능력개선에효과가있다고보고되었다 (Baird, 1977). 또한생균제의첨가는장내효소의활성을증가시켜사료내영양소의이용율을향상 시킬수있었으며(Mollgaard, 1946; Collington 등, 1988; Scheuermann,, 1993), 면역 능력을향상시켜동물의건강을증진시킬수있다고보고되고있다(Kato 등, 1983; Fuller, 1989). 현재까지의생균제에관한대부분의연구들은주로돼지의사양시기를자돈기와육 성 비육기로나누어그효과를단계별로검증하였다(Hale과 1979;Pollman 등,1980). Newton, 항생제는치료의목적보다낮은농도로사료에첨가되어미생물의성장을저해하 기위하여사용하는물질이다(Cromwell, 2001). 항생제는지난 50여년이상가축의성 장을향상시키고농장의사양환경에서질병을예방하는차원에서널리사용되어져 왔다(Gustafson 등, 1997). 이러한항생제의급여시성장의향상효과에가능성있는 기전으로는질병인자를가지고있는미생물의저해와동물의성장을저해하는독소 와같은미생물관련물질의감소, 위장관내에서필수영양소를파괴하는미생물 의저해및장관벽의얇아짐으로인한영양소의흡수및이용효율의향상등이보고 되어있다 (Visek, 1978). 이런한항생제의동물영양학에있어서의우수한효과에도불구하고오늘날항생 제내성미생물과같은잠재적인공중위생에서의위험성으로인해많은문제점이제 기되고있는실정이다(NRC, 1998). 유럽의몇몇나라는사료항생제사용에대해엄 격한지침과규제를하고있다. 이러한관점에서많은사료업계종사자및동물영 양학자들은생균제, 식물성추출물, 올리고당류, 유기산과같은항생제대체물질에

21 대한연구가활발해지고있다. 따라서, 본과제의일련의실험들은이러한관점에서 돼지성장개선물질이자항생제대체물질로서가능성이있는생균제를개발코저 한다. 동물의성장능력과건강상태의개선에의한생산성증진을통해양돈산업의경 쟁력향상이요구되고있다. 특히돼지에서자돈의설사증은성장능력감소와폐사의 주요원인이며, 설사증의예방, 치료를위해서항생제를사용하나(Visek, 1978; Walton, 1980), 축산물내잔류및내성에관한위험성이부각되고있다. 또한, 국내 축산업에있어서도사료내항생제첨가는단계적으로제한될전망이며, 항생제의대 체효과를가지는생균제가이미사용되고있으나그효과는미미한실정이다. 생균제란동물또는사람이섭취하였을때장내토착미생물들의특성을향상시켜 숙주에게유익한영향을주는살아있는단종또는혼합된균주들로정의된다. 이러 한생균제는가축이섭취였을때성장촉진과사료효율의향상, 장내미생물의경합 에의한어린동물들의장질환방지및병원성미생물감소, 면역기능향상등다양 한면에서유익한영행을미치며, 그결과로돼지의경우설사에의한성장장해와폐 사율을줄일수있다. 특히, 생균제와특정기질을함께사용하여유발되는시너지 효과에의해생균제가발표된이후, 생균제와시너지효과를일으킬수있는물질중 하나인 Probiotics 는사료첨가제료서의이용이고려되어왔다. Probiotics 란장내에서서식하고있는미생물들의성장과활력에선택적으로작용 하여숙주에게유익한영향을주는비소화성식품성분들을총칭하는물질로서생균 제에기질로작용하여궁극적으로는숙주의건강을향상시키는기능을발휘한다. Probiotics 는특정균주의선택적인성장을촉진하여장관내미생물균총을변화시키 며대표적으로 inulin과 fructooligosaccharides(fos) 에대한연구가이루어져왔다. 이유자돈의설자는이유직후에빈번히나타나며, 여기에관여하는병원성미생 물들로는 enterotoxic E. coli(etec) (26%), Clostridial enteritis (18%), Coccidiosis (14%), Rotavirus (8%) 등이알려져있다. 이우자돈설자증에의해장내서식하는 Bifidobacteria와 lactobacilli 를감소하고, Enterobacteria는증가시키는것으로알려 져있다 (Kimura, 1983). Lactobacillus reuteri에의해발효된 yoghurt와 milk를생후 2일령돼지에급여하였 을때장내 lactobacilli 는증가하고, E. coli 는감소되었다(Hoefling, 1989). 포유자돈에 게 Bifidobacterium과 Bif. pseudolongum을경구투여할경우임상적인설사증을예 방하는효과가보고되었다(Ervolder, 1984). 또한, Enterococcus faecium C68을 4개월

22 동안어린돼지에급여하였을때증체량과사료효율이증가하고, 설사증은감소하였 다(Maeng 등, 1989). 비육돈에서도생균제(C. butyricum ID) 의사용은설사의감소및병원성미생물감 염의예방뿐만아니라성장률과사료효율의개선효과가있는것으로알려져있다 (Pollman 등, 1980). 현재시판되고있는생균제는미생물단독, 혹은다양한물질들 과혼합하여사용되고있으며하루에동물개체당대략 수준의미생물을급 여하는방법을사용하고있으나생존율에근거한정확한수치, 투여량과투여방법 에따른효과등에대한자료는제시되어있지않다 (Tuschy, 1986). 양돈사료의세가지주요유형은사균과생균 Lactobacillus 또는생균 Enterococcus faecium을첨가하는것으로사료 1g당 10-10으로첨가하여혼합하는 것이일반적이다. 생균제내의균주는단독으로사용되었을때보다혼합된경우가더우수한것으로 나타났으나상반되는결과도보고되고있어, 보다체계적인실험을통해생균제기 능을향상시키는방법이모색되어야할것이다. 이들생균제용균주를분체복합화하 는방법은액상바인더의분무방식에의한피복방식보다뛰어난생존능력을부여하는 것으로알려져있으며, pelleting후에도약40% 이상의균주가생존하는것으로보고 되었다(Lyons, 1988). 후 생균제는분체복합화에의한내산성및장용성생균제의제조 2차적인처리로전분및증량제등으로외층을감싸고재차구형화처리를해줌으 로써분말의입도를균일하게제어할수있으며소량으 l제제로이용율을극대화함 으로써경제성을제고하는방안으로기대된다. 이러한생존율은미생물의성장조건, 회수방법, 저장환경, 저장기간, 사료에첨가하는방법에따라매우상이하며특히 lactobacilli 는동결건조, 통풍건조에민감한것으로알려져있고 lactobacilli 보다 streptococci 가더열악한환경에서도견디는것으로알려져있다(Hardis, 1986; Mundt, 1986). 그밖에는 Bacillus와 Clostridium 이생균제로사용되어왔다(Han 등, 1984). 일반적으로사료에는 heteropolysaccharides인 glucans, fructans, arabans 및 xylans, 그리고 heteropolysaccharides인 arabinoxylan, gluconoxylans, 기타 oilgosaccharides등의탄수화물이존재하며이들중 oilgosaccharides는 Prebiotics로서 생균제의기질로사용되어활력증진효과를나타낼수있다. 이에지금까지생균제와 Probiotics 를함께혼합하여급여한연구결과는있으나, 복합분체의시너지효과를 검증한연구가수행된바있다

23 Probiotics로서 oilgofructose 는소장에서흡수되지않고, 장내 Bifidobacteria의성 장을증진시킨다. 일반적으로 oilgofructoses는단맛이나며향기및기호성이좋고 높은용해도를갖는다(Niness, 1999). Inulin과 oilgofructose 는장내미생물균총, 장 관생리, 면역기능, 미네랄의생체이용성및지질대사에유익한조절인자로작용하 며, 항암작용이있는것으로알려져있다(Roberfroid, 1999). 유산균을이용한여러종류의생균제가개발되어있지만이는사료효율증진, 장 내정장작용, 유해세균및독소의흡착및배설에의한분변내악취감소효과를위 주로하고있을뿐본연구에서목표로하는면역기능및질병억제효과를가진생 균제는아직까지개발되어있지않다. 유럽에서유통중인. 프로바이오틱스제품을수거하여검사한결과대부분의제 품에서균주이름의오기균수의부, 족등이관찰되었다. 일종의식품미생물학교 재인에서도 Fundamental Food Microbiology 실제적으로는유산균이거의모두죽 어있는이들제품에대해서는건강기능성효과가없는것으로제시하였다. 프로바이오틱스는병원성미생물과경합하여장내의영양분을선점할수있고장 점막부위에병원성균과경쟁적으로먼저부착할수있다또한다양한종류의항균 성물질을생산하거나생체의면역증진을통하여병원균의증식을억제할수있다. 보통로타바이러스는자연적으로장관내로감염되어어린이나어린동물들에게서설 사를일으킨다. 로타바이러스의작용기작은동물에서많이알려져있으며로타바 이러스는주로상피세포층상부의성숙된상피세포에서증식한다. 이것은분화된 장상피세포가감염과복제에필요한인자들을많이가지고있기때문으로보인다. 로타바이러스의감염은소장상피세포의기능을변화시켜설사를유발하게되고설 사는보통영양소흡수불량과상피세포파괴를가져온다. 흡수불량은분해되지 않은단당류이당류지방단백질을대장으로이동하게하고대장은충분한수분을 흡수할수없어서삼투성설사를초래하게된다. 로타바이러스는또한장상피세 포에서와케모카인의분비를유도하는데이것들은감염에대한면역반응을시작하 는인자들로알려져있다. 한편 Lactobacillus는숙주의물리적인방어기능을포함 한여러방어기작에도움을줌으로서병원성균에대한억제하는것으로알려져있 다. 프로바이오틱 Lactobacillus를투여한아이들은아토피가감소하였고혈중의 농도와혈중또는요중의염증성지표물질인 eosinophil cationic CD4 단백질을감소시 켰다. 또한프로바이오틱스투여군의분변 TNF-α 감소가나타났으며 Lactobacillus

