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해우 피
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1 Reprod Dev Biol 32(1) : 1-7 (2008) 1 돼지골수조혈세포의이종마우스동물모델생체증식및분화특성 이용수 1 이현주 1 김태식 1 김혜선 1 김유경 1 김재환 1 박진기 2 정학재 2 장원경 2 김동구 1, 1 포천중문의과대학교차줄기세포연구소, 2 축산과학원응용생명공학과 Effective Reconstitution of Porcine Hematopoietic Cells in Newborn NOD/SCID Mice Xenograft Yong-Soo Lee 1, Hyun-Joo Lee 1, Tea-Sik Kim 1, Hye-Sun Kim 1, Yoo-Kyong Kim 1, Jae-Hwan Kim 1, Jin-Ki Park 2, Hak-Jae Chung 2, Won-Kyong Chang 2 and Dong-Ku Kim 1, 1 Graduate School of Life Science and Biotechnology, College of Medicine, CHA Stem Cell Institute, Pochon CHA University, Seoul , Korea 2 Animal Biotechnology Division, National Livestock Research Institute, Suwon , Korea ABSTRACT The SCID repopulation cells(srcs) assay has been widely used to determine the self renewal capacity of hematopoietic stem cells (HSCs). In this study, we tested the repopulating efficiency of porcine bone marrow derived hematopoietic stem cells using nonobese diabetic/severe combined immunodieficient (NOD/SCID) mice which was inherited immunodeficiency mice with defect of T cells, B cells, and low activity of NK cells. We transplanted porcine bone marrow hematopoietic stem/progenitor cells with intraperitoneal injection into neonate NOD/SCID mice. We confirmed efficient reconstitution activity of inoculated porcine hematopoietis cells in variety of organs of NOD/SCID mice. Interestingly, pig CD3 + T lymphocytes detected with high level in liver(15.6±3.7%), spleen(5.6±3.0%), thymus(1.5±1.3%), and BM(2.3±0.9%), respectively. These data imply that microenvironment of neonate NOD/SCID mice is very efficient for proliferation and differentiation of pocine T cells, and can be useful for the study of T cells development and xenogeneic organ transplantation. (Key words : Porcine, Hematopoietic stem cells, NOD/SCID mice, Engraftment, Differentiation) 요약 본연구는돼지골수에서존재하는조혈줄기세포및전구세포를이용해이종동물모델인태아마우스복강생체이식을통하여돼지조혈세포의이종조혈조직에서의증식과분화특성을규명하였다. 선천성면역부전마우스인 NOD/SCID 마우스태아조혈환경에돼지골수유래조혈줄기세포및전구세포를이식하고, 이식후 5 주령에마우스조혈기관에서의돼지조혈세포의증식과분화특성을돼지특이적항체면역염색으로유세포분석을실시한결과, 마우스조혈조직인골수, 흉선, 간장, 비장및림파절에서돼지조혈세포의분화및증식이관찰되었다. 