Journal of Breast Cancer ISSN J Breast Cancer 2007; March 10 (1): ORIGINAL ARTICLE 유방의침윤성관암에서의현미부수체불안정성 정덕현ㆍ정진철ㆍ박찬흔ㆍ권미정 1 ㆍ조성진 1 ㆍ남은숙

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1 Journal of Breast Cancer ISSN J Breast Cancer 2007; March 10 (1): ORIGINAL ARTICLE 유방의침윤성관암에서의현미부수체불안정성 정덕현ㆍ정진철ㆍ박찬흔ㆍ권미정 1 ㆍ조성진 1 ㆍ남은숙 1 ㆍ신형식 1 ㆍ김관석 2 한림대학교의과대학외과학교실, 1 병리학교실, 2 김관석의원 Microsatellite Instability in Invasive Ductal Carcinomas Duck Hyoun Jeong, Jin Cheol Jeong, Chan Heun Park, Mi Jung Kwon 1, Seong Jin Cho 1, Eun Sook Nam 1, Hyung Sik Shin 1, Kwan Seok Kim 2 Departments of Surgery and 1 Pathology, Hallym University College of Medicine, Seoul; 2 Dr. Kim s Clinic, Seoul, Korea Purpose: Breast cancer shows various molecular and genetic alterations in its development and progression. Microsatellite alterations, and especially microsatellite instability (MSI) and loss of heterozygosity (LOH), have recently been postulated as a novel mechanism of carcinogenesis and as a useful prognostic factor for several gastrointestinal malignancies. LOH is related to the allelic loss of various tumor suppressor genes; however, MSI has been found to be the result of an erroneous DNA mismatch repair system and this has been known to be involved in the carcinogenesis of the hereditary non-polyposis colon cancers and some portion of the sporadic colorectal or gastric cancers. Yet MSI has rarely been studied in invasive ductal carcinoma. Our objectives were to evaluate the MSI and p53 protein expression in invasive ductal carcinomas and to correlate this with various clinicopathological factors. Methods: The MSI analysis was performed by using polymerase chain reaction with five polymorphic microsatellite markers (the BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 and D17S250 loci as recommended by the 1998 NCI International Workshop on Microsatellite Instabilitis and RER phenotypes) in 50 surgically resected tumors and each of their non-tumorous counterpart. The p53 protein expression was studied using immunohistochemistry. Results: MSI and a p53 protein expression were detected in 22% and 54% of the tumors and non-tumorous tissues, respectively. MSI was more frequently detected in tumor grade I, T-stage I, non-metastatic tumor and tumor stage I. Also there were