공개특허 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) A61K 39/145 ( ) A61P 31/16 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 (

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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) A61K 39/145 ( ) A61P 31/16 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제출원일자 ) 2008 년 06 월 27 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2010 년 01 월 19 일 (86) 국제출원번호 PCT/IB2008/ (87) 국제공개번호 WO 2009/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2008 년 12 월 31 일 60/937, 년 06 월 27 일미국 (US) 전체청구항수 : 총 12 항 (54) 첨가물이적은인플루엔자백신 (11) 공개번호 (43) 공개일자 2010년05월03일 (71) 출원인 노파르티스아게 스위스체하 바젤리히트스트라쎄 35 (72) 발명자 그레거슨, 젠스 - 피터 독일 마르부르크에밀 - 본 - 베링 - 스트라세 76 노파르티스백신스 루벤, 홀거 독일 마르부르크에밀 - 본 - 베링 - 스트라세 76 노파르티스백신스 보를로프, 위르겐 독일 마르부르크에밀 - 본 - 베링 - 스트라세 76 노파르티스백신스 (74) 대리인 박종혁, 김정욱, 정삼영, 송봉식 (57) 요약 인플루엔자백신은수은보존제 ; 항생물질 ; 포름알데히드 ; 및난 - 유래물질중적어도세가지가결핍하다. 일부실시형태에서, 백신은이들네가지성분중어떤것도포함하지않는다

2 특허청구의범위청구항 1 인플루엔자바이러스항원을포함하며, 항생물질, 포름알데히드및난-유래물질을함유하지않는백신. 청구항 2 인플루엔자바이러스항원을포함하며, 수은보존제, 항생물질및포름알데히드를함유하지않는백신. 청구항 3 인플루엔자바이러스항원을포함하며, 수은보존제, 항생물질및난-유래물질을함유하지않는백신. 청구항 4 인플루엔자바이러스항원을포함하며, 수은보존제, 항생물질, 포름알데히드및난-유래물질을함유하지않는백신. 청구항 5 제 1 항내지제 4 항중어느한항에있어서, 0.1IU/ml 미만의내독소를갖는것을특징으로하는백신. 청구항 6 제 1 항내지제 5 항중어느한항에있어서, 15μg의헤마글루티닌당 1Ong 미만의숙주세포 DNA를갖는것을특징으로하는백신. 청구항 7 제 1 항내지제 6 항중어느한항에있어서, 항원은전체바이러스항원인것을특징으로하는백신. 청구항 8 제 1 항내지제 7 항중어느한항에있어서, 항원은분할바이러스항원인것을특징으로하는백신. 청구항 9 제 1 항내지제 8 항중어느한항에있어서, 항원은정제표면당단백질항원인것을특징으로하는백신. 청구항 10 제 1 항내지제 9 항중어느한항에있어서, 항원은비로좀인것을특징으로하는백신. 청구항 11 제 1 항내지제 10 항중어느한항에있어서, 하나이상의인플루엔자바이러스균주로부터의항원을포함하는것을특징으로하는백신. 청구항 12 (i) 난-유래물질및항생물질의부재하에서세포배양시스템에서인플루엔자바이러스를성장시키는단계 ; (ii) 단계 (i) 에서성장한인플루엔자바이러스를포름알데히드의부재하에서불활성화하는단계 ; 및 (iii) 불활성화된인플루엔자바이러스로부터티메로살의부재하에서백신항원제제를제조하는단계를포함하는, 인플루엔자바이러스항원의제조방법. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은인플루엔자바이러스감염에대항하여보호하기위한백신, 특히적은수준의약학적첨가물을함유 하는백신의분야에관한것이다

3 [0002] [0003] [0004] 배경기술다양한형태의인플루엔자바이러스백신이현재이용가능하다 ( 예컨대참고문헌 1의 17장및 18장참조 ). 백신은일반적으로생바이러스또는불활성화바이러스에기반한다. 불활성화백신은전체비리온, ' 분할 ' 비리온, 또는정제표면항원에기반할수있다. 그들의항원성성분에더하여, 현재인플루엔자백신은다양한약학적첨가물및다른오염물질, 예를들어 : 항박테리아보존제, 예컨대티메로살 ; 세척제, 예컨대 CTAB, 폴리소르베이트 80, 옥토시놀 10 등 ; 항생물질, 예컨대네오마이신, 카나마이신 ; 포름알데히드 ; 및난단백질 ( 예컨대오보뮤코이드 ) 및닭의 DNA를포함하는난-유래물질을포함한다. 2006/07 시즌에, 예를들어미국에서사용된 4개불활성백신에대한제조자의데이타시트는하기정보를나타낸다 : [0005] [0006] Fluvirin 제품과유사하게, 참고문헌 2 는포름알데히드가부재이지만티메로살및난산물을함유하 는백신을제조하였다. 발명의내용 [0007] 해결하려는과제 본발명의목적은이들약학적첨가물의양및 / 또는수를축소또는제거하여보다순수한백신제품을제공하 는, 그이상의개선된인플루엔자백신, 및그들의제조방법을제공하는것이다. [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] 과제의해결수단본발명에따르면, 인플루엔자백신은수은보존제 ; 항생물질 ; 포름알데히드 ; 및난-유래물질중적어도세가지를결여한다. 일부실시형태에서, 백신은이들 4가지성분중어떤것도포함하지않는다. 따라서한실시형태에서본발명은인플루엔자바이러스항원을포함하며, 수은보존제, 항생물질및난-유래물질을함유하지않는백신을제공한다. 포름알데히드가없는백신이바람직하다. 따라서본발명은인플루엔자바이러스항원을포함하며, 수은보존제, 항생물질및포름알데히드를함유하지않는백신을제공한다. 본발명은또한인플루엔자바이러스항원을포함하며, 항생물질, 포름알데히드및난-유래물질을함유하지않는백신을제공한다. 본발명은또한인플루엔자바이러스항원을포함하며, 수은보존제, 항생물질, 포름알데히드및난-유래물질을함유하지않는백신을제공한다. 바람직한백신은또한매우낮은내독소함유량, 예컨대 0.1IU/ml 미만, 바람직하게는 0.05IU/ml 미만을갖는다. 내독소측정에대한국제단위는잘알려져있으며, 예컨대 NIBSC로부터이용가능한 2nd International Standard( 코드 94/580-IS) 과같은, 국제표준 [3,4] 에의해샘플에대하여산출할수있다. 현재난에서성장한바이러스로부터제조된백신은내독소수준이 0.5-5IU/ml 범위내이다. 본발명은 (i) 난-유래물질및항생물질의부재하에서세포배양시스템에서인플루엔자바이러스를성장시키는단계 ; (ii) 단계 (i) 에서성장한인플루엔자바이러스를포름알데히드의부재하에서불활성화하는단계 ; 및 (iii) 불활성화된인플루엔자바이러스로부터티메로살의부재하에서백신항원제제를제조하는단계를포함하는인플루엔자바이러스항원의제조방법을제공한다. 얻어진항원제제는 1가또는다가백신의제조에사용할수있는벌크백신항원일수있다. 발명을실시하기위한구체적인내용 - 3 -

4 [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] 항원성분본발명은인플루엔자비리온으로부터제조된인플루엔자바이러스항원을사용한다. 비리온은포름알데히드를사용하지않고불활성화된다. 바이러스를불활성화하기위한화학적수단은하기물질 : 세척제, β-프로피오락톤또는 UV광중하나이상의유효한양으로처리하는것을포함한다. 불활성화를위한추가의화학적수단은메틸렌블루, 프소랄렌, 카르복시플러렌 (C60) 또는이들의조합으로처리하는것을포함한다. 예컨대이원에틸아민, 아세틸에틸렌이민또는감마조사와같은다른바이러스불활성화방법은기술분야에알려져있다. 비리온은다양한방법에의해바이러스-함유액체로부터수확될수있다. 예를들어, 정제공정은비리온을분해하기위한세척제를포함하는선형수크로스구배용액을사용하는띠원심분리를수반할수있다. 그다음항원은선택적희석후에정용여과에의해정제될수있다. 분할비리온은정제된비리온을세척제 ( 예컨대에틸에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸포스페이트, Triton X-100, Triton N1O1, 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 터지톨 NP9 등 ) 로처리하여서브비리온제조물을생성함으로써얻어지며, 'Tween-ether' 분할공정을포함한다. 인플루엔자바이러스를분할하는방법은기술분야에잘알려져있으며, 예컨대참고문헌 5-10 등을참조한다. 바이러스의분할은일반적으로분할제의분해농도로감염성이든지비감염성이든지모든바이러스를분해또는분열시킴으로서수행된다. 분해는바이러스의완전성을변형하여바이러스단백질의전체또는부분용해화를야기한다. 바람직한분할제는비이온성및이온성 ( 예를들어, 양이온성 ) 계면활성제, 예를들어알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실, 당, 술포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카메그 (Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, 4차암모늄화합물, 사르코실, CTAB( 브롬화세틸트리메틸암모늄 ), 트리-N-부틸포스페이트, 세타블론 (Cetavlon), 미리스틸트리메틸암모늄염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOTMA, 옥틸- 또는노닐-페녹시폴리옥시에탄올 ( 예를들어, Triton X-1OO 또는 Triton N101과같은 Triton 계면활성제 ), 폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르 (Tween 계면활성제 ), 폴리옥시에틸렌에테르, 폴리옥시에틸렌에스테르등이다. 한가지유용한분할과정은데옥시콜레이트나트륨및포름알데히드의연속작용을사용하고, 분할은초기비리온정제동안 ( 예를들어, 수크로오스밀도구배용액에서 ) 일어날수있다. 분할비리온은소듐포스페이트-완충등장염화나트륨용액에유용하게재현탁될수있다. 정제표면항원백신은인플루엔자표면항원헤마글루티닌및통상적으로또한뉴라미니다아제를포함한다. 이들정제형태의단백질제조를위한공정은잘알려져있다. 인플루엔자항원은또한 INFLEXAL V 및 INVAVAC 제품에서와같이비로좀 [11] ( 핵산부재바이러스-유사리포좀입자 ) 의형태로존재할수있다. 인플루엔자바이러스는약독화될수있다. 인플루엔자바이러스는온도에민감할수있다. 인플루엔자바이러스는냉적응될수있다. 그러나이들세가지특징은생바이러스백신과더욱연관된다. 백신에사용하기위한인간인플루엔자바이러스균주는시즌별로변화한다. 현재대유행사이의시기에, 백신은통상적으로 2개의인플루엔자 A 균주 (H1N1 및 H3N2) 및 1개의인플루엔자 B 균주를포함하며, 3가의백신이통상적이다. 본발명은 H2, H5, H7 또는 H9 아형균주 ( 특히인플루엔자 A 바이러스 ) 와같이, 대유행균주 ( 예컨대백신수용자및일반적인사람집단이면역학적으로경험한적없는균주 ) 로부터의 HA를사용할수있고, 대유행균주에대한인플루엔자백신은 1가일수있거나, 또는대유행균주에의해보충되는정상 3가의백신을기반으로할수있다. 그러나, 백신에포함되는항원의활동기및성질에의존하여, 본발명은 HA 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16( 인플루엔자 A 바이러스 ) 중하나이상에대하여보호할수있다. 본발명은인플루엔자 A 바이러스 NA 아형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9 중하나이상에대하여보호할수있다. 본발명의조성물은대유행사이의균주에대하여면역화하는데적합할뿐만아니라대유행균주에대한면역화에특히유용하다. 대유행발생을초래하는잠재성을제공하는인플루엔자균주의특성은 (a) 현재순환하는인간균주내헤마글루티닌과비교하여새로운헤마글루티닌, 즉수십년에걸쳐인간집단에서명백하지않거나 ( 예를들어, H2), 또는인간집단내모든것에서이전에보이지않는 ( 예를들어, 오직조류집단에서만일반적으로발견된 H5, H6 또는 H9) 것을함유, 및 / 또는현재순환하는인간균주내뉴라미니다아제에비하여새로운뉴라미다아제를함유하여, 인간집단이균주의헤마글루티닌및 / 또는뉴라미니다아제에대해면역학적으로경험한적없는것 ; (b) 인간집단에서수평적으로전달되는것이가능한것 ; 및 (c) 인간에대해병원성인것이다

