추가로 본 발명은 상기 형질전환 복제 소로부터 유래된 정육(meat) 및 가공식품에 관한 것이다. 대표도 도 2 색인어 광우병, 프리온, 핵 이식란, 형질전환 복제 소 명세서 도면의 간단한 설명 도 1은 마우스의 PrP 유전자 및 단백질의 모식도를 나타낸 것이다. 도

Transcription

1 (51) Int. Cl. 7 C12N 5/16 (19)대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 년06월14일 (21) 출원번호 (22) 출원일자 2003년12월09일 (71) 출원인 재단법인서울대학교산학협력재단 서울특별시 관악구 봉천동 산 4-2 (72) 발명자 황우석 서울특별시강남구논현동22논현아파트106동701호 이병천 서울특별시관악구봉천동1708-1두산아파트207동203호 강성근 서울특별시관악구봉천7동서울대학교교직원아파트936동807호 장구 서울특별시관악구봉천2동1703봉천아파트104동1805호 고경희 서울특별시도봉구창2동 /1 박희정 서울특별시송파구거여동34-1거여2단지동아아파트201동1203호 김성기 경기도화성군팔탄면가재리359-4 박정수 경기도여주군여주읍상리316-1 구자홍 경기도이천시증포동선경아파트205동1601호 안규리 서울특별시종로구명륜동2가236아남아파트201동708호 한재용 서울특별시강남구대치동316은마아파트6동1407호 이창규 서울특별시관악구봉천7동244-2교수아파트나동301호 한호재 광주광역시 북구 두암2동 무등파크맨션 102동 807호 정의배 충청북도청주시흥덕구수곡동세원홍실아파트101동1306호 임정묵 서울특별시서초구반포동60-4미도아파트308동404호 (74) 대리인 이세진 김성남 심사청구 : 없음 (54) 프리온 변이체를 보유한 형질전환 복제 소 및 이의 생산방법 요약 본 발명은 소의 프리온 (이하 PrP라 함) 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민 이 리신으로 치환된 PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 도입된 소 유래 체세포 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 소의 핵 이식란 및 이의 작제방법에 관한 것이다. 본 발명은 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 PrP 변이체를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소 및 이의 생산방법에 관한 것이다

2 추가로 본 발명은 상기 형질전환 복제 소로부터 유래된 정육(meat) 및 가공식품에 관한 것이다. 대표도 도 2 색인어 광우병, 프리온, 핵 이식란, 형질전환 복제 소 명세서 도면의 간단한 설명 도 1은 마우스의 PrP 유전자 및 단백질의 모식도를 나타낸 것이다. 도 2는 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체인 PrPmut1, PrPmut2 및 PrPmut3의 모식도를 나타낸 것이다. 도 3은 ODA(Oligonucleotide-directed Dual Amber) - LA(Large and Accurate) PCR을 이용하여 본 발명에 따른 소 의 PrP 변이체를 작제하는 방법을 간략하게 도시한 것이다. 도 4의 좌측 도면은 ODA-LA PCR 산물의 전기영동 결과를 나타낸 것이고, 우측 도면은 본 발명에 따른 소의 PrP 변이 체를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터인 PrPmut-pKF18k의 유전자 지도를 나타낸 것이다. 도 5는 본 발명에 따라 작제된 소의 PrP 변이체의 염기 서열과 소의 천연형 PrP 염기 서열을 비교 분석한 결과 및 그래 프를 나타낸 것이다. 도 6은 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 소에서 유래된 체세포에 도입하기 위해서 작제한 벡터인 PrPmut-pCMS/EGFP 및 PrPmut-pIRESpuro의 유전자 지도를 나타낸 것이다. 도 7은 PrPmut-pCMS/EGFP 및 PrPmut-pIRESpuro를 제한효소로 처리하고 전기영동한 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 및 5는 초코일(supercolied) DNA, 레인 2 및 6은 EcoRI으로 처리, 레인 3 및 7은 BamHI으로 처리, 레인 4는 분자량 마 커). 도 8은 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 수핵 난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸 사진이다. 도 9는 탈핵 과정으로 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 제 1 극체와 핵을 제거하는 과정을 나타낸 것이다. 도 10은 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫과 이식용 피펫(4)으로 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸 사진 이다. 도 11은 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 발현하는 형질전환 복제 소를 나타낸 사진이다. 발명의 상세한 설명 발명의 목적 발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술 본 발명은 프리온 변이체를 보유한 형질전환 복제 소 및 이의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 (1) 소의 PrP 아 미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 도입된 소 유래 체세포 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 소의 핵 이식란 및 이의 작제방법; (2) 소의 PrP 아미 노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 PrP 변이체를 발현하는 것 을 특징으로 하는 형질전환 복제 소 및 이의 생산방법 및 (3) 상기 형질전환 복제 소로부터 유래된 정육(meat) 및 가공식품 에 관한 것이다. 프리온 질병(Prion disease)은 사람 및 동물 모두의 신경계에 영향을 미치는 서로 밀접하게 연관된 전염병의 일종이다. 인간 및 포유동물에서 뇌의 스폰지양 병변(spongiform encephalopathy)이 보고(Prusiner, 1991; Cunninham, 1992)된 이후로 프리온 단백질은 치명적이고 지속적인 퇴행성 신경증을 야기한다고 보고되었다 (Prusiner et al. 1994). 동일한 병 인으로 각 동물에서 발병되는데, 면양 및 산양의 스크래패(scrapie), 인간의 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt Jakob disease; CJD) 및 그 변종, 밍크의 전염성 뇌염(transmissible encephalopathy of minks), 사슴의 만성 소모성질환 (chronic wasting disease of deer), 고양이 해면양뇌증(feline spongiform encephalopathy), 산양, 명주원숭이 (marmosets), 마우스 및 타조에서 프리온 질병이 발생된다고 보고된 바 있다 (Prusiner, 1998)