rare cases showing a high grade and stage with metastasis in the MSI-high group, in which more than 3 microsatellite loci had MSI. The p53 expression results correlated well with a higher tumor grade. Correlation between MSI and the p53 expression was not found. Conclusion: These results may suggest that MSI may be involved in some portions in mammary carcinogenesis and tumor invasion. Also the clinical use of the MSI status may help to determine a better prognosis among invasive ductal cancer patients. (J Breast Cancer 2007;10:77-84) Key Words : Invasive ductal carcinoma, p53, MSI, Immunohistochemistry 중심단어 : 침윤성유방암, p53, 현미부수체불안정성, 면역조직화학 서 국내외적으로암의조기검진에대한일반인들의인식과암질환진료의의료수준이선진화되었음에도불구하고여전히암발생률과암사망률은감소하지않고있다. 21 세기들어국내암통 론 책임저자 : 박찬흔 서울시강동구길 1 동 445, 한림대학교강동성심병원외과 Tel: , Fax: hhh@hallym.or.kr 접수일 : 2007 년 1 월 24 일게제승인일 : 2007 년 3 월 7 일 계에서유방암이국민의 5대암군에진입하였고여성에서제일높은발생률을보임에따라유방암환자들에대한새로운차원의진단과진료가요구되고있다.(1) 특히유방암은국민보건상매우중요하게강조되어와서조기발견을위한다양한이학적검사기법, 세포병리진단및영상진단을적극적으로실시하고는있지만암종으로진단될때에는상당히진행된채로발견되는경우가대부분이다.(2, 3) 따라서유방암의종양생물학적성상과발암, 진행기전에대한분자생물학적연구는매우중요하다고할수있다. 일반적으로유방암의분자적발생기전도위, 장관종양을비롯 77

2 78 Duck Hyoun Jeong, et al. 한주요장기의암종같이복수의유전자이상이한종양세포내에서종양의진행단계에따라차례로축적되는것으로알려져있다. 그러나유방암은전암병변, 상피내암, 초기암, 진행성암으로이어지는이른바다단계발암기전이제시되지못하고있다. 최근종양분자생물학의연구추세는다양한암유전자, 암억제유전자의단순한돌연변이개념을넘어서새로운작용기전을모색하며발전하고있다. 이중암억제유전자의불활성화기전에서방대한규모의 microsatellite ( 현미부수체 ) 에서의결손이중요하게작용하는대립유전자의이형접합소실 (loss of heterozygosity, LOH) 은이미중요한발암기전으로인정되었고그결손정도와임상특성과의연관성에대해많은연구가이루어져왔다. 한편, LOH 처럼현미부수체에서변이가일어나지만변이기전이복제오류교정유전자 (mismatch repair gene) 들이관여하는것이며, 변이양상은이들유전자들의증폭이일어나는새로운기전으로서현미부수체불안정성 (microsatellite instability, MSI) 이최근 10 년간연구되어왔다.(4-9) MSI 는원래유전성비용종성대장암의주요발암기전으로알려진것이지만 (10, 11) 단일대장암, 위암및다양한장기의산발성 (sporadic) 암종의일부에서도 MSI 가발암기전으로작용한다고보고되고있다.(12-15) 게다가 MSI 는임상적으로도중요하여그검사기법이국내에서보험급여항목으로인정되고있지만국내적으로는 MSI 기전에대한연구는드문실정이며, 외국에서도 MSI 가유방암에서어떤양상으로발암기전에작용하는지, 그리고임상및병리학적으로는어떤특성을갖는지에대해아직확실히밝혀진바는없으며의외로그에대한연구가드물다. 이에본연구에서는유방의침윤성관암에서 MSI 를연구하고자하며, 또한 MSI 같은새로운기전을평가하는데이해를돕기위해기존에유방암에서많은연구가이루어지고예후인자들과의연관성이비교적잘규명된객관적인종양생물학적인자의발현을동시에실험하여단순비교하는것이의의가있다고판단하였다. 이에거의모든장기에서종양의악성화와종양의진행성성장에관여하는것으로잘알려진 p53 유전자의단백발현도동시에연구하고침윤성관암의임상적특성및중요예후인자와의연관성을분석하고자하였다.(16, 17) 방법 1. 연구대상한림대학교의료원에서 1999년 1월부터 2003년 1월까지유방의침윤성관암으로진단받고유방절제술및액와림프절청소술을시행한증례중수술전항암화학요법을받지않았으며환자의임상기록이잘보관되어있고임상추적기록과파라핀블록상 태가양호한 50 예를연구대상으로하였으며, 모든증례들은수술전날에연구목적으로의조직사용에동의한증례들이었다. 