24 가포함된요구르트를 12개월이상섭취한건강한노인을대상으로한실험에서요 구르트를섭취하지않은군에비하여알레르기증상이더낮은빈도로나타났다. 혈장중의 IL-2, IL-4, IL-6, IL-1, TNF- α, TGF- 1, TGF- 2, C-reactive protein을 비교연구한결과는 C-reactive protein과 IL-6는 L. rhamnosus 투여군에서 IL-10 수준이상승한다고보고하였다. 다양한동물실험에서는숙주의면역계이상이염증성대장질환을유발하는주요 원인으로나타났다. 예를들어사이토카인이나사이토카인수용체혹은면역물질을 코딩하고있는유전자를변형할경우염증성대장증상이쥐의대장에서주로나타 났다고보고되어 료된다. 장관의미생물환경이대장질환의진행에관련이있는것으로사 DC Th1의항원제시는림프구를자극하게되며이것은 IL-2와 IFN-γ를통해대 식세포의활성화를유도하게된다. 이는다른사이토카인이나매개체인 IL-12와 IL-18 의분비를유도한다. 활성화된대식세포는 IL-1, IL-6 TNF-α를분비하여염 증반응을증폭시키게된다. 유산균의작용메커니즘은여러가지로생각되고있는데여기에는병원성미생물의 생장억제로 점막층에부착하거나투과하려는병원균을억제하고점막층의기능을 자극하거나염증성물질과방어물질을증진시켜서면역을조절하는기작으로생각 되고있다. 프로바이오틱스를이용한다양한임상실험결과들은유산균을부작용이적은자 연적인치료방법및예방물질로서의가능성을제시하고있다. 따라서유해세균및 로타바이러스등의유해미생물의증식을억제하고아울러알레르기와염증성장관 질환억제능력이우수하고장내정착성이좋은프로바이오틱스균주를개발하는것 이필요하다. 특히프로바이오틱스의섭취는숙주의장내세균총에미치는영향이크므로장내 의우점균으로서 Lctobacillus 와상피세포의접착력과장내면역반응의조절에대 해고려해야할것이다. 즉미생물과숙주세포그리고점막과면역방어체계에대 한연구가보완되어야할것으로보인다. 항생제오남용에대한인식이확산되면서축산물소비자들의친환경축산물에대 한욕구는갈수록증가하고있다. 따라서양돈에있어서도친환경사육환경조성의 필요성이대두되고있다. 여러종류의수입생균제를포함한국내시판되고있는생균제는사료효율증진,

25 변비예방, 장내정장작용, 유해세균및독소의흡착및배설에의한해독작용과축사 내악취감소에다소의효과가있다고알려져있지만최근의저항생제사육과양돈 의생산성을향상시키기에는턱없이부족한형편이다. 따라서국내축산농가에게 희망을주고국제경쟁력을확보한유기농축산을시작하기위해서는항병력을가진 생균제의개발이필수적이다

26 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절. 면역기능강화생균제개발및면역증강효과규명 본연구에서는 Lactobacillus acidophilus를이용하여돼지의면역기능을증강시 킬수있는 porcine IL-2 유전자와 porcine IFN-r 유전자를각각 cloning 하여생균 제표면에서 pig IL-2와 IFN-r 가분비되는면역기능강화생균주를개발하고면역 기능증강효과를확인하는데있다. 1. 연구재료및방법 1) 실험방법및설계 가) 공시동물 사양시험은 공시동물로는평균체중이 13 주령비육전기돈을사용하여전남대학교시험돈사에서실시하였다. 53.3kg 인비육전기돈인삼원교잡종 (Landrace x Large White x Duroc) 암컷을공시하였다. 처리는 2처리에각각 5두씩총 10 마리를이용 하여실시하였다. 나) 시험설계및사양관리 처리Ⅰ은대조구로처리Ⅱ는대조구사료에우수생균주 B. subtilis, L. acidophilus를각각 1% 을첨가한처리구로하였다. 사료는자동급이기, 물은자동급 수기에의해자유채식시켰으며, 기타사양관리는전남대학교시험돈사표준사양관 리법에준하였다. 다) 돼지의장관내정상세균총에대한조사 비육전기돈에대한정장세균총검사를실시하고자처리군별로 5두씩각각의 소장과장간막임파절에서세균검사를실시하였다. 장관내정상세균총에대한조 사는검사대상돼지의장관내용물을약 10배가량의 Selenite broth (Difco) 에 증균하여혈액배지, Salmonella-Shigella agar (Difco) 및 MacConkey agar

27 (Difco) 에서분리배양한다. 동정하였다. 집락을선택한후생화화적검사를실시하여균체를 2. 1) 연구결과및고찰 우수생균주선발및생균제대량증식법확립 가) 우수생균주의발굴및우수생균주의생물학적특성규명 우수생균주을분리동정하기위하여돼지의장관과토양에서채취한가검 재료를검량하여 5% 면양혈액한천배지에접종하여 37, 10% CO2에서 초대배양하여집락을선택하여 37 에서 24시간계대배양한후 catalase, gram stain, H 2 S, indole등의 test 로균들을분리동정하였다. 면양혈액한천배지에서생성된집락을선택하여생화학검사결과를토대로 B.subtilis, L.acidophilus 를분리동정하였다. 이들세균은 60 0 C의온도에서도 안정성을나타내었다. 분변및토양유래의토착유효미생물의분리를시도하여 B. subtilis, L. acidophilus 를생화학검사법을이용하여동정하였다. 이들세균의특징은표 1의 결과와같다. 나) 우수생균제미생물의최적배양온도및조건확립 동정된 B.subtilis, L.acidophilus 를 증식곡선을통해최적생장조건을확인하였다. LBS액체배지에서각각혼합배양하고세균의 분리동정된우수생균주미생물의혼합성장을시간별로확인하였다. 성장곡선 을통해확인된조건은이들을사료에첨가하여양돈생산성에이용할수있는가능 성을탐색에이용되었다. 아래그림에서와같이 L.acidophilus, B.subtilus 는미호 기성조건에서전형적인세균증식곡선의형태로증식하였으며 성화된세포를회수할수있는조건을확립하였다. 36시간배양에서활

28 Table 1. Isolation of Lactobacillus acidophilus and Bacilius subtilis Isolates B.subtilis L.acidophilus Catalase + Gram stain + + Hemolysis factor Heat resistance at 60C + + 다) 우수생균주대량생산최적조건확인 분변및토양유래의우수생균미생물 B. subtilis, L. acidophilus 를온도조건에혼 합배양하여균체의생존능력을평가하였다. 평가된생존능력에따라혼합배양의 최적조건을평가하였다. 우수우수생균제미생물은배양온도 60 에서까지활성을 유지하였다

29 Fig 1. Growth curve B.subtilis and L.acidophilus on incubation time

30 Table 2. Condition of temperature for incubation combined probiotics Incubation temperature B.subtilis L.acidophilus 실온

31 2. 생균제급여후육성비육돈의 장내와분변의미생물성상조사 유효미생물을첨가한사료를투여한 1주일후비육후기돈에장관내세균총의조사 결과는아래표에서보는바와같다. 우수생균제미생물첨가에따른정상세균총구성 세균의균체수의분포에서는아래표와같이우수생균제후 B. subtilis, L. acidophilus 의 10 2 이상증가하여생존하고있는것으로관찰되었다. 또한유효미생물을첨가 한사료를투여한 함한전체실험구에서 1주일후비육후기돈의장간막임파절을검사한결과대조구를포 Salmonella 를포함한병원성세균은검출되지않았다. 이상의결과를종합하여볼때음식물사료에첨가된유효미생물은투여 1주일후 부터장관내유용정상세균총을구성할수있음을확인할수있었으며이들정상 세균총은돼지의소화기감염원인이되고있는병원성 E.coli, Salmonella, Serpulina 등의기회감염을예방할수있다고생각된다. Table 3. Condition of normal flora after 1 weeks adminstration with developed probiotics Ⅰ Ⅱ B.subtilis L.acidophilus [*]Ⅰ : Control Ⅱ : Probiotics B. subtilis, L. acidophilus 1%

