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주승 견
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1 임상검사와정도관리 : 제 30 권제 1 호 2008 J Lab Med Qual Assur 2008; 30: Biphasic Electrophoresis 를이용한혈청지질상의분석 박지영 최현우 이진솔 김수현 조덕 신명근 신종희 서순팔 양동욱 전남대학교의과대학진단검사의학교실 Serum Lipid Analysis Using Biphasic Electrophoresis Ji-Young Park, Hyun-Woo Choi, Jin-So Lee, Duck Cho, Myung-Geun Shin, Jong-Hee Shin, Soon-Pal Suh, and Dong-Wook Ryang Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea Background: Recently biphasic agarose gel electrophoresis method using Chol/Trig Combo TM for simultaneous detection of cholesterol and triglyceride on lipoprotein fractions has been developed to facilitate the classification and interpretation of abnormal lipoprotein patterns of patients with hyperlipidemia. The author analysed serum lipid profiles using Chol/Trig Combo TM in the patients of OPD in Department of Internal Medicine. Methods: Measurement of serum cholesterol and triglyceride using enzymatic method was performed in the sera of 415 patients from April, 2006 to July, Simultaneously, we electrophoresed serum cholesterol and triglyceride using Chol/Trig ComboTM with analysis software (ED BANK, Helena Laboratories, Saitama, Japan). Results: According to ATP III guideline, we set up standard cholesterol as 200 mg/dl and triglyceride as 150 mg/dl, respectively, and the patients were classified into control, hypercholesterolemic, hypertriglyceridemic and hypercholesterolemic/hypertriglyceridemic groups, respectively. Hypercholesterolemic group had higher HDL and LDL, hypertriglyceridemic group had higher HDL, VLDL and the rates of positive modified LDL, hypercholesterolemic/ hypertriglyceridemic group have higher VLDL and the rates of positive modified LDL than the control. Otherwise, the rates of positive modified LDL were 19.8% in the control, 23.6% in the hypercholesterolemic group, 50.9% in hypertriglyceridemic group, and 39.3% in hypercholesterolemic/hypertriglyceridemic group. Conclusions: The frequency of the rates of positive modified LDL and VLDL was higher in the hypertriglyceridemic group than those in the control. Key Words:Biphasic electrophoresis, Cholesterol, Triglyceride 교신저자 : 서순팔우 ) 광주광역시동구학동 8 번지전남대학교병원진단검사의학과전화 :062) , FAX:062) spsuh@jnu.ac.kr 서 일반검사실에서총콜레스테롤, low density lipoproteincholesterol (LDL-C), high density lipoprotein-cholesterol (HDL)-C, 그리고중성지방등의지질측정에는흔히효소법이이용되고있다. HDL-C 의경우 heparin sulfate-mn 2+, 론 dextran sulfate-mg 2+ 등의 polyaniondivalent cation 을이용하는방법은다른지질을침전시키는전처리후측정해야하는번거로움이있고, 지단백을각분획으로정확히분리할수있는초고속원심법 (ultracentrifugation) 은 16 시간이상원심을해야하므로일상적검사로사용하기힘들며, 아가로스젤을이용한전기영동법은분획의구분이뚜렷하지않아정확한지단백을정량할수없는단점이있다 [1]. 근래에들어 HDL-C 및 LDL-C 을효소법을이용하여직접측정할수있고, 분석법의개선으로보다많은지질성분을간편하게검사할수있게되었지만, 아직까지당화 LDL (glycated LDL) 또는산화 LDL (oxidized LDL)