3 특히, 소에서 발병하는 프리온 질병인 광우병(Bovine Spongiform Encephalopathy)은 잠복기가 매우 길며 치사율이 100%에 이른다 (Stekel et al. 1996). 주로 3~5년령의 소에서 발현되나 20개월령부터 15년령까지 발생되는 것으로 알려 져 있다 (Stekel et al. 1996). 주요 임상증상으로는 광폭한 행동, 지각과민 및 운동실조, 소리나 접톡에 과민한 행동, 발길질 증가, 귀의 과대운동 및 털 핥기, 보폭의 감소 및 만곡성 보행, 후지 운동실조나 보행마비, 유량 및 체중감소, 아급성의 경우 광우병 특이적 면역결핍 을 나타낸다 (David, 1992; DeArmond, 1995). 광우병의 특징적인 뇌 병변은 도 1에서 보는 바와 같이, 정상적인 뇌아 비교하여 신경세포 세포질의 심한 공포화 (vacuolation) 및 변성, 뇌회백질 교질의 공포화 및 astrocyte 침윤, obex, caudal cerebellar peduncle 및 mesencephalon 등에서 양측, 대칭성 병변이 관찰된다 (Ironide, 1997). 이러한 광우병은 감염 후 면역반응이나 염증반응을 동반하지 않음으로 사망 전 진단이 어려운 실정이다. 폐사우 뇌의 병 리조직학적 검사, 예를 들면 면역조직화학염색, 웨스턴 블랏팅을 통한 변형 프리온 단백질 검출 및 전자현미경을 이용한 검경 등이 유일한 진단법으로 알려져 있다. 한편, 광우병은 알츠하이머병과 유사한 발생기전 및 초기 임상증상을 가지는 것으로 보고되었으며 (Gajdusek et al., 1989 ; Besssen, 1996), 포유류 신경(교)세포 체세포 막에 정상적으로 존재하는 프리온 단백질이 변형되면서 발생한다고 보고되었다 (Piccardo et al., 1990 ; Diedrich et al., 1991). 즉, 유전자의 점 돌연변이에 의하여 α-helical 구조가 β- sheet로 바뀐 변형 프리온은 신경세포의 라이소좀(lysosome)에 축적되게 된다(Prusiner, 1998). 생쥐실험을 통하여 체 내 정상 프리온이 인위적으로 증폭되면 광우병 감수성이 증가한다고 밝혀진 바 있다 (Westaway et al., 1994). 광우병은 Protein X에 의하여 이종간 감염이 가능하며 Bcl-60, Hsp-60 등의 단백질이 protein X 후보단백질로 추정된 다 (Kurschner et al., 1996 ; Edenhofer et al., 1996). 이와 관련하여, 스크래피 감염이 된 면양 유래의 동물성 골 육분 사료가 광우병 감염원으로 보고된 바 있다 (Nathanson et al., 1997 ; Stekel et al., 1996). 위와 같이, 임상역학을 기반으로 한 감염원으로부터 격리시키는 것만으로는 광우병 발생을 근본적으로 차단할 수는 없 으며, 광우병의 근본적인 예방대책은 감염원 노출이나 환경 변화에 의한 체내 프리온 단백질 변형을 방지하는 것이 하나의 방법이 될 수 있다 할 것이다. 구체적으로, 감염원에 대한 정상 프리온의 감수성을 낮추는 방법 또는 프리온 단백질 생합성 억제에 의한 감염원 영향 배제가 또한 추천될 수 있다. 이러한 방법의 예로 프리온 유전자 적중 생쥐를 생산하고 이에 변형 프리온을 인공감염 한 경우에 광우병이 유발되지 않 는 사례가 있었으며 (Bueler et al., 1992), 프리온 유전자적중으로 생산된 양 1두가 있었지만 생존하지 못하였다 (Denning et al., 2001). 이와 같이, 생쥐를 제외한 동물에서 프리온 유전자 적중으로 생산된 살아있는 동물이 생산된 없으며, 더욱이 소에 있어 서 광우병을 유발하는 프리온이 적중된 동물의 생산이 알려져 있지 않았다. 이에, 본 발명자들은 생물정보처리를 기반으로 한 유전자 변형기술 및 체세포 핵이식 동물복제기술을 접목하여 광우병 내성소를 생산하는 것에 성공하고 본 발명에 이르게 되었다. 발명이 이루고자 하는 기술적 과제 본 발명은 한 관점으로서, 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 도입된 소 유래 체세포 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 핵 이식란을 제공한다. 본 발명은 다른 관점으로서, (1) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 작제하는 단계; (2) 소에서 유래한 체세포주에 상 기 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 도입시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; (3) 수핵 난자의 난구 세포 를 제거하고, 수핵 난자의 제 1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; (4) 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 수핵 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단 계를 포함하는 PrP 변이체를 발현하는 소의 핵 이식란 작제방법을 제공한다. 본 발명은 또 다른 관점으로서, 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타 민이 리신으로 치환된 PrP 변이체를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소를 제공한다. 본 발명은 또 다른 관점으로서, (1) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 작제하는 단계; (2) 소에서 유래한 체세포주에 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 도입시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; (3) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제 1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준 비하는 단계; (4) 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계 및 (5) 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함하는 소의 PrP 변이체를 발현하는 형질전환 복제 소 의 생산방법을 제공한다. 본 발명은 또 다른 관점으로서, 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타 민이 리신으로 치환된 PrP 변이체를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소로부터 유래된 정육(meat) 및 가공식 품을 제공한다

4 발명의 구성 및 작용 Ⅰ. 용어의 정의 본 발명의 명세서에서 사용된 아미노산 일문자는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한 다: A: 알라닌; B: 아스파라긴 또는 아스파트산; C: 시스테인; D: 아스파트산; E: 글루탐산; F: 페닐알라닌; G: 글라이신; H: 히스티딘; I: 이소루신; K: 리신; L: 류신; M: 메티오닌; N: 아스파라긴; P: 프롤린; Q: 글루타민; R: 아르기닌; S: 세린; T: 쓰레오닌; V: 발린; W: 트립토판; Y: 티로신; Z: 글루타민 또는 글루탐산. 본 발명의 명세서에 사용된 용어 "PrP 변이체"는 정상적인 소의 PrP를 코딩하는 유전자에서 하나 이상의 코돈을 치환 (substitution)하여 결과적으로 변이되지 않거나 천연형(native)인 PrP와 비교했을 때 아미노산 서열에서 변화가 있는 단 백질을 말한다. 구체적으로 본 발명의 명세서에서 "PrP 변이체"는 다음 3개의 PrP 변이체를 포함한다: (1) 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민(Q)이 아르기닌(R)으로 치환된 PrP 변이체로, 본 명세서에서 Q179R 또는 "PrPmut1"로 표기될 수 있음 (서열번호 1); (2) 소의 PrP 아미노산 서열 중 230번째 글루타민(Q)이 리신(K)으로 치환된 PrP 변이체로, 본 명세서에서 Q230K 또는 "PrPmut2"로 표기될 수 있음(서열번호 2) 및 (3) 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민(Q)이 아르기 닌(R)으로 치환되고, 230번째 글루타민(Q)이 리신(K)으로 치환된 PrP 변이체로, 본 명세서에서 Q179R+Q230K 또는 "PrPmut3"으로 표기될 수 있음(서열번호 3). 본 발명의 명세서에 사용된 용어 " 벡터" 는 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 숙주세포(즉, 체세포) 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하고, 숙주세포 내로 유입될 수 있어야 하며, 특히, 본 발명에서는 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여야 한다. 본 발명의 명세서에 사용된 용어 재조합 발현 벡터 라는 용어는 일반적으로 외래 유전자가 숙주세포에서 발현될 수 있 도록 벡터에 작동가능하게 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 재조합 발현 벡터는 수 개의 카피 및 그의 삽입된 이종의 DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해 서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어야 만 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자를 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication)을 같이 포함하고 있 는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵 세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주세포 내에서 유용 한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다. 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 발현하기 위해서, 진핵 숙주세포에서 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터가 무난하게 이용될 수 있다. 바람직하게는 포유동물 숙주세포에서 효율적으로 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터를 이 용한다. 그러한 발현 벡터는 상업적으로 입수 가능하며, 이에 제한되는 것은 아니지만, pmsg Inducible mammalian Expression vector(amersham Biosciences), pires2-egfp(bd Biosciences Clontech), pcmv/blue vector(bd Biosciences Pharmingen), prk-5-c-gfp Mammalian Expression vector(bd Biosciences Pharmingen), pcdnatm3.1(+) * (Invitrogen), Vitability pires-hrgfp-2 vector(stratagen), psfv1 Eukaryotic Expression Vector(Invitrogen) 등이 있다. 본 발명의 명세서에 사용된 용어 조절 서열 (expression control sequence) 은 본 발명의 폴리펩타이드 발현에 필수 적인 혹은 이로운 핵산 서열들을 말한다. 각각의 조절 서열은 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 천연적(native) 혹은 외래적(foreign)일 수 있다. 그러한 조절 서열에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩타 이드(propeptide) 서열, 프로모터, 인핸서(enhancer) 혹은 업스트림(upstream) 활성화 서열, 시그날 펩타이드 서열 및 전 사 종결인자 등을 포함한다. 최소한 조절 서열은 프로모터를 포함한다. 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 발현시키기 위하여, 포유동물 세포에서 발현을 지시하는데 적합한 조절 서열 중 어느 것이라도 사용될 수 있다. 이러한 조절 서열의 예에는 SV40 및 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들(예, 아데노바 이러스 주요 후기 프로모터), MT-1(멜라티오네인 유전자) 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 초기 유전자(CMV), 인 간 신장 인자 1α(human elongation factor 1α, EF-1α), 초파리 미니멀 열 충격 단백질 70(Drosophila minimal heat shock protein 70) 프로모터, 라우스육종바이러스(RSV) 프로모터, 인간 인간의 유비퀴틴C(UbC) 프로모터, 인간 성장 호 르몬 전사 종결인자, 아데노바이러스 Elb 영역 폴리아데닐화 서열 및 소의 성장 호르몬(BGH)의 폴리아데닐화 서열 등을 포함한다. 본 발명의 명세서에 사용된 용어 작동가능하게 연결된(operably linked) 은 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배 치된 상태를 의미한다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가 능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 - 4 -