특히돼지의 T 면역세포가골수계세포에비해서높은 chimerism 이관찰되어태생초기의 NOD/SCID 조혈환경에의한특이적 T 면역세포의증식에적합한조혈환경을제공하고있다는사실이밝혀졌다. 본마우스신생 NOD/SCID 복강이식동물모델을이용해돼지 T 면역세포의분화발달연구및이종장기이식기전연구에좋은모델로서활용이기대된다. 서론 생체조직에존재하고있는세포는다양한분화와특성을지니고있다. 21세기의재생의료는이러한조직특이적으로존재하고있는줄기세포를포함하는세포를이용한응용기술을토대로하여시험관에서의조직재생 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 기술에의응용이활달하게이루어지고있다. 또한, 현재의심장, 간장, 신장및각막과피부조직을비롯한다양한생체조직의이식인장기이식은절대적인공급자부족과지속적인수요자의증가로인하여심각한사회적문제로대두되고있는현상이다. 배아줄기세포의전분화성과자기복제능력을이용한다양한특이적조직세포로의분화유도및배양에대한전세계적인연구와더불어성체의 * 본연구는농촌진흥청바이오그린 21 사업연구비 ( ) 의지원에의하여이루어진것임. Corresponding author : Phone: , dokukim@cha.ac.kr

2 2 이용수등 조직에존재하는조직특이적인줄기세포를이용한임상치료에의응용이활발히진행되고있다. 그중에서특히골수조직에존재하고있는조혈줄기세포는약 50 년이상의오랜기간동안연구가이루어진대표적인줄기세포이다. 최근의돼지장기를이용한이종장기이식분야는국내외적으로활발한기초연구와전임상연구가진행되고있으며, 수많은난치성질환을치료할수있는차세대의가장각광받는바이오분야이다. 그러나돼지를비롯한동종및이종세포나장기이식시해결해야할가장커다란문제로서주요조직적합항원 (MHC) 차이에의한급성또는만성적인이식면역거부반응이다. 면역거부반응을제어하고있는요인으로서골수에존재하는조혈줄기세포로부터분화된 T 림파구와 B 림파구세포등과같은면역세포의면역반응에의한이식세포거부반응이라할수있다. 성체골수조직의약 0.001% 의매우낮은비율로존재하는조혈줄기세포는매일수억개의성숙한조혈세포를분화와증식과정을반복하면서생체항상성을유지하고있다. 조혈줄기세포로부터성숙한림파구계세포와골수구계세포로분화할수있는다분화능력과자신과동일한분화능력의세포를재생할수있는자기복제능력을보유하고있다 (Keller 등, 1990; Morrison 등, 1995). 조혈줄기세포의기능및특성을연구하는방법에는조혈줄기세포분화조절인자인 GM CSF, G CSF, EPO, IL 3, SCF 등을이용한시험관에서이루어지는 CFU C, HPP CFU 및 LTC IC 등의검증방법이널리이용되고있다. 그러나시험관배양을통한자기복제유도는한정된조혈환경으로인하여한정된세포로만분화를유도할수있는단계이다 (Nakahata 등, 1982; Shtherland 등, 1989). 또한, 마우스의조혈줄기세포의연구와달리사람의조혈줄기세포에대한연구는적절한생체이식동물모델이부재로인하여초보적인연구단계이다 (Jean 등, 1997). 사람을비롯한이종줄기세포의생체특성연구를위한대체동물모델로서이종세포및장기이식에따른면역거부반응이낮은면역결핍마우스를이용한생체이식연구가활발히진행되고있다. 면역결핍마우스를사용하는이유는정상적인마우스의경우정상적으로면역작용이일어나자신의세포가아닌이종세포나다를항원인경우사멸시키는방어기작을가지고있다. 이면역방어기작으로인하여이종이식에의한생체내세포의특성을알아보기위해서는좋은모델이될수가없다. 결국인간조혈세포의마우스생체이식을위하여면역기작을없앤동물모델이개발되었으며, 이동물모델을면역결핍 (Severe combined immunodeficiency, SCID) 마우스라명명되었다 (Bhatia 등, 1998). 대표적인면역결핍마우스로서 SCID (severe combined immunodeficient disorder) 마우스와당뇨병 (nonobese diabeteic, NOD) 동물모델과면역결핍모델 (SCID) 마우스의교배로인하여두가지성질을모두가진 NOD/SCID (Non obese diabetetic/ SCID) 모델등이있다. 이동물모델은 T, B 림프구가존재하지않으며, NK cells, Macrophage, 보체등의기능이정상보다현저히낮은특성을지니고있다 (Kamal Reid 등, 1998). NOD/SCID 마우스의낮은이종이식반응특성을이용해사람조혈줄기세포를비롯해다양한이종세포및장기이식용동물모델로서활용되고있으며, 특히인간조혈줄기세포의정상적인성숙조혈세포로의분화및 증식유도가가능하여줄기세포의자기복제능력검증및다분화능력검증및유전자치료분야등다양한분야에이용되고있다 (Larochelle 등, 1996; Peled 등, 1999; Shultz 등, 1995). 