5 H5 헤마글루티닌형을갖는바이러스는 H5N1 균주와같은대유행인플루엔자에대한면역화를위해바람직하다. 다른가능한균주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 및어떤다른출현한잠재적으로유행성인균주를포함한다. H5 아형에서, 바이러스는 HA 클레이드 1, HA 클레이드 1', HA 클레이드 2 또는 HA 클레이드 3으로구분될수도있으며 [12], 클레이드 1 및 3이특히적절하다. [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] 그항원이조성물에유용하게포함될수있는다른균주는내성대유행균주 [14] 를포함하는항바이러스치료에내성 ( 예를들어, 오셀타미비르 [13] 및 / 또는자나미비르에대한내성 ) 이있는균주이다. 본발명의조성물은인플루엔자 A 바이러스및 / 또는인플루엔자 B 바이러스를포함하는하나이상의 ( 예를들어, 1, 2, 3, 4 또는그이상 ) 인플루엔자바이러스균주로부터의항원 ( 들 ) 을포함할수있다. 1가백신을제조할수있으며, 2가, 3가, 4가등도가능하다. 백신이하나이상의인플루엔자의균주를포함하는경우, 상이한균주들은일반적으로분리하여성장되고, 바이러스를수확하여항원을제조한후에혼합된다. 따라서본발명의과정은하나이상의인플루엔자균주로부터의항원을혼합하는단계를포함할수있으며, 이과정은비냉각조건하에서행할수있다. 2개의인플루엔자 A 바이러스균주와 1개의인플루엔자 B 바이러스균주로부터의항원을포함하는 3가백신이바람직하다. 본발명의일부실시형태에서, 조성물은단일인플루엔자 A 균주로부터의항원을포함할수있다. 일부실시형태에서, 조성물은 2개의인플루엔자 A 균주로부터의항원을포함할수도있으며, 단이들 2개의균주는 H1N1 및 H3N2가아니다. 일부실시형태에서, 조성물은 2개이상의인플루엔자 A 균주로부터의항원을포함할수있다. 인플루엔자바이러스는재배열균주일수있고, 역유전기술에의해획득될수있다. 역유전기술 [ 예를들어, 15-19] 은시험관내에서플라스미드를사용하여제조되는소망하는게놈단편을갖는인플루엔자바이러스를허용한다. 일반적으로, 그것은 (a) 예를들어 poli 프로모터로부터소망하는바이러스 RNA 분자를암호화하는 DNA 분자, 및 (b) 예를들어, polii 프로모터로부터바이러스단백질을암호화하는 DNA 분자를발현시키는것을포함하여, 세포내두가지종류 DNA의발현은완전한무손상감염비리온의조립을유도한다. DNA는바람직하게는바이러스 RNA 및단백질모두를제공하지만, 그것은또한 RNA 및단백질의일부를제공하기위한헬퍼바이러스를사용하는것이가능하다. 각바이러스 RNA를제공하기위한분리플라스미드를사용하는플라스미드-기반방법이바람직하며 [20-22], 또한이들방법은일부방법에서사용되는최대 12개플라스미드로바이러스단백질의모두또는일부 ( 예를들어, 단지 PB1, PB2, PA 및 NP 단백질 ) 를발현시키기위한플라스미드의사용을포함할것이다. 필요로되는플라스미드의수를감소시키기위해, 최근의접근 [23] 은동일한플라스미드 ( 예를들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는모든 8 인플루엔자 A vrna 단편을암호화하는서열 ) 상에서복수의 RNA 중합효소 I 전사카세트 ( 바이러스 RNA 합성을위함 ), 및다른플라스미드 ( 예를들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는모든 8 인플루엔자 A mrna 전사를암호화하는서열 ) 상에서 RNA 중합효소 II 프로모터를갖는복수의단백질-암호화영역을조합한다. 참고문헌 23 방법의바람직한양태는다음을수반한다 : (a) 단일플라스미드상의 PB1, PB2 및 PA mrna-암호화영역 ; 및 (b) 단일플라스미드상의모든 8개 vrna-암호화단편. 한개의플라스미드상에 NA 및 HA 단편을포함하는것및다른플라스미드상에 6개의다른단편을포함하는것은또한문제를용이하게할수있다. 바이러스 RNA 단편을암호화하기위해 poli 프로모터를사용하는것의대안으로서, 박테리오파지중합효소프로모터를사용하는것이가능하다 [24]. 예를들어, SP6, T3 또는 T7 중합효소에대한프로모터가편리하게사용될수있다. poli 프로모터의종-특이성때문에, 비록세포가또한외인성중합효소를암호화하는플라스미드로트랜스펙션되어야하더라도박테리오파지중합효소프로모터는많은세포형태 ( 예를들어, MDCK) 에대해더욱편리할수있다다른기술에서, 바이러스 RNA 및단일주형으로부터발현가능한 mrna를동시에암호화하기위해이중 poli 및 polii 프로모터를사용하는것이가능하다 [25,26]. 따라서바이러스, 특히인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34 바이러스로부터하나이상의 RNA 단편 ( 일반적으로 A/PR/8/34로부터 6개의단편, HA 및 N 단편은백신균주로부터유래함, 즉 6:2 재배열 ) 을포함할수있다. 이는또한 A/WSN/33 바이러스로부터, 또는백신제조를위한재배열바이러스를발생시키는데유용한다른바이러스균주로부터하나이상의 RNA 단편을포함할수도있다. 일반적으로, 본발명은인간대인간전염이가능한균주에대해보호하고, 따라서균주의게놈은보통포유동물 ( 예를들어, 인간 ) 인플루엔자바이러스에서기원하는적어도하나의 RNA 단편을포함할것이다. 이는조류인플루엔자바이러스에서기원된 NS 단편을포함할수있다

6 [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] 상기설명한바와같이, 항원의근원으로서사용되는바이러스는세포배양액에서일반적으로성장하고, 이로써자충포장란으로부터의성분으로의오염을피한다. 따라서본발명의백신은닭의 DNA가부재할뿐만아니라난단백질 ( 예컨대오브알부민및오보뮤코이드 ) 도부재할수있다. 세포기질은일반적으로포유동물기원의셀라인일것이다. 적합한포유동물기원의세포는, 이에제한되는것은아니지만, 햄스터, 소, 영장류 ( 인간및원숭이를포함 ), 및개의세포를포함한다. 신장세포, 섬유아세포, 망막세포, 폐세포등과같은다양한세포형태가사용될수있다. 적당한햄스터세포의예는명칭 BHK21 또는 HKCC를갖는셀라인이다. 적당한원숭이세포는예를들어, 베로 (Vero) 셀라인에서와같이신장세포와같은아프리카그린원숭이세포이다. 적당한개의세포는, 예를들어, MDCK 셀라인에서와같이신장세포이다. 따라서적당한셀라인은, 이에제한되는것은아니지만 : MDCK; CHO; 293T; BHK; 베로 ; MRC-5; PER.C6; WI-38; 등을포함한다. 성장인플루엔자바이러스에대한바람직한포유동물셀라인은 : 개의원위세뇨관 (Madin Darby canine kidney) 으로부터유래한 MDCK 세포 [27-33]; 아프리카그린원숭이 (Cercopithecus aethiops) 신장으로부터유래한베로세포 [31-33]; 또는인간배아망막아세포로부터유래한 PER.C6 세포 [34] 를포함한다. 이들셀라인은, 예를들어, American Type Cell Culture(ATCC) collection[35], Coriell Cell Repositories[36], 또는 European Collection of Cell Cultures(ECACC) 으로부터일반적으로이용가능하다. 예를들어, ATCC는카탈로그넘버 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587 하에서다양한다른베로세포를공급하고, 이는카탈로그넘버 CCL- 34 하에서 MDCK 세포를공급한다. PER.C6는기탁번호 하에이용가능하다. 포유동물셀라인에대안으로서, 바이러스는조류배아줄기세포 [37,40] 를포함하는조류의셀라인 [ 예컨대참고문헌 37-39] 및오리 ( 예를들어, 오리망막 ) 또는닭으로부터유래한셀라인상에서성장될수있다. 적절한조류배아줄기세포는닭배아줄기세포로부터유래하는 EBx 셀라인, EB45, EB14, 및 EB14-074를포함한다 [41]. 닭배아섬유아세포 (CEF) 등도사용할수있다. 성장인플루엔자바이러스에대한가장바람직한셀라인은 MDCK 셀라인이다. 본래의 MDCK 셀라인은 CCL-34로서 ATCC로부터이용가능하지만, 이셀라인의유도체가사용될수도있다. 예를들어, 참고문헌 27은현탁배양액내성장에적합하게된 MDCK 셀라인을개시한다 (DSM ACC 2219로서기탁된 'MDCK 33016'). 유사하게, 참고문헌 42는무혈청배양액내현탁액에서성장하는 MDCK-유래셀라인을개시한다 (FERM BP-7449로서기탁된 'B-702'). 참고문헌 43은 'MDCK-S'(ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (PTA-6503) 를포함하는비발암성의 MDCK 세포를개시한다. 참고문헌 44는 'MDCK.5F1' 세포 (ATCC CRL-12042) 를포함하는감염에대해고민감성을갖는 MDCK 셀라인을개시한다. 이들 MDCK 셀라인중어떤것이사용될수있다. 세포성장을위한배양액, 및또한배양을시작하는데사용되는바이러스접종은, 바람직하게는단순포진바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 파라인플루엔자바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 비르나바이러스, 시르코바이러스, 및 / 또는파르보바이러스가부재할것이다 ( 즉이들에의한오염을테스트하면음성결과가얻어질것이다 )[45]. 단순포진바이러스의부재가특히바람직하다. 바이러스는현탁액 [31,49,50] 또는부착성배양액에서세포상에서성장할수도있다. 한실시형태에서, 세포는현탁액에서의성장에적합하게될수있다. 현탁배양액에서의성장에적합하게된하나의적당한 MDCK 셀라인은 MDCK (DSM ACC 2219로서기탁됨 ) 이다. 대안으로서, 마이크로담체배양이사용될수있다. 인플루엔자바이러스복제를지원하는셀라인은바람직하게는무혈청배양배지및 / 또는무단백질배지에서성장된다. 본발명의문맥에서배지는인간또는동물기원의혈청으로부터어떤첨가물도없는무혈청배지를말한다. 무단백질은단백질, 성장인자, 다른단백질첨가물및무혈청단백질을배제한상태에서세포의증식이일어나는배양액을의미하는것으로이해되며, 이것은바이러스성장에필요할수있는트립신또는다른프로테아제와같은단백질을선택적으로포함할수있다. 이러한배양액에서성장하는세포는단백질자체를자연적으로함유한다. 인플루엔자바이러스복제를지원하는셀라인은바이러스복제동안바람직하게는 37 이하 [48]( 예를들어, ) 에서성장한다. 배양된세포에서바이러스를증식하는방법은일반적으로배양된세포를배양될균주로접종하는단계, 예를들어바이러스역가또는항원발현에의하여측정된바이러스증식을위한소망하는시간 ( 예를들어, 접종후