32 3. Pig IFN-r를발현하는 Lactobacillus acidophilus 제조과정 가. 전체적인실험개요실험의전체적인개요는다음과같다 (Figure 2) 1 Lactobacillus acidophilus (ATCC4356) 로부터 chromosomal DNA 추출 2 3 PCR을이용한 slpa 프로모터(PslpA) 와종결시퀀스(TslpA) 증폭 돼지비장으로부터 RNA 추출 4 RT-PCR을통해 pig IFN-γ gene 증폭 5 6 증폭된 3가지 gene을차례로 cloning vector (puc19) 에삽입 puc19으로부터 expression vector (pnz123) 로 gene cloning 실시 7 TPslpA와 pig IFNγ가삽입된 pnz123를 L. acidophilus로전기천공실시 8 L. acidophilus의 TPslpA-pig IFNγ gene 보유일수확인 나. 실험내용 1. Lactobacillus acidophilus (ATCC4356) 로부터 chromosomal DNA 추출 Lactobacillus acidophilus (ATCC4356) 을 Luria-Bertani agar (BD biochemical co., Sparks, USA) 배지에배양 (37 /24h) 후, 세균집락을채취하여이로부터 DNA 를추출하였다. 추출방법은다음과같다: 배양된세균집락을 100μl의멸균증 류수에부유하여 100 에서 10 분간, -20 에서 20 분간의과정을차례로그친다음, 상온에서녹을때까지정치하였다. 다음으로 3000rpm에서 1 분간원심분리하였다. 분리된상층액을수거하여 PCR의 template 로사용하였다. 2. PCR을이용한 slpa 프로모터와종결시퀀스증폭 2.1. PCR primer and condition Lactobacillus acidophilus (ATCC4356) 의chromosomal DNA를 template로하여 Lactobacillus 내의 slpa gene의 PslpA ( 프로모터) 와 TslpA ( 종결시퀀스) 를아래 primer 쌍들을이용하여 PCR 을통해증폭하였다. PslpA primers : Forward 5'-GGC GGA ATT CGG TAA GCG GTA GGT GAA-3' Reverse 5'-GCG CTC TAG ATG GTC TTT TCC TCC TTG-3'

33 Fig 2. Scheme of amplification of sequence with cdna on Lactobacillus acidophilus

34 TslpA primers : Forward 5'-GCA ACT GCA GTA ATA AGT CGT AC ACT AAC-3' Reverse 5'-GGC CAA GCT TCA GAA GAT CCT ATT AGA ACT-3' PCR반응은 95 에서 5 분간충분히전반응 (pre-denaturation) 시킨후, 94 에서 1 분, 55 에서 1 분, 72 에서 1분간의반응 cycle을 35 회반복하였다. 최종적으로 72C 7 분간더반응시켰다. 증폭된 PCR산물은 0.7% agarose gel에서 40분간전기영 동을실시하였고, 전기영동이완전히끝난후 UV아래에서 PslpA(275bp), TslpA(117bp) band 를확인하였다. 전기영동결과는 figure 3 같다

35 Fig. 3. Agarose gel electrophoresis of polymerase chain reaction -amplified PslpA (275bp)and TslpA (117bp) band. From left to right: M, 100 base pair DNA ladder; lane 1,2, PslpA; lane 3,4, TslpA cdna on Lactobacillus acidophilus

36 2.2. PslpA와 TslpA gene gel elution Figure 2 에서보는바와같이, PslpA와 TslpA band를 Qiagen사의gel extraction kit 를이용하여각각유리하였다. 추출하는방법은제조사의공정을따랐다. 간단히 설명하면다음과같다. PslpA 또는 TslpA band가포함된 gel과 buffer QG를 1:3의 비율로혼합한후, 50 water bath에 10분동안정치하여 gel 을완전히녹였다. PslpA 또는 TslpA band가포함된 gel과동량의 Isopropanol 을넣고잘섞어준후, QIAquick spin column에옮겨담고 13000rpm에서 1 분간원심분리하였다 ( 이후 과정의원심분리조건은 13000rpm/1min 으로동일하다). Gel을완전히분리하기위해 0.5ml의 buffer QG 를추가로첨가하여원심분리하였다. 이후에세척을위해 0.75ml Buffer PE 를넣고원심분리하였으며, 분리된하층액을버리고한번더원심분리 하여완전히이물질을제거하였다. QIAquick spin column을새 EP tube에옮겨담 은후, 50μl의 Buffer EB를이용하여 PCR product 즉 PslpA와 TslpA gene을유리 하였다. 3. IFN-r를 cloning 하기위한돼지비장세포로부터 RNA 추출 돼지의 RNA는 Qiagen사의 RNeasy Mini kit 를사용하여추출하였다. 추출하는방 법은제조사의공정을따랐다. 간단히설명하면다음과같다. 비장적출후 cell strainer(bd biosciences, USA) 를이용하여세포를유리시켰으며, 개의유리된 비장세포를 β-mercaptoethanol이첨가된 600μl의 RLT buffer 에넣어서용해하였다. 다음으로, 동량의 ethanol 을첨가하여잘혼합하였으며, 혼합물은 RNA 흡착을위하 여 RNeasy column 에넣어원심분리하였다. 이후, washing buffer로 RNA를세척한 후, RNase-free water를이용하여 RNA 를정제하였다. 4. RT-PCR을통해 pig IFN-γ gene 증폭 4.1. cdna 합성 비장으로부터추출한 RNA로부터 SuperScriptTM First-Strand synthesis system (Invitrogen, USA) 를이용하여제품설명서에따라 cdna 를합성하였다. 간단히설명 하면다음과같다. Total RNA(50ng/ μl) 7 μl, random hexamers(50ng/ μl) 1 μl, 10mM dntp 1μl그리고 DEPC-treated water 1μl를잘혼합하여 65 에서 5분동 안반응시킨후, 1 분간얼음넣어정치시켰다. 이때, 10 RT buffer 2 μl, 25mM

37 MgCl2 4 μl, 0.1M DTT 2μl그리고 RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor 1 μl를잘혼합하여준비하였다. 이렇게준비한혼합물을얼음에넣어두었던 시료와혼합하여 25 에서 2 분간반응시켰다. 다음으로, SuperScriptTM(50unit) 1μl 를첨가하고다시 25 에서 10 분간더반응을시켰다. 그이후, 42 에서 50 분, 70 에서 15 분간을차례로반응시켰다. 마지막으로 RNase H 1μl를첨가하여 37 에서 20분간반응시켜 cdna 합성을완료하였다 PCR primer and condition 합성한 cdna를 template로하여 Pig IFN-γ를 PCR 을통해증폭하였다. PCR에사 용된 primer 쌍들을아래와같다. Pig IFN-γ Primer Pig IFNγ-F: 5'-ATG CTC TAG ACT CTC TCC GAA ACA ATG AGT-3' Pig IFNγ-R: 5'-ATG CGT CGA CCA GGA TGA CAA TTA TTT TGA TG-3' PCR반응은 95 에서 5 분간충분히전반응 (pre-denaturation) 시킨후, 94 에서 1 분, 55 에서 1 분, 72 에서 1분간의반응 cycle을 35 회반복하였다. 최종적으로 7 2 에서 7 분간더반응시켰다. 증폭된 PCR산물은 0.7% agarose gel에서 40분간전 기영동을실시하였고, 전기영동이완전히끝난후 UV아래에서 Pig IFN- γ (526bp) band 를확인하였다. 전기영동결과는 figure 4 와같다

38 Fig. 4. Agarose gel electrophoresis of polymerase chain reaction-amplified Pig IFN-γ cdna products. M, 100 base pair DNA ladder

39 5. 증폭된 3가지 gene을차례로 cloning vector (puc19) 에삽입 puc19 vector의 transformation을위한 Competent cell로는 DH5a 를사용하였고, puc19 vector의 size는 2686bp 이다. Competent cell의배양을위해서는 ampicillin이 첨가된 LB(BD biochemical co., Sparks, USA) 배지가사용되었다 Clone TslpA gene to puc19 vector TslpA를제한효소 HindIII와 PstI 으로처리하였다. 결과는 figure 5 와같다. pup19 vector를제한효소 HindIII와 PstI 으로처리하였다. 결과는 figure 6 와같다

40 Fig. 5. Agarose gel electrophoresis of polymerase chain reaction on digested with HindIII and PstI with Clone TslpA vector on cdna products. M, 100 base pair DNA ladder

41 Fig. 6. Agarose gel electrophoresis of polymerase chain reaction on digested with HindIII and PstI with Clone puc19 vector on cdna products. M, 100 base pair DNA ladder