2 202 박지영 최현우 이진솔 김수현 조덕 신명근외 등의변성 LDL (modified LDL, m-ldl) 을쉽게측정할수있는방법은흔하지않다. 최근소개된 Epalyzer 2 (REP; Helena Laboratories, Saitama, Japan) 는 biphasic electrophoresis 법을이용하여콜레스테롤과중성지방을각각아가로스젤전기영동을시행한후, LDL, very low density lipoprotein (VLDL), HDL, chylomicron (CM) 및중간밴드 (midband) 등의 5 분획으로나누어지질양상을검색하는장비로서혈청콜레스테롤과중성지방농도를이용하여각각의분획을정량할수있으며, Fredrickson 유형분류및 m-ldl 의측정도가능하다. 저자들은본연구에서대학병원외래를방문한환자를대상으로 biphasic electophoresis 법을이용하여고지혈증군에따른지질양상의분석, Fredrickson 유형에따른분류및 m-ldl 의분포등을조사하고자하였다. 대상및방법 1. 대상및혈청지질측정 하였다. 아가로스젤은 REP Lipo-30 plate (Helena Laboratories, Japan) 을사용하였고, 콜레스테롤과중성지방은각각 cholesterol dehydrogenase 와 glycerol-3- phosphate 를포함한시약 (CHOL/TRIG COMBO TM, Helena Laboratories) 을이용하여염색하였다. 이동거리에따른젤의변이영향을제거하고, 염색과스캔후에두분획이보다정확하게겹쳐져나타나게하기위해서젤을두부분으로나누어, 한쪽은콜레스테롤을염색하고, 다른한쪽은중성지방을염색하였다. 염색한젤은 5% 초산에 30분간고정한후, 증류수로세척하고건조후에 570 nm 에서 densitometer 로스캔하였다. 스캔된패턴은분석소프트웨어 (ED BANK, Helena Laboratories) 를이용하여 LDL, VLDL, HDL, CM 및 midband 등의 5분획으로나누었다. 나누어진분획은필요에따라수기로 LDL, VLDL, HDL, CM 등의 4분획으로수정하였으며, 수정된분획을효소법으로측정된콜레스테롤과중성지방농도를대입하여각각의분획을정량하였고, Fredrickson 유형에따라관찰되는고지혈증예를각각 I, IIa, IIb, III, IV 및 V형등으로분류하였다 년 4월부터동년 6월까지전남대학교병원내과외래를방문한환자 415 명을대상으로하였으며, 남자 204 명 (60±15.6세) 및여자 211명 (60±15.1 세 ) 이었다. 혈청분리는 12시간공복후채취한말초혈액검체를 4 에서 15분간 3,000 rpm으로원심하여시행하였으며, 총콜레스테롤과중성지방은 GPO-PAP (glycerol phosphate oxidase-phenylperoxidase aminophenozonphenol) 와 CHOD- PAP (cholesterol oxidase phenol 4-aminoantipyrine peroxidase) 를각각이용하여효소법으로측정하였다. NCEP-ATP III 지침 [2] 에따라콜레스테롤과중성지방의정상범위상한치를각각 200 mg/dl 과 150 mg/dl 로하여, 이를기준으로 정상대조군 ( 콜레스테롤 <200 mg/ dl, 중성지방 <150 mg/dl), 고콜레스테롤혈증군 ( 콜레스테롤 200 mg/dl, 중성지방 <150 mg/dl), 고중성지방혈증군 ( 콜레스테롤 <200 mg/dl, 중성지방 150 mg/ dl), 고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군 ( 콜레스테롤 200 mg/dl, 중성지방 150 mg/dl) 등의 4군으로나누었다. 2. 지단백전기영동 지질측정에이용한혈청검체로콜레스테롤및중성지방에대한전기영동을시행하였다. 1 L의혈청을 Epalyzer 2 의아가로스젤상에주입한후, 400V 로 15 분간전기영동 3. modified-ldl Chol/Trig Combo TM 를이용하여 CMF (charge modification frequency) 값을얻어 m-ldl 을측정하였다. CMF는혈청검체를주입시킨기점에서부터대조군의 LDL 최고점위치를 a로, 기점에서부터샘플의 LDL 최고점위치를 b로각각설정하여 b-a/a*100 의식을이용하여계산하였으며, 이 CMF 값이 m-ldl 의단위로정해진다. CMF 는정상범위를 -8에서 +8까지로샘플이대조군보다음극쪽으로이동하게되면 CMF 는음의값을갖고, 양극쪽으로이동하게되면양의값을갖게되는데, CMF 값이 -8보다작거나 +8보다큰경우는 'm-ldl 양성 ' 이라정의하였다. 4. 통계분석통계패키지프로그램으로 SPSS 11.0 윈도우버전 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을이용하여유의성을검정하였으며, P값이 0.05 미만인경우 통계학적으로유의하다 고판정하였다. 정상대조군과고지혈증군간에각종지질측정치간에유의한차이가있는지독립표본 T검정을실시하였고, m-ldl 의비율이유의한차이가있는지는 chi-square 검정법을이용하여분석하였다.