7 내지 168 시간 ) 기간동안감염된세포를배양하는단계및증식된바이러스를수거하는단계를포함한다. 배양된세포는바이러스 (PFU 또는 TCID 50 으로측정 ) 로, 세포비가 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 더바람직하게는 1:50 내지 1:10이되도록접종할수있다. 바이러스는세포의현탁액에첨가되거나또는세포의단일층에도포될수있으며, 바이러스는 25 내지 4O 에서, 바람직하게는 28 내지 37 에서적어도 60분동안, 그러나보통 300분미만으로, 바람직하게는 90 내지 240분동안세포상에서흡수된다. 감염된세포배양물 ( 예컨대단일층 ) 은냉동-해동법또는수확된배양상청액의바이러스함량을증가시키는효소작용에의하여제거될수있다. 수확된유체를불활성화또는냉동저장한다. 배양된세포는감염다중도 ("m.o.i.") 약 내지 10, 바람직하게는 내지 5, 더바람직하게는 내지 2로감염될수있다. 더욱더바람직하게는, 세포는 m.o.i가약 0.01로감염된다. 감염된세포는감염의 30 내지 60 시간후수확된다. 바람직하게는, 세포는감염의 34 내지 48 시간후수확된다. 더욱더바람직하게는, 세포는감염의 38 내지 40 시간후수확된다. 프로테아제 ( 일반적으로트립신 ) 는일반적으로세포배양중에첨가되어바이러스방출이되도록하며, 프로테아제는배양중임의의적합한단계에서첨가될수있다. 본발명에따르면, 배양중항생물질을피할수있다. [0040] 인플루엔자백신은현재일반적으로 SRID 분석으로측정되는 HA 수준을참조하여표준화된다. 비록더낮은투 약량을사용할수있지만 ( 예컨대보조제를사용하는경우 ), 현존하는백신은일반적으로균주당약 15μg 의 HA 를함유한다. 더높은투약량을가짐에따라 ( 예를들어, 3x 또는 9x 투약량 [49,50]) 1 / 2 ( 즉, 균주당 7.5μg HA), 1 / 4 및 1 / 8 과같은분할투약량이사용되어왔다 [62,63]. 따라서, 백신은인플루엔자균주당 0.1 내지 150 μg의 HA, 바람직하게는 0.1 내지 50μg, 예컨대, μg, μg, μg, μg, 0.5-5μg 등을포함할수있다. 특정투약량은, 균주당예컨대약 90, 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5 등을포함한다. 본발명의백신, 키트및과정의성분 ( 예컨대이들의부피및농도 ) 은최종제품중이들항원투약량을제공하도록선택될수있다. [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] 본발명에서사용된 HA는바이러스에서발견되는것과같은천연 HA일수있고, 또는변형된것일수도있다. 예를들어, 이것은 HA를변형시켜서결정소 ( 예를들어, HA1과 HA2 사이의절단지점주변과같은하이퍼베이직영역 ) 를제거하는것으로알려져있다. 헤마글루티닌을포함할뿐만아니라, 본발명의조성물은인플루엔자바이러스단백질을더포함할수있다. 예컨대, 이들은뉴라미니다아제당단백질을통상적으로포함할것이다. 이들은또한 M1 및 / 또는 M2( 또는이들의단편 ) 와같은매트릭스단백질, 및 / 또는뉴클레오단백질을포함할수있다. 숙주세포 DNA 바이러스가셀라인상에서성장하는경우, DNA의어떤발암활성을최소화하기위하여, 최종백신내의잔여셀라인 DNA의양을최소화하는것이표준적으로실시된다. 따라서조성물은, 미량의숙주세포 DNA가존재할수는있지만, 투약량당 10ng 미만 ( 바람직하게는 1ng 미만, 보다바람직하게는 100pg 미만 ) 의잔류숙주세포 DNA를함유하는것이바람직하다. 일반적으로, 본발명의조성물로부터배재되는것이요망되는숙주세포 DNA는 100bp 보다긴 DNA이다. 잔여숙주세포 DNA의측정은현재통상적인생물학적조절요건이며당업자의일반적인능력의범위내에존재한다. DNA 측정에사용되는분석은일반적으로입증된분석일것이다 [51,52]. 입증된분석의성능특징은수학적및정량적인용어로설명될수있으며, 이들의가능한오차의원인은확인된다. 분석은일반적으로정확성, 정밀도, 특이성과같은특징에대하여테스트한다. 분석을조정 ( 예컨대, 공지된숙주세포 DNA의표준량에대하여 ) 및테스트하면, 그다음정량적 DNA 측정을통상적으로수행할수있다. DNA 정량을위해 3개의주요기술을사용할수있다 : 혼성화방법, 예컨대서던블롯또는슬롯블롯 [53]; 면역분석방법, 예컨대, Threshold 시스템 [54]; 및정량적 PCR[55]. 각방법의정확한특징은대상으로하는숙주세포, 예컨대혼성화용프로브의선택, 증폭을위한프라이머및 / 또는프로브의선택등에달려있지만, 이들방법은당업자에게익숙한것이다. Molecular Devices의 Threshold 시스템은총 DNA의피코그램수준에대한정량적분석법이며, 생약학적물질내의 DNA 오염수준을모니터링하기위하여사용되어왔다 [54]. 일반적인분석법은바이오티닐화 ssdna 결합단백질, 우레아제-컨쥬게이트항-ssDNA 항체, 및 DNA 간의반응복합체의비-서열-특이적형성을수반한다. 모든분석성분은제조자로부터입수가능한완전한총 DNA 분석키트내에포함되어있다. 다양한상업적제조사들이잔류숙주세포 DNA를검출하기위한정량적 PCR 분석법을제공하며, 예컨대 AppTec Laboratory Services, BioReliance, Althea Technologies 등이있다. 인간바이러스백신의숙주세포 DNA 오염을측정하기위한 - 7 -

8 화학발광혼성화분석법과총 DNA Threshold 시스템의비교는참고문헌 56 에서찾을수있다. [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] DNA의오염은, 예컨대크로마토그래피등의표준정제과정을사용하여백신제조시제거될수있다. 잔여숙주세포 DNA의제거는, 예컨대 DNase를사용함으로써핵산분해효소처리에의하여증진될수있다. 숙주세포 DNA 오염을감소시키는편리한방법은참고자료 57 및 58에개시되어있으며, 먼저바이러스성장시에사용할수있는 DNase( 예컨대, 벤조나아제 ), 및그다음비리온분열시사용될수있는양이온세척제 ( 예컨대, CTAB) 사용의두단계처리를수반한다. β-프로피오락톤과같은알킬화제처리를숙주세포 DNA의제거에사용할수있으며, 포름알데히드의사용을피하면서비리온불활성화에유리하게사용될수도있다 [59]. 15μg의헤마글루티닌당 <10ng ( 예컨대, <1ng, <100pg) 숙주세포 DNA를함유하는백신이바람직하며, 따라서 0.25ml 부피당 <10ng ( 예컨대, <1ng, <100pg) 숙주세포 DNA를함유하는백신이다. 50μg의헤마글루티닌당 <10ng ( 예컨대, <1ng, <100pg) 숙주세포 DNA를함유하는백신이더바람직하며, 따라서 0.5ml 부피당 <10ng ( 예컨대, <1ng, <100pg) 숙주세포 DNA를함유하는백신이다. 보조제본발명의조성물은보조제를포함하는것이유리할수있으며, 이것은조성물을투여한환자에게서유발되는 ( 체액성및 / 또는세포성 ) 면역반응을증진시키는기능을할수있다. 인플루엔자백신과함께보조제를사용하는것은전술하였다. 참고문헌 60 및 61에서는알루미늄히드록시드를사용하였으며, 참고문헌 62에서는알루미늄히드록시드와알루미늄포스페이트의혼합물을사용하였다. 참고문헌 63에는알루미늄염보조제의사용이기술되어있다. Chiron Vaccines사의 FLUAD 제품은수중유에멀젼을포함한다. 본발명에서사용할수있는보조제는다음을포함하지만이에제한되는것은아니다 : 칼슘염및알루미늄염 ( 또는그것의혼합물 ) 을포함하는미네랄함유조성물. 칼슘염은인산칼슘 ( 예컨대, 참고문헌 64에서개시되는 "CAP" 입자 ) 을포함한다. 알루미늄염은어떤적당한형태 ( 예컨대, 겔, 결정형, 무정형등 ) 를갖는염과함께히드록시드, 포스페이트, 술페이트등을포함한다. 이들염에대한흡착이바람직하다. 또한조성물을함유하는미네랄은금속염의입자로서제형될수있다 [65]. 알루미늄염보조제는하기에서더욱상세하게설명된다. 사이토카인-유도제 ( 더욱상세는하기참조 ). 이종유래그룹의스테롤글리코사이드및트리테르페노이드글리코사이드로서다양한식물종의껍질, 잎, 줄기, 뿌리및심지어꽃에서발견되는사포닌 [ 참고문헌 101의 22장 ). 장미과퀴라야 (Quillaia saponaria Molina) 나무수피의사포닌은보조제로서널리연구되어왔다. 또한사포닌은 Smilax ornata(sarsaprilla), Gypsophilla paniculata(brides veil), 및 Saponaria officianalis(soap root) 로부터얻을수있다. 사포닌보 조제제제는정제된제제, 예컨대 QS21, 및지질제제, 예컨대 ISCOM를포함한다. QS21은 Stimulon TM 으로판매된다. 사포닌조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를사용하여정제되어왔다. 이러한기법을사용한특이적정제분획이확인되어왔고, QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를포함한다. 바람직하게는, 사포닌은 QS21이다. QS21의생산방법은참고문헌 66에설명되어있다. Quil A의분획 A를적어도하나의다른보조제와사용할수있다. 사포닌제제는스테롤, 예컨대콜레스테롤을포함할수있다 [67]. 사포닌과콜레스테롤의조합은면역자극복합체 (ISCOM) 라고하는독특한입자를형성하기위하여사용될수있다 [ 참고문헌 101의 23장 ]. 또한 ISCOM 는일반적으로포스파티딜에탄올아민또는포스파티딜콜린과같은인지질을포함할수있다. 어떤알려진사포닌은 ISCOM에서사용될수있다. 바람직하게는, ISCOM은하나이상의 QuilA, QHA & QHC를포함한다. ISCOM은참고문헌 68-70에서더설명된다. 선택적으로, ISCOMS는추가세척제가결여될수도있다 [71]. 적어도두개의 ISCOM 복합체의혼합물을사용할수있으며, 각복합체는필수적으로하나의사포닌분획을포함하고, 이때복합체는 ISCOM 복합체또는 ISCOM 매트릭스복합체이다 [72]. 사포닌계보조제개발의개관은참고문헌 73 & 74에서발견할수있다. [0054] [0055] [0056] 지방성보조제 ( 더욱상세는하기참조 ). 박테리아 ADP-리보실화독소 ( 예컨대, E.coli는불안정한엔테로톡신 "LT", 콜레라독소 "CT", 또는백일해독소 "PT" 를가열한다 ) 및그것의해독된유도체, 예로써, LT-K63 및 LT-R72로서알려진돌연변이독소 [75]. 해독된 ADP-리보실화독소의사용은점액성보조제로서참고문헌 76에, 비경구적보조제로서참고문헌 77에설명된다. 에스테르화된히알루론산마이크로스피어 [78] 또는키토산및그것의유도체와같은생체부착성및점막부 - 8 -