42 TslpA gene과 puc19 vector ligation 유리된 TslpA gene과 puc19 vector를 T4 DNA ligase를이용하여 ligation 하였다. Ligation 방법은다음과같다. puc19 vector 2 μl, TslpA gene 6 μl, T4 DNA ligase 2 μl, T4 ligase buffer x2 10μl을혼합하여 16 에서overnight 하였다 TslpA gene이삽입된 puc19 vector를competent cell (DH5 α) 로 transformation Transforamtion 방법을간단히설명하면다음과같다. TslpA gene이삽입된 puc19 vector 20μl와 competent cell (DH5 α) 100μl를 EP tube에넣고 20분동안얼음에넣 어정치하였다. 다음으로, 42 water bath에 1 분, 다시얼음에 2 분간정치하였다. 그 후, LB broth 950μl를넣고 37 shaking bath에서 150rpm/1.5hrs 동안배양하였다. 다음으로 amphicillin이첨가된 LB agar 배지에 24시간동안배양하여세균집락의 형성을확인하였다. 형성된세균집락을다시 amphicillin이첨가된 LB broth에 16시 간을배양하였다 TslpA gene과 puc19 vector의 cloning 확인 제한효소를처리하여결과를확인하였다. 결과는 figrue 7 과같다 Clone PslpA gene to puc19-tslpa vector PslpA gene은이미 TslpA gene이삽입된 puc19에 cloning 하였다. Competent cells로는 DH5 α를사용하였고, puc19-tslpa vector의 size는2823 bp 이다. PslpA를 제한효소 XbaI와 EcoRI 을이용하여차례로처리하였다. 결과는 figure 8 과같다

43 Figure 7. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the TslpA vector cloning with restriction enzymes(hindiii, EcoR1 and PstI). M: 100 DNA ladder marker

44 Figure 8. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the PslpA gene to puc19-tslpa vector restricted enzymes(xbai, EcoR1). M: 100 DNA ladder marker

45 puc19-tslpa vector 를제한효소로자르기 puc19-tslpa vector를 XbaI과 EcoRI 으로차례로처리하였다. 결과는 figure 9과같 다 PslpA gene과 puc19-tslpa vector ligation 유리된 PslpA gene과 TslpA-pUC19 vector를 T4 DNA ligase를이용하여 ligation 하였다. Ligation 방법은다음과같다. puc19-tslpa vector 2 μl, PslpA gene 6 μl, T4 DNA ligase 2 μl, T4 ligase buffer x2 10μl을혼합하여 16 에서 overnight하였 다 PslpA gene과 puc19-tslpa vector의 cloning 성공여부확인 제한효소를처리하여결과를확인하였다. 결과는 figure 10 과같다. 3개의세균집락중 sample B가 cloning에성공한것으로의심되어 sample B만 다시제한효소로처리하였다. 결과는 figure 11 과같다. 이상으로 puc19 vector에 PTslpA gene 을삽입하는과정은성공하였다. 아래과정부터는이 vector를 puc19- PTslpA 로표기하겠음 pifnγ을 puc19-ptslpa vector에삽입하기 Pig IFN-γ gene을제한효소 SalI와 XbaI 으로처리하였다. 결과는 figure 12과같 다 pUC19-PTslpA vector 를제한효소로자르기 puc19-ptslpa vector를 SalI과 XbaI 으로차례로처리하였다. 결과는 figure 13와 같다

46 Figure 9. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the puc19-tslpa vector with digested restricted enzymes(xbai, EcoR1). M: 100 DNA ladder marker

47 Figure 10. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the PslpA gene and puc19-tslpa vector with digested restriction enzymes(hind III, Pat1, EcoR1). M: 100 DNA ladder marker

48 Figure 11. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the puc19-tslpa vector with digested restriction enzymes(hind III, Xbar1, Pat1, EcoR1). M: 100 DNA ladder marker

49 Figure 13. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the puc19-ptslpa vector with digested restriction enzymes(sal1, XbarI) and uncuted pifn γ. M: 100 DNA ladder marker

50 Figure 13. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the puc19-ptslpa vector with digested restriction enzymes(sal1, XbarI). M: 100 DNA ladder marker

51 5.3.2 pifnγ gene과 puc19-ptslpa vector ligation 유리된 PslpA gene과 TslpA-pUC19 vector를 T4 DNA ligase를이용하여 ligation 하였다. Ligation 방법은다음과같다. puc19-ptslpa vector 2 μl, pifnγgene 6 μl, T4 DNA ligase 2 μl, T4 ligase buffer x2 10μl을혼합하여 16 에서 overnight하였 다 pifnγ gene과 puc19-ptslpa vector의 cloning 성공여부확인 제한효소를처리하여결과를확인하였다. 결과는 figure 14 과같다. 6. puc19으로부터 PTslpA-pigIFNγ을 expression vector (pnz123) 로 gene cloning 실시 pnz123 vector를위한 Competent cells로는 JM109 을사용하였고, pnz123 vector의 size는 2.8kbp 이다. Competent cell의배양을위해서는 chloramphenical이첨가된 LB(BD biochemical co., Sparks, USA) 배지가사용되었다 PTslpA-pigIFNγ gene을제한효소로자르기 puc19-ptslpa-pigifnγ gene을제한효소 EcoRI와 HindIII 으로처리하였다. 결과는 figure 15 와같다 pnz123 vector 를제한효소로자르기 pnz123 vector를제한효소 EcoRI와 HindIII 으로차례로처리하였다. 결과는 figure 16 와같다

52 Figure 14. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the pifnγ gene and puc19-ptslpa vector. M: 100 DNA ladder marker

53 Figure 15. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the puc19-ptslpa-pigifnγ gene with digested restriction enzymes(sal1, XbarI). M: 100 DNA ladder marker

54 Figure 16. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the pnz123 vector with digested restriction enzymes(ecori, HindIII). M: 100 DNA ladder marker

55 6.3. PTslpA-pigIFNγ gene을 pnz123 vector에삽입하기 유리된 PTslpA-pigIFNγgene과 pnz123 vector를t4 DNA ligase를이용하여 ligation 하였다. PTslpA-pigIFNγ gene이삽입된 pnz123 vector (pnz123-ptslpa-pifn γ) 를 JM109으로 transformation 을실시하였다 PTslpA-pigIFNγ gene과 pnz123 vector의 cloning 성공여부확인 제한효소를처리하여결과를확인하였다. 결과는 figure 17 과같다. 7. TPslpA와 pig IFNγ가삽입된 pnz123를 L. acidophilus 로전기천공실시 전기천공조건과 L. acidophilus 배양을위한배지는다음과같다. Transform pnz123-ptslpa-pigifnr to Lactobacillus acidophilus Electroporation condition: - using 0.2-cm cuvette - C = 25 μf - V= 2.1 kv - PC=infinite ohms Medium: MRS agar 전기천공실법을이용하여 transformation 을실시하였으며, 결과는 L. acidophilus의 DNA를 boiling 방법을통해추출후 PCR 을통해확인하였다. 결과는 figure 18과 같다. 8. L. acidophilus의 pnz123-tpslpa-pig IFNγ gene 유지기간확인.L. acidophilus 내의 pnz123-tpslpa-pig IFNr gene 이항생제없이계대하였을 때얼마동안유지되는지를검사하였다. 매일균을항생제가첨가되지않는배지에 접종하여계대하고매일균에서 boiling 방법을통해 L. acidophilus의 DNA를추출 하였고, 이를 template로하여 PCR을통해 pnz123-tpslpa-pig IFNr gene 의유무 를확인하였다. 결과는 figure 19와같계대하는 29일동안유지하다가 30일되는 30 번계대후에 gene 이제거되었다

56 Figure 17. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the PTslpA-pigIFNγ gene과 pnz123 vector. marker. M: 100 DNA ladder

57 Fig. 18. Boiling DNA of transformed pnz123-tpslpa-pig IFNγ in Lactobacillus acidophilus. Transform pnz123-ptslpa-pigifnr to Lactobacillus acidophilus Electroporation condition: using 0.2-cm cuvette, C = 25 μf, V= 2.1 kv, PC=infinite ohms

58 Figure 19. Ethidium bromide-stained 1% agarose gel electrophoresis showing detection of the pnz123-tpslpa-pig IFNr gene. M: 100 DNA ladder marker

59 4. Pig IL-2를발현하는 Lactobacillus acidophilus 제조과정 먼저돼지의혈액에서림파구를분리하여배양하면서 PHA로자극한후 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를이용하여 IL-2 gene 을증폭하였다. 사용된 primer는 Sense: GC TCTAGA GCCA CAA TGT ATA AGA TGC AGC T와 Anti-sense: GC GTCGAC TTAT CAA GTC AGT GTT GAG T 이었다. IL-2는 489bp의 밴드를확인하였다. Pig IL-2를발현하는 Lactobacillus acidophilus 제조과정은 Pig IFN-r를 생성하는것과같은방법으로 pnz123-tpslpa-pig IFNγ gene 벡터에서 IFN-r를 제거하고이곳에 transform 시켜완성하였다. IL-2 gene을삽입하여같은방법으로 Lactobacillus acidophilus 에