한편, 이들환자들의적출된유방조직중정상부분 50예는 MSI 실험기법에서 정상대조군 으로사용되었으며이정상대조군중20 예에서비종양대조군에대한결과를얻었다. 2. 연구방법 1) 병리조직학적검색모든검체는 10% 중성포르말린에양호하게고정된후통상병리진단을위한처리과정을거친파라핀포매조직을이용하였으며각예에서암종과비암종부위가포함된파라핀블록을선택하여 hematoxylin and eosin 염색을시행하였다. 50 예의침윤성관암증례들은광학현미경으로조직학적등급을 Bloom과 Richardson 체계의변형인 Nottingham 방법 (21) 에따라세등급으로재분류하였으며, 종양의크기는 2 cm 이하인예를 T1, 2 cm 보다크고 5 cm 이하인경우를 T2, 5 cm 보다큰경우를 T3으로구분하였다. 2) 5가지현미부수체표식자의 MSI 분석 DNA 는모두파라핀블록에서획득하였으며, 각예당유방의침윤성관암조직과정상조직등2개의파라핀포매조직을 6 m 두께의연속절편으로만들어파라핀을제거한후 H&E 염색을매우약하게한후, 슬라이드를 2% 글리세롤용액에 2분간담가두었다가광학현미경하에서관찰하면서미세절제기를이용하여슬라이드상의순수암종과비암종을조직을 1 ml 주사기바늘로긁어내고각각 DNA 추출완충액 (100 mm Tris-HCl, ph 8.0; 1% Tween 20, 0.1 mg/ml proteinase K) 이들어있는 1.5 ml eppendorf tube에넣었다. 이때슬라이드가바뀔때마다조직이서로오염되지않도록알코올솜으로충분히칼을닦아냈으며, 증례가바뀔때마다오염을방지하기위해새로운칼을사용하였다. 그후 eppendorf tube는 2일간 52 수조에두었다. 그후시료는끓는물에 10 분간방치하여 proteinase K의반응을불활성화시킨후, 분광광도계로 DNA 농도를측정한다음 -20 에서냉장보관하면서이중용액 1 L를중합효소연쇄반응 (PCR) 증폭시주형 DNA 로사용하였다. MSI 를검출하기위해분석하려는 5가지염색체의현미부수체표식자는 1997년 NIH International workshop에서권고한 BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, D17S250 등 5가지이며그시발체는 GIBCO사 (Carlsbad, CA, USA) 에서제작된것을사용하였고, 염기서열은 Table 1과같다. 그리고암종, 비암종부위에서추출한 DNA 를주형으로각각 PCR 을시행하였다. 우선종양부위와정상부위에서추출한 DNA 를주형으로하여각

3 MSI in Invasive Ductal Carcinoma 79 Table 1. DNA sequences of 5 microsatellites in MSI study BAT25 BAT26 D2S123 D5S346 D17S250 (f) 5 -TCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3 (r) 5 -TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3 (f) 5 -TGACTACTTTTGACTTCAGCC-3 (r) 5 -AACCATTCAACATTTTTAACCC-3 (f) 5 -AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3 (r) 5 -GGACTTTCCACCTATGGGAC-3 (f) 5 -ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3 (r) 5 -AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT-3 (f) 5 -GGAAGAATCAAATAGACAAT-3 (r) 5 -GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3 각 PCR 을시행하였으며, 각각의 PCR 용액은주형 DNA 1 L, 0.2 mm dntp, 10 buffer, 10 pmol/ L primer, 1U Taq polymerase에증류수를가하여 12 L 로되게하였고, PCR 은각표본에대하여 35 내지 40 주기를반복실시하였다. 모든중합효소연쇄반응은 thermal cycler (Perkin Elmer Cetus 9700, PerkinElmer Inc., MA, USA) 에서시행하였다. 기본적으로는각주기당변성반응은 94 에서 30 초, 결합반응은 에서 30 초, 연장반응은 72 에서 40 초씩시행하고마지막주기의연장반응은 72 에서 10 분간반응시키고, 증폭된 PCR 산물 3 L 를 2% agarose gel 전기영동으로확인하였다. 