9 착성 [79]. [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] 생분해성및비독성인물질 ( 예컨대, 폴리 (α-히드록시산), 폴리히드록시부티르산, 폴리오르소에스테르, 폴리하이드라이드, 폴리카프로락톤등 ) 로부터형성된마이크로입자 ( 즉, 직경 ~1OOnm 내지 ~150μm, 더바람직하게는직경 ~200nm 내지 30μm, 또는직경 ~500nm 내지 ~10μm의입자 ), 폴리 ( 락티드-코-글리콜리드 ) 가바람직함, 선택적으로음으로하전된표면 ( 예컨대, SDS로 ) 또는양으로하전된표면 ( 예컨대, CTAB와같은양이온성세척제 ) 을가지도록처리된다. 리포좀 ( 참고문헌 101의 13 및 14 장 ). 보조제로서사용에적당한리포좀제제의예는참고문헌 80-82에설명되어있다. 수중유에멀전 ( 상세는하기참조 ). 폴리옥시에틸렌에테르및폴리옥시에틸렌에스테르 [83]. 또한이러한제제들은옥톡시놀과조합하여폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르계면활성제 [84] 및옥토시놀과같은적어도하나의추가의비이온성계면활성제와조합하여폴리옥시에틸렌알킬에테르또는에스테르계면활성제 [85] 를포함한다. 바람직한폴리옥시에틸렌에테르는다음의군으로부터선택된다 : 폴리옥시에틸렌-9-라우릴에테르 (laureth 9), 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴에테르, 및폴리옥시에틸렌-23-라우릴에테르. 무라밀펩티드, 예로써 N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D- 이소글루타민 ("thr-mdp"), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 ( 노르-MDP), N-아세틸글루크사민일-N- 아세틸무라닐-L-Al-D-이소글루-L- 알라-디팔미톡시프 로필아미드 ("DTP-DPP", 또는 "Theramide TM ), N- 아세틸무라밀 -L- 알라닐 -D- 이소글루타민일 -L- 알라닌 -2-(1'-2' 디팔 미토일 -sn- 글리세로 -3- 히드록시포스포릴옥시 )- 에틸아민 ("MTP-PE"). [0062] [0063] [0064] 1차그람-음성박테리아로부터제조된외막단백질프로테오좀제조물과 2차그람-음성박테리아로부터유도된리포사카라이드제조물의조합, 여기서외막단백질프로테오좀및리포사카라이드제조물은안정적인비-공유보조제복합체를형성한다. 이러한복합체는 "IVX-908" 를포함하며, 복합체는네이세리아메닝기티디스 (Neisseria meningitidis) 외막및리포폴리사키라이드로구성되어있다. 이들은인플루엔자백신의보조제로서사용되어왔다 [86]. 메틸이노신 5'-모노포스페이트 ("MIMP")[87]. 폴리히드록실화피롤리지딘화합물 [88], 예컨대하기화학식을갖는것 : [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] 여기서 R은수소, 선형또는분지형, 미치환또는치환, 포화또는불포화아실, 알킬 ( 예컨대, 시클로알킬 ), 알케닐, 알키닐및아릴기, 또는약학적으로허용가능한염또는이들의유도체를포함하는군으로부터선택된다. 그예에는다음을포함하나이에한정되지않는다 : 카수아린, 카수아린-6-α-D-글루코피라노스, 3-epi-카수아린, 7-epi-카수아린, 3,7-디epi-카수아린등. 감마이눌린 [89] 또는이들의유도체, 예컨대알가뮬린. CD1d 리간드, 예컨대 α-글리코실세라마이드, 예컨대 α-갈락토실세라마이드. 이들또는다른보조제-활성물질은참고문헌 101 및 102에서보다상세하게설명된다. 조성물은상기보조제중 2개이상을포함할수있다. 예를들면, 이들은수중유에멀젼및사이토카인-유도제모두를포함하는것이유리할수있고, 따라서이조합은인플루엔자백신에의하여유발되는사이토카인반응, 예컨대인터페론-γ 반응을개선시키며, 에멀젼또는제제가그자체로사용되는경우에관찰되는것보다더큰개선이있게된다. 조성물중에서항원과보조제는일반적으로혼합물로존재할것이다

10 [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] 백신이보조제를포함하는경우, 이것은송달시에즉석에서제조할수있다. 따라서본발명은혼합을위해준비된항원및보조제성분을포함하는키트를제공한다. 키트는보조제및항원을사용시까지분리하여보관하게한다. 성분들은서로키트내에서물리적으로분리되며, 이분리는다양한방식으로이루어질수있다. 예컨대, 두성분은바이알과같은두개의분리된용기에존재할수있다. 그다음두바이알의내용물을예컨대하나의바이알의내용물을이동시키고이들을다른바이알에첨가함으로써, 또는두바이알의내용물을별도로이동시키고이들을제3의용기에서혼합함으로써혼합할수있다. 바람직한장치에서, 키트성분중하나는주사기에존재하고다른것은바이알과같은용기에존재한다. 주사기를사용하여 ( 예컨대바늘과함께 ) 그것의내용물을혼합을위한제2 용기로삽입시키고, 그다음혼합물을주사기로인출할수있다. 혼합된주사기의내용물은그다음환자에게통상적으로새로운멸균바늘을통해투여될수있다. 주사기에하나의성분을패킹하는것은환자에게투여하기위해별도의주사기를사용할필요성을제거한다. 또다른바람직한장치에서, 두개키트성분을동일한주사기, 예컨대참고문헌 등에개시되어있는것과같은듀얼-챔버주사기에서함께그러나분리하여유지한다. 주사기가작동할때 ( 예컨대환자에게투여하는동안 ) 두챔버의내용물이혼합된다. 이장치는사용시별도혼합단계에대한필요성을피한다. 수중유에멀젼보조제수중유에멀젼은인플루엔자바이러스백신을보조하는용도에특히적합한것으로발견되었다. 다양한이러한에멀젼은공지되어있으며, 그것들은일반적으로적어도한가지의오일과적어도한가지의계면활성제를포함하며, 생분해성이고 ( 물질대사가가능한 ) 생체적합한오일 ( 들 ) 과계면활성제 ( 들 ) 이다. 에멀젼내의오일방울은일반적으로직경이 5μm 미만이며, 심지어마이크론이하의직경을가질수도있고, 이들작은크기는마이크로플루이다이저로달성되어적합한에멀젼을제공한다. 220nm 미만크기의방울이여과멸균을실시할수있어바람직하다. 본발명은오일, 예로써동물성 ( 예로써, 어류 ) 또는식물성원으로부터의것과함께사용될수있다. 식물성오일원은견과, 종자, 곡물을포함한다. 가장흔하게이용가능한땅콩오일, 대두오일, 코코넛오일, 및올리브오일은견과오일의예가된다. 호호바오일은, 예컨대, 호호바열매로부터획득되어사용될수있다. 종자오일은홍화오일, 면실오일, 해바라기씨오일, 참깨씨오일등을포함한다. 곡물군에서, 옥수수오일이가장용이하게이용가능하지만, 또한밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프 (teff), 라이밀등과같은다른곡류곡물의오일이사용될수도있다. 종자오일에서자연적으로발생하지않는글리세롤및 1,2-프로판디올의 6-10개의탄소지방산에스테르는견과및종자오일로부터출발하는적합한물질의가수분해, 분리및에스테르화에의해제조될수있다. 포유동물젖으로부터의지방및오일은물질대사가능하며, 따라서본발명의실시에사용될수있다. 동물성원으로부터순수한오일을획득하는데필요한분리, 정제, 비누화및다른필요한수단은당업계에공지되어있다. 대부분의어류는용이하게회수될수있는대사가능한오일을함유한다. 본원에서사용될수있는몇몇의어류오일은, 예를들어, 대구간오일, 상어간오일및경뇌와같은고래오일로예시된다. 많은분지쇄오일은 5-탄소이소프렌단위에서생화학적으로합성되며, 일반적으로테르펜으로서언급된다. 상어간오일은스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔으로서알려진분지, 불포화테르펜을함유하고, 이는본원에서특히바람직하다. 또한, 스쿠알렌, 스쿠알란에대한포화유사체는바람직한오일이다. 스쿠알렌및스쿠알란을포함하는어류오일은시중의공급원으로부터용이하게이용가능하거나또는당업계에공지된방법으로획득될수있다. 다른바람직한오일은토코페롤이다 ( 하기참조 ). 오일의혼합물이사용될수있다. 계면활성제는그것의 'HLB' ( 친수성 / 친유성밸런스 ) 에의해분류될수있다. 본발명의바람직한계면활성제는적어도 10, 바람직하게는적어도 15, 및더바람직하게는적어도 16의 HLB를갖는다. 본발명은폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르계면활성제 ( 통상적으로 Tweens으로서언급됨 ), 특히폴리소르베이트 20 및폴리소르베이트 80; 상표명 DOWFAX TM 으로판매되는선형 EO/PO 블록공중합체와같은에틸렌옥사이드 (EO), 프로필렌옥사이드 (PO) 및 / 또는부틸렌옥사이드 (BO) 의공중합체 ; 반복하는에톡시 ( 옥시-1,2-에탄디일 ) 기의수가다양한옥토시놀, 옥토시놀-9 (Triton X-1OO, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 ) 가특히해당됨 ; ( 옥틸페녹시 ) 폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예로써포스파티딜콜린 ( 레시틴 ); 라우릴, 세틸, 스테아릴및올레일알코올로부터유도되는폴리옥시에틸렌지방산에테르 (Brij 계면활성제로서공지됨 ), 예로써트리에틸렌글리콜모노라우릴에테르 (Brij 30); 및소르비탄트리올레에이트 (SPAN 85) 및소르비탄모노라우레이트와같은소르비탄에스테르 ( 흔히 SPAN으로서알려짐 ) 를포함하는계면활성제들을사용할수있으나, 이에한정되지않는다. 에멀젼에포함되는바람직한계면활성제는 Tween 80 ( 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레이트 ), SPAN 85 ( 소르비탄트리올레에이트 ), 레시틴및 Triton X-1OO이다. 상기설명한바와같이, Tween 80과같은세척제는하기실시예

11 에서보이는열안정성에기여할수있다. [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] 계면활성제의혼합물은, 예컨대, Tween 80/SPAN 85 혼합물이사용될수있다. 또한폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레에이트 (Tween 80) 와같은폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르와 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X- 100) 과같은옥토시놀의조합이적당하다. 다른유용한조합은 laureth 9에폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르및 / 또는옥토시놀을합한것을포함한다. 바람직한계면활성제의양 ( 중량 %) 은폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르 ( 예로써, Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히약 0.1%; 옥틸또는노닐페녹시폴리옥시에탄올 ( 예로써, Triton X-100, 또는 Triton 시리즈중다른세척제 ) 내지 0.1 %, 특히 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌에테르 ( 예로써, laureth 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1% 내지 10% 및특히 0.1 내지 1% 또는약 0.5% 이다. 본발명에유용한특정한수중유에멀젼보조제는다음을포함하나이에한정되지않는다 : 스쿠알렌, Tween 80, 및 SPAN 85의서브마이크론에멀젼. 부피기준으로에멀젼조성물은약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및약 0.5% SPAN 85가될수있다. 중량환산으로, 이들비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% SPAN 85이된다. 이보조제는 'MF59' 로알려져있으며 [98-100], 참고문헌 101의 10장및참고문헌 102의 12장에보다상세하게설명되어있다. MF59 에멀젼은시트레이트이온, 예컨대 1OmM 소듐시트레이트완충제를포함하는것이유리하다. 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Tween 80의에멀젼. 에멀젼은포스페이트완충식염수를포함할수있다. 또한이는 SPAN 85 ( 예컨대 1%) 및 / 또는레시틴을포함할수있다. 이러한에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤및 0.3 내지 3% Tween 80을포함할수있으며, 스쿠알렌 : 토코페롤의중량비로더안정적인에멀젼을제공하기위하여바람직하게는 1이다. 스쿠알렌과 Tween 80은약 5:2의부피비로존재할수있다. 이러한하나의에멀젼은 Tween 80을 PBS에용해시켜 2% 용액을제공하고, 그다음 90ml의이용액을 (5g의 DL-α-토코페롤및 5 ml의스쿠알렌 ) 의혼합물과혼합한뒤, 혼합물을극소액체화하여제조할수있다. 얻어진에멀젼은예컨대 100 내지 250 nm, 바람직하게는약 180 nm의평균직경의서브마이크론오일방울을가질수있다. 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Triton 세척제 ( 예컨대, Triton X-100) 의세척제. 이에멀젼은 3d-MPL를포함할수있다 ( 하기참조 ). 에멀젼은포스페이트완충제를함유할수있다. 폴리소르베이트 ( 예컨대, 폴리소르베이트 80), Triton 세척제 ( 예컨대, Triton X-100) 및토코페롤 ( 예컨대, α -토코페롤숙시네이트 ) 을포함하는에멀젼. 에멀젼은이들세성분을약 75:11:10 ( 예컨대 750μg/ml 폴리소르베이트 80, 110 μg/ml Triton X-100 및 100μg/ml α-토코페롤숙시네이트 ) 의질량비로포함할수있으며, 이들농도는항원으로부터이들성분의어떤부담분을포함하여야한다. 에멀젼은스쿠알렌을포함할수있다. 에멀젼은또한 3d-MPL를포함할수있다 ( 하기참조 ). 수성상은포스페이트완충제를포함할수있다. 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및폴록사머 401("Pluronic TM L121") 의에멀젼. 에멀젼은포스페이트완충식염수, ph 7.4에서제형화될수있다. 이에멀젼은무라밀디펩티드를위한유용한전달비히클이고, "SAF-I" 보조제 (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80) 내트레오닐-MDP와함께사용되었다 [103]. 또한이는 "AF" 보조제에서와같이 Thr-MDP 없이사용될수있다 [104] (5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 마이크로유동화가바람직하다. 스쿠알렌, 수성용제, 폴리옥시에틸렌알킬에테르친수성비이온성계면활성제 ( 예컨대폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴에테르 ) 및소수성비이온성계면활성제 ( 예컨대소르비탄모놀레이트또는 'Span 80' 와같은소르비탄에스테르또는만니드에스테르 ) 를포함하는에멀젼. 에멀젼은열가역적인것이바람직하고및 / 또는크기가 20nm 미만인오일액적을적어도 90%( 부피 ) 를갖는다 [105]. 에멀젼은알디톨 ; 동결억제제 ( 예컨대도데실말토사이드및 / 또는수크로스와같은당 ); 및 / 또는알킬폴리글리코사이드중하나이상을포함할수도있다. 이러한에멀젼은동결건조될수있다 % 의오일, % 의인지질, 및 % 의비이온성계면활성제를갖는에멀젼. 참고문헌 106에서설명되는바와같이, 바람직한인지질성분은포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아닐린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딘산, 스핑고미엘린및카디올리핀이다. 서브마이크론의방울크기가유리하다. 대사분해가능하지않은오일 ( 예로써, 경광유 ) 의서브마이크론수중유에멀션및적어도하나의계면활성제 ( 예로써, 레시틴, Tween 80 또는 SPAN 80). QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성결합 ( 예로써, 참고문헌