이와같이면역결핍마우스모델을이용한인간세포의연구를위한동물모델을 humanized NOD/SCID 동물모델이라명명한다. 이는인간의세포가인간모델이아닌이종동물모델생체내에서정상적으로증식및분화가일어나는마우스를말하며, 인간세포의특성및발달을연구하는데이용된다. 시험관실험 (in vitro) 의환경은생체내환경 (in vivo) 환경과다르기때문에인간조혈세포의생체내환경에서의분화및발달을연구하여인간조혈세포의특성을연구하기위해마우스내에인간조혈세포를이식하여분화및발달을유도한마우스이다 (Ishikawa 등, 2002). Humanized NOD/SC ID 동물모델을만드는이식방법들이여러논문을통하여발표되고있으며, 줄기세포의동물모델생체이식방법에생체증식효능검증연구로서정맥이식방법 (intravenous injection) 보다골수 (bone marrow) 공간에직접적으로이식하는방법인 IBM(Intra bone marrow) 이 15 배더높은증식및분화가높다는연구가발표되었다 (Yahata 등, 2003). 또한, 조혈줄기세포의생체내조혈지지환경의차이에대한연구로서 5~8 주령의성체마우스에의생체이식에비해서신생 1~3 일내의동물모델내에서조혈줄기세포의생체이식방법이줄기세포의분화및증식에매우높은효율이관찰되었으며, 특히조혈줄기세포로부터림파구계면역세포의분화와증식효능이뛰어나다는사실이밝혀졌다 (Shultz 등, 2005). 본연구는돼지골수에서채취한돼지조혈줄기세포및전구세포를이용하여신생 NOD/SCID 마우스모델에의생체이식을실시하고, 이종동물모델생체에서의돼지조혈줄기세포및전구세포의성숙조혈세포로의분화및증식특성을분석하였다. 신생 NOD/SCID 마우스생체조혈조직인혈액과간장, 비장, 흉선조직및골수조직에서돼지조혈세포의증식및분화를돼지조혈세포특이적인항체와유세포분석방법으로높은이종생체증식돼지조혈줄기세포의증식및분화특성을확인하였다. 재료및방법 실험동물동물모델로서는 NOD/SCID 마우스의교배에의해출생한생후 1 주령이하의신생 NOD/SCID 마우스를돼지골수조혈세포의이식용동물로서이용하였으며, 포천중문대학교세포유전자치료연구소의동물실에서번식을실시하였다. SPF(Specific Pathogen Free) 조건에서멸균된깔짚과물과사료를공급하고사육조건으로는온도 24 ~26 C, 습도 45~55% 를유지하였다. 돼지골수조혈줄기세포채취및분리축산과학원에서사육되고있는돼지 (5~8 주령 ) 의골수조직대퇴부에서주사기 (18G) 를이용하여돼지골수를채취하였고, Ficoll paque TM plus (Lymphocyte isolation, 0.12EU/ml; Amershem bioscience, Sweden) 로 density gradient centrifugation 하여돼지조혈줄기세포분획을

3 돼지조혈세포의신생이종마우스생체이식 3 분리하였다. 분리된돼지조혈줄기세포는 PBS (Phosphate buffer saline) 에 2% FBS (Fetal bovine serum) 이포함된용액으로 2 번세척한후 PBS 용액에부유하여 NOD/SCID 마우스이종생체이식용세포로사용하였다. 마우스복강에의이종이식 NOD/SCID 마우스를 Male 과 Female 을교배하여임신을유도하였고, 20 일간의임신기간을거쳐신생 NOD/ SCID 마우스를얻었다. 돼지골수조혈세포의복강주입을위해서신생 NOD/SCID 마우스를얼음에올려순간마취를실시하였다. 돼지골수조혈줄기세포를 20μl 의 PBS 에부유하고, 주사기 (Ultra fine needle, BD insulin syringe, USA) 를이용하여신생 NOD/SCID 마우스한마리당 의돼지조혈줄기세포를복강에이식하였다. 돼지조혈세포생착분석을위한항체면역염색돼지조혈줄기세포를이식한신생 NOD/SCID 마우스생체조혈조직내에서의돼지조혈세포의생착및분화특성을분석하기위한돼지조혈세포특이적인항체는 BD bioscience, Serotec 으로부터구입하여사용하였다. 돼지 T 면역세포특이적인항체인 anti porcine 항체인 CD3e (fluorescein isothiocyanate(fitc) conjugated, BD PharmigenTM), pcd45 (fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated, Serotec), pcd4a (phycoerythrin (PE) conjugated, BD Pharmigen TM ), pcd8a (phycoerythrin (PE) conjugated, BD Pharmigen TM ), pcd14 (phycoerythrin (PE) conjugated, Serotec) 를이용해면역염색을실시하고, 유세포분석기인 FACSvantageSE(BD) 로세포의증식과분화특성을분석하였다. 