3 Biphasic Electrophoresis 를이용한혈청지질상의분석 203 결 과 2. 각군의지질분획양상 1. 환자의분포총 415 명의환자는정상대조군 232 명 [ 남 127 명 (63±15.959세), 여 119명 (58±16.85세)], 고콜레스테롤혈증군 72명 [ 남 23명 (61±9.4 세 ), 여 49명 (64±12 세 )], 고중성지방혈증군 55 명 [ 남 29 명 (55±17 세 ), 여 26 명 (64±14 세 )], 고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군 56명 [ 남 25명 (59±16 세 ), 여 31명 (60±10 세 )] 으로각각분류되었다. 각군의지질분획양상은 Table 1과같다. 고콜레스테롤혈증군은정상대조군에비해 HDL 의수치가유의하게낮았고, LDL 은유의하게높았다. 고중성지방혈증군은 HDL, VLDL 수치및 m-ldl 의양성율이, 그리고고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군은 VLDL, LDL 의수치및 m-ldl 의양성율이각각대조군에비하여유의하게높았다 (P<0.05). Table 1. Comparisons of lipid values (mean±sd, mg/dl) in normolipidemic and hyperlipidemic groups* according to cholesterol and triglyceride level Normolipidemic Hyperlipidemic A (N=232) B (N=55) P value C (N=72) P value D (N=56) P value Total Cholesterol 157 ± ± ± 23 < ± 36 <0.001 Triglyceride 90 ± ± 84 < ± ± 157 <0.001 HDL 53 ± ± ± ± VLDL 24.5 ± ± 16.9 < ± ± 31 <0.001 LDL 87.5 ± ± ± 28 < ± 44 <0.001 *A, triglyceride <150 mg/dl, total cholesterol <200 mg/dl; B, triglyceride 150 mg/dl, total cholesterol <200 mg/dl; C, triglyceride <150 mg/dl, total cholesterol 200 mg/dl; D, triglyceride 150 mg/dl, total cholesterol 200 mg/dl. Independent sample T-test, considered to be significant when P<0.05. Abbreviations: HDL, high density lipoprotein; VLDL, very low density lipoprotein; LDL, low density lipoprotein. Table 2. Fredrickson phenotypic classification of normolipidemic and hyperlipidemic groups* according to serum cholesterol and triglyceride level Normolipidemic Hyperlipidemic Phenotype A (N=232) B (N=55) C (N=72) D (N=56) N % N % N % N % I IIa IIb III IV V Unclassifiable *Same as Table 1.