이후 3 L의 PCR 산물과 formamide loading dye (95% formamide, 20 mm EDTA, 10 mm NaOH, 0.05% bromphenol blue, 0.05% xylene cyanol) 3 L를취해 98 에서 5분간끓여변성시킨후, 얼음으로급히냉각시킨다음 3 L를취해전기영동에사용하였다. 전기영동을 1,400 V에서 1시간반동안시행한후 gel 을은염색하였다. 은염색은 binding solution 에의해 gel 이붙어있는유리판쪽을그대로염색용기에서 10% acetic acid로 30 분간고정시킨후, 증류수로 3분씩 2회반복하여세척하고, silver nitrate 용액에서 30 분간반응시킨다음증류수에서신속히세척을한후, sodium carbonate 용액에서띠가뚜렷이보일때까지발색시킨후, 앞과정에서사용한고정액 10% acetic acid를혼합하여반응을중지시킨후띠의소실여부를관찰하였다. 된단클론성의 1차 p53 항체 (DO-7, Novocastra, UK) 를상온에서 2시간반응시킨후 PBS 액으로세척하였다. 2차항체인 biotinylated link antibody (LSAB kit, DAKO, Carpinteria, CA, USA) 와 20분간반응시킨후 PBS로세척하였다. Streptavidin (Zymed, CA, USA) 과 peroxidase가결합된용액에 30분간반응시키고, 이후발색반응은 3,3-diaminobenzidine tetrachloride (DAB) (Sigma, Korea) 로발색시킨다음 Meyer s hematoxylin으로대조염색후흐르는물에세척하여실온에건조시킨후봉입하였다. 4) 결과판정과통계처리 (1) MSI 판정 MSI 판정은 gel 상의띠 (band) 를밀도측정기를이용하여측정하고정상조직에비해추가띠가생긴경우는 MSI 로판정하였고, MSI 의경우 3개이상의표지자에서검출되면 MSI-High군으로분류하였다. 실험결과중동형접합성을보이는경우와종양세포와대조군세포중어느하나에서라도 PCR 이되지않아유전자변이를확인할수없는경우 (non-informative) 는결과분석에서제외시켰다. (2) 면역조직화학염색판정 p53 단백발현판정은광학현미경 400 배고배율하에서실시하였다. 종양세포의핵이진한적갈색으로염색되는경우로서세포의수를세어백분율을구했고, 5% 이상의염색을보일경우그리고대조군인정상관상피에서발현이없을경우양성으로판정하였다. (3) 통계학적분석각증례의각 microsatellite 표식자에대한 MSI 의빈도와 p53 단백발현결과등과제반임상병리학적소견및예후인자들과의상관관계를 Chi-square 검정을이용하여구하였으며, p 값이 0.05 미만인것을통계적으로유의한것으로판정하였다. 3) p53 단백에대한면역조직화학염색 10% 중성포르말린고정과파라핀포매를거친조직을 4 m 두께로연속절편을만들어 100% xylene으로 3-5분간탈파라핀하고, 증류수로함수시킨후 p53 단백에대하여면역조직화학적염색을시행하였다. 이들단백에대한면역조직화학적염색은단백의항원성을유지하기위해 pressure cooker를이용하였고끓는 phosphate buffered saline (PBS) 에 5분간처리하였다. 4 의 PBS에다시 5분간처리한후, 내인성 peroxidase의활성을억제하기위해 3% 의과산화수소를도포한후, 1:100으로희석 결과 1. 임상정보및조직학적소견대상환자들총 50 예의연령분포는 29 세부터 67 세까지였고평균연령은 44.5세였다. 종양의크기는 2 cm 이하인 T1 등급이 14예 (28%), 5 cm 이하인 T2 등급이 20예 (40%), 5 cm 보다큰 T3 등급이 16 예 (32%) 이었다. 조직학적분화도는 Nottingham I 등급이 10예 (20%), II 등급이 25 예 (50%), III 등급이 15 예 (30%) 이었다. 림프절전이가있었던예는 23예 (46%) 이었고, 전이가없었

4 80 Duck Hyoun Jeong, et al. 던예는 27 예 (54%) 이었다. 병기별로는 I기가 13 예 (26%), II 기는 25예 (50%), III기는 12 예 (24%) 이었다 (Table 2). 2. MSI 검출과 p53 단백발현양상 침윤성관암에서 MSI 를보인증례는총 11 예 (22%) 이었다. BA- T25, BAT26, D2S123, D5S346, D17S250 표식자의분석에서유전자변이를확인할수있는 (informative) 증례는각표식자당 39예, 41예, 36예, 35 예, 32예이었고그중각각 8예 (20.5%), 7 예 (17.1%), 4예 (11.1%), 6예 (17.1%), 4예 (12.5%) 에서 MSI를보였으며, 5개의표식자중 BAT25 표식자에서 MSI 검출률이 20.5% 로가장높았으며, D2S123에서 11.1% 로 MSI 검출률이가장낮았다. 