유세포분석을통한돼지면역세포생착능력검증돼지골수유래조혈세포생체이식신생 NOD SCID 마우스를이식 5 주후에이식마우스의말초혈액을채취, 적혈구 lysis 용액을이용하여적혈구세포를제거한후단핵구세포만을분리하였다. NOD/SCID 마우스의조혈조직에서의돼지면역세포의증식능력분석을위하여이식후 5 주에마우스를도살하여마우스의간장 (liver), 비장 (spleen), 흉선 (thymus), 골수 (BM) 조직을채취하여 mesh 를이용하여 single cells 을준비하였다. 혈액및조직에서채취된단핵구세포는항체면역염색용액인 (PBScontaining 2% FBS, 0.05% NaN 2) 에부유하여 nylon filter 를통과시켜서 debris 를제거하였다 의세포를돼지면역세포특이항체로면역염색을실시한후에 4 C 의암실에서 30 분간반응시킨후 staining solution 으로두번세척하여세포와결합하지않은항체를제거하였다. 돼지조혈세포의마우스조혈조직에서의키메리즘분석은유세포분석기인 FACS vantage SE(Becton Dickinson, CA) 를이용하여분석하였다. 결과 돼지골수조혈줄기세포이식마우스말초혈액내돼지조혈세포증식 Fig. 1. Determination of porcine hematopoietic cells in peripheral blood of NOD/SCID mice. Cells from peripheral blood in NOD/ SCID mice inoculated with porcine bone marrow hematopoietic stem/progenitor cells was harvested at 5 weeks from intraperitoneal injection. The percentage of porcine hematopoietic cells in peripheral blood was indicated with dot blot of flow cytometry analysis, implied the engraftment of porcine mononuclear cells(pcd45 + ) and T lymphoyctes(pcd4,8 + ). The chimerism of porcine hematopoietic cells, myeloid cells(pcd14 + ) and T lymphocytes(pcd4,8 + ), in peripheral blood was demonstrated. 돼지골수에서채취하여분리한조혈줄기세포를교배를통하여분만된생후 1 주령미만의 NOD/SCID 동물모델에복강에 의세포를이식하였다. 이종돼지골수조혈세포의생체이식에따른마우스조혈조직에서의증식과분화특성을분석하기위해서, 복강이식 5 주후에마우스의말초혈액을채취하고, 돼지혈액세포특이적항체인 pcd45 항체와 T 림파구세포특이적항체인 pcd3, pcd4,8 항체, 골수계세포특이항체인 pcd14 로면역염색을실시하여유세포분석을실시하였다. 유세포분석결과, Fig. 1 에서 NOD/SCID 마우스혈액내돼지조혈세포마커인 pcd45 양성의세포가 0.64±0.39% 의비율로존재하였으며, 이중 pcd4, pcd8 양성돼지 T 면역세포는 0.3±0.08% 의증식능력이관찰되었다. 반면, 돼지골수구계세포인 pcd14 양성세포는 0.02±0.01% 의매우낮은증식능력이관찰되었다. 마우스골수조직조혈환경에서의돼지면역세포의증식조혈줄기세포의자기복제와다분화능력을유지하고있는기관인골수조직에서이식된돼지골수조혈줄기세포의키메리즘과분화특성을분석한결과, 조혈세포마커인 pcd45 양성세포와 T 림파구세포인 pcd3 양성의세포가존재하고있다는사실이밝혀졌다. 특히골수조직에서 2.3±0.9% 의 pcd3 양성림파구세포의키메리즘을나타내었으며, 돼지조력세포마커인 pcd4 양성과세포독성 T 세포마커 pcd8 양성의세포가 0.7±0.4% 존재하고있었다. 그에반해골수구계세포는 0.1±0.1% 의낮은키메리즘이관찰되었다 (Fig. 2). 이결과로 NOD/SCID 마우스골수조혈환경은돼지골수구계세포의증식및분화보다는림파구세포의증식과분화에는적합한환경이라는사실을시사해주고있다. 이종마우스조혈조직에서의돼지조혈세포분화특성분석골수에서유래된면역세포전구세포는흉선조직에서 T 림파구세포로분화발달되어 2 차면역기관인비장조직으로이동한다. 돼지조혈줄기세포생체이식마우스