4 204 박지영 최현우 이진솔 김수현 조덕 신명근외 Table 3. Distribution of modified LDL of normolipidemic and hyperlipidemic groups* according to serum cholesterol and triglyceride level CMF A (N=232) B (N=55) C (N=72) D (N=56) Normolipidemic Hyperlipidemic N % N % N % N % -9 ~ ~ ~ ~ ~ ~ Over *Same as Table 1. CMF: charge modification frequency, defined 'modified LDL positive' when <-8 or >+8. Fig. 1. The distribution of modified LDL. Abbreviations: TG, triglyceride; Chol, cholesterol; CMF, charge modification frequency. 3. 고지혈증에서 Fredrickson 형에따른분류 과 III 형의환자는관찰되지않았다. 대조군에서 Fredrickson 유형이판정되지않은예가 97% (225/232) 이었다. 고콜레스테롤혈증군에선 IIa 형이 58.4% (42/72), 고중성지방혈증군에선 IV형이 96.4% (53/55), 고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군에선 IIb 가 55. 4% (31/56) 로각각가장많았다 (Table 2). 한편본연구에서 I형 4. 고지혈증에서 m-ldl 의분포고지혈증에서의 m-ldl 의분포는 Table 3 및 Fig. 1 과같다. 정상대조군에서 m-ldl 이양성인예는 19.8% (46/232) 으로서그중 CMF 가 +8이상이 31예이었으며,

5 Biphasic Electrophoresis 를이용한혈청지질상의분석 205 A B CM VLDL LDL CM CM VLDL LDL CM C D CM VLDL LDL CM CM VLDL LDL CM Fig. 2. Densitometric scanning of various hyperlipidemias. Cholesterol and triglyceride are red and gray, respectively, in the densitogram. (A) Normolipidemic control (total cholesterol 139 mg/dl, triglyceride 100 mg/dl). (B) Type IIa hyperlipidemia (total cholesterol 231 mg/dl, triglyceride 129 mg/dl) with high peak LDL-C. (C) Type IIb hyperlipidemia (total cholesterol 231 mg/dl, triglyceride 259 mg/dl) with high peak LDL-C and VLDL-TG. (D) Type IV hyperlipidemia (total cholesterol 195 mg/dl, triglyceride 335 mg/dl) with high peak of VLDL-TG. Abbreviations: HDL, high density lipoprotein; VLDL. very low density lipoprotein; LDL, low density lipoprotein; TG, triglyceride; CM, chylomicron. -8미만은 15예이었다. 고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군은 50.9% (28/55) 에서 m-ldl 이관찰되었으며, 그중 CMF +8이상이 26예, -8미만은 2예였다. 고콜레스테롤혈증군은 23.6% (17/72) 이 m-ldl 이양성이었으며, 그중 16명이 CMF +8 이상이었고, 나머지 1명이 -8 미만이었다. 고중성지방혈증군은 39.3% (22/56) 에서 m-ldl 이양성이었으며, CMF +8이상인경우가 20예, -8미만인경우가 2 예였다. 5. 고지혈증군의지단백전기영동상정상대조군, 고중성지방혈증군, 고콜레스테롤혈증군및고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군등의전형적지단백전기영동상은 Fig. 2에서와같았다. 고 Epalyzer 2는 biphasic electrophoresis 법을이용하여콜레스테롤과중성지방을각각아가로스젤전기영동을시행한후, LDL, VLDL, HDL, CM 및 midband 등의 5 분획으로나누어지질양상을검색하는장비로서최근혈청고지혈증의양상을검색하는데이용되고있다 [3]. Toshimi 등 [3] 은상기방법이지질검사에대한직선성, 상관성및정밀도등을고려할때기존의효소법을대치할수있다고보고하였다. LDL 은순환중 VLDL 대사과정에서생성되는데, 그구성은 50% 가에스테르화된콜레스테롤이며, 25% 가 apolipoprotein (apo) B로구성된단백, 20% 가인지질, 그리고약간의중성지방으로이루어져있다 [2]. HDL 은대부분이단백질이며, 콜레스테롤과인지질, 약간의중성지방으로이루어져있다 [4]. 본연구에서는혈청중성지방농도와관계없이고콜레스테롤혈증군에서정상대조군에비해 LDL 이 찰