5가지표식자중최소 3개이상의 MSI를보인 MSI-high군의증례는총 4예 (8%) 이었다. 한편, 정상대조군조직에서는 MSI 가검출되지않았다 (Fig 1, Table 3). 따라서 5가지 microsatellite에서의 MSI는암종에서만유의하게검출되었다 (p=0.020). N T N T Fig 1. Representative MSI pattern of BAT25 (left) and D17S250 (right) markers in invasive ductal carcinoma. Each T lane shows mid-lower band gain. N=normal; T=Tumor. Table 2. Clinicopathologic findings of 50 invasive ductal carcinomas Clinicopathologic parameters Number of case (%) Age Below 35 9 (18) Above (82) Grade I 10 (20) II 25 (50) III 15 (30) Size 2 cm 14 (28) 2-5 cm 20 (40) >5 cm 16 (32) LN metastasis Positive 23 (46) Negative 27 (54) Stage I 13 (26) II 25 (50) III 12 (24) 한편, 면역조직화학적방법에의해서검출된 p53 단백발현은종양세포에서는모두세포의핵에서양성으로염색되었고, 비종양부분과주변간질세포및혈관등에서는전혀염색성을보이지않았다. p53 단백은총 27 예 (54%) 에서발현되었으며, 암종에서만특이적으로발현이관찰되었다 (p=0.001) (Fig 2, Table 3). 3. MSI 검출과임상병리학적인자와의상관관계 MSI 검출률은 35 세를기준으로구분할경우연령에따른유의성있는차이는없었다. 종양의분화도에따른 MSI 검출률은 I 등급증례 10예중 4예 (40.0%), II 등급 25예중 6예 (24.0%), III 등급 15 예중 1예 (6.7 %) 로서분화도와 MSI 검출률간에는유의한역상관관계가있었다 (p=0.033). 종양의크기에따른 MSI 검출률은 T1군에서 5예 (35.7%), T2군에서 4예 (20.0%), T3군에서 2예 (12.5%) 로서 T3 군에서 MSI 검출률이낮은경향을보였으나유의성은없었다. 림프절전이에따른 MSI 검출률은전이성암종에서 4예 (17.4%), 비전이성암종에서 7예 (25.9%) 로서전이성인경우 MSI 검출률이낮은경향을보였으나유의성있는차이는없었다. 병기에따른 MSI 검출률은 I기 13 예중 5예 (38.5%), II 기 25 예중 4예 (16.0%), III기 12 예중 2예 (16.7%) 로서병기별로 MSI 검출률의차이는없었지만, 병기 I기와 II+III기로구분하면병기 I기에서유의성있게높은검출률을보였다 (p=0.038). Table 3. p53 protein expression and MSI detection rate according to the clinicopathological factors (%) Total p53 Protein (%) MSI (%) Tumor vs. Normal Tumor (54) 11 (22) Normal 20 0 (0) 0 (0) Age Below 35 9 Above Tumor grade I 10 3 (30.0) 4 (40.0) II (52.0) 6 (24.0) III (73.3) 1 (6.7) Tumor size Below 2 cm 14 8 (57.1) 5 (35.7) 2-5 cm 20 9 (45.0) 4 (20.0) Above 5 cm (62.5) 2 (12.5) LN Metastasis (-) (44.4) 7 (25.9) (+) (65.2) 4 (17.4) Tumor stage I 13 8 (61.5) 5 (38.5) II 25 9 (45.0) 4 (16.0) III (83.3) 2 (16.7) MSI=microsatellite instability; LN=lymph node.

MSI in Invasive Ductal Carcinoma 81 Table 4. Correlation between MSI & p53 protein expression p53 protein expression (+) (-) MSI (+) 14 8 MSI (-) 40 38 고 찰 Fig 2.