5 (leader)가 성숙한 단백질의 분비에 참여함으로써 기능을 발휘했다면 그 단백질에 작동가능하게 연결된 것이다. 프로모터 가 코딩 서열의 전사를 조절했다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 리보좀 결합 자리가 코딩 서열의 해독이 가능 한 위치에 놓여져 있다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 은 연결된 DNA 서 열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 적합한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존 재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고 뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker) 를 사용한다. 본 발명의 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 새로운 DNA(즉, 세포에서 외인성 DNA)의 결합 후 세포에서 유도된 영구 적 또는 일시적인 유전적 변화, 바람직하게는 영구적인 유전적 변화를 의미한다. 유전적 변화는 새로운 DNA와 숙주세포 의 결합에 의해서 또는 에피솜(episome) 요소로서 새로운 DNA의 일시적 또는 안정한 보존에 의해 달성될 수 있다. 세포 는 포유류 세포이며, 영구적인 유전적 변화는 일반적으로 세포의 게놈으로 DNA의 도입에 의해서 달성된다. 본 발명의 명세서에 사용된 용어 "형질전환 복제 소"는 그것의 세포의 어떤 부분에 있는, 또는 그것의 생식 계통 DNA(대 부분 또는 모든 그것의 세포의 게놈 서열에 있는)에 안정하게 통합된 염색체외 요소로서 존재하는 이종성 핵산 서열을 갖 는 소를 의미한다. 본 발명의 명세서에서 사용된 용어 "핵 이식(nuclear transfer)"은 소에서 유래된 체세포 핵을 탈핵된 난자(또는 수핵 난 자)에 이식하는 과정을 의미하며, 이러한 과정을 통하여 수득한 세포는 "핵 이식란(nuclear transfered embryo)"이라고 한다. 상기 체세포의 핵은 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 보유하는 것을 특징으로 한다. Ⅱ. 제조방법 본 발명은 (1) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 작제하는 단계; (2) 소에서 유래한 체세포주에 상기 PrP 변이체를 코 딩하는 DNA를 도입시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; (3) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제 1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; (4) 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 수핵 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계를 포함하는 PrP 변이체를 발현하는 소의 핵 이식란 작제방법을 포함한다. 본 발명에 따른 핵 이식란의 작제방법에 있어서, 상기 소의 PrP 변이체는 소의 PrP 아미노산 중 179번째 글루타민이 아 르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 변이체를 의미한다. 또한, (1) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 작제하는 단계; (2) 소에서 유래한 체세포주에 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 도입시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; (3) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제 1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; (4) 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계 및 (5) 상기 핵 이식란을 대 리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함하는 소의 PrP 변이체를 발현하는 형질전환 복제 소의 생산방법을 포함한 다. 마찬가지로 본 발명에 형질전환 복제 소의 생산방법에 있어서, 상기 소의 PrP 변이체는 소의 PrP 아미노산 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 변이체를 의미한다. 특히, 본 발명에서는 형질전환 복제 소를 생산하기 위한 방법으로 동물 복제 기술을 이용할 수 있다. 상기 단계의 외래 유 전자가 도입된 체세포의 형질을 동물 복제 기술을 이용하여 복제되는 산자에 그대로 발현되도록 함으로써 모자이크 현상 이 없는 100% 형질전환 복제 소를 효율적으로 생산할 수 있다. 본 발명에서의 체세포 복제 기술은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 국제특허출원 PCT/KR00/00707 "체세포 복제동물 및 그 생산 방법"(황 등, )의 기술을 이용할 수 있다. 즉, 체세포 핵 이식은 탈핵 과정을 통해 미수정란 으로부터 유전 물질(genetic material)을 포함한 핵을 제거하고 다른 형질전환된 체세포의 핵을 주입하는 것을 포함한다. 또한 이렇게 생산된 핵 이식란을 재구성된 핵 이식란(recontructed embryo) 이라고 하고, 상기 핵 이식된 재구성된 핵 이 식란을 체외 배양하여 발육시켜 대리모에 이식하여 체세포 복제 동물을 생산할 수 있다. 이하에서는, 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA와 이 유전자가 도입된 핵 이식란의 작제방법 및 형질전 환 복제 소의 생산방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명한다. 제 1단계 : 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA의 작제 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해서 제조할 수 있다. 이러한 방 법에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 올리고뉴클레오타이드에 의해서 매개되는 돌연변이(oligonucleotide-mediated mutagenesis) 및 카세트 돌연변이(casette mutagenesis) 등이 포함된다. 본 발명에 있어서, 78056bp의 광우병 프리온 단백질 코딩 유전자(prp)는 Gen Bank Accession Number AJ298878로부터 확인할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드에 의해서 매개되는 돌연변이 방법은 본 발명에 따른 PrP 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 제조함 에 있어서, 특히 바람직한 방법이다. 이러한 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, Zoller et al. supra에 의해서 개시되어 있 다. 간단하게 설명해서, PrP 변이체를 코딩하는 DNA는 DNA 주형에 목적한 변이를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 혼 성화시키면 변이될 수 있다. 여기서, 상기 DNA 주형은 변이되지 않거나 천연형(native)인 PrP를 코딩하는 DNA를 포함하 는 플라스미드가 바람직할 것이다. 혼성화 후, DNA 폴리머라아제를 이용하여 상기 주형에 상보적인 완전한 두 번째 가닥 을 합성하면 이 가닥은 PrP 유전자에서 선택한 변이를 코딩하게 될 것이다