After 5 weeks from injection, bone marrow was analyzed the efficiency of engraftment of procine hematopoietic cells with indicated porcine hematopoietic specific antibodies.

4 4 이용수등 Fig. 2. Engraftment of porcine hematopoietic cells in bone marrow of NOD/SCID mice. NOD/SCID mcie was transplanted with porcine bone marrow hematopoietic stem/progenitor cells by intraperiponeral injection. After 5 weeks from injection, bone marrow was analyzed the efficiency of engraftment of procine hematopoietic cells with indicated porcine hematopoietic specific antibodies. Flow cytometry analysis from bone marrow was showed the engraftment of porcine T lymphocytes and myeloid cells. The percentage of chimerism of porcine myeloid cells and T lymphocytes in bone marrow of NOD/SCID mice was calculated and demonstrated. 에서의 T 면역세포의발달과정을조사하기위해서흉선조직을채취하여돼지의 T 면역세포의증식특성을분석하였다. 유세포분석기를통하여마우스흉선조직을분석한결과, pcd3 양성의돼지 T 면역세포가 1.5±1.3% 의비율로존재하고있었으며, pcd4,8 양성의 T 면역세포가 1.9±1.7% 의비율로존재하고있었고, 0.3±0.1% 의 pcd14 양성골수구계세포가관찰되었다 (Fig. 3). 또한, 대표적인 2 차면역기관인비장조직을상기와동일한방법으로분석한결과, pcd3 양성 T 면역세포가 5.6±3.0% 관찰되었고, pcd4 양성 pcd8 양성 T 면역세포가 0.8±0.5% 의비율로존재하고있다는사실이밝혀졌다 (Fig. 4). 돼지골수조혈줄기세포의 NOD/SCID 마우스간장조직에서의키메리즘을유세포분석기를통하여분석한결과, 돼지 T 면역세포인 pcd3 양성세포가 15.6±3.7% 의높은비율의키메리즘이관찰되었으며, 돼지 pcd4,8 T 면역세포는 7.3±3.9% 의분화능력이관찰되었다. 그에반해서 pcd14 양성골수구계세포는 1±0.7% 의낮은키메리즘을나타내었다 (Fig. 5). 이결과로돼지면역세포가골수조직에서와동일하게골수구계의세포의분화에비해서림파 Fig. 3. Porcine T lymphocytes development in thymus of NOD/ SCID mice. Thymocytes from NOD/SCID mice injected with porcine bone marrow hematopoietic stem/progenitor cells was harvested for analysis of chimerism of porcine hematopoietic cells. Flow cytometry profiles and percentage of chimerism in thymus of NOD/SCID mice was demonstrated. 구세포의분화에적합한조혈환경을지지하고있다는사실이밝혀졌다. 특히골수조직에비해서현저히높은키메리즘을나타내었으며, 이러한결과로골수조직에비해서림파구세포의분화및증식에간장조직에서분비되는다양한조혈인자가돼지의면역세포분화를위해서는충분한역할을지니고있다는사실을증명해주고있다. 이종마우스조혈조직에서의돼지 T 면역세포의분화특성 T 면역세포는골수에서존재하는조혈줄기세포로부터분화된림파구전구세포가흉선조직으로이동하여다양한발달단계를거치면서성숙한 T 림파구세포로분화발달된다. 마우스말초혈액을비롯한골수, 비장, 간장, 림파절조직에서돼지조혈세포의키메리즘을유세포분석으로확인하였다. 돼지골수조혈줄기세포의복강이식 NOD/SCID 마우스의각조혈조직에서의 T 림파구세포의증식과분화를분석하였다. 이식 5 주후마우스간장, 비장, 흉선, 골수조직을채취하여돼지림파구계특이항체인 pcd3 로면역염색을실시한후유세포분석기로분석한결과, 간장에서 15.7±3.7% 의가장높은돼지 T 림파구세포의생착이관찰되었다. 또한, 비장에서 5.6± 3%, 흉선에서 1.5±1.3%, 골수에서는 2.3±0.9% 의돼지조혈세포의증식능력이관찰되었다 (Fig. 6).