12 107 에서설명되는 GPI-0100, 글루쿠론산의카르복실기를통해데스아실사포닌에방향족아민의첨가에의해제 조됨 ), 디메틸디옥타데실암모늄브로마이드및 / 또는 N,N- 디옥타데실 -N,N- 비스 (2- 히드록시에틸 ) 프로판디아민과 같은첨가제가포함될수있다. [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] 미네랄오일, 비이온성친유성에톡시화지방알콜및비이온성친수성계면활성제를포함하는에멀젼 ( 예컨대에톡시화지방알콜및 / 또는폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌블록공중합체 )[108]. 미네랄오일, 비이온성친수성에톡시화지방알콜및비이온성친유성계면활성제를포함하는에멀젼 ( 예컨대에톡시화지방알콜및 / 또는폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌블록공중합체 )[108]. 사포닌 ( 예컨대, QuilA 또는 QS21) 및스테롤 ( 예컨대, 콜레스테롤 ) 이나선형마이셀로회합된에멀젼 [109]. 에멀젼은송달시에즉석에서항원과혼합될수있다. 따라서, 보조제및항원은사용시최종제제를위한준비로, 패키징되거나유통된백신에서분리하여유지될수있다. 항원은일반적으로수성형태로존재하여, 백신은최종적으로 2가지의액체를혼합함으로써제조된다. 혼합을위한 2가지액체의부피비는다양할수있지만 ( 예컨대, 5:1 내지 1:5), 일반적으로는약 1:1이다. 항원과보조제가혼합된후에, 헤마글루티닌항원은일반적으로수성용액중에존재할것이지만오일 / 물경계면주변에분포될수도있다. 일반적으로, 어떤헤마글루티닌이에멀젼의유층으로들어가는것은거의없다. 조성물이토코페롤을포함하는경우, 어떤 α, β, γ, δ, ε 또는 ξ 토코페롤이사용되지만, α-토코페롤이바람직하다. 토코페롤은여러가지형태, 예컨대다른염및 / 또는이성질체를취할수있다. 염은, 숙시네이트, 아세테이트, 니코티네이트등과같은유기염을포함한다. D-α-토코페롤및 DL-α-토코페롤두가지가모두사용될수있다. 토코페롤은고령의환자 ( 예컨대, 60세또는그이상 ) 에서사용하기위한백신에유리하게포함되며, 비타민 E가이환자군의면역반응에긍정적인효과를가지는것으로보고되었기때문이다 [110]. 그것들은또한에멀젼을안정화하는데도움이되는항산화특성을가진다 [111]. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이고, 이토코페롤의바람직한염은숙시네이트이다. 숙시네이트염은생체내에서 TNF-관련리간드와협력하는것으로발견되었다. 게다가, α-토코페롤숙시네이트는인플루엔자백신과양립가능하고, 수은화합물의대안으로서유용한보존제인것으로알려져있다 [8]. 사이토카인-유도제본발명의조성물에포함을위한사이토카인-유도제는환자에투여될때면역시스템을도출하여인터페론및인터류킨을포함하는사이토카인을방출한다. 사이토카인반응은초기에포함되는것으로알려져있고, 숙주의결정단계는인플루엔자감염에대해방어한다 [112]. 바람직한제제는인터페론-γ; 인터류킨-1; 인터류킨-2; 인터류킨-12; TNF-α; TNF-β; 및 GM-CSF 중하나이상의방출을도출할수있다. 바람직한제제는 Th1-타입면역반응, 예컨대인터페론-γ, TNF-α, 인터류킨-2와관련된사이토카인의방출을도출한다. 인터페론-γ와인터류킨-2 모두의자극이바람직하다. 따라서, 본발명의조성물을투여받은결과로서, 환자는인플루엔자항원으로자극시항원-특이적방식으로소망하는사이토카인 ( 들 ) 을방출하는 T 세포를가질것이다. 예를들어, 시험관내에서인플루엔자바이러스헤마글루티닌에노출되는경우혈액을형성하는정제된 T 세포는 γ-인터페론을방출할것이다. 말초혈액단핵세포 (PBMC) 내의이러한반응을측정하기위한방법은당업계에공지되어있으며, ELISA, ELISPOT, 유세포분석및실시간 PCR을포함한다. 예를들어, 참고문헌 113은파상풍톡소이드, 특히 γ-인터페론반응에대한항원특이적 T-세포매개면역반응을모니터링하였고, ELISPOT이자발적반응으로부터항원-특이적 TT-유도반응을식별하기위한가장민감한방법으로발견되었지만, 유세포분석기로검출되는세포질내사이토카인검출은재자극효과를검출하기위한가장효과적인방법이었다는연구를보고한다. 적합한사이토카인-유도제는다음을포함하지만이에제한되는것은아니다 : 면역촉진올리고뉴클레오티드, 예로써 CpG 모티프 ( 구아노신에대한인산결합에의해연결된비메틸화된시토신을함유하는디뉴클레오티드서열 ), 또는이중가닥의 RNA, 또는회문형서열을함유하는올리고뉴클레오티드, 또는폴리 (dg) 서열을함유하는올리고뉴클레오티드. 3-O-탈아실화모노포스포릴지질 A('3dMPL', 또한 'MPL TM ' 으로서알려짐 )[ ]. 이미퀴모드 ("R-837")[118,119], 레시퀴모드 ("R-848") [120], 및이들의유사체 ; 및이것의염 ( 예를들어, 염산염 ) 과같은이미다조퀴놀린화합물. 면역촉진이미다조퀴놀린에관한다른상세는참고문헌 121 내지 125에

13 서찾을수있다. [0101] [0102] [0103] 참고문헌 126에개시되는것과같은티오세미카르바존화합물. 또한활성화합물의제형화, 제조및스크리닝방법은참고문헌 126에서설명된다. 티오세미카르바존은 TNF-α와같은사이토카인의제조를위한인간말초혈액단핵세포의자극에서특히효과적이다. 참고문헌 127에서개시되는것과같은트립탄트린화합물. 또한활성화합물의제형화, 제조및스크리닝방법은참고문헌 127에서설명된다. 티오세미카르바존은 TNF-α와같은사이토카인의제조를위한인간말초혈액단핵세포의자극에서특히효과적이다. 뉴클레오시드유사체, 예를들어 : (a) 이사토라빈 (Isatorabine)(ANA-245; 7-티아-8-옥소구아노신 ): [0104] [0105] 및이것의프로드러그 ; (b)ana975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) 참고문헌 128 내지 130 에서개시되는화합 물 ; (f) 다음의식을갖는화합물 : [0106] [0107] [0108] 상기식에서 : R 1 및 R 2 는각각독립적으로 H, 할로, -NR a R b, -OH, C 1-6 알콕시, 치환된 C 1-6 알콕시, 헤테로시클릴, 치환된헤테 로시클릴, C 6-10 아릴, 치환된 C 6-10 아릴, C 1-6 알킬, 또는치환된 C 1-6 알킬이고 ; [0109] R 3 는부재하거나, H, C 1-6 알킬, 치환된 C 1-6 알킬, C 6-10 아릴, 치환된 C 6-10 아릴, 헤테로시클릴, 또는치환된헤 테로시클릴이고 ; [0110] R 4 및 R 5 는각각독립적으로 H, 할로, 헤테로시클릴, 치환된헤테로시클릴, -C(O)-R d, C 1-6 알킬, 치환된 C 1-6 알 킬이거나, 또는함께결합하여 R 4-5 에서와같이 5 원환을형성하고 : [0111] [0112] 결합은 로나타낸결합에서이루어짐 [0113] [0114] X 1 및 X 2 는각각독립적으로 N, C, O, 또는 S 이고 ; R 8 은 H, 할로, -OH, C 1-6 알킬, C 2-6 알케닐, C 2-6 알키닐, -OH, -NR a R b, -(CH 2 ) n -O-R c, -0-(C 1-6 알킬 ), -S(O) p R e, 또는 -C(O)-R d 이고 ; [0115] [0116] R 9 는 H, C 1-6 알킬, 치환된 C 1-6 알킬, 헤테로시클릴, 치환된헤테로시클릴또는 R 9a 이고, R 9a 는 :

14 [0117] 이고 [0118] 결합은 로나타낸결합에서이루어짐 [0119] [0120] [0121] [0122] R 10 및 R 11 은각각독립적으로 H, 할로, C 1-6 알콕시, 치환된 C 1-6 알콕시, -NR a R b, 또는 -OH이고; 각각의 R a 및 R b 는독립적으로 H, C 1-6 알킬, 치환된 C 1-6 알킬, -C(O)R d, C 6-10 아릴이고 ; 각각의 R c 는독립적으로 H, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, C 1-6 알킬, 또는치환된 C 1-6 알킬이고 ; 각각의 R d 는독립적으로 H, 할로, C 1-6 알킬, 치환된 C 1-6 알킬, C 1-6 알콕시, 치환된 C 1-6 알콕시, -NH 2, -NH(C 1-6 알킬 ), -NH( 치환된 C 1-6 알킬 ), -N(C 1-6 알킬 ) 2, -N( 치환된 C 1-6 알킬 ) 2, C 6-10 아릴, 또는헤테로시클릴이고 ; [0123] 각각의 R e 는독립적으로 H, C 1-6 알킬, 치환된 C 1-6 알킬, C 6-10 아릴, 치환된 C 6-10 아릴, 헤테로시클릴, 또는치환 된헤테로시클릴이고 ; [0124] 각각의 R f 는독립적으로 H, C 1-6 알킬, 치환된 C 1-6 알킬, -C(O)R d, 포스페이트, 디포스페이트또는트리포스페이 트이고 ; [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] 각각의 n은독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고 ; 각각의 p는독립적으로 0, 1, 또는 2이고 ; 또는또는 (g) (a) 내지 (f) 중어느것의약학적으로허용가능한염, (a) 내지 (f) 중어느것의호변체, 또는호변체의약학적으로허용가능한염. 록소리빈 (Loxoribine)(7-알릴-8-옥소구아노신) [131]. 다음을포함하는참고문헌 132에개시된화합물 : 아실피페라진화합물, 인돌레디온화합물, 테트라히드라이소퀴놀린 (THIQ) 화합물, 벤조시클로디온화합물, 아미노아자비닐화합물, 아미노벤즈이미다졸퀴놀리논 (ABIQ) 화합물 [133,134], 히드라프탈아미드화합물, 벤조페논화합물, 이속사졸화합물, 스테롤화합물, 퀴나질리논화합물, 피롤화합물 [135], 안트라퀴논화합물, 퀴녹살린화합물, 트리아진화합물, 피라잘로피리미딘화합물, 및벤즈아졸화합물 [136]. 폴리옥시도늄중합체 [137,138] 또는다른 N-산화폴리에틸렌-피페라진유도체. 참고문헌 139에개시된화합물. RC-529와같은아미노알킬글루코사미나이드포스페이트유도체 [140,141]. CD1d 리간드, 예로써 α-글리코실세라마이드 [ ]( 예컨대 α-갈락토실세라마이드 ), 피토스핑고신-함유 α-글리코실세라마이드, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노일아미노 )- 1,3,4-옥타데칸트리올 ], CRONY- 101, 3"-O-술포-갈락토실세라마이드등. 예를들어참고문헌 150 및 151에서설명한바와같은폴리 [ 디 ( 카르복실레이토페녹시 ) 포스파젠 ] ("PCPP") 과같은포스파젠. 다음과같은소분자면역강화제 (SMIP): N2-메틸-1-(2-메틸프로필 )-1H-이미다조 [4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2,N2-디메틸-1-(2-메틸프로필 )-1H-이미다조 [4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2-에틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2-메틸-1-(2-메틸프로필 )-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; 1-(2-메틸프로필 )-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ;