6 통상적으로, 길이(length)면에서 약 25개 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 사용된다. 더 짧은 올리 고뉴클레오타이드가 도입될 수도 있지만 최적의 올리고뉴클레오타이드는 치환을 코딩하는 뉴클레오타이드의 양쪽으로 주 형에 상보적인 12개 내지 15개의 뉴클레오타이드를 가지는 것이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드가 주형 DNA에 충분히 혼성화될 수 있기 때문이다. 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 기술에 의해서 합성될 수 있다(Crea et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol.75, p.5765). 본 발명의 양태로서, 하나의 아미노산이 변이된 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 제공한다. 소의 PrP를 코딩하는 DNA를 주형으로 하고, 변이를 코딩하는 합성 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머(primer)로 사용하여 PCR을 수행한다. PCR의 가열(heating) 단계에서 이중 가닥 주형이 분리되면 각각의 단일 가닥 주형에 상보적인 프라이머가 혼성화 (hybridzation)된다. DNA 합성효소(DNA polymerase)는 변이를 코딩하는 프라이머의 -OH기로부터 주형에 상보적인 뉴 클레오타이드를 5- 에서 3- 방향으로 연결시켜 나간다. 결과적으로 두 번째 가닥은 변이를 코딩하는 프라이머를 포함하게 되므로 유전자 상에서 목적한 변이를 코딩하게 되는 것이다. 상기 두 번째 가닥은 PCR의 반복되는 복제 단계에서 주형 DNA로 작용하게 되므로 변이를 코딩하는 유전자는 계속 증폭될 것이다. 본 발명의 추가 양태로서, 둘 이상의 아미노산 변이를 포함하는 소의 PrP 변이체가 제공된다. 그러나 변이시키고자 하는 둘 이상의 아미노산이 폴리펩타이드 상에서 멀리 위치한다면(10개 이상의 아미노산에 의해서 떨어져 있는 경우) 목적한 변이를 모두 코딩하는 하나의 올리고 뉴클레오타이드를 제작하는 것은 불가능하다. 대신에 다른 방법들이 도입되어야 한 다. 첫 번째 방법은 각각의 아미노산이 변이를 포함하는 개별적인 올리고 뉴클레오타이드를 제작하는 것이다. 그 올리고 뉴클레오타이드들이 단일가닥 주형 DNA에 동시에 어닐링(annealing)되면 그 주형으로부터 합성된 두 번째 가닥 DNA는 목적한 아미노산 변이 모두를 코딩할 것이다. 본 발명에서 사용한, 또 다른 방법은 그러한 변이체를 생산하기 위해서 두 차 례 이상의 돌연변이 유발(mutagenesis)을 포함하고 있다. 1차 돌연변이 유발에서는 천연형의 DNA가 주형으로 사용되고, 첫 번째 목적한 아미노산 변이를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드가 이 주형에 어닐링되면 이형(heteroduplex) DNA가 제작된다. 2차 돌연변이 유발에서는 1차(상기) 돌연변이 유발에서 생성된, 변이된 DNA를 주형으로 이용한다. 그러므로 이 주형은 이미 적어도 하나 이상의 변이를 포함하고 있는 것이다. 부가적인 아미노산 변이를 포함하는 올리고 뉴클레오타 이드가 이 주형에 어닐링되면 결과적으로 생산되는 DNA는 1차와 2차 돌연 변이 유발의 변이를 모두 코딩하게 되는 것이 다. 이 결과물 DNA는 3차 돌연변이 유발에서 주형으로서 사용될 수 있다. 요약하면 상기된 둘 이상의 뉴클레오타이드를 변이시키는 방법은 하나의 뉴클레오타이드를 변이시키는 방법을 여러 차례 반복하는 것과 같다. 카세트 돌연변이 방법이 또한 본 발명에 따른 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 제조하는데 선호되는 방법이다. 이러 한 방법은 Well et al. supra에 의해서 개시된 기술을 기초로 한다. 출발 물질은 변이를 유발하고자 하는 소의 PrP 유전자 를 포함하는 플라스미드(또는 다른 벡터)이다. 카세트 돌연변이 방법에서는 변이시키고자 하는 위치에만 특이적으로 존재 하는 제한 효소가 있는 경우에 이용하는 것이 바람직하다. 그러나 이는 필수 사항은 아니다. 만약 그러한 제한 효소 자리가 존재하지 않는다면 상기된 올리고뉴클레오타이드에 의해서 매개되는 돌연변이 방법을 사용하여 PrP 유전자의 적절한 위 치에 도입하는 것이 가능하다. 제한 효소 자리가 플라스미드에 도입된 이후에 이 효소로 상기 플라스미드를 처리하여 선형 화한다. 목적한 돌연변이를 포함하면서 제한 효소 자리들 사이에 위치하는 DNA 서열을 가지는 이중 가닥 올리고뉴클레오 타이드는 통상적인 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 이 두 가닥은 개별적으로 합성된 다음 통상적인 기술을 사용해서 함 께 혼성화시킨다. 이러한 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드가 카세트로서 명명된다. 이러한 카세트는 선형화된 플라스미드 의 양 말단과 상용성을 가진 3- 및 5-말단을 가지도록 제조되어야 하며, 이들이 플라스미드에 직접적으로 연결될 수 있다. 이러한 플라스미드는 상기 과정을 통하여 목적한 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 포함하게 될 것이다. 본 발명에서 보다 바람직한 양태는 올리고뉴클레오타이드에 의해서 지시되는 이중 앰버 방법(oligonucleotidedirected Dual Amber Method : ODA PCR)이다. 통상적으로 이중 앰버 방법에는 벡터 및 숙주의 조합으로 pkf18k/19k 및 E.coli MV1184가 이용된다. 상기 벡터는 카나마이신-저항 유전자 상에 이중 앰버 돌연변이를 함유하고 있기 때문에, MV1184와 같은 sup0 숙주에 도입되었을 때 카나마이신에 대한 저항성을 나타내지 않을 것이다. 목적한 돌연변이를 포함 하는 올리고뉴클레오타이드 및 선택 프라이머를 이용해서 PCR을 수행하면 상기 PCR 프라이머로 인하여 카나마이신에 대 한 저항성 유전자 상에 앰버 돌연변이가 회복된다. 이렇게 증폭된 DNA는 동시에 PCR 주형으로서 이용되기 때문에, 중합 효소 반응은 계속 진행되어 nick 이중가닥 플라스미드를 수득할 수 있게 된다. 이 nick DNA로 E.coli MV1184를 형질전환 하면, 상기 nick은 수선되어, 목적한 위치-특이적 돌연변이를 포함하는 돌연변이체가 카나마이신을 함유하는 배지 상에서 배양될 수 있다. 제 2단계 : 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 도입된 핵 이식란 (1) 공여핵 세포의 준비 본 발명에서는 성숙한 소에서 수득한 세포를 배양한 세포주를 공여핵 세포로 사용할 수 있다. 이 때, 소의 품종이 특별히 제한되는 않는다. 소에서 수득한 세포는 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포, 난구세포 또는 태아 섬유아 세포이며, 이들을 마더(Marther)와 바네스(Barnes)의 방법(참조 : Marther & Barnes, Methods in cell Biology, vol.57, 1998, Animal Cell Culture Methods, Academic Press)을 응용하여 배양함으로써 세포주를 작제할 수 있다. 예를 들어, 자궁관류액에 P/S 항생제(페니시린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)가 함유된 인삼염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 원심분리하여 세척한 다음, 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential amino acid) 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 39, 5% CO 2 의 조건으로 배양 한다. 자궁내막의 일부 또는 난관으로부터 난관상피 조직을 채취하여, 상기 PBS로 세정하고, 트립신과 EDTA가 포함된 용액 에서 정치한 다음, 이를 원심세정하고, 상기한 조건에서 배양할 수 있다