The engraftment of porcine myeloid cells(pcd14 + ) and T lymphocytes(pcd3 + and pcd4,cd8 + ) was demonstrated in splenocytes of NOD/SCID mice. Fig. 5.

5 돼지조혈세포의신생이종마우스생체이식 5 Fig. 4. Flow cytometry analysis of porcine hematopoietic cells in spleen. Flow cytometry profiles indicated the engraftment of porcine myeloid cells and T lymphoyctes in splenocytes of NOD/ SCID mice. The engraftment of porcine myeloid cells(pcd14 + ) and T lymphocytes(pcd3 + and pcd4,cd8 + ) was demonstrated in splenocytes of NOD/SCID mice. Fig. 5. Efficient engraftment of porcine hematopoietic cells in liver. Data from flow cytometry analysis was showed the presence of porcine myeloid cells and T lymphocytes in liver of NOD/SCID mice. The percentage of porcine myeloid cells and T lymphocytes in liver of NOD/SCID mice was demonstrated. 고찰 본연구는돼지의골수에서존재하고있는조혈줄기세포의분획을분리하여이종동물모델인마우스에생체이식을실시함으로써이종골수이식키메리즘의형성능력을검증함과동시에돼지골수존재조혈줄기세포의성숙한조혈세포로의분화및증식특성을이종동물모델생체에서분석하기위해서연구를실시하였다. 본연구에사용된 NOD/SCID 마우스는이종세포및조직이식시유발되는면역거부반응에관여하고있는 T 면역세포와 B 면역세포가선천적유전자결핍으로인하여존재하고있지않으며, 또한비특이적면역거부반응에관여하고있는마크로파지와 NK 세포및보체의기능도정상마우스에비해서매우낮은특성을지니고있다 (Peled 등, 1999). 최근에는 NK 세포가이종세포및조직이식시의거부반응에깊이관여하고있다는사실이밝혀져 NOD/ CID 마우스모델보다더욱진보된 NOD/ SCID β2 microglobulin null 과 NOD/SCID/IL2 receptor γ null 형질전환면역결핍마우스가제작되어보고되었으며, 실질적인이종세포생체이식실험결과약 2 배이 Fig. 6. Engraftment of porcine T lymphocytes in hematopoietic organs. Cells was obtained from indicated organs from NOD/SCID mice injected with porcine bone marrow hematopoietic cells to analyze the engraftment efficiency at 5 weeks from injection. The chimerism of T lymphocytes in NOD/SCID mice was determined with flow cytometry analysis. 상의높은이종세포생착능력을나타내었다 (Ishikawa 등, 2002; Shultz 등, 2005). 현재알려진대표적인인간조