15 [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] N2-부틸-1-(2-메틸프로필 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2-부틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2-메틸-1-(2-메틸프로필 )-N2-펜틸-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2-메틸-1-(2-메틸프로필 )-N2-프로프-2-엔일-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; 1-(2-메틸프로필 )-2-[( 페닐메틸 ) 티오 ]-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-4-아민 ; 1-(2-메틸프로필 )-2-( 프로필티오 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-4-아민 ; 2-[[4-아미노-1-(2-메틸프로필 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2-일 ]( 메틸 ) 아미노 ] 에탄올 ; 2-[[4-아미노-1-(2-메틸프로필 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2-일 ]( 메틸 ) 아미노 ] 에틸아세테이트 ; 4-아미노-1-(2-메틸프로필 )-1,3-디히드로-2H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2-온 ; N2-부틸-1-(2-메틸프로필 )-N4,N4-비스( 페닐메틸 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2-부틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필 )-N4,N4-비스( 페닐메틸 )-1H-이미다조[4,5- c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2-메틸-1-(2-메틸프로필 )-N4,N4-비스( 페닐메틸 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; N2,N2-디메틸-1-(2-메틸프로필 )-N4,N4-비스( 페닐메틸 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민 ; 1-{4-아미노-2-[ 메틸 ( 프로필 ) 아미노 ]-1H-이미다조 [4,5-c] 퀴놀린-1-일 }-2- 메틸프로판-2-올 ; 1-[4-아미노-2-( 프로필아미노 )-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-1-일 ]-2-메틸프로판-2-올; N4,N4-디벤질-1-(2-메톡시-2-메틸프로필 )-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2,4-디아민. 본발명에서사용하기위한사이토카인-유도제는톨-유사수용체 (Toll-Like Receptor(TLR)) 의조절제및 / 또는작용제일수있다. 예를들어, 그것들은인간 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, 및 / 또는 TLR9 단백질중의하나이상의작용제일수있다. 바람직한물질은 TLR7( 예를들어, 이미다조퀴놀린 ) 및 / 또는 TLR9 ( 예를들어, CpG 올리고뉴클레오티드 ) 의작용제이다. 이들물질은선천면역경로를활성화시키는데유용하다. 사이토카인-유도제는조성물에그제조동안다양한단계에서첨가될수있다. 예를들어, 이것은항원조성물내에있을수도있고, 이혼합물을그후수중유에멀젼에첨가할수있다. 대안적으로, 이것은수중유에멀젼내에존재할수있으며, 이경우물질은에멀젼화전에에멀젼성분에첨가되거나또는에멀젼화후에에멀젼에첨가될수있다. 유사하게, 물질은에멀젼방울내에코아세르베이트화될수있다. 최종조성물내의사이토카인-유도제의위치및분포는이들의친수 / 친유특성에의존하며, 예컨대물질은수성상, 오일상, 및 / 또는오일- 물경계에위치할수있다. 사이토카인-유도제는항원과같은별도물질, 예컨대항원 ( 예컨대, CRM197) 에컨쥬게이트될수있다. 소분자의컨쥬게이션기술의일반적인개요는참고문헌 154에제공되어있다. 대안으로서, 보조제는예컨대소수성또는이온상호작용에의하여첨가제와비공유적으로결합될수있다. 두개의바람직한사이토카인-유도제는 (a) 면역자극올리고뉴클레오티드및 (b) 3dMPL 이다. 면역자극올리고뉴클레오티드는뉴클레오티드변성체 / 유사체, 예컨대포스포로티오에이트변성체를포함할수있으며, 이중-가닥또는 (RNA 제외 ) 단일-가닥일수있다. 참고문헌 153, 154 및 155에서는가능한유사체치환, 예컨대구아노신을 2'-데옥시-7-데아자구아노신으로대체하는것을개시하고있다. CpG 올리고뉴클레오티드의보조제효과는참고문헌 에더설명되어있다. CpG 서열은 TLR9, 예컨대모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT로지시될수있다 [162]. CpG 서열은 Th1 면역반응, 예컨대 CpG-A ODN ( 올리고데옥시뉴클레오티드 ) 을유도하는데특이적일수있거나, 또는 B 세포반응, 예컨대 CpG-B ODN을유도하는데더욱특이적일수있다. CpG- A 및 CpG-B ODN은참고문헌 에논의되어있다. 바람직하게는, CpG는 CpG-A ODN이다. 바람직하게는, CpG 올리고뉴클레오티드는 5` 말단부가수용체인식을위해접근가능하도록구성된다. 선택적으로, 두 CpG 올리고뉴클레오티드서열은이들의 3' 말단에결합하여 " 이뮤노머 (immunomers)" 를형성할수있다. 예를들면, 참고문헌 162 및 을참고한다. 유용한 CpG 보조제는 ProMune (Coley Pharmaceutical Group, Inc.) 로서도알려진 CpG7909이다. CpG 서열을사용하는것의대안으로서또는추가하여, TpG 서열이사용될수있다 [169]. 이들올리고뉴클레오티

16 드는비메틸화 CpG 모티프가없어도좋다. [0163] [0164] [0165] [0166] 면역자극올리고뉴클레오티드는피리미딘이풍부할수있다. 예를들면, 하나이상의연속적인티미딘뉴클레오티드 ( 예컨대, TTTT, 참고문헌 169에개시됨 ) 를포함할수있으며, 및 / 또는 >25% 티미딘 ( 예컨대, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, 등 ) 을갖는뉴클레오티드조성물을가질수있다. 예를들면, 하나이상의연속적인사이토신뉴클레오티드 ( 예컨대, CCCC, 참고문헌 169에개시됨 ) 를포함할수있으며, 및 / 또는 >25% 사이토신 ( 예컨대, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% 등 ) 을갖는뉴클레오티드조성물을가질수있다. 이들올리고뉴클레오티드는비메틸화 CpG 모티프가없어도좋다. 면역자극올리고뉴클레오티드는일반적으로적어도 20개뉴클레오티드를포함할것이다. 이들은 100개미만의뉴클레오티드를포함할수있다. 3dMPL (3 탈-O-아실화모노포스포릴지질 A, 또는 3-O-데사실-4'-모노포스포릴지질 A로서알려짐 ) 은모노포스포릴지질 A에서환원말단글루코사민의위치 3이탈-아실화된보조제이다. 3dMPL은살모넬라미네소타 (Salmonella Minnesota) 의헵토스가없는돌연변이로부터제조되며, 지질 A와화학적으로유사하나산-불안정포스포릴기및염기-불안정아실기가부족하다. 이는단핵구 / 대식세포계통의세포를활성화시키고, IL-1, IL- 12, TNF-α 및 GM-CSF를포함하는여러사이토카인의방출을자극한다 ( 참고문헌 170 참조 ). 3dMPL의제조는참고문헌 171에본래설명되어있었다. 3dMPL은이들의아실화에의하여변화하는관련분자의혼합물의형태를취할수있다 ( 예컨대, 서로길이가다를수있는 3, 4, 5 또는 6개아실쇄를보유 ). 두글루코사민 (2-데옥시-2-아미노-글루코스로서도알려짐 ) 단당류는이들의 2-위치탄소 ( 즉, 위치 2 및 2') 에서 N-아실화되며, 또한 3' 위치에서도 O-아실화된다. 탄소 2에부 착된기는식 -NH-CO-CH 2 -CR 1 R 1' 이다. 탄소 2' 에부착된기는식 -NH-CO-CH 2 -CR 2 R 2' 이다. 탄소 3' 에부착된기는 화학식 -0-CO-CH 2 -CR 3 R 3' 이다. 대표적인구조는다음과같다 : [0167] [0168] 기 R 1, R 2 및 R 3 은각각독립적으로 -(CH 2 ) n -CH 3 이다. n 값은바람직하게는 8 내지 16, 더바람직하게는 9 내지 12 이며, 가장바람직하게는 10 이다. [0169] 기 R 1', R 2' 및 R 3' 은각각독립적으로 (a) -H; (b) -OH; 또는 (c) -O-CO-R 4 가될수있고, 여기서 R 4 는 -H 또는 -(CH 2 ) m -CH 3 이고, 여기서 m 값은바람직하게는 8 내지 16, 더바람직하게는 10, 12 또는 14 이다. 2 위치에서, m 은 바람직하게는 14 이다. 2' 위치에서, m 은바람직하게는 10 이다. 3' 위치에서, m 은바람직하게는 12 이다. 따라서 기 R 1', R 2' 및 R 3' 은바람직하게는도데칸산, 테트라데칸산또는헥사데칸산으로부터의 -O- 아실기이다. [0170] 모든 R 1', R 2' 및 R 3 모두 -H 인경우, 3dMPL 은 3 개아실쇄 ( 각각위치 2, 2' 및 3' 에하나 ) 만을보유한다. R 1', R 2' 및 R 3' 중둘만 -H인경우, 3dMPL은 4개아실쇄를보유할수있다. R 1', R 2' 및 R 3' 중의하나만 -H인경우, 3dMPL은 5개아실쇄를보유할수있다. R 1', R 2' 및 R 3' 중의어느것도 -H 가아닌경우 3dMPL은 6개아실쇄를보유할수있다. 본발명에따라사용되는 3dMPL 보조제는 3 내지 6개아실쇄를지닌이들형태의혼합물이될수있지만, 혼합물내에 6개아실쇄를보유한 3dMPL를포함하는것이바람직하며, 헥사아실쇄형태가총 3dMPL 의중량부로적어도 10%, 예컨대, 20%, 30%, 40%, 50% 또는그이상을차지하도록확보하는것이특히

17 바람직하다. 6 개아실쇄를보유한 3dMPL 은대부분의보조제 - 활성형태로발견된다. [0171] 따라서, 본발명의조성물내에포함되는가장바람직한형태의 3dMPL 는 [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] [0177] [0178] 이며, 3dMPL이혼합물의형태로사용되는경우, 본발명의조성물내의 3dMPL 양또는농도에대한기준은혼합물내에조합된 3dMPL종을참조한다. 수성조건에서, 3dMPL은예컨대직경이 <150nm 또는 >500nm인서로다른크기의미셀응집체또는입자를형성할수있다. 이들각각또는모두를본발명에서사용할수있으며, 더나은입자를기존의분석에의하여선택할수있다. 더작은입자 ( 예컨대, 3dMPL 수성현탁액에투명성을부여할정도로작은 ) 가본발명에따른사용에바람직하며, 이는이들의월등한활성때문이다 [172]. 바람직한입자는평균직경이 220nm 미만, 더바람직하게는 200nm 미만또는 150nm 미만또는 120nm 미만이며, 100nm 미만의평균직경을보유할수도있다. 대부분의경우, 그러나평균직경이 50nm보다작지않다. 이러한입자는여과멸균에적합할정도로충분히작다. 직경은평균입자직경을측정하는동적광산란의통상기술로측정할수있다. 입자의직경을 x nm라고하는경우, 일반적으로이평균부근에입자가분포할것이며, 입자수의적어도 50% ( 예컨대, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는그이상 ) 는직경이 x±25% 범위내일것이다. 3dMPL은수중유에멀젼과조합하여사용되는것이유리하다. 실질적으로모든 3dMPL이에멀젼의수성상에위치할수있다. 3dMPL은그자체로사용할수있거나, 또는하나이상의추가의화합물과조합하여사용될수있다. 예를들면, 3dMPL은 QS21 사포닌 [173] ( 수중유에멀젼내에포함 [174]), 면역자극올리고뉴클레오티드, QS21와면역자극올리고뉴클레오티드, 알루미늄포스페이트 [175], 알루미늄히드록시드 [176], 또는알루미늄포스페이트및알루미늄히드록시드와조합하여사용하는것이알려져있다. 지방보조제본발명에사용될수있는지방보조제는상술한수중유에멀젼을포함할수있으며, 예를들면다음을포함한다 :