7 난구-난모 세포 복합체를 하이알루로니다제로 처리하여 난자를 둘러싸고 있는 난구 세포층을 분리하고, 난구 세포층에 상기 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 39, 5% CO 2 의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심 세정하고, 상기한 조건에 서 배양할 수 있다. 귀의 피부 조직으로부터 채취된 연골 조직, 면한 피부 내측의 조직, 근육조직 또는 태아의 동체와 사지 부위에서 연골 조 직을 포함하지 않는 부위의 조직을 세정하고 세절한 다음, 상기 트립신-EDTA 용액 및 콜라게나제 II 용액을 첨가하여 39, 5% CO 2 의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심 세정하고, 상기한 조건에서 배양할 수 있다. 이처럼 작제된 세포주는, 일정 시간 간격으로 세포주의 배양액을 제거하고 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 정치한 다음, 새로운 배양액으로 교체하며 배양하는 계대 배양, 윌머트(Wilmut) 등의 방법을 응용하여 배양 중인 세포주의 배양액을 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM으로 교체하여 배양하는 혈청기아배양(참조: Wilmut et al. Nature, 385: , 1997) 또는 동결보존 등의 방법을 통하여 보존되며, 보존된 세포주는 공여세포로서 제공될 수 있다. (2) 재조합 벡터의 작제 본 발명에서는 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 체세포에 도입하는 방법으로 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질감염방법 등을 사용할 수 있다. 생화학적 방법에는 칼슘을 매개체로 하는 칼슘 침전법, 세포막 성분인 양이온 리피드를 매개체로 하는 리포펙션 (lipofection) 또는 리피드는 아니지만 양전하는 지니는 폴리머(polymer)를 매개체로 하는 방법 등을 사용할 수 있는데, 이 는 실험의 용이성과 효율성 및 안정성 측면에서 많이 이용되는 방법이다. 물리적인 방법에는 일렉트로포레이션, 유전자 총, 세포내 직접 미세주입법 등을 사용할 수 있다. 바이러스 매개 방법에는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스의 게놈에 원하는 DNA를 클로닝하여 세포에 감염시키는 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서는 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하여 생화학적인 방법으로 유전자를 도입하는 방법을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는, 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하고 리피드-매개 방법을 이용하여 PrP 변이체를 코 딩하는 DNA를 도입할 수 있다. (3) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA의 공여핵 세포내로의 도입 외래 유전자의 세포 내로의 도입은 작제된 재조합 벡터를 체세포 내로 도입시키는 방법으로 행한다. 외래 유전자를 세포 내로 도입시키는 방법으로는 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질감염방법 등을 사용할 수 있다. 바람직하게 는, 본 발명에서는 생화학적인 방법으로 FuGene6(Roche Molecular Biochemicals, IN, USA), 리포펙타민 플러스 (Lipofetamine Plus, Life Technologies) 및 엑스진 500(ExGen 500, MBI Fermentas)을 사용할 수 있다. Fugene6은 다성분 지방계 시약으로서 다양한 세포 타입에서 높은 도입 효율을 가지고 세포 독성이 없으며, 혈청 첨가 여부에 관계 없이 기능을 발휘하고 최소한의 최적화 작업이 쉬운 장점을 가진다. 리포펙타민 플러스는 양전하 지질이며, 엑스진 500은 비지방 양전하 중합체로 여러 가지 세포 타입에서 높은 효율이 보고되어 있다. 본 발명에서는 소의 PrP 변이체 유전자의 도입을 위하여 바람직하게는 Fugene6을 이용한다. 즉, 소의 PrP 변이체 유전 자를 리포좀 형성 성분과 혼합하여 생성된 리포좀-DNA 구조 복합체를 세포 배양액에 첨가하여 일정시간 배양하고, 이 복 합체의 DNA 구조가 세포 내로 도입되도록 50-70% 정도 증식한 체세포에 형질감염을 실시할 수 있다. FuGene6을 통한 효과적인 도입을 위해서는 세포마다 최적 방법을 선정하고 각 변수들을 최적화하여 유전자를 도입함으로써 PrP 변이체 발 현을 극대화할 수 있다. 구체적으로, 제 3단계에서는 상기 제 2단계에서 준비된 체세포주에 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 도입시킬 수 있 다. 즉, 상기 제2단계의 재조합 벡터와 시약을 혼합하여 배양 배지와 함께 배양한다. 유전자의 도입 후, 도입된 체세포를 자 외선 하에서 표준 플루오레세인 이소티오사이아테이트(FITC) 필터 셋을 이용하여 검사할 수 있다. (4) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 도입된 체세포의 선별, 증식 및 동결 보존 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 도입된 세포의 선별은 벡터 상의 항생제 또는 마커 유전자를 이용하여 선별할 수 있다. 이 같은 항생제에 의한 선별은 항생제의 적정 선별 농도를 정함으로써 효과적으로 이루어지도록 할 수 있다. 세포의 종 류에 따라 차이가 있으나, 적중된 세포는 하나의 세포로부터 증식을 시작하게 되므로 다음 단계의 확인을 위해서는 일정 수 이상으로 증식하는 것이 바람직하다. 항생제를 통한 선별 과정이 이루어지면 정상 배양으로 전환하고, 세포의 신속한 증식과 배양 시 세포 사멸에 의한 불필요한 손실을 감소시키기 위해 적절한 성장인자와 세포사멸 억제제 등을 첨가하는 방 법을 적용할 수 있다. 또한, 마커 유전자로 녹색 형광을 발광하는 단백질인 GFP를 코딩하는 유전자를 이용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. PrP 변이체를 코딩하는 DNA의 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 구조체로 적중된 세포는 GFP 유전자에 의해 현미 경 하에서 자외선 필터를 이용하여 관찰하면 초록색을 띄는 세포만을 선별할 수 있다. GFP 유전자 도입 세포의 증식 배양 및 동결 보존은 전술한 항생제 선별 및 GFP 발현유무로 선별한 형질전환 세포를 대 상으로 할 수 있다. 핵 이식용 세포로 사용할 세포는 선별된 하나의 세포로부터 증식시키며, 특히 섬유아세포는 다수의 세 - 7 -

8 포로 증식되기까지 상당한 시간이 소요되고 세포가 노화되어 증식이 둔화되면서 성장을 멈추기 때문에, 단 시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존할 수 있다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵 이식 시 핵 공여세포로서의 안정성에 적합토록 하는 것 이 바람직하다. (5) 수핵 난자의 준비 본 발명에서는 소의 난소에서 미성숙 난자를 채취 및 배양하여 성숙한 수핵 난자로 이용될 수 있다. 헤페스(HEPES, N- [hydroxyethyl]piperazine-n'-[2-ethanesulfonic acid]) 완충 용액에 TCM199(Tissue Culture Medium 199)가 용해 된 세정용 TCM199 배지에서 채취된 미성숙 난자를 선별한 후, 5% CO 2 의 조건 하에 16 내지 22시간 동안 배양하여 난자 를 성숙시킨다. 이때, 사용되는 배양액은 TCM, 나트륨-피루브산 및 P/S 항생제가 포함된 배양용 TCM199 배양액에 에스트라디올 (Estradiol, E2), 난포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone) 및 소 태아 혈청을 포함한다. 상기 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 수핵 난자의 투명대의 일부를 제거하고 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵된 난자를 작제할 수 있다. 먼저, 성숙한 수핵 난자를 하이알루로니다제가 용해된 세정용 TCM199배양액에 넣고, 난구 세포를 물리적으로 제거한 후, 세정용 TCM199 배양액으로 세정한다. 그런 다음, 난구 세포가 제거된 난자를 사이토칼라신 B(cytochalasin B) 용액 으로 옮기고, 미세작업장치를 이용하여 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 난자의 전체 세포질 의 10 내지 15%에 해당하는 양의 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵시킬 수 있다. 이어, 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 배양용 TCM 배양액에 정치시킨다. 이때, 사용되는 사이토칼라신 B 용액은 사이토칼라신 B를 DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시키고, 이를 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석한 것이다. 자외선 하에서 Hoechst 33342(Sigma Co.)로 염색된 세포질체를 관찰함으로써 탈핵 여부를 확인할 수 있다. (6) 소의 PrP 변이체를 보유한 공여핵 세포의 준비 공여핵 세포의 준비를 위해 상기에서 형질감염된 세포를 PBS에서 세척하여 사용할 수 있다. 그 후, 단일 세포 현탁을 위 해 0.1% 트립신-EDTA를 사용하여 배양된 세포들을 트립신 처리한다. 세포들을 펠릿화하고 0.5%(v/v) FBS가 포함된 200μl PBS에서 재현탁화시키고 핵 이식에 사용하기 전에 마이크로원심관으로 옮긴다. (7) 공여핵 세포와 수핵 난자의 융합 및 활성화 상기와 같이 준비된 공여 핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고, 이식된 핵 이식란을 전기융합을 통해 활성화시킬 수 있다. 먼저, 공여 핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 작제한다. 배양용 TCM199 배양액에 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 PHA-P(phytohemagglutinin) 용액으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 PHA-P 용액에 있는 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입시켜서 핵 이식란을 작제할 수 있다. 이어, 세정용 TCM 199 배양액으로 세정하고 정치시킨다. 이때, 사용되는 PHA-P 용액은 PHA-P를 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 것이다. 상기 정치된 핵 이식란을 세포 조작기를 이용하여 전기융합시킬 수 있다. 먼저, 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨 용액에 넣고, 이를 세포 조작기에 연결시킨 2개 전극 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣음 다음, 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시킨다. 그런 다음, 전압은 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간은 10 내지 20μs, 횟수는 0.01 내지 10초, 바람직하게는 1초 간격으로 1 내지 5회, 바람직하게는 2회의 조건으로 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시킬 수 있다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액과 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 상기 사이토칼라신 B 용 액으로 정치한 후 활성화시킨다. 이때 사용하는 만니톨 용액은 HEPES 완충용액에 MgSO 4 또는 MgCl 2, BSA 및 만니톨이 용해된 ph 7.2 내지 7.4의 용액으로서 Ca 2+ 가 포함되어 있다면 융합과 동시에 활성화되지만, Ca 2+ 가 포함되어 있지 않다 면 활성화시키는 과정을 수행한다. Ca 2+ 가 포함되지 않은 만니톨 용액을 사용하여 세포 융합을 수행한 경우, 활성화시키는 과정은 융합된 핵 이식란을 암 실에서 이오노마이신(ionomycin) 용액에 정치하여 활성화시킨 후, 소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배 양액으로 세척하고 정치하여 이오노마이신을 제거한다. 이때, 이오노마이신 용액은 DMSO에 이오노마이신을 용해시켜서 원액을 만들고 사용할 때, BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석하여 사용한다. (8) 핵 이식란의 후활성화 및 체외 배양 본 발명은 활성화된 핵 이식란을 후활성화시킨 후, 체외 배양 단계를 포함한다. 소태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액에 정치된 활성화된 핵 이식란은 사이클로헥시미드 (cycloheximide) 용액 또는 DMAP(4-dimethylaminopurine) 용액에 침지하여 배양하여 후활성화시킨 다음, 체외 배양용 배지에서 5% CO 2 배양기 또는 5% CO 2, 7% O 2, 88% N 2 배양기를 사용하여 배양한다. 이때, 사이클로헥시미드 용액은 에 탄올에 사이클로헥시미드를 용해시킨 용액으로서, 체외 배양용 배지에 첨가하여 사용하고, DMAP 용액은 DMAP를 체외 배양용 배지에 용해시켜 사용한다. 또한, 체외 배양용 배지는 msof 배지(참조 : 표1)를 사용한다