60 제 규명 2 절면역강화생균제의면역증강효과및항병력효과 1. 재료및방법 돼지의 IFN-r 유전자와 IL-2 유전자를발혀하는면역기능강화생균제의백신에 대한항체가증강효과및면역세포변화를관찰하였고돼지의 IFN-r 유전자와 유전자를발혀하는면역기능강화생균제의살모넬라에대한항병력을알아보았다. IL-2 실험동물및실험설계 실험동물은 4 주령의삼원교잡종돼지(Landrace x Yorkshire x Duroc) 24두를공시 하였다. 실험 1군으로 IFN-r를발현하는 Lactobacillus, 실험2군으로 IL-2를발현하 는 Lactobacillus 그리고실험3군으로정상 Lactobaciluus (cloning 사용돼었던균주) 그리고 Lactoabcillus를첨가하지않는대조군으로나누어각그룹당 6마리의돼지를 사용하였다. 실험군과대조군으로나누어실시하였다. 시험기간동안물과사료는 자유롭게섭취하도록하였으며외부와격리된전남대학교실험동물사에서사육하며 실험하였다. 시험군돼지의사료에는유용미생물 Lactobacillus acidophilus 를 0.3% 를첨가였고대조군의사료에는첨가하지않았다. 생균제급여전과급여1 주일후에혈액을채취하여혈액내적혈구, 백혈구, 림프구및 total IgG 농도를측정하여혈액내면역학적지표를비교하였다. 또한혈청내의코티 졸, 에피네플린및노에피네플린의농도를측정하여스트레스지표를비교하였다. 그 리고혈액내의 T cell 의분포변화는유세포분석기를이용하여측정하였으며, 혈액내 의 macrophage를분리하여 cytokine 의발현을측정하였다. 생군제급여 8일후에항체가생성증강효과실험을위하여항원으로 Bordetella Bronchiseptica(Bbs) 균을포르말린으로처리한후 Freund s adjuvant와혼합하여백 신으로사용하여모든군에근육으로 3ml 씩접종하였다. 처음접종후 14일과 28일 후에 2차 3차접종하고마지막으로 4차접종을 35일에한후 39일되는날돼지에서 에서혈청을회수하였다. 회수된혈청으로 ELISA 실시하여항체생성여부및생성 능을확인하였다

61 2. 1) 결과및고찰 혈액내면역학적지표 Solto B 급여가육성돈의혈액내면역학적지표에미치는영향을 table 2에나 타내었다. 혈액내적혈구, 백혈구, 림프구및 IgG은처리구간유의적인차이를나타 내지않았다

62 Figure 20. Agarose gel electrophoresis of multiplex RT-PCR-amplified pig IL-2 cdna products. From left to right: M=100 base pair DNA ladder; lane 1=positive control for common Pig IL-2; lane 2,3=sample from cloned Lactobaclillus acidophillus

63 Table 2. Effects of immune enhancing Lacobacillus on blood immunological parameters in pigs Item CON IL-2 Lacto IFN-r Lacto Lacto only RBC, 10 6 / μl Initial 6.92(±1.2) 7.02(±1.0) 6.88(±1.5) 6.52 (±1.6) Final 7.33(±1.8) 7.37(±1.5) 7.49(±2.2) 6.94 (±1.2) Difference WBC, 10 3 / μl Initial 14.03(±3.5) 13.74(±4.2) 13.63(±2.5) (±3..2) Final 18.16(±4.4) 16.81(±3.6) (±1.9) (±4.2) Difference Lymphocyte, % Initial 59.55(±6.3) 51.88(±6.6) 59.17(±7.3) (±8.3) Final 55.42(±4.7) 56.37(±3.9) (±5.1) (±5.8) Difference IgG, mg/dl Initial (±22.7) (±32.5) 33.67(±35.8) (±47.1) Final (±46.7) (±46.9) (±89.6) Difference ( ± )standard error (±69.4)

64 3. 혈청내스트레스지표 Solto B 급여가육성돈의혈액내스트레스지표에미치는영향을관찰한결과는 table 3 에서보는바와같이혈청내코티졸, 에플네플린및노에플네플린에서는처리구간유의적인차이를나타내지않았다. 4. 유세포분석기를이용한혈액내의 T cell의분포변화 급여 1주일후에혈액에서 Lymphoprep을사용하여얻은 lymphocytes 를이 용하여, CD4 및 CD8 lymphocyte 분포율을 flow-cytometry 를이용하여측정하였다. CD4 및 CD8, 의 population 은 phycoerythrin(pe) 와 FITC-conjugated monoclonal antobodies 를 PharMingen (USA) 으로부터구입하여사용하였으며유세포분석기 (Flow Cytometry; FACSCalibur) 를이용하여측정하였다. 급여 1주일후의혈액내 lymphocyte의 CD4와 CD8의 population에는시험군에서 CD4 및 CD8의수가약간 증가하는것으로보였으나유의적인차이는없었다 (figure 21)

65 Table 3. Effects of dietary Solto B on blood stress parameterin growing pigs Item CON 1 IL-2 Lacto IFN-r Lacto IFN-r Lacto Cortisol, μg /dl Initial 3.28(±1.5) 3.90(±1.1) 2.58(±0.8) 3.70(±1.4) Final 2.85(±1.1) 3.33(±1.4) 2.67 (±1.3) 2.93 (±1.6) Difference Epinephrine, pg/ml Initial 53.85(±4.5) 54.67(±4.8) 62.73(±6.7) 66.25(±7.1) Final 58.77(±3.5) 52.27(±6.3) (±6.3) (±5.3) Difference Norepinephrine, pg/ml Initial (±23.5) (±31.5) (±32.6) (±32.7) Final (±35.5) (±29.8) (±47.1) (±38.5) Difference ( ± )standard error

66 Fig 21. IL-2 and INF-r proportion in the piglets peripheral lymphocytes (%)

67 5. 항체가형성수준평가 항-Bbs immunoglobulin의측정을위해 ELISA 를이용하였으며, the horseradish peroxidase-labelled goat anti-pig IgG (Jackson ImmunoResearch, Laboratories, INC., USA) 을 2 차항체로사용하였다. 간단히설명하면다음과같다, flat bottomed 96-well microtitre plates (Iwaki, Japan) 는각 well당 CFU/ ml의포르말린처 리된 Bbs가포함된 coating buffer 100μl씩으로코팅되어 4 에서 overnight으로정 치하였다. 이후, 0.05% (v/v) Tween 20이포함된 PBS (PBS-T) 으로 3회세척하 였고각 well당 5% skim milk 200μl으로실온에서 2 시간동안안정화하였다. 다시 PBS-T로 3 회세척하였고, PBS-T에 100배희석된측정하고자하는돼지의혈청을 각 well당 100μl씩을넣어실온의암실에서 1 시간동안정치하였다. 세척후, PBS-T 에 1:5000으로희석된 anti-pig HRP conjugated를첨가하였으며실온에 1시간동안 반응시켰다. 이전과동일하게 well 들은세척되었으며, 세척이후 50μl substrate (0.01% (v/v) hydrogen peroxid가포함된 phosphate-citrate buffer (ph 5.0, 24 mm citrate, 64 mm disodium hydrogen phosphat에녹여진 0.04% (w/v) o-phenylenediamine (Sigma)) 를첨가하여실온에서 10 분간반응시켰다. 50μl의 10%SDS solution 을첨가하여반응을종료하였으며, Multiskan Ascent microplate reader (Thermo Labsysterms, Finland) 를이용하여 405nm 에서측정하였다. 혈청중 anti-bbs IgG 항체수준은시험군의돼지와 control group의돼지들에유의 적인차이는보이지않았다

68 Antibody production after vaccination ELISA OD value 계열 Control IL-2 Lacto IFN-r Lacto Lacto Only Fig 22. Effects of IL-2 and INF-r transformed probiotics in the piglets peripheral blood. Antibody production after vaccination

69 6. 분변에서암모니아태질소측정 유용미생물의친환경적효과를검토하기위하여분변내의악취발생원인인암모니 아의농도를측정하였다. 분변은유용미생물첨가사료를먹인돼지와먹이지않는 돼지의분변을채취하여분변내에서암모니아태질소의함량을측정하였다. 그방법 을간단히기술하면분변 10g을 125ml flask에취하여 2M-KCL 50ml를가하고 30 분간진탕하여 100ml volumetric flask 에여과한후 Kjeldahl (B-316, Buchi) 을이 용하여증류한후적정하였다. 유용미생물의친환경적효과를검토하기위하여분변내의악취발생원인인암모니아 의농도를측정하였다. 이를위하여분변내존재하는암모니아태질소의함량을측 정하였다. 실험군의돼지분변내암모니아태질소함량은대조군보다낮게검출되었 다

70 amonia concentration in fecal samples ) m p (p ts n te n o c m iu n o m m A Control IL-2 Lacto IFN-r Lacto La cto Only Figure 23. Effects of production on piglets. IL-2 and INF-r transformed probiotics on ammonia gas