18 [0179] 화학식 I, II 또는 III 의화합물, 또는이들의염 : [0180] [0181] 참고문헌 177 에서정의한바와같이, 예컨대 'ER ', 'ER ', 'ER ', 'ER ', 'ER ', 'ER ', 'ER ', 'ER ', 'ER ' 또는 'ER ' 예컨대 : [0182] [0183] [0184] [0185] Escherichia coli로부터의지질 A의유도체, 예컨대 OM-174 ( 참고문헌 178 및 179에기재됨 ). 양이온지질및 ( 일반적으로중성 ) 보조-지질의제제, 예컨대아미노프로필-디메틸- 미리스트올레일옥시- 프로판아미늄브로마이드-디피타노일포스파티딜 -에탄올아민("Vaxfectin ") 또는아미노프로필-디메틸- 비스-도데실옥시-프로판아미늄브로마이드-디올레오일포스파티딜 -에탄올아민 ("GAP-DLRIE:DOPE"). (±)-N-(3-아미노프로필 )-N,N-디메틸-2,3-비스( 신-9-테트라데세닐옥시 )-1-프로판아미늄염을함유한제제가바람직하다 [180]. 3-0-탈아실화모노포스포릴지질 A ( 상기참조 )

19 [0186] 포스페이트 - 함유비환형뼈대에연결된지질을함유하는화합물, 예컨대, TLR4 길항제 E5564[181,182]: [0187] [0188] [0189] [0190] 알루미늄염보조제알루미늄히드록시드및알루미늄포스페이트로알려진보조제를사용할수있다. 이들명칭은통상적이지만존재하는실제화학적화합물의정확한설명이아님에도편의를위하여사용한다 ( 예컨대, 참고문헌 101의 9장참조 ). 본발명은일반적으로보조제로서사용하는어떤 " 히드록시드 " 또는 " 포스페이트 " 보조제중어떤것을사용할수있다. " 알루미늄히드록시드 " 로알려진보조제는일반적으로알루미늄옥시히드록시드염이며, 대개적어도부분적으 로결정체이다. 식 AlO(OH) 로표시될수있는알루미늄옥시히드록시드는적외선 (IR) 분광법, 특히 1070cm -1 에서의흡수밴드및 cm -1 에서의스트롱숄더 (strong shoulder) 의존재에의해다른알루미늄화합물, 예컨대알루미늄히드록시드 Al(OH) 3 등과구별될수있다 [ 참고문헌 101의 9장 ]. 알루미늄히드록시드보조제의결정도는절반높이에서의회절밴드폭 (WHH) 에의하여반영되며, 열등한결정입자는더작은결정크기로인하여더큰선확장을나타낸다. 표면적은 WHH가증가함에따라증가하며, 높은 WHH 값의보조제는큰항원흡수능을가지는것으로보인다. 섬유형태 ( 예컨대, 투과전자현미경으로관찰 ) 가알루미늄히드록시드보조제에일반적이다. 알루미늄히드록시드보조제의 pi는일반적으로약 11, 즉보조제자체는생리학적 ph에서양성표면전하를띤다. 알루미늄히드록시드보조제에대하여 ph 7.4에서 mg Al +++ 당 mg 단백질의흡수능이보고되었다. [0191] " 알루미늄포스페이트 " 로알려진보조제는일반적으로알루미늄히드록시포스페이트이며, 때로는소량의술페이트 ( 즉알루미늄히드록시포스페이트술페이트 ) 를함유한다. 이들은침전에의하여획득할수있으며, 침전시의반응조건및농도는염내의히드록실에대한포스페이트의치환도에영향을미친다. 히드록시포스페이트는일반적으로 PO 4 /Al 몰비가 0.3 내지 1.2이다. 히드록시포스페이트는히드록실기의존재에의하여완전한 AlPO 4 와 구별될수있다. 예를들어, 3164cm -1 에서의 IR 스펙트럼밴드 ( 예컨대, 200 로가열시 ) 는구조적히드록실의존 재를나타낸다 [ 참고문헌 101 의 9 장 ]. [0192] 알루미늄포스페이트보조제의 PO 4 /A1 3+ 몰비는일반적으로 0.3 내지 1.2 이며, 바람직하게는 0.8 내지 1.2, 더 바람직하게는 0.95±0.1이다. 알루미늄포스페이트는일반적으로무정형이며, 특히히드록시포스페이트염에서그러하다. 일반적인보조제는무정형알루미늄히드록시포스페이트로서 PO 4 /Al 몰비가 0.84 내지 0.92이며, 0.6 mg Al 3+ /ml를포함한다. 알루미늄포스페이트는일반적으로입자화된다 ( 예컨대, 투과전자현미경으로관찰시판 -유사형태 ). 일반적인입자의직경은어떠한항원흡착후 0.5 내지 20μm ( 예컨대, 약 5 내지 10μm ) 범위내이다. 알루미늄포스페이트보조제는 ph 7.4에서mg Al +++ 당 0.7 내지 1.5 mg단백질의흡착능이보고되었다. [0193] [0194] 알루미늄포스페이트의제로전하점 (PZC) 은히드록실에대한포스페이트의치환도에밀접하게연관되어있으며, 이치환도는침전에의한염제조시사용되는반응물의반응조건및농도에의존하여달라질수있다. PZC는용액내의유리포스페이트이온의농도를변화시키거나 ( 포스페이트증가 = 산성 PZC 증가 ) 또는히스티딘완충제와같은완충제의첨가 (PZC를더욱염기성화 ) 에의해변화된다. 본발명에따라사용된알루미늄포스페이트는일반적으로 PZC가 4.0 내지 7.0, 더바람직하게는 5.0 내지 6.5, 예컨대약 5.7이다. 본발명조성물의제조에사용된알루미늄염의현탁액은완충제 ( 예컨대, 포스페이트또는히스티딘또는 Tris 완충제 ) 를함유할수있지만항상요구되는것은아니다. 현탁액은바람직하게는무균및무발열원이다. 현탁액

20 은유리수성포스페이트이온을포함할수있으며, 예컨대 1.0 내지 2O mm, 바람직하게는 5 내지 15 mm, 더바 람직하게는약 10 mm 농도로존재한다. 현탁액은또한염화나트륨을포함할수있다. [0195] [0196] [0197] [0198] [0199] [0200] [0201] [0202] [0203] [0204] [0205] [0206] [0207] [0208] [0209] [0210] [0211] 본발명은알루미늄히드록시드와알루미늄포스페이트의혼합물을사용할수있다 [62]. 이경우히드록시드보다알루미늄포스페이트가더존재할수있으며, 예컨대중량비로적어도 2:1, 예컨대, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 등이다. 환자투여용조성물중의 Al +++ 의농도는바람직하게는 10mg /ml 미만, 예컨대 5mg /ml, 4mg /ml, 3mg /ml, 2mg /ml, 1mg /ml 등이다. 바람직한범위는 0.3 내지 1mg /ml이다. 최대 0.85mg / 투약량이바람직하다. 하나이상의알루미늄염보조제를포함할뿐만아니라, 보조제성분은하나이상의추가의보조제또는면역자극제를포함할수있다. 이러한추가적인성분은 3-O-탈아실화모노포스포릴지질 A 보조제 ('3d-MPL'); 및 / 또는수중유에멀젼을포함하나이에한정되지않는다. 3d-MPL은또한 3 탈-O-아실화모노포스포릴지질 A 또는 3-O- 데스아실-4'-모노포스포릴지질 A로서언급되어왔다. 이명칭은모노포스포릴지질 A 중환원말단글루코스아민의위치 3이탈-아실화되었다는것을나타낸다. 이것은 S.minnesota의헵토스가없는돌연변이로부터제조되며, 화학적으로지질 A와유사하지만산-불안정포스포릴기및염기-불안정아실기가결핍되어있다. 이것은단핵백혈구 / 대식세포계통의세포를활성화하며 IL-1, IL- 12, TNF-α 및 GM-CSF를포함하는여러사이토키닌의방출을촉진한다. 3d-MPL의제조는참고문헌 171에본래설명되어있으며, Corixa Corporation에의해상표 MPL 으로제조및판매되어왔다. 더욱상세한내용은참고문헌 114 내지 117에서발견할수있다. 약학적조성물본발명의조성물은약학적으로허용가능하다. 이들은대개항원이외의성분들을포함하며, 예컨대이들은일반적으로하나이상의약학적담체 ( 들 ) 및 / 또는부형제 ( 들 ) 를포함한다. 이러한성분의완전한논의는참고문헌 183에서이용가능하다. 조성물은일반적으로수성형태일것이다. 조성물은수은물질을포함하지않는다. 이것은 2-페녹시에탄올과같은보존제를포함할수있지만, 보존제가없는백신이보다바람직하다. 장성을조절하기위해, 나트륨염과같은생리학적염을포함하는것이바람직하다. 염화나트륨 (NaCl) 이바람직하며, 이는 1 내지 20 mg/ml로존재할수있다. 존재할수있는다른염은염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산나트륨이수화물, 염화마그네슘, 염화칼슘등을포함한다. 조성물은일반적으로삼투질농도가 200mOsm/kg 내지 400mOsm/kg, 바람직하게는 mOsm/kg이며, 더바람직하게는 mOsm/kg의범위에있다. 삼투질농도는백신화에의해야기되는통증에영향을주지않는것으로이전에보고되었지만 [184], 그럼에도불구하고이범위에서삼투질농도를유지하는것이바람직하다. 조성물은하나이상의완충제를포함할수있다. 일반적인완충제는포스페이트완충제 ; Tris 완충제 ; 보레이트완충제 ; 숙시네이트완충제 ; 히스티딘완충제 ; 또는시트레이트완충제를포함한다. 완충제는일반적으로 5-2O mm의범위로포함된다. 완충제는에멀전의수성상으로존재할수있다. 조성물의 ph는일반적으로 5.0 내지 8.1, 더일반적으로 6.0 내지 8.0, 예컨대 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.8이다. 본발명의방법은따라서패키징전에벌크백신의 ph를조절하는단계를포함한다. 조성물은멸균된것이바람직하다. 조성물은바람직하게는글루텐이부재한다. 백신은항생물질 ( 예컨대네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B) 이부재한다. 조성물은단일면역화를위한물질을포함할수도있고, 또는복수면역화를위한물질 ( 즉, ' 복수투약 ' 조성물 ) 을포함할수도있다. 복수투약장치는대개백신중에보존제를포함한다. 이필요성을피하기위해서, 백신은물질인출을위한무균어댑터를갖는용기에함유될수있다. 비록인플루엔자백신은일반적으로약 0.5ml의투여부피로투여되고, 어린이에게는절반의투약량 ( 즉, 약 0.25ml) 이투여될수있으며, 따라서단위투약량은환자에게 0.5ml 투여되도록선택될것이다. 조성물또는키트성분의패키징본발명의방법은백신을용기, 특히의사에의한사용을위한유통을위해용기에위치시키는단계를포함할