9 선택적으로 상기의 체외 배양된 핵 이식란을 동결 보존한 후, 필요한 때에 이를 용해시켜서 사용할 수도 있다. 핵 이식란 을 동결할 경우, 먼저 동결할 수정란을 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고, P/S 항생제, CaCl 2, 포도당, MgCl 2, Na- 피루베이트 및 PBS를 포함하는 동결액에 넣은 다음, 온도를 천천히 저하시킨 후, 액체 질소를 동결시킨다. 이처럼 동결된 핵 이식란을 용해시킬 때는 액체질소에서 꺼낸 핵 이식란을 상온에서 일정기간 동안 정치했다가 온수에 넣어 융해시킨다. 융해된 핵 이식란은 글리세롤, 자당, BSA 및 PBS가 포함된 용해용 배지에 넣고, 글리세롤의 양이 많은 배지에서 적은 배지로 차례대로 정치시켜서 핵 이식란 내의 동결액을 제거할 수 있다. 상기의 성숙한 홀스타인종의 소에서 유래한 형질전환된 체세포를 공여핵 세포로 하여 제조한 핵 이식란을 "SNU-B6"이 라고 명명하여, 이를 2003년 11월 25일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10556BP로 기탁하였다. 표 1. msof 배지 성 분 농 도 NaCl 99.1~106mM KCl 7.2mM NaHCO3 25mM NaH2PO4 1.2mM Na-락테이트 5mM CaCl2 2H2O 1.7mM MgCl2 6H2O 0.5mM Na-피루베이트 0.3mM 포도당 1.5mM 페놀레드 10μg/l BSA 8mg/ml 카나마이신 0.75μg/ml 필수아미노산 2% 비필수아미노산 1% L-글루타민 1mM ITS 0.5% 제 3단계: 형질전환 복제 소의 생산방법 상기의 체외 배양된 핵 이식란을 대리모에 이식하여 송아지를 생산할 수 있다. 이때, 핵 이식란은 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적된 상태로 대리모의 자궁에 이식될 수 있다. Ⅲ. 용도 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 PrP 변이 체를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소로부터 유래된 정육(meat) 및 가공식품을 포함한다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명 하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지 식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. <실시예> 실시예 1 : 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA의 작제 (1) 주형(소의 야생형 PrP 유전자가 삽입된 플라스미드)의 작제 - 9 -

10 pkf18k 벡터(Takara, Japan)의 Eco RI 제한효소 부위에 소의 야생형 PrP 유전자를 도입하여 주형 DNA를 제조하였다. 이 벡터로 supe주(e.coli JM109)를 열충격 (heat shock, 42도 45초) 형질전환시킨 다음, 이 형질전환체를 카나마이신 (kanamycin) 및 X-gal을 함유한 배지에서 배양하였다. 하얀색을 띄는 콜로니(colony)를 배양하여 얻은 박테리아로부터 plasmid miniprep kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 주형 dsdna를 제조하였다. (2) ODA-LA PCR 방법을 이용한 PrP 변이체를 코딩하는 DNA의 작제 변이 유발용 올리고뉴클레오타이드(이하, 변이 유발용 프라이머라고 함)는 실시예 1의 (1)에서 작제된 벡터의 (+) 가닥 에 상보적인 서열을 갖도록 디자인하였으며, 앰버 돌연변이 복원용 프라이머(이하, 선택 프라이머라고 함)는 상기 벡터의 (-) 가닥에 상보적인 서열을 갖도록 디자인하였다. 앞서 작제된 소의 야생형 PrP 유전자가 삽입된 플라스미드를 주형으로 하고, 목적한 변이체에 따라 선택된 변이 유발용 프라이머 및 선택 프라이머를 이용하여 ODA-LA PCR을 수행하였다(도 3 참조). PCR용 튜브(0.5ml)에 10ng 주형 DNA, 1μl 변이 유발용 프라이머(10pmol), 1μl 선택 프라이머(5pmol), 5μl 10 x LA PCR 버퍼, 8μl dntp 혼합물, 0.5μl LA Taq 폴리머라제를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 10μl가 되도록 첨가하여 PCR 반응액을 제조하였다. 반응액의 증발을 방지하기 위해 50μl 미네랄 오일로 중층하고 열 순환기(thermal cycler)에 튜브를 장착하였다. 열 순환기의 조건은 먼저 94 에서 1분간 변성(denaturation)하고, 55 에서 1분간 어닐링(annealing)한 다 음 72 에서 3분간 연장(extention)하는 1 사이클을 30회 반복하도록 설정하였다. 반응 종료 후 반응액은 4 로 냉각하였 다. 반응액의 일부를 전기영동한 결과 변이 유발용 프라이머 및 니크(nick)가 들어있는 ds DNA를 확인할 수 있었다(도 4). 한편, 반응액(50μl)에 25μl 4M 암모늄 아세테이트 및 100μl 에탄올을 첨가하고, -20 에서 30분간 방치하였다. 미니 원심기로 10분간 원심분리하여 침전을 회수하였다. 70% 에탄올로 2~3회 침전을 세정한 후 에탄올을 제거하고 진공건조 하여 침전을 건조시켰다. 이 침전물을 5μl의 멸균된 증류수로 현탁하였다. 이상과 같이, 작제된 벡터를 PrPmut-pKF18k 로 명명하였다. (3) 컴피턴트(competent) 세포의 제조 E. coli MV1184 균주를 M9 글루코오스 플레이트에서 37, 하룻밤 배양하여 단일 콜로니를 형성하였다. 이 콜로니를 수집하여 다시 M9 글루코오스 배지(테트라사이클린 10μl/ml 및 스트렙토마이신 30μg/ml 함유)에서 37, 하룻밤 배양한 다음 배양액 1.5ml를 동량의 20% 글리세롤(glycerol)과 혼합해서 -80 에서 보존하였다. 이어서, 단일 콜로니로부터 콜 로니(colony)를 배양하여 얻은 박테리아로부터 plasmid miniprep kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 주형 dsdna를 제 조하였다. (4) 형질전환체의 제조 실시예 1의 (3)에서 제조된 E.coli MV1184 컴피턴트 세포 100μl 및 실시예 1의 (2)에서 제조된 에탄올 침전으로 회수 한 DNA 함유 용액 2μl를 혼합하여 0 에서 30분간, 42 에서 45초간, 0 에서 1~2분간 정치하였다. 37 의 LB 배지를 첨가하여 총 부피가 1ml가 되도록 한 다음 이를 1시간 동안 진탕하였다. LB-Km 플레이트(카나마이신(Km) 50μl/ml를 포 함) 상에 상기 배양액을 적당량 플레이팅(plating)한 다음 37 에서 하룻밤 배양하였다. 발생한 몇 개의 콜로니 세포에서 DNA를 추출하여 염기 서열을 결정하고, 변이체를 확인하였다(도 5). 도 5에 따르면, 소의 야생형 PrP 유전자와 본 발명에 따른 변이체의 염기 서열의 동일성(identity)이 348/350(99%)라는 것을 확인할 수 있는데, 이것은 둘의 염기 서열이 99% 일치한다는 것으로, 본 발명에 따라 치환된 2개의 염기를 제외한 다 른 염기는 일치한다는 것을 의미한다. (5) 핵 이식용 벡터의 작제 앞서 작제된 PrPmut-pKF18k 벡터를 핵 이식하고자 하는 포유동물(mammalian) 체제로 바꾸기 위하여 pcms/gfp 벡 터(Clontech, CA) 및 pirespuro2 벡터(Clontech, CA)를 사용하였다. PrPmut-pKF18k 벡터로부터 Eco RI를 이용하여 795bp의 PrPmut를 잘라내어, pcms/gfp와 pirespuro2 벡터의 EcoRI 자리로 연결시켰다. 이렇게 형성된 벡터를 각각 PrPmut-pCMS/GFP 및 PrPmut-pIRESpuro2로 명명하였고, 유전자 지도는 도 6에 나타내었다. 한편, 상기 벡터들을 EcoRI로 처리하고 전기영동한 결과(도 7) PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 목적한 위치에 삽입되었 음을 확인할 수 있었다. 이어서, 상기 벡터들을 BamHI으로 처리하고 전기영동한 결과(도 7), PrP 변이체를 코딩하는 DNA 가 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 실시예 2 : 핵 이식란의 작제 (1) 공여핵 세포의 준비 먼저, 소의 귀에서 채취한 피부 내측의 조직을 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco BRL, Life Technologies, USA)로 세정 하고 100 메시(mesh)의 크기로 세절한 다음, 이를 상기 인산염 완충 식염수에 넣고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 및 1mg/ ml 콜라게나제(collagenase type II)를 첨가하여 39, 5% CO 2 의 포화습도 배양기 내에 1시간 동안 정치시킨 후, 원심세 정시킨다. 그런 다음, 10% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 1% 비필수 아미노산 용액 및 P/S 항생제가 첨가된