5 MSI in Invasive Ductal Carcinoma 81 Table 4. Correlation between MSI & p53 protein expression p53 protein expression (+) (-) MSI (+) 14 8 MSI (-) 고 찰 Fig 2. On immunohistochemical stain for p53, the tumor cells of invasive ductal carcinoma show strong nuclear expression. 한편, MSI-high군 4예를별도로분석하면종양의분화등급 III 등급의증례는없었으며, T1 군이 3예이었고, 병기 I기군이 3 예, 비전이성인경우 3예이었으나, 통계적유의성은없었다. 4. p53 단백발현과임상병리학적인자와의상관관계 p53 단백발현은 35세를기준으로구분할경우연령에따른유의성있는차이는없었다. 종양의분화도에따른 p53 단백은 I 등급증례중 3예 (30.0%), II 등급에서 13 예 (52.0%), III 등급에서 11 예 (73.3%) 로서저분화도일수록단백발현비율이높아졌으며이는통계적으로유의하였다 (p=0.044). 종양의크기에따른단백발현은 T1군에서 8예 (57.1%), T2군에서 9예 (45.0%), T3군에서 10예 (62.5%) 로서유의성있는차이는없었다. 림프절전이에따른단백발현은전이성인경우 15예 (65.2%), 비전이성인경우 12 예 (44.4%) 로서전이성암종에서높은발현의경향을보였지만유의성있는차이는없었다. 병기에따른단백발현은 I기 8예 (61.5%), II 기 9예 (45.0%), III기 10 예 (83.3%) 로서병기 III 기에서높은단백발현의경향이 있었으나병기별유의성있는단백발현차이는없었다 (p=0.133). 5. MSI 와 p53 단백발현과의상관관계 MSI와 p53 단백발현과의상관관계를보면양자모두양성인증례는 7예 (14%), MSI만검출된증례는 4예 (8%), p53 단백발현만있는경우 20예 (40%) 이었고, 양자모두음성인증례는 19예 (38%) 이었으며, 양검사법간의통계적유의성은없었다 (Table 4). 최근국내의암발생빈도가크게변화되어유방암이한국인의 5대암에속할정도로유방암발생률이증가되고있는추세이며, 35 세미만의젊은여성에서도유방암에대한조기발견과관리가더욱중요하게되었다.(1) 게다가동일한병기의암종이라도치료성적과재발, 암전이양상이차이가나고나쁜예후를보이는경우도많으므로암의침윤및전이에관련된다양한분자, 종양생물학적인자들의임상적인적용에대한연구는중요하다.(16-21) 암의발생과진행은복수의발암유전자나종양억제유전자들의이상이한종양세포내에서여러단계에걸쳐축적되는복잡한기전이병인론으로제시되고있으며, 동시에많은발암화관련유전자들의염색체상에서의위치가알려지면서암의발생과염색체이상과의상관성을밝히려는연구들이진행되어왔다.(4, 5) 이중종양억제유전자는세포주기, 세포증식, 전사및신호전달체계등의과정을조절하여종양의발생을억제하는기능을하므로종양억제유전자의비활성화는정상세포에서암이발생하는생성기전중에가장많이확인된유전학적변이라고할수있다. 이에특정부위종양억제유전자의두개의대립유전자가모두변이및소실되어일어나는종양억제유전자의비활성화는현미부수체표식자를이용한 LOH 의확인을통해알아낼수있다. 현미부수체는생체내의게놈 (genome) 전반에걸쳐풍부하게존재하는짧은염기로단순하게반복되는형태의 DNA 로단백질합성에직접관여하지않는비전사 (non-coding) DNA에위치하며, 부모세대로부터자손에게유전되어세대간에걸쳐잘유지되며다형성이커서염색체결손검사와유전자지문 (DNA fingerprinting) 검사에활용된다.(4, 5) 이러한특성을보이는현미부수체를이용하여염색체상에서 LOH 를검출하는기법이최근발전되어왔으며동시에 DNA 의복제오류교정에관여하는유전자들에서장애가생겨발암화되는새로운기전인현미부수체불안정성 (MSI) 에대한연구도발전되어왔다. 복제오류교정유전자의이상이현미부수체의반복되는염기서열의큰변화를야기시킨다는사실이밝혀졌으며이같은 DNA 수복기능의결함을나타내주는특성을돌연변이발생률이증가되어현미부수체의반복염기서열에광범위하게축적된소위 mutator phenotype 으로명명되고 MSI 가그척도라고할수있다.(6, 7)

6 82 Duck Hyoun Jeong, et al. 최근이러한 MSI 가유전성비용종성대장암증후군 (HNPCC) 에서발생하는대장암에서높은빈도로검출된다고알려져있으며, (8, 9) 몇차례에걸쳐 HNPCC의임상진료차원에서 MSI 의국제적인표준화를위한국제적합의가이루어질정도이다.(18, 19) 한편, MSI 기전은 HNPCC 이외에도단일형 (sporadic) 결직장암, 위암, 식도암, 담관암, 갑상선암등다양한여러암종의약 10-15% 에서발암기전으로작용한다는보고들도많이발표되고있다.(12-15) 이같은현미부수체변이들에대한연구가초기에는소화기계암종위주로많이이루어졌지만최근에는거의모든장기의암종에서연구되어왔지만, 국내에서의연구는많은편이아니며특히유방암을대상으로한 MSI 연구는국내외적으로미진하다고할수있다. 본연구에서는 MSI 검출을위해 1998년미국 NIH NCI에서임상적적용을위해 MSI의표준화를위해권고한 BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, D17S250 등 5가지표식자를사용하였다.