21 수있다. 이러한용기에패키징한후용기를냉각하지않는다. [0212] [0213] [0214] [0215] [0216] [0217] [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] [0223] [0224] 백신에적합한용기는바이알, 비강스프레이및일회용주사기를포함하며, 이들은멸균되어야한다. 조성물 / 성분이바이알에위치하는경우, 바이알은유리또는플라스틱물질로제조되는것이바람직하다. 바이알은조성물이첨가되기전에멸균되는것이바람직하다. 라텍스-민감성환자의문제를피하기위하여, 바이알은라텍스가없는마개로밀봉되는것이바람직하며, 모든패키징물질내에라텍스가부재하는것이바람직하다. 바이알은단일투약량백신을포함할수있거나, 또는 1회투약량이상 (' 복수투약 ' 바이알 ), 예컨대 10회투약량을포함할수있다. 바람직한바이알은무색유리로제조된다. 바이알은미리충전된주사기가캡에삽입될수있고, 주사기의내용물이바이알로방출될수있으며, 바이알의내용물이주사기로다시이동될수있도록적합하게된캡 (cap)( 예컨대, Luer lock) 을구비할수있다. 바이알로부터주사기제거후바늘을부착하여조성물을환자에게투여할수있다. 캡은밀봉부또는덮개내부에위치하여, 밀봉부또는덮개는캡이접근할수있기전에제거되어야한다. 바이알은그내용물의항균제거를허용하는캡, 특히다중투약바이알용캡을구비할수있다. 조성물 / 성분이주사기에패키징되는경우, 주사기는이것에부착된바늘을구비할수있다. 바늘이부착되지않은경우, 별도의바늘이조립및사용을위하여주사기와함께공급될수있다. 이러한바늘은내장될수있다. 안전한바늘이바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지및 5/8-인치 25-게이지바늘이일반적이다. 주사기는기록유지를용이하게하기위해내용물의제품번호, 인플루엔자시기및유효기간이인쇄된접착식라벨과함께제공될수있다. 주사기의플런저 (plunger) 는흡인동안플런저가사고로제거되는것을예방하기위하여마개가구비된것이바람직하다. 주사기는라텍스고무캡및 / 또는플런저를구비할수있다. 1회용주사기는단일투약량의백신을함유한다. 주사기는바늘부착전에팁을밀봉하기위하여팁캡 (tip cap) 을구비하는것이일반적이며, 팁캡은부틸고무로제조되는것이바람직하다. 주사기및바늘이별도로패키징되면, 바늘을부틸고무차단재로막는것이바람직하다. 바람직한주사기는상표 "Tip-Lok" 로판매되는것이다. 용기는절반-투약량부피을표시하여어린이에대한송달을용이하게할수있다. 예를들면, 0.5ml 투약량를함유하는주사기는 0.25ml 부피를나타내는표시를한다. 유리용기 ( 예컨대, 주사기또는바이알 ) 가사용되는경우, 소다라임유리보다는규산염유리로제조된용기를사용하는것이바람직하다. 조성물은백신의상세, 예컨대투여설명서, 백신내의항원의상세등을포함하는인쇄물과 ( 예컨대, 동일박스에 ) 조합될수있다. 설명서에는경고문, 예컨대예방접종후과민성반응의경우쉽게입수가능한아드레날린용액을사용하라는등의경고문을포함할수있다. 치료방법및백신의투여본발명의조성물은인간환자로의투여에적합하며, 본발명은본발명의조성물을환자에투여하는단계를포함하는환자에서면역반응을일으키는방법을제공한다. 본발명은또한의약품으로서용도를위한본발명의키트또는조성물을제공한다. 본발명의방법및용도에의하여발생된면역반응은일반적으로항체반응, 바람직하게는보호성항체반응을포함할것이다. 항체반응의평가, 중화능력및인플루엔자바이러스예방접종후보호에대한방법은당해기술분야에공지되어있다. 인간연구는인간인플루엔자바이러스의헤마글루티닌에대한항체역가가보호와연관되어있다는것을보여주었다 ( 약 30-40의혈청시료적혈구응집-억제역가는동종바이러스에의한감염으로부터약 50% 보호를제공 )[185]. 항체반응은일반적으로적혈구응집억제, 미세중화법, 일원방사면역확산 (SRID), 및 / 또는일원방사용혈 (SRH) 에의하여측정된다. 이들분석기술은당해기술분야에공지되어있다. 본발명의조성물은다양한방식으로투여될수있다. 가장바람직한예방접종경로는근육내주입 ( 예컨대팔또는다리 ) 에의한것이나, 다른이용가능한경로는피하조직주입, 비강내 [ ], 구강 [189], 진피내 [190,191], 경피, 피부 [192] 등을포함한다. 본발명에따라제조된백신은성인및어린이모두의치료에사용될수있다. 인플루엔자백신은현재 6개월령부터소아및성인면역에사용되도록제안되고있다. 따라서, 환자는 1세미만, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세, 또는적어도 55세일수있다. 백신투여에바람직한환자는고령 ( 예컨대 50세이상, 60세이상, 및바람직하게는 65세이상 ), 유아 ( 예컨대 5세이하 ), 입원환자, 건강관리종사자, 군인및군사요원, 임산부,

22 만성환자, 면역결핍환자, 백신투여전 7일이내에항바이러스화합물 ( 예컨대오셀타미비르또는자나미비르화합물 ; 하기참조 ) 을투여한환자, 난알레르기가있는사람및해외여행자이다. 백신은이들그룹에단독으로적합하지는않지만, 그러나집단적으로보다일반적으로사용될수있다. 유행성균주에대해서는, 모든연령의그룹으로의투여가바람직하다. [0225] [0226] [0227] [0228] [0229] [0230] [0231] [0232] [0233] [0234] [0235] [0236] 바람직한본발명의조성물은효능에대한 CPMP 기준중 1, 2 또는 3을만족한다. 성인의경우 (18-60세), 이들기준은 : (1) 70% 혈청방어율 ; (2) 40% 혈청전환율 ; 및 / 또는 (3) GMT의 2.5배증가이다. 고령자의경우 (>60세), 이들기준은 : (1) 60% 혈청방어율 ; (2) 30% 혈청전환 ; 및 / 또는 (3) GMT의 2배증가이다. 이들기준은적어도 50명의환자를대상으로한공개표식연구에기초한다. 치료는단일투약계획또는복수투약계획에의할수있다. 복수투약은 1차면역계획및 / 또는추가면역계획에사용될수있다. 복수투약계획에서, 동일하거나상이한경로, 예컨대비경구프라임및점막부스트, 점막프라임및비경구부스트등에의해다양한투약을제공할수있다. 1회투약이상의투여 ( 일반적으로 2회투약 ) 는특히면역학적으로미경험환자, 예컨대인플루엔자백신을전에투여받은경험이없는사람, 또는신규의 HA 아형에대한접종 ( 유행성발병 ) 에유용하다. 다중투약은일반적으로적어도 1주간격 ( 예컨대약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주등 ) 으로투여될것이다. 본발명에의하여생산되는백신은다른백신과실질적으로동시에, 예컨대홍역백신, 볼거리백신, 풍진백신, MMR 백신, 수두백신, MMRV 백신, 디프테리아백신, 파상풍백신, 백일해백신, DTP 백신, 컨쥬게이트된 H. 인플루엔자타입 b 백신, 불활성화폴리오바이러스백신, B형간염바이러스백신, 수막구균컨쥬게이트백신 ( 예컨대 4가 A-C-W135-Y 백신 ), 호흡기세포융합바이러스백신, 폐렴구균컨쥬게이트백신등과실질적으로동시에 ( 예컨대동일한의학적자문또는의료전문가나예방접종센터에방문시에 ) 환자에투여될수있다. 폐렴구균백신및 / 또는수막구균백신이실질적으로동시에투여되는것이특히노령의환자에유용하다. 이와유사하게, 본발명의백신은항바이러스화합물, 특히인플루엔자바이러스에대하여활성인항바이러스화합물 ( 예컨대, 오셀타미비르및 / 또는자나미비르 ) 이실질적으로동시에 ( 예컨대동일한의학적자문또는의료전문가방문시에 ) 투여될수있다. 이들항바이러스는뉴라미다아제억제제, 예컨대 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노 -5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1- 시클로헥센-1-카르복시산또는 5-( 아세틸아미노 )-4-[( 아미노이미노메틸 )-아미노]-2,6-안하이드로-3,4,5-트리데옥시 -D-글리세로-D-갈락토논- 2-에논산및이들의에스테르 ( 예컨대에틸에스테르 ) 및이들의염 ( 예컨대포스페이트염 ) 을포함한다. 바람직한항바이러스는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1- 에틸프로폭시 )-1-시클로헥센-1-카르복시산, 에틸에스테르, 포스페이트 (1:1) 이며, 이는오셀타미비르포스페이트 (TAMIFLU ) 로도알려져있다. 일반용어 " 포함하는 (comprising)" 은 " 포함 (including)" 및 " 구성된 (consisting)" 을포괄하며예컨대 X를 " 포함하는 " 조성물은배타적으로 X로구성될수있거나또는추가적인무엇인가를포함할수있으며, 예컨대 X + Y 이다. 단어 " 실질적으로 (substantially)" 는 " 완전히 (completely)" 를배제하지않으며, 예컨대 Y가 " 실질적으로부재한 " 조성물은 Y가완전히부재할수있다. 필요한경우, 단어 " 실질적으로 " 는본발명의정의에서생략될수있다. 수치 x에관한용어 " 약 " 은, 예를들어 x±10% 를의미한다. 특별한언급이없다면, 둘이상의성분이혼합되는단계를포함하는방법은특정혼합순서를요하는것이아니다. 따라서성분들은어떠한순서로혼합될수도있다. 세성분이존재하는경우, 두성분이서로조합될수있고, 그후조합물이제3 성분등과조합될수있다. 동물 ( 및특히소 ) 물질이세포배양에사용되는경우, 감염성해면상뇌증 (TSE), 및특히소해면상뇌증 (BSE) 이부재한공급원으로부터획득하여야한다. 전체적으로, 동물-유래된물질이전부부재인배양세포가바람직하다. 화합물이조성물의일부로서신체에투여되는경우, 그화합물은적합한프로드러그로대안적으로대체될수있다. 세포기질이재배열또는역유전학절차에사용되는경우, 예컨대 Ph Eur general chapter 5.2.3에서와같이인

23 간백신생산에사용이승인된것이바람직하다. [0237] [0238] [0239] [0240] [0241] [0242] [0243] [0244] 폴리펩티드서열간의식별은 MPSRCH 프로그램 (Oxford Molecular) 으로수행되는 Smith-Waterman 상동성조사알고리즘에의해갭개방패널티 =12 및갭확장패널티 =1로친화성갭조사를사용하여바람직하게결정된다. 본발명을행하기위한방식난을사용하기보다는, 인플루엔자 A 및 B 바이러스를참고문헌 27 및 47의지침에따라현탁배양액에서 MDCK 세포에서성장시켰다. 배양액은어떤항생물질을포함하지않았다. 최종배양배지를정화하여비리온을제공하였으며, 그다음이것을크로마토그래피및한외여과 / 정용여과하였다. 불활성화를위해포름알데히드를사용하기보다는, 참고문헌 59의지침에따라얻어진물질중의비리온을 β- 프로피오락톤 ( 최종농도 0.05% v/v; 16-20시간동안 2-8 에서인큐베이션한다음 37 에서 2-2.5시간동안인큐베이션함으로써가수분해 ) 을사용하여불활성화하였다. 그다음 CTAB을사용하여비리온을분할하였고, 여러가지다른공정단계는정제표면단백질을함유하는최종 1가벌크백신을제공하였다. 최종벌크물질은수은보존제, 항생물질, 포름알데히드및난-유래물질을함유하지않았다. 벌크로부터백신의개별투약량을제조하였으며, 각각 A/H1N1, A/H3N2 및 B 균주로부터 HA 15μg을함유하였다. 이백신은임상시험에서환자에게투여되었으며, 대조군환자는난-유래 Agrippal ( 포름알데히드및미량의항생물질을포함할수있음 ) 을투여받았다. MDCK-유래백신은양호한내성을나타내었으며, 매우면역원성이고 ( 면역학적으로 Agrippal에뒤떨어지지않음 ), 인플루엔자백신의평가를위한 CHMP 및 CBER 기준을만족하였다. MDCK-유래백신의세개다른부분에의해유사한면역성및안전성프로파일이유도되었으며, 이것은세포배양제조기술이일정한임상결과를발생시킬수있다는것을확인한다. 본발명은단지예시의방식으로설명되었으며본발명의범위및본질내에서변형이이루어질수있다는것이이해될것이다

24 [0245] 참고문헌 [0246]

25 [0247]

26 [0248]

27 [0249]

28 [0250]