11 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL, Life Technologies, USA) 배양액에서 부유시키고, 이를 세포 배양용 디쉬로 옮겨 39, 5% CO 2 의 조건 하에 포화습도 배양기 내에서 배양하여, 세포주를 수득하였다. DMEM에서 배 양 중인 세포주를 0.5% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM에서 7일간 배양한 다음, 배지를 제거하고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 2분간 정치시켰다. 그런 다음, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 재부유시켜서 세포의 수가 2000 개/0.1ml가 되도록 조절하고, 이를 에펜돌프 시험관에 분주하여 공여핵 세포를 준비하였다. (2) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA의 도입을 통한 체세포의 형질전환 실시예 2에서 작제된 Prpmut2-pIRESpuro2 벡터를 FuGene6(Cat. No ; Roche Molecular Biochemicals, IN, USA)을 사용하는 리피드-매개 방법으로 공여핵 세포 내로 삽입하였다. 세포들을 형질전환 전 1일 동안 2차 배양하였다. 세포들을 35mm 디쉬에서 2ml 당 1~3 ⅹ 10 5 세포의 수로 플레이팅되 고, 50~80%의 컨플런시에 도달할 때까지 밤새 배양하였다. 그 후, Prpmut2-pIRESpuro2 벡터는 실험자 프로토콜에 따 른 FuGene6를 사용하여 세포주 내로 삽입되었다. 간단히 말해서, Prpmut2-pIRESpuro2(1μg) + 형질전환 시약(3μg) + DMEM(96μl)의 혼합물을 상온에서 15분간 배양한 후에 배양 배지 상에 오버레이(overlay)하였다. (3) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 도입된 세포의 선별, 증식 및 동결 보존 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA가 도입된 세포주는 벡터(PrPmut-pIRESpuro2 및 PrPmut-pCMS/GFP)에 따라 항 생제 또는 GFP의 발현을 관찰함으로써 선별하였다. 유전자 적중시 DNA 구조체(DNA construct)에 이용된 양성 마커인 암피실린 등 항생제에 대한 저항성 유전자는 세포 내에서 재조합이 정확하게 이루어지면 저항성 유전자 및 GFP 유전자가 발현된다. 본 발명에는 암피실린 항생제를 통한 선별 과정이 이루어졌으며, 3-4일 간격으로 3주간 선별하였다. 또한, 형질감염 2 일 후에 형질감염된 각 세포를 자외선 하에서 표준 플루오레세인 이소티오사이아네이트 (FITC; 여기 파장: nm B-mode filter, Nikon, Japan) 필터 셋을 사용하여 검사하여 GFP의 발현 여부를 검사하여 형질감염된 세포를 선별하였 다. 전술한 항생제 선별 또는 GFP 발현 여부로 유전자 적중이 확인된 PrP 변이체 유전자가 도입된 세포는 핵 이식용 세포로 증식 배양하였다. 특히 섬유아세포는 다수의 세포로 증식되기까지 상당한 기간이 소요되고 점차 세포가 노화되어 증식이 둔화되면서 성장을 멈추기 때문에 단시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양하는 것이 관건이다. 암피실린 항생제 선별 후 세포들은 하나의 집락으로 자라게 되는데 이를 트립신으로 처리하여 96-웰의 배양용기로 옮겨 배양한 후 이들이 증식 되면 이후 24-웰로 옮겨 배양하고 더 나아가서 12-웰과 6-웰까지 증식 배양을 실시하였다. 증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존하였다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵 이식 시 핵 공여세포로서의 안정성에 적합토록 해야 한다. (4) 수핵 난자의 준비 도축장에서 채취된 소의 난소로부터 18G 주사침이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 직경 4mm 내외의 난포를 흡입한 다 음, 1cm 간격의 격자 눈금을 그은 100mm 디쉬에 난포를 옮긴 후, 난구 세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난 자를 선별하였다. 선별된 난자를 세정용 TCM199 배양액(참조: 표 2)이 2ml씩 분주된 35mm 디쉬에서 3회에 걸쳐 세정하고, 배양용 TCM199 배양액(참조: 표 3)으로 최종적으로 세정한 다음, 에스트라디올(Estradiol) 용액 (참조: 표 4) 0.5μl, 난포자극호 르몬 용액 (참조: 표 5) 12.5μl, 배양용 TCM199 배양액 450μl 및 10% 소 태아 혈청이 포함된 배지에서 5% CO2의 조건 하에 20시간 동안 배양하여 수핵 난자를 준비하였다. 성 분 농 도 TCM 분말 Gibco HEPES 10mM NaHCO 3 2mM 표 2. 세정용 TCM199 배양액 BSA 0.5% W/V P/S 항생제 1%(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 100mg) 표 3. 배양용 TCM199 배양액 성 분 농 도 TCM 액체 Gibco Na-피루베이트 1mM