6 6 이용수등 혈줄기세포의마커는 CD34 + CD38 집단을가리켜조혈줄기세포라고일컬어지며, 이마커를이용한분리를통하여많은인간조혈줄기세포의분화및증식에관하여많은연구가진행되었다 (Christopher 등, 2002). 또한, 생체이식방법으로서인간제대혈유래조혈줄기세포인 CD34 + 양성세포를분리하여신생아 NOD/SCID/IL2 receptor γ null 이나 NOD/CID β2 microglobulin null 마우스에주입한결과 20% 이상의높은인간 T 면역세포의증식및분화가관찰되어성체의마우스에비해서신생마우스의조혈조직이조혈줄기세포에서면역세포의분화에적합한환경을제시해주고있다는사실이밝혀졌다 (Ishikawa 등, 2002; Ishikawa 등, 2005). 본연구팀은돼지골수유래조혈줄기세포를성체의 NOD/SCID 마우스모델에골수이식방법을통하여세포이식을실시하였다. 현재돼지조혈줄기세포의연구가부족하여조혈줄기세포의마커가발견되어지지않았으며, 골수에돼지조혈줄기세포가존재하기때문에골수조혈세포를이식하였다. 그결과, 골수에서 5.4±1.9%, 비장에서 15.4±7.3%, 간장에서 21.3±1.4% 의비율로돼지의 T 면역세포가존재한다는연구결과를발표하였다 (Lee 등, 2007). 신생 NOD/SCID 마우스복강조직에의돼지골수조혈줄기세포의생체이식실험에서도유사한조혈조직특이적인키메리즘양상이관찰되었으며, 특히간장조직에서다른조직에비해서가장높은키메리즘을나타내었다. 이러한결과는골수조직에의직접이식법과복강주입을통한이식방법상의조혈조직특이적증식에는영향이없다는사실을알수있었으며, 또한성체 NOD/SCID 마우스와신생 NOD/SCID 마우스의조혈환경에의한돼지의골수조혈세포의분화및증식유지기전에는특이적인차이점이관찰되지않았다. 또한, 골수구세포인 pcd14 양성세포는신생마우스복강이식을통해서도매우낮은분화특성을나타내어성체마우스생체이식과유사한결과를얻었다. 이는마우스조혈환경은돼지조혈줄기세포에서골수구계세포로의분화및증식에충분하지못하다는사실을시사해주고있다. 조혈줄기세포를이용해골수구계세포의분화유도증진을위해서는 GM CSF 와 IL 3 와같은골수구계세포분화조절인자및유전자도입등의방법이고려되어야할것으로사료된다. 본연구는돼지조혈줄기세포와같은이종동물모델에의생체이식을통한높은키메리즘유도의방법으로서신생 NOD/SCID 마우스를이용한이종조혈세포이식을실시하였다. 상기의다양한조혈조직분석결과, 신생 NOD/SCID 마우스에의생체이식을통하여돼지 T 면역세포가특이적으로매우높은키메리즘을형성하며분화발달되었으며, 이러한연구결과를바탕으로돼지 T 면역세포로의분화연구에좋은모델이될것으로사료된다. 인용문헌 1. Bhatia M, Bonnet D, Murdoch B, Olga I, John E (1998): A newly discovered class of human hematopoietic cells with SCID repopulating activity. Nature Medicine 4: Christopher J, Hogan, Elizabeth J, Shpall, Gordon K (2002): Differential long term and multilineage engraftment potential from subfractions of human CD 34 + cord blood cells transplanted into NOD/SCID mice. PNAS 99: Ishikawa F, Livingston AG, Wingard, JR, Nishikawa S, Ogawa M (2002): An assay for long term engrafting human hematopoietic cells based on newborn NOD/SCID/beta2 microglobulin(null) mice. Exp Hematol 30: Ishikawa F, Yasukawa M, Lyons B, Yoshida S, Miyamoto T, Yoshimoto G, Watanabe T, Akashi T, Shultz LD, Harada M (2005): Development of functional human blood and immune systems in NOD/ SCID/IL2 receptor γ chainnull mice. Blood 106: Jean CY, Wang, Doedens M, John ED (1997): Primitive human hematopoietic cells are enriched in cord blood compared with adult bone marrow or mobilized peripheral blood as measured by the quantitative in vivo SCID repopulating cell assay. Blood 99: Kamal Reid S, Dick JE (1988): Engraftment of immuno deficient mice with human hematopoietic stem cells. Science 242: Keller G, Snodgrass R (1990): Life span of multipotential