71 제 3 절. 면역증강생균제의 Salmonella대한항병력증강효과규명 1. 재료및방법 가. 실험동물및실험설계 실험동물은 8 주령의삼원교잡종돼지(Landrace x Yorkshire x Duroc) 24두를공 시하였다. 인공감염실험은실험 1군으로 IFN-r를발현하는 Lactobacillus, 실험2군 으로 IL-2를발현하는 Lactobacillus 그리고실험3군으로정상 Lactobacillus (cloning 사용돼었던균주) 그리고 Lactoabcillus를첨가하지않는대조군으로나누어각그룹 당 6 마리의돼지를사용하였다. 시험기간동안물과사료는자유롭게섭취하도록하 였으며외부와격리된전남대학교실험동물사에서사육하며실험하였다. 시험군돼 지의사료에는유용미생물 Lactobacillus acidophilus 를 0.3% 를첨가였고대조군의 사료에는첨가하지않았다. 실험전모든돼지에서혈액검사와분변검사를실시하였 다. 혈액학적으로정상범주를지니며살모넬라항체가음성을나타내고분변에서살 모넬라검출이모두음성을확인한후실험을실시하였다. 급여 1주일후에실험군과대조군모두에 Salmonella typhimurium 배양액 ( cfu/ml) 50ml를 3 일동안경구접종하였다. 접종전 1일부터매일분변을채취 하여분변으로분비하는세균수를측정하였으며매일체온등임상증상을관찰하였 다. 실험은돼지의분변에서 Salmonella typhimurium 균의배출유무를세균배양검 사방법을통해확인하여음성이나올때종료하였으며부검을통해주요병변을관 찰하였다. 나. 실험균주 돼지에살모넬라를인공적으로감염시키기위하여사용한균주는 Salmonella typhimurium ATCC 이었다. 이균주들을 Brain Heart Infusion broth (BBL, USA) 에접종하여 37 에서 24 시간진탕배양한균액 (1 10 CFU/ml) 을 시동물에 3 일간경구접종하였다. 9 50ml씩공

72 Figure 24. Effects of continuous feeding of IL-2 and INF-r transformed probiotics on growth performance in pigs

73 2. 결과및고찰 1) 체온검사 돼지체온은접종하루전부터실험마지막날까지매일직장에서측정하였다. 돼지 살모넬라를경구로인공감염시킨후체온을매일측정한결과, 실험군및대조군 에서체온이감염후 1일째부터상승하기시작하여지속적으로정상치이상의체온 상승을나타냈다. 하지만본실험에서실험군과대조군사이의유의적인체온변화 는나타나지않았다. 2) 분변에서분비되는 Salmlonella 균수검사 실험하루전부터실험마지막날까지매일직장을자극하여분변을직접채취하였 다. 접종전, 후의분변 g 당총세균수및살모넬라수는다음과같이확인하였다. 분 변 1 g 을채취하여 BHI broth (BBL, USA) 9 ml 에혼합하고, 이를 10 배수계단 희석하여각각 plate count agar (BBL, USA) 및 MacConkey agar (BBL, USA) 또 는 XLD 배지(BBL, USA) 에도말한후 37 에서 24 시간배양하여집락을계수 하였다. 장간막임파절에서살모넬라균의분리는 1 g 의장간막임파절을 BHI broth 를이용하여분쇄한후 3,000 rpm 에서 5 분동안원심분리하여상층액을회수하였 다. 이를 BHI broth 로 10 배수계단희석하여 MacConkey agar 와 XLD 배지에도 말한후 37 에서 24 시간배양하여계수하였다. 접종후분비되는 Salmonella 수는감염후 1일째부터증가하기시작하여실험군의 돼지에서접종후 을보였지만감염후 군에비교하여 2일동안에는대조군보다더많은양의살모넬라를배출하는양상 3일부터는대조군보다감소하면서실험군의돼지에서는대조 Salmonella 배출농도가감소하였다

74 Number of Salmonella spp. from fecal samples 12 lo g cfu/1 g o f feca l s a m les Control IL-2 Lacto IFN-r Lacto Lacto Only dpi Fig 25. A number of lactic acid bacteria isolated from the fecal samples of pig

75 3) 임상증상실험이진행되는전기간동안임상증상을관찰하였다. 돼지살모넬라를경구로인공감염시킨후임상증상을매일확인한결과, 실험군및대조군모두에서심한설사증상을일으키지는않았지만약간의무른변이관찰되었다. 그이외의임상증상으로는경미한정도의침울등을관찰할수있었다. 실험종료후일반적인부검술식에의해부검을실시하였다. 4) 부검소견 실험종료후부검결과실험군및대조군의돼지에서경미한비장의종대를관찰 할수있었으며, 장간막임파절의종대와미세한충출혈소견을관찰할수있었다. 이러한소견들은살모넬라에감염시에나타나는일반적인부검소견과임상증상들이 었다대조군은실험 1과실험 2군에비교하여현저한장간막임파절의종대와충혈 소견을나타내었으며그외의장기에서도대조군은실험군에비해현저한병변소견 을보였다 (figure 25)

76 Fig. 25. Gloss finding on intestinal tract in pigs with INF-r and IL-2 produced probiotics

77 8. 장간막임파절에서 Salmonella 균수검사실험종료후에돼지를부검하여장간막임파절에서살모넬라분리를시도하여대조군과실험군에존재하는살모넬라수를측정하였다. 대조군에서는실험군보다많은살모넬라가검출되었다. 7 Number fo Salmonella spp. in mesentric lymph node lo g c fu /1 g o f t is s u e s a m p le Control IL-2 Lacto IFN-r Lacto Lacto Only Fig 26. A number of lactic acid bacteria isolated from the mesenteric lymph node on experimental feeding pig

78 이상의결과돼지의 cytokine IFN-r와 IL-2를발현하는 Lactobacillus acidophillus 를성공적으로개발되었다. Cytokine을발현하는면역증강생균제는 29일간외부gene 인 cytokine gene을보유하다가 30 일경에제거하였다. 돼지에면역증강생균제를급여한후 면역증강효과를검사한결과혈액내면역세 포의변화와혈청내스트레스지표에는유의적인차이는없었다. 균제를급여한후혈액내 하는경향이있었지만유의적인차이는없었다. 돼지에면역증강생 T-cell의분포와백신접종후항체가변화에서도약간증가 돼지에면역증강생균제를급여한후분변내의암모니아농도는감소하는경향이 있었다. 돼지에면역증강생균제를급여한후 Salmonella를이용하여공격접종을실시 하여그방어효과를측정한결과분변에서살모넬라의검출율이감소하는경향을보 였다. 돼지에면역증강생균제를급여한후 Salmonella를이용하여공격접종을실시하여 그방어효과를측정한결과장간막임파절의육안적소견에서개선되는효과를보였다 돼지에면역증강생균제를급여한후 방어효과를측정한결과장간막임파절에서 Salmonella를이용하여공격접종을실시하여그 salmonella 분리율이감소하였다. 이상의결과를종합해보면면역증강생균제를급여한돼지에서면역증강효과를측정한결과약간증가하는경향이있었지만유의적인차이는없었다. 하지만살모넬라를공격접종한결과분변내의살모넬라분리율과장간막임파절에서의살모넬라분리율이현저히감소하였다. 따라서면역증강생균제는돼지의설사질병에효과가있는것으로판단되며이를이용하여바이러스성설사에서의효과등이연구되어야할필요가있다

79 제 4 절생균주투여동물항병력규명 1. 재료및방법 돼지대장균감염실험및생균제의항병력및질병방어효과를검토하고돼지 살모넬라감염실험및생균제의항병력및질병방어효과를알아보기위하여대 장균인공감염돼지와생균제급여후대장균감염돼지의설사감소율및임상병 리학적병변을검사하였다. 돼지살모넬라감염실험및생균제의항병력및질병방어효과를알아보기 위하여살모넬라인공감염돼지와생균제급여후대장균감염돼지의설사감소율 및임상병리학적병변을검사하였다. 린및 인공감염후생균제급여군과비급여군의 Inf-r 발현율차이를확인하였다. ELISA를통한혈청내면역글로불 1) 실험방법및설계 가) 공시동물 사양시험은 1주령자돈을 100두를공시하여천안연암대학실험농장과인근의부 영농장과청명농장을이용하여실험군을배치하였다. 공시동물로는평균체중이 4.23kg 인포유자돈을사용하였고삼원교잡종(Landrace x Large White x Duroc) 으로 각각 10복을선발하여아래표와같이그룹별로 10두씩 80두를선발하여대장균과 살모넬라감염그룹을구분하여배치하였다. 시험생균제는 1세부과제에서개발된면역강화생균인 L. acidophilus 각각 1% 을첨가한처리구로하였다. 사료는자동급이기, 물은자동급수기에의해자유채식 시켰으며, 기타사양관리는연암대학농장의표준사양관리법에준하였다

80 Table. 4. Experimental grouping for administrated with Lactobacillus and E-coli on piglets. The number of pig (no.) Probiotics E-coli Group 1 10 Group 2 10 Group 3 10 Group 4 10 Group 5 10 Group 6 10 Group 7 10 Group

81 Table. 5. Table. 4. Experimental grouping for administrated with Lactobacillus and Salmonella on piglets. The number of pig (no.) Probiotics Salmonella Group 1 10 Group 2 10 Group 3 10 Group 4 10 Group 5 10 Group 6 10 Group 7 10 Group