6 206 박지영 최현우 이진솔 김수현 조덕 신명근외 높았다. 반면, HDL 농도는고콜레스테롤혈증군에선정상지질군에비해높았으나, 고중성지방혈증군에서는정상대조군에비해낮았으며, 오히려고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군에서는정상대조군과차이가없었다. HDL 농도가콜레스테롤이나중성지방농도에따라상하값의차이를보이는기전에대해서는좀더많은연구가필요할것으로생각된다. 한편본결과에서는고중성지방혈증군에서혈청 VLDL 농도가높았는데, 이는 12 시간공복후에혈액을채취하여대부분의혈청중성지방이 VLDL 에존재하였기때문으로생각된다 [5]. 본연구에서 m-ldl 양성비율은정상대조군과고콜레스테롤혈증군에선각각 29.8% 및 23.6% 이었으며, 고중성지방혈증군과고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군에선각각 50.9% 및 39.3% 로정상대조군에비하여유의하게높았다. 이러한결과는높은중성지방의농도와 m-ldl 의연관성을시사한다. 이는중성지방이풍부한 LDL 일수록입자가작으며 [6,7], 작은입자를갖는 LDL 일수록산화되기쉬워 m-ldl 을보다잘생성하기때문으로사료된다 [8]. m-ldl 은 LDL 이혈관벽으로들어간후 lipid 와 apo-b 에의해서 LDL 이산화되고, phosphatidylcholine 을 lysophosphatidylcholine 으로수용화시키는과정에서생성되며, 또한 LDL 상호간에응집하고여러가지변형을거치면서생성된다 [9]. 이러한 m-ldl 은 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 을발현시키거나단구세포를자극하여탐식세포를생성하며, 탐식세포는거품세포 (foam cell) 를만든다. 또한 m-ldl 은탐식세포를자극하여 cytokine 들을분비하는데, 이러한 cytokine 들은부착인자의발현을유도한다. 한편, 거품세포는성장인자나 metalloproteinase 를분비하여기질을분해시키거나세포를증식시킨다. 이런작용을통하여 m-ldl 은죽상경화증의전구인자가된다 [10]. 또한 m-ldl 은당뇨병이나죽상경화증에서당화 LDL 이나산화 LDL 로질병의지표와치료예후판정에중요한역할을하는것으로알려져있으며 [11,12], 따라서 m-ldl 은관상동맥질환이나당뇨병의추적관찰에유용할수있다. 한편저자들은 LDL 과 m-ldl 사이에어떠한관계가있는지알아보기위해 NCEP-ATP III guideline 에따라 LDL 농도 100 mg/dl 을기준으로 LDL 이 100 mg/dl 이상인군과 100 mg/dl 미만인군으로각각나누어변성 LDL 의양성율을비교하였다. 저 LDL 군과고 LDL 군의 m-ldl 양성율은각각 29.6% (42/142) 및이고, 고 LDL 군의 m-ldl 양성율은 27.1% (74/273) 로서로유의한차이가없었다 ( 결과미제시 ). 따라서, LDL 농도는 m-ldl 농도에큰영향을미치지않는것으로보였다. Kannel 등 [13] 은산화 LDL 과혈청에서측정한 LDL 은관계가없고, 오히려개개인의항산화상태가산화 LDL 의혈청농도와관련이있다고보고하였다. 본연구에서정상대조군과고지혈증군의형별을분류한결과, 정상대조군에서는유형이결정되지않은예가 97.0% 이 었으며, 고중성지방혈증군에선 IV 형이 96.4%, 고콜레스테롤혈증군은 IIa 형이 58.4%, 고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군은 IIb 가 55.4% 로서각각가장높은비율을차지하였다. 이는대체적으로 Fredrickson 유형에합당한결과로사료되며, 이미수치로서짐작할수있는 Fredrickson 유형분류를 densitogram 으로시각화함으로서어느지질분획이특히증가되었는가를쉽게알수있는동시에치료후추적관찰에도유용할것으로보인다 [14]. 본연구에서는각고지혈증군에따라각지질의혈청농도와나오는유형, m-ldl 의분포에대해알아보았는데, 대학병원외래초진환자만을대상으로시행되어질병및질환군이확정이되지않은사례가많아임상질환이아닌지질농도의정도에따라환자군을분류하고, 그의의를알아보고자하였기에다소미흡한성적이라고여겨진다. 따라서다양한질환군에대한의의규명을위해서는향후장기간에걸친추가적연구가필요할것으로사료된다. 요 배경 : 최근콜레스테롤과중성지방을각각전기영동한후 Chol/Trig Combo TM (Helena Laboratories, Japan) 로구분염색하여그양상을검색하는 biphasic electrophoresis 법이소개되었다. 저자는대학병원내과외래초진환자를대상으로 biphasic electrophoresis 법을이용하여혈청지질양상, Fredrickson 유형별고지혈증분류및변성 LDL (modified LDL; m-ldl) 등을조사하였다. 방법 : 2006 년 4 월부터동년 6 월까지전남대학교병원내과외래를방문한초진환자 415 명을대상으로하였다. ATP III guideline 에따라콜레스테롤 200 mg/dl 및중성지방 150 mg/dl 를기준으로대조군과고지혈증군으로나누었다. 효소법으로혈청콜레스테롤과중성지방을측정하였으며, 동시에 biphasic electrophoresis 후분석소프트웨어 (ED BANK, Helena Laboratories) 를이용하여 HDL, VLDL, LDL 및 m-ldl 등의양상을분석하였다. 결과 : 고콜레스테롤혈증군은정상대조군에비해 HDL 이유의하게낮았으며, LDL 은유의하게높았다. 고중성지방혈증군은 HDL, VLDL 수치및 m-ldl 의양성율이, 그리고고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군은 VLDL, LDL 수치및 m-ldl 의양성율이대조군에비하여유의하게높았다 (P<0.05). 한편 m-ldl 양성율은대조군에서는 19.8% (46/232), 고콜레스테롤혈증군은 23.6% (17.72), 고중성지방혈증군에선 50.9% (28/55), 그리고고콜레스테롤 / 고중성지방혈증군에선 39.3% (22/56) 이었다. 결론 : 이장비로 m-ldl 을측정할수있었다. LDL 은중성지방농도와관계없이고콜레스테롤혈증군에서, 그리고 m-ldl 의양성율과 VLDL 은콜레스테롤농도와관계없이고중성지방혈증군에서각각높았다. 약