(18, 19) BAT26 좌위와 D2S123 좌위는 2p21-2p16에위치하고 hmsh2 유전자와연관이있고, D5S346은 5q21에위치하고 APC 유전자와연관이있으며, D17S250 좌위는염색체 17q11.2-q12에위치하며, BRCA 유전자와연관되어있다. 본연구에서 MSI 는침윤성관암중 11 예 (22%) 에서검출되었으나, 이를평가하기위해참고가될만한국내에서의연구가미흡할뿐만아니라또한외국의연구와는실험방법이동일하지않으므로분석이용이하지않다. 우선본연구는 1998년 NCI 학회에서권고된 5가지의표준화된표식자들을사용하였지만많은연구들은표준화된표식자들을사용하지않고나름대로의다양한염색체의좌위들을사용하였다. Siah 등 (20) 은침윤성관암에서 306 개의표식자를연구하였으며증례의 35.5% 에서 MSI 검출되었으나평균적으로표식자의 2.9% 에서만검출되었음을보고하여비교적낮은 MSI 검출률을보였다. Molist 등 (21) 의보고에서는사용한표식자에서어떤 MSI 도검출되지않았다. 반면 Murata 등 (22) 은 5개의표식자를사용하여 15 개의 MSI 가검출하였으며, 그중 6예는 MSI-High군이었다. 또한 Pizzi 등 (23) 은8개의표식자를사용하였으며증례의 36.5% 에서최소 2개이상의 MSI가있음을보고하여다소높은비율의 MSI 검출률을보고하였다. Mendez 등 (24) 은 5개의표식자를사용하여 2개이상의 MSI 가검출된증례가 11.6% 이었음을보고하여 8% 의 MSI-High군을보인본연구와 MSI 검출률이유사하였다. 국내문헌에서는참고할문헌이드물었지만외국에발표된국내문헌을참고하면 Kim 등 (25) 은염색체 11p15.5 상에있는 IGF-II와관련된 D11S922, D11S988에서높은비율의검출률을보였고 D11S922 표식자는침윤성관상피암의 45.3% 에서 MSI가검출되었음을보고하여매우높은검출률을보였다. 또한, 본연구에서 BAT25, BAT26 이두가지표식자는각각 8예, 7예에서 MSI 를보였으며, BAT25, BAT26에서의높은검출률이었다. 특히 BAT26은 MSI 여부를조사하는데민감도가매우높고위양성, 위음성정도가낮아서유용한표지자로알려져있고 (26) 본실험에서도어느정도부합되는것으로판단된다. 다만, Siah 등 (20) 은 BAT25, BAT26에서 MSI가없었다고보고하여본연구결과와큰차이가있었다. 본연구결과를임상및병리학적인자들의특성에따라분석하면 MSI 검출률은높은등급의분화도일수록유의하게낮게검출되었으며, 종양의크기가큰 T3 군에서그리고전이성암종에서 MSI 검출률이낮은경향을보였다. 또한, 병기별로 MSI의검출률의차이는없었지만, 병기 I기와 II+III기로구분하면병기 I기에서유의성있게높은 MSI의검출률을보였다. 한편, MSI-high 군 4예의경우를기술하면분화도 III 등급의증례는없었으며, T1 군이 3예이었고, 병기 I기군이 3예, 비전이성인경우 3예이므로비록통계적유의성은없지만본연구에서는 MSI 를갖는암종이보다좋은예후를보이는것을제시하였다. 외국문헌을참고하면 MSI와 LOH를동시에연구한 Regitnig 등 (27) 은40예의재발성유방암에서 3예에서만 MSI 가검출되었고, 반면각증례당평균 4개의 LOH 가검출을보고하여 LOH 와 MSI 가예후에역상관성이있음을제시하였다. 반면 Pizzi 등 (23) 은MSI를보인증례들이큰종양크기, 높은림프절전이능및높은병기를보였다고보고하여본연구와상반된결과를보였다. 그러나 Iwase 등 (28) 은 MSI를갖는증례중에는높은전이능, 낮은분화도및나쁜예후를보이는증례들이없음을보고하여본연구결과와부합되었다. 아울러본연구에서는 MSI 검출결과를검증하고객관적으로판단하는데도움을주기위해 MSI 와는직, 간접적인연관성이없으면서기존에이미많은연구가이루어진 p53 단백발현을참고하여비교해보았다. p53 유전자발현과관련된대다수의연구문헌에서는종양의높은악성도, 종양의침윤및전이와 p53 유전자이상또는단백발현사이에관계가있다고일반적으로제시되고있다.(16, 17, 29) 본연구에서면역조직화학방법으로검출한 p53 단백발현은암종의 54% 에서관찰되었고, 정상조직에서는발현이없어서암종과정상조직의구분에특이성이있었다. 또한 p53 단백발현은종양의크기, 림프절전이여부, 병기와는유의성있는차이가없었지만, 종양의분화도가낮을수록발현이유의성있게높았고, 전이성암종과병기 III기암종에서높은발현의경향을보여비록 MSI와 p53 단백발현간에는어떤유의한상관성을볼수없었지만 MSI 와는일반적으로상반되는예후를보이는양상을보였다. 참고로 Molist 등 (21) 은 MSI와 p53 유전자의 LOH 를동시에연구하고 MSI 는검출되지않았으나 p53 LOH는 17% 의검출률을보였다고보고하여본연구결과와어느부분에서는부합되는결과를보였다.