82 나) 임상증상및병리학적소견조사 실험기간동안모든자돈은매일오전 10 시~12시에사료섭취량과설사발현 정도를조사하였고 1주간격으로체중을측정하고혈액을채취하여면역글로불 린양을측정하였다. 시험기간동안폐사한돼지는부검을실시하여병변을확인 하고분변과장관에서세균분리를시도하였다. 장관내감염세균에대한검사는 실험용돼지의장관내용물을약 10배가량의 Selenite broth (Difco) 에증균하여 혈액배지, Salmonella-Shigella agar (Difco) 및 MacConkey agar (Difco) 에서분 리배양하고집락을선택한후생화화적검사를실시하여균체를동정하였다. 모든실험자돈은매주 1두씩부검을실시하였고 7주경과후남아있는자돈들은 모두부검을실시하여혈청내면역글로불린검사와조직하적소견을검사하기위하 여실험돈의장관및조직샘플을채취하였고조직검사를위하여채취된샘플은 10% 중성포르말린에 24 시간고정하였으며, 일반적인조직처리과정을거쳐파라핀 포매하고, hematoxylin and eosin (H&E) stain으로염색하여광학현미경으로검사하 였다. 2. 연구결과및고찰 가) 대장균인공감염자돈의생균제투여효과 개발생균제의자돈에서의대장균감염증에대한항병효과를알아보기위하여 자돈에대장균을감염시키고생균제를급여하면서대장균감염증에대한방어효과 를검토하였다. 대장균인공감염자돈들은감염 2일째부터심한설사를보이기시 작하였고지속적으로설사를보이면서폐사하기시작하였으나, 생균제를급여한그 룹에서는대장균만투여한그룹에비하여폐사율이유의하게감소하였고 (figure 27) 평균증체율에있어서도유의적인차이는아니지만체중증가량이보다높게나타나 (figure 28) 질병의방어효과는물론생산성의향상에도기여할것으로판단되었다

83 3 2.5 Probiotics+E-coli E-coli Control Mortality( Day after birth Fig. 27. The mortality of piglets with probiotics and E-coli

84 Body Weigh Control Probiotics E-coli Pro+E-coli Day of Birth piglets. Figure 28. Effects of dietary probiotics complex on growth performance in

85 나) 대장균인공감염자돈의병변및설사발생율 1 주령의자돈에대장균을인공감염시킨결과대부분의자돈에서수양성설사가 나타나기시작하였고감염 3일째부터는심한수양성설사로폐사가나타나기시작하 였다. 감염자돈들은심하게위축되기시작하였으나생균제를지속적으로급여한그 룹에서는설사발생율이감소하기시작하였다. (Figure 29-30) 심한설사를보인자돈과생균제급여한그룹의자돈을감염 1주째에각각 1두씩 부검한결과대장균단독투여군에서는심한수양성설사와장벽의박리가나타났으 나생균제투여군에서는경도의충혈소견이관찰되었으나장벽의박리가경미하게 나타났고조직학적으로도소장의염증소견이감소되는것으로관찰되었다 (figure 31-34)

86 Figure 29. A piglet was worn out infected with E-coli Figure 30. Piglets fed probiotics was normal body condition infected with E-coli

87 Figure 31. A gross lesion on piglet fed probiotics infected with E-coli Figure 32. A gross lesion on piglet fed control feed infected with E-coli

88 Figure 33. Intestine of piglet fed probiotics infected with E-coli Figure 34. Intestine of piglet fed control feed infected with E-coli

89 다) 살모넬라균인공감염자돈의생균제투여효과 하여 개발생균제의자돈에서의살모넬라균에대한대한항병력효과를알아보기위 11주령의포유자돈에살모넬라균을경구감염시키고개발생균제를급여하면서 살모넬라균감염에대한자돈의방어효과를조사하였다. 살모넬라균인공감염자 돈들은감염 2일째부터설사를보이기시작하여 5일째에는심한설사가나타나기시 작하였고이후간헐적인설사를보이면서위축과폐사가발생하기시작하였다. 그러 나, 세균감염후개발생균제를급여한그룹에서는살모넬라균만을단독투여한그 룹에비하여설사발생율이낮아지는것이관찰되었고폐사율또한감소하였다 (figure 35). 살모넬라인공감염군과생균제투여군의평균증체율은생균제투여군에서살 모넬라균단독투여군에비하여약 이는것으로나타났다 (figure 36). 22% 높게나타나증체량과생산성향상효과를보 라) 살모넬라균인공감염자돈의병변및설사발생율 1주령의자돈에살모넬라균을인공감염시킨결과감염자돈에서 3일째부터설사 가나타나기시작하였고감염 4-5일째부터는심한설사가발생하기시작하였고일부 자돈에서혈변을보이기도하였다. 감염자돈들은설사와함께사료섭취량이감소하 면서서서히위축되기시작하였다. 반면에생균제를지속적으로급여한그룹에서는 설사의정도가약해지고사료섭취량이증가하면서증체량도성장률이회복되는양상 을보였다 (Figure 37-40)

90 Mortality( Day after birth Probiotics +Salmonella Salmonella Control Figure 35. Effects of dietary probiotic complex on growth performance in growing pigs

91 Body Weig Control Probiotics Salmonella Pro+Salmonella Day of Birth Fiogure 36. Effects of dietary probiotic complex on growth performance in growing pigs after infected with salmonella and E-coli

92 Figure 37. A piglet was worn out infected with Salmonella. Figure 38. Piglets fed probiotics was normal body condition infected with salmonella

93 Figure 39. A piglet was diarrhea appear infected with Salmonella. Figure 40. Piglet fed probiotics was normal body condition infected with salmonella. A pig was not diarrhea

94 살모넬라투여후설사를보이는자돈과개발생균제를급여한그룹의자돈을그 룹별로감염 1주와 2주째에각각 1두씩부검한결과살모넬라균단독투여군에서는 장벽의충출혈과궤양소견이나타났으나생균제투여군에서는약한정도의충혈소 견이관찰되었을뿐궤양과출혈소견은나타나지않아(figurte 41-48) 생균제의투 여가장벽의보호효과를보이는것으로나타났다. 각그룹의실험자돈에대하여폐사한개체와매주 1두씩부검을실시한개체에 대한병리학적소견검사결과는육안소견에서나타난병변과대부분일치하였고대 장균성장염에서는궤양성병변보다는장점막의탈락과점막의비박화과특징적으로 나타났고살모넬라감염증에서는소장과결장에서충출혈과궤양형성이특징적으로 나타났다. 이들병변에서도생균제투여그룹에서병변의정도가일반적으로 30% 이 상감소하여나타나설사의감소원인이조직손상의경감으로확인되었다. 또한장 내세균의재분리율에있어서도유의성있게낮은수의장내병원균의분리율을보이 는것으로나타났다

95 Figure 41. A piglet was diarrhea appear infected with Salmonella. Figure 42. Piglets fed probiotics was normal body condition infected with salmonella

96 Figure 43. A piglet was diarrhea appear infected with Salmonella. Figure 44. Piglets fed probiotics was normal body condition infected with salmonella

97 Figure 45. A piglet was diarrhea appear infected with Salmonella. Figure 46. Piglets fed probiotics was normal body condition infected with salmonella

98 Figure 47. A piglet was diarrhea appear infected with Salmonella. Figure 48. Piglets fed probiotics was normal body condition infected with salmonella

99 제 1. 5 절. 생균제의사양효과및친환경축산물생산 재료및방법 개발생균제의급여가돼지의성장률및혈중요소태질소및면역능력에미치는영향조 사 가) 공시동물 사양시험은평균 5.69kg의 1주령포유자돈 100두를선발하여생균제 0.1% 처리군 33두와생균제 0.2% 투여군 33두그리고비처리대조군 34두를대상으로하여천안 연암대학실험농장에서 함량등을조사하였다. 20주간사육하면서혈액학적변화와증체량및분변내요소 나) 시험설계및사양관리 처리Ⅰ은생균제 1% 처리구로처리Ⅱ는생균제 2% 처리구로일반사료에우수 생균주 B. subtilis, L. acidophilus를각각 0.1과 0.2% 을첨가한처리구로하였다. 실 험사료의영양소함량은 NRC(1998) 의영양소요구수준과같거나높게배합하였다. (table 6-8) 실험돈은자돈, 육성기, 비육기에따라각각자돈기는슬롯-콘크리트-바 닥인자돈사에서이유후약 35일간사육하였고육성돈과비육돈시기는슬러리콘 크리트돈사에서각각사육되었다. 전체시험기간동안사료는자동급이기, 물은자 동급수기에의해자유급식시켰으며, 사료섭취량과체중은 3주간격으로측정하였고 종료시에측정하여일당증체량, 일당사료섭취량및사료효율을각각계산하였다