7 Biphasic Electrophoresis 를이용한혈청지질상의분석 207 참고문헌 1. 대한진단검사의학회. 진단검사의학. 제3판. 서울 : 고려의학, 2001: Mcpherson RM and Pincus MR, ed. Henry's clinical diagnosis and management by laboratory methods. 21th ed. Philadelphia: WB Saunders, 2006: Kido T, Kurata H, Matsumoto A, Tobiyama R, Musha T, Hayashi K, et al. Lipoprotein analysis using agarose gel electrophoresis and differential staining of lipids. J Atheroscler Thromb 2001;8: Anthony C. LDL cholesterol: "bad" cholesterol? or bad science? J Am Phys Surg 2005;10: Anjali M and Lalit MS. Triglycerides as an independent risk factor in coronary heart disease: emerging trends in the postprandial state. J Med Sci 2002;5: Mcnamara JR, JennerJL, Li Z, Wilson PW, Schaefer EJ. Change in LDL particle size is associated with change in plasma triglyceride concentration. Arterioscler Throm 1992;12: Kondo A, Muranaka Y, Ohta I, Notsu K, Manaba M, Kotani K, et al. Relationship between triglyceride concentrations and LDL size evaluated by malondialdehyde-modified LDL. Clin Chem 2001;46: Dejager S, Brucker E, Chapman MJ. Dense low density lipoprotein subclass resistance predominate in combined hyperlipidemia. J Lipid Res 1993;34: Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, Jhoo JC, Witzum JL. Beyond cholesterol modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenecity. N Engl J Med 1989;320: Ross R. Mechanism of disease: atherosclerosis - an inflammatory disease. N Engl J Med 1999;340: Suh J, Byun JD, On YK, Hyon MS, Kim SK, Kwon YJ. Oxidized LDL and inflammatory markers in ischemic disease. Korean J Med 2003;64: Cohen MP, Jin Y, Lautenslager GT. Increased plasma glycated low-density lipoprotein concentrations in diabetes: a marker of atherogenic risk. Diabetes Technol Ther 2004;6: Kannel WB, Gordon T, Castelli WP. Role of lipids and lipoprotein fractions in atherogenesis: the Framingham Study. Prog Lipid Res 1981;20: Ohno F, Suehiro T, Uga S, Kawada M, Takamatsu K, Yasuoka N, et al. Studies on the phenotyping system of hyperlipoproteinemias. Evaluation of a new method by enzymic staining of lipids in serum lipoproteins separated by electrophoresis on agarose. Jpn J Med 1983;22:200-5.

012임수진

012임수진 Received : 2012. 11. 27 Reviewed : 2012. 12. 10 Accepted : 2012. 12. 12 A Clinical Study on Effect of Electro-acupuncture Treatment for Low Back Pain and Radicular Pain in Patients Diagnosed with Lumbar