7 MSI in Invasive Ductal Carcinoma 83 결론적으로본연구를종합하면비록국내에서의연구보고가매우미흡하여비교분석문헌이드물고또한외국의연구들과다소상이한부분들이있지만 MSI 는유방의침윤성관상피암종에서비록검출률이미약하지만기존의종양억제유전자의불활성화와발암유전자의활성화기전과는다른차원의발암기전으로작용할수있음을시사하며, 암종중에서는비교적양호한예후를보여임상적인유용성이있을것으로판단된다. 아울러 p53 단백발현이있는 27 예중 20 예에서 MSI 가검출되지않았으므로일부의침윤성유방관상피암종의발암과정상 p53 이불활성화되는기전과는다르게독립적으로작용하는것으로보이지만일부의암종에서는두기전이동시에발암기전에서작용하는것으로판단된다. 아울러많은연구그룹마다 MSI 를적용하는기준과그결과가크게상이하지만더많은현미부수체표식자를대상으로연구하는것이바람직한것만은사실이다. 향후에는더많은침윤성관상피암종증례를대상으로가능한많은현미부수체표식자를연구하는것은물론이거니와전구병변증례까지도포함하는포괄적인연구가요구된다고본다. 결론유방의침윤성관암에서 5개염색체상의 5가지현미부수체표식자 BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, D17S250에서의 MSI 및 p53 단백발현을연구하고임상및병리학적소견과비교하여다음과같은결과를얻었다. MSI와 p53 단백발현은암종에서만관찰되었고정상에서는검출되지않았다. MSI 는증례의 22% 에서검출되었으며 MSI- High군은 8% 이었다. MSI 검출률은분화도와역상관성이있었고병기 I기에서유의하게높은검출률을보였으며, 또한통계적유의성은없지만 T3 군과전이성암종에서낮은 MSI 검출률의경향을보였다. 한편, MSI-high군 4예를별도로분석하면종양의분화등급 III 등급의증례는없었으며, T1 군이 3예이었고, 병기 I 기군이 3예, 비전이성인경우 3예이었다. p53 단백발현은증례의 54% 에서관찰되었으며암종의분화등급과상관관계를보였으나다른인자들과의상관성은없었다. MSI 는유방의침윤성관암에서비록낮은검출률을보였지만기존의종양억제유전자에의한발암기전과는다른양상의발암기전으로작용할가능성이있는것으로판단되며, 암종중에서는비교적양호한예후를보여임상적인유용성이있을것으로판단된다. 아울러 p53 단백발현이있는 27예중 20 예에서 MSI가검출되지않았으므로일부의유방의침윤성관암의발암과정상 p53 이불활성화되는기전과는다르게독립적으로작용하는것으로보이지만일부의암종에서는두기전이동시에발암기전에서작 용하는것으로판단된다. 참고문헌 Annual Report of the Central Cancer Registry in Korea. Ministry of Health and Welfare. Republic of Korea 2003; Lo S, Johnston SR. Novel systemic therapies for breast cancer. Surg Oncol 2003;12: Hollingsworth AB, Singletary SE, Morrow M, Francescatti DS, O Shaughnessy JA, Hartman AR, et al. Current comprehensive assessment and management of women at increased risk for breast cancer. Am J Surg 2004;187: Weisenbach J, Gyapay G, Dib C. A second-generation linkage map of the human genome. Nature 1992;359: Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 1993;363: Loeb L. Microsatellite instability: marker of a mutator phenotype in cancer. Cancer Res 1994;54: Eshleman J, Markowitz S. Mismatch repair defects in human carcinogenesis. Hum Mol Genet 1996;5: Leach F, Nicolaides N, Papadopoulos N, Liu B, Jen J, Parsons R, et al. Mutations of a muts homolog in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cell 1993;75: Peltomaki P, Lothe R, Aaltonen L, Pykkanen L, Nystrom-Lahti M, Seruca R, et al. Microstallite instability is associated with tumors that characterize the hereditary non-polyposis colorectal carcinoma syndrome. Cancer Res 1993;53: Aaltonen L, Peltomaki P, Leach F, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin J, et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science 1993;260: Peltomaki P, Lothe R, Aaltonen L, Pykkanen L, Nystrom-Lahti M, Seruca R, et al. Microstallite instability is associated with tumors that characterize the hereditary non-polyposis colorectal carcinoma syndrome. Cancer Res 1993;53: Lothe RA, Arzimanoglou II, Gilbert F, Barber HR. microsatellite instability in human solid tumors. Cancer 1998;82: Miyoshi E, Haruma K, Hiyama T, Tanaka S, Yoshihara M, Shimamoto F, et al. Microsatellite instability is a genetic marker for the development of multiple gastric cancers. Int J Cancer 2001;95: Momoi H, Itoh T, Nozaki Y, Arima Y, Okabe H, Satoh S, et al. Microsatellite instability and alternative genetic pathway in intrahepatic

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