100 Table 6. Composition of starter diets (phase 2 : 8-21 day) Ingredient % Corn Broken rice Whey 18.0 Soybean meal 8.0 Fish meal 4.5 Wheat middlings 2.5 Milk by-product 11.0 Biscuit by-product 4.0 Whey protein 2.0 Soy protein 7.21 Dried porcine soluble 2.0 Soy oil 3.0 Sweetner 0.02 Flavorings 0.1 Acidifier 0.3 Lecithin 0.25 Limestone 0.2 DCP 0.7 Salt 0.25 Premix 1.2 Choline 0.45 Antibiotics 0.3 Total Calculated values DE, Kcal/kg Crude protein 19.0 Crude fiber 2.5 Crude ash 6.0 Ca 0.7 P 0.7 Available Phosphorous 0.5 Lysine 1.3 Available lysine

101 Table 7. Composition of diets for weanded pigs Ingredient % Corn SBM Wheat Tallow 2.50 Wheat hull 6.22 Dicalcium P Limestone 0.32 Vitamin Mix Mineral Mix Salt 0.20 Total Calculated values ME, Kcal/kg 3362 Crude protein, % Ca, % 0.74 P, % 0.69 Lysine, % 1.12 Met+Cys, % vitamin mixtures was formulated to meet of exceed the NRC(1998) requirements 2 mineral mixtures was formulated to meet of exceed the NRC(1998) requirements

102 Table 8. Composition of diet for growing-finishing pig Ingredient % Corn SBM Wheat Tallow 2.50 Wheat hull 6.00 Dicalcium P Limestone 0.70 Vitamin Mix Mineral Mix Salt 0.20 Total Calculated values ME, Kcal/kg 3362 Crude protein, % Ca, % 0.66 P, % 0.61 Lysine, % 0.99 Met+Cys, % vitamin mixtures was formulated to meet of exceed the NRC(1998) requirements 2 mineral mixtures was formulated to meet of exceed the NRC(1998) requirements

103 다) 소화실험및혈청학적분석 소화실험은실험돈의평균체중이 18.45± 1.85 와 42.35± 2.73kg시기에두번 에걸쳐수행하였다. 1 차,2차소화실험에사용된돼지는세그룹에서무작위로 12두씩선발하여 3처리 4 반복으로배치하였다. 소화실험에사용된돼지는대사틀 에수용되어 5일간적응기를둔다음 5일간분과뇨를체취하는전분채취법을 사용하였다. 전체사료섭취량및분과뇨의양은매일기록보관하였으며채취된 샘플은냉동보관하면서분석하였다. 사료, 분변, 뇨의일반성분분석은 AOAC(1995) 의방법으로분석하였다. 혈액분석을위하여각그룹별로시험개시후 1,3,5,8,11,20주에각처리군별 로 5두를선발하여동일한개체를대상으로매일오전 10시에서 11시사이에경 정맥에서채혈을실시하여곧바로 3,000rpm으로원심분리하여혈청을분리하여 -20 에냉동보관하였다. 혈중요소태질소(Blood Urea Nitrogen, BUN) 는혈액 분석기(Culter counter, JAPAN) 를이용하여분석하였고혈액내백혈구수는 HEMAVET 850(CDC tech, USA) 을이용하여 CDC HEMAVET 전용시약으로 전기저항법에의해분석하고 IgG 및 IgA의분석은 Brio(SEAC, Italy) 를이용하 여 Pig IgG, IgA ELISA Quantitation kit로 ELISA 방법을이용하여분석하였 다. 2. 연구결과 생균제첨가에의한돼지의사양시험결과는 0-9주까지는생균제처리구에서 비처리구보다일당증체량, 일당사료섭취량및사료효율에있어서증가하는것 으로나타났다. 10주에서 20주까지는생균제첨가구에서유의적으로증가하였고 특히, 0.1% 에서 4.5% 증가효과가나타났으나 0.2% 첨가구에서는대조구에비하여 7.2% 의일당증체량증가효과를보여생균제의농도가높아질수록일당증체량 이더욱향상되는것으로나타났다(table 9). 이결과는본연구에서개발된생균 제가지속적급여는육성기는물론비육기에이르기까지성장촉진효과를보이 는것으로나타났다

104 Table 9. Effects of dietary probiotic complex on growth rate in growing pigs Item Control Probiotics content 0.1% 0.2% Standard Deviation ADG(g) 0~8 weeks ~20 weeks ~20 weeks ADFI ~8 weeks ~20 weeks 2,493 2,588 2, ~20 weeks G:F ratio 1,893 1,896 1, ~8 weeks ~20 weeks ~20 weeks

105 생균제첨가가영양소소화율및질소축적율에미치는영향에대한결과는 표 2에서보는바와같이자돈에서는생균제 0.1% 투여군과 0.2% 투여군에서대 조군에비해건물조단백질, 조지방의소화율이유의하게증가하였으며 (P<0.05), 0.2% 처리군에서는칼슘의소화율도증가하는것으로나타났다. 그러나 인의소화율은유의할만한차이를보이지않았다. 그러나육성기이후의돼지에 서는생균제첨가에따른소화율과과영양소개선은나타나지않았다. 생균제투여가질소축적율에미치는영향에대해서는표 11에나타난바와 같이생균제처리군에서분변내질소의양이유의하게줄어드는것으로나타났 다. 뇨내질소의성분변화는큰차이를보이지않았고육성돈과비육돈에서는 소화율과마찬가지로유의성있는차이를보이지않았다. 혈액내요소태질소의성분변화에서는자돈에서약간증가하는경향을보였으나는전실험기간동안생균제투여군과비투여군에서유의성있는변화가나타나지않았고시간이경과하면서일정한수준을유지하는것으로나타났다 (Figure 49)

106 Table 10. Effect of probiotics complex on nutrient digestibily in weaning and growing pig Item Control Probiotics content 0.1% 0.2% Standard Deviation Weaning pig DM(%) Protein(%) Fat(%) Ca(%) P (%) Growing pig DM(%) Protein(%) Fat(%) Ca(%) P (%)

107 Table 11. Effect of probiotics complex on nitrogen retention in weaning and growing pigs Item Control Probiotics content 0.1% 0.2% Standard Deviation Weaning pig N intake (g/d) Fecal N excretion (g/d) Urinary N excretion (g/d) Nitrogen retention (g/d) Nitrogen retention rate (%) Growing pig N intake (g/d) Fecal N excretion (g/d) Urinary N excretion (g/d) Nitrogen retention (g/d) Nitrogen retention rate (%)

108 B U N Probiotics 0.1% Probiotics 0.2% Control Day after birth Figure 49. Effect of continous feeding of probiotics complex on blood urea nitrogen(bun) concentration in pigs

109 생균제의면역기능에관해서는대부분의생균제가면역기능의향상효과를 보이지않는다고하였다. 그러나본연구에서개발된생균제는표 4에서보는바 와같이면역기능이강화된생균제로기존의생균제보다면역기능강화효과가 개선된결과를보여주었다. 특히 0.2% 처리군에서는 IgG 의함량이증가할뿐만 아니라 Inf-r의증가가관찰되어본생균제의급여가질병의예방과방어에효과 를발휘할수있을것으로판단되었다. 이를확인하기위하여각그룹별로혈청을 채혈할때 1두씩안락사시켜부검을하여장내소견을관찰한결과 Figure 와같이생균체처리군에서임상증상은물론부검소견에서도양호한장관 의상태를보이고있었다. 이러한결과를바탕으로 Figure 55에보는바와같이 시제품을제작하였다. 는 생균제의급여방법은젤타입과물에타먹이는방법이있는데본연구에서 Table 12와같이이두가지의시제품을모두제작하여현장에서의활용도를 검사한결과젤타입이효과는우수하나농가의불편으로현장적용에어려움이 있어음수용으로제작된가루타입을사용하는것이좋을것으로판단되었다

110 Table 12. Effect of continous feeding of probiotics complex on immune responses in pigs Item Control Probiotics content 0.1% 0.2% Standard Deviation 1 week WBC (10 3 / μl) IgG (mg/dl) IgA (mg/dl) Inf- (mg/dl) weeks WBC (10 3 / μl) IgG (mg/dl) IgA (mg/dl) Inf- (mg/dl) weeks WBC (10 3 / μl) IgG (mg/dl) IgA (mg/dl) Inf- (mg/dl) weeks WBC (10 3 / μl) IgG (mg/dl) IgA (mg/dl) Inf- (mg/dl) weeks WBC (10 3 / μl) IgG (mg/dl) IgA (mg/dl) Inf- (mg/dl) weeks WBC (10 3 / μl) IgG (mg/dl) IgA (mg/dl) Inf- (mg/dl)

111 Figure 50. Piglets fed conventional feed was normal body condition Figure 51. Piglets fed probiotics was normal body condition

112 Figure 52. Piglets fed conventional feed probiotics showed edmatous intestinal tract Figure 53. Piglets fed conventional feed probiotics was normal intestinal condition

113 Figure 54. Blood collction with piglets fed conventional feed and probiotics complex Figure 55. A manufactured products with pig INF-r and pig IL-2 lactobacillus