hematopoietic stem cells in vivo. J Exp Med 171: Larochelle A, Vormoor J, Hanenberg H, Wang JC, Bhatia M, Lapidot T, Moritz T, Murdoch B, Xiao XL, Kato I, Williams DA, Dick JE (1996): Identification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating NOD/SCID mouse bone marrow: implications for gene therapy. Nat Med 2: Lee YS, Kim TS, Kim JH, Chung HJ, Park JK, Chang WK, Kim DK (2007): Differentiation and proliferation of porcine T lymphocytes in NOD/SCID mice. Reprod Dev Biol 31: Morrison SJ, Uchida N, Weissman IL (1995): The biology of hematopoietic stem cells. Annu Rev Cell Dev Biol 11: Nakahata T, Ogawa M (1982): Hemopoietic colonyforming cells in umbilical cord blood with extensive capability to generate mono and multipotential hemopoietic progenitors. J Clin Invest 70: Peled A, Petit I, Kollet O, Magid M, Ponomaryov T, Byk T, Nagler A, Ben Hur H, Many A, Shultz L, Lider O, Alon R, Zipori D, Lapidot T (1999): Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science 283: Shultz LD, Lyons BL, Burzenski LM, Gott B, Chen X, Chaleff S, Kotb M, Gillies SD, King M, Mangada J, Greiner DL, Handgretinger R (2005):

7 돼지조혈세포의신생이종마우스생체이식 7 Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol 174: Shultz LD, Schweitzer PA, Christianson SW, Gott B, Schweitzer IB, Tennent B, McKenna S, Mobraaten L, Rajan TV, Greiner DL (1995): Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz scid mice. J Immunol 154: Sutherland HJ, Eaves CJ, Eaves AC, Dragowska W, Lansdorp PM (1989): Characterization and partial purification of human marrow cells capable of initiating long term hematopoiesis in vitro. Blood 74: Yahata T, Ando K, Sato T, Miyatake H, Nakamura Y, Muguruma Y, Kato S, Hotta T (2003): A highly sensitive strategy for SCID repopulating cell assay by direct injection of primitive human hematopoietic cells into NOD/SCID mice bone marrow. Blood 101: ( 접수일자 : / 채택일자 : )

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Kaes010.hwp 갑상선자극호르몬이갑상선암세포의 VEGF, 신생혈관형성, 성장, 침윤및전이에미치는영향 Effects of TSH on the Production of VEGF, Angiogenesis, Growth, Invasion and Metastasis in Thyroid Cancer Cells Euy Young Soh, M.D., Hee Boong Park, M.D.,