12 P/S 항생제 1%(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg) 표 4. 에스트라디올 용액 성 분 농도 에스트라디올 5mg 에탄올 10ml 표 5. 난포자극 호르몬 성 분 농 도 난포자극호르몬 2AU 배양용 TCM199 배양액 10ml (5) 체세포의 핵 이식 상기 실시예 5에서 준비된 수핵 난자를 세정용 TCM199 배양액에서 1회 세정하고, 5ml의 세정용 TCM199 배양액에 하 이알루로니다제(Sigma Chemical Co., USA) g을 용해시킨 용액 111μl과 세정용 TCM199 배양액 1ml을 혼합하 여 최종 농도를 0.1%로 적정한 하이알루로니다제 용액 내에 난자를 옮긴 다음, 난구 세포를 제거하고 세정용 TCM199 배 양액에서 3회 세정하고 정치시켰다. 이어서, 7.5mg/ml의 농도가 되도록 DMSO에 사이토칼라신 B (Sigma Chemical Co., C-6762, USA)를 용해시킨 용액 1μl와 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액 1ml을 혼합한 사이토칼라신 B 용액으로 난자를 옮기고, 미세작업장치(Narishige, Japan)를 사용하여 정치된 수핵 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 전체 세포질의 10 내지15%에 해당하는 양의 난자의 세포질을 제거함으로써 난자를 탈핵시켰다. 좀 더 구체적으로 탈핵 과정을 설명하면, 작업용 디쉬를 미세작업장치의 미세작업판 위에 놓고, 미세작업장치의 왼쪽 암 (arm)에는 고정용 피펫을, 오른쪽 암에는 절개용 피펫을 장착하였다. 그런 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절 개용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정하였 다. 두 피펫을 작업용 미소적에서 상하 유동시키면서, 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고, 피펫 끝을 미 소적의 중앙에 위치시켰다. 내경 200μm 이상의 세정용 마우스 피펫을 이용하여 세정용 TCM199 배양액에서 난자를 사이 토칼라신 B 용액으로 이동시켰다. 이어, 미세작업장치의 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자에 먼저 초점을 맞추고, 2 개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정하였다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제 1극체가 위치하도 록 하고, 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤, 유압을 걸어 난자를 고정시켰다. 도 8은 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸다. 도 8에서 보듯이, 절개용 피펫 (2)을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 후, 세포질에 손상을 가하지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시켰다. 고정용 피펫(1)에 압력을 걸어 난자(3)를 분리하고, 절개용 피펫이 통과한 제 1극체 상단부의 투명대에 고정용 피펫을 접 촉시킨 다음, 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개하였다. 도 9는 수핵 난자의 제 1 극체와 핵을 제거하는 탈핵 과정을 나타낸다. 도 9에서 보듯이 난자(3)를 회전시켜 절개창을 수 직으로 위치시키고, 고정용 피펫(1)을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 지지한 다음, 절 개용 피펫(2)을 난자의 위에서 가볍게 눌러 난자를 탈핵시켰다. 이처럼 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세 정하고, 배양용 TCM199 배양액에 정치시켰다. 그런 다음, 미세작업장치를 사용하여 탈핵된 수핵 난자에 준비된 공여세포를 이식하였다. 먼저, 5mg의 PHA-P를 10ml 의 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 용액 100μl과 400μl의 세정용 TCM199 배양액을 혼합한 PHA-P 용액으로 작업 용 디쉬 상단 중앙에 4μl의 이식용 미소적을 만들고, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 이식용 미소적 위 아래에 각각 1개 씩의 4μl의 공여세포 미소적을 만들었다. 이들 미소적을 미네랄 오일로 도포한 후, 작업용 디쉬를 미세작업판에 위치시켰 다. 미세작업장치에 장착된 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체한 후, 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 이식용 미소적으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여세포를 이식용 미소적으로 이동시켰다. 도 10에는 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸다. 도 10에서 보듯이, 탈핵된 난자(3)의 절개창을 양 피펫과 1시 방향으로 놓고 고정용 피펫(1)으로 고정한 다음, 이식용 피펫(4)을 절개창으로 주입하고, 유압으로 공여세포를 주입하 여 핵이식란을 작제하였다. 이처럼, 작제된 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액으로 옮겨서 3회 세정 후, 정치시켰다. (6) 세포 융합 및 활성화

13 BTX-세포 조작기(electro cell manipulator, ECM 2001, BTX, USA)를 사용하여 핵 이식란을 전기 융합하여 활성화시 켰다. 0.5mM HEPES 완충용액(pH 7.2)에 0.1mM MgSO 4, 0.05% BSA 및 0.28M 만니톨을 용해시킨 만니톨 용액 15μl을 세 정용 마우스 피펫으로 핵 이식란이 있는 세정용 TCM199 배양액에 첨가하고, 1분간 정치시켰다. 그런 다음, 세정용 마우 스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨 용액에 주입하여 다시 1분간 정치시키고, 세정 용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 만니톨 용액에 넣었다. 이어서, 핵 이식란을 BTX-세포 조작기에 연결시킨 2개 전 극(3.2mm chamber No. 453) 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣고, 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시켰 다. 전압은 1kV/cm, 시간은 15μs, 횟수는 1초 간격으로 2회의 조건에서 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시켰 다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액을 거쳐 세정용 TCM199 배양액으로 옮긴 후, 3회 세정하였다. DMSO 1.34ml에 이오노마이신(Sigma Chemical Co., USA) 1mg을 용해시키고, 최종농도가 5μM이 되도록 1% BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액을 첨가하여 제조된 이오노마이신 용액에 융합된 핵 이식란을 암조건에서 4분간 정치하여 활성화시킨 후, 융합된 핵 이식란을 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 배지가 분주된 35mm 디쉬 내에서 5분간 정치시켜 서 이오노마이신을 제거하였다. 이렇게 수득한 핵 이식란을 SNU-B6으로 명명하였고, 부다페스트 국제기탁기관인 생명공학연구원 부설 유전자 은행에 2003년 11월 25일자로 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 10556BP를 부여받았다. (7) 핵 이식란의 동결보존, 융해 및 이식 상기 핵 이식란을 장기간 보존하기 위하여, 동결 보존을 수행하였다. 먼저, 동결용 배지(참조: 표 6, 표 7)를 35mm 디쉬 에 분주하고, 동결기를 가동하여 -5 를 유지시킨 다음, 동결할 핵 이식란을 선발하여 10% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고 동결용 배지에 넣어 20분간 정치시켰다. 이어, 0.25ml 스트로우(straw)의 양 끝단에 공기층을 2층씩 만들어, 가 운데에 수정란이 포함된 동결용 배지를 흡입하여 수정란을 장착하고, 가열한 집게(forcep)를 사용하여 열 밀봉(heat sealing)하였다. 그런 다음, -5 에서 동결기에 스트로우를 장착하고, 5분간 이 온도를 유지시킨 다음, 액체질소로 예냉한 집게로 스트로우의 하단을 살짝 집어주어 식빙(seeding)시켰다. 식빙한 직후, -0.3 /min의 속도로 -30 까지 온도를 하 강시킨 다음, -30 가 되면 10분간 온도를 유지시키고, 이를 액체질소 탱크에서 동결보존하였다. 표 6. 동결용 PBS 성 분 농 도 PBS(1x) Gibco Na-피루베이트 0.033mM 포도당 0.15mM CaCl2 2H2O 0.171mM P/S 항생제 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg) MgCl2 6H2Om 0.049mM 표 7. 동결용 배지 성 분 농도 동결용 PBS(표 8) 2.25ml(45%) 소 태아 혈청 2.25ml(45%) 글리세롤 0.5ml(10%) 이처럼 동결 보존한 핵 이식란을 융해시키기 위하여, 먼저 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS와 융해용 배지를 35mm 디 쉬에 3ml씩 분주하고, 각각에 글리세롤을 첨가하여 포함된 글리세롤 농도가 0%, 3% 및 6%가 되도록 제조하였다 (참조: 표 6 및 표 8). 그런 다음, 액체질소 탱크로부터 동결된 스트로우를 꺼내 공기 중에서 5초간 노출시킨 후, 직경 20cm 이상 인 용기에 담겨진 30 의 온수에 30초간 담가서 융해시켰다. 이어, 무균적으로 스트로우의 양 끝단 공기층을 절단하여, 스 트로우 내의 배지를 디쉬에 밀어내고, 현미경 하에서 수정란을 확인한 다음, 차례대로 핵 이식란을 6% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하고, 3% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하며, 글리세롤이 없는 융해용 배지에서 5분간 정 치시킴으로써, 핵 이식란에 함유된 동결용 배지를 제거하였다. 표 8. 용해용 배지 성 분 6% 글리세롤 PBS 3% 글리세롤 PBS 0% 글리세롤 PBS

14 PBS (표 8) (표 8) (표 8) BSA 0.5% 0.5% 0.5% 글리세롤 6% 3% 0% 자당 0.3M 0.3M 0.3M 실시예 3 : 형질전환 복제 소의 생산 (1) 핵 이식란의 대리모에의 이식 상기 핵 이식란을 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적시키고, 이를 스트로우에 장착한 다음, 대리모의 자궁각내 심 부에 이식하였다. 모두 4 마리의 소가 경기도 광주시 퇴촌면 영동리 소재의 퇴촌 목장에서 2003 년 11월 14일, 24일, 26일, 29일에 각각 태어났다. 도 11의 2마리 중 왼쪽이 11월 14일에 태어난 소이고, 오른쪽이 11월 26일에 태어난 소이다. 발명의 효과 본 발명은 체세포에 외래 유전자를 도입하는 기술 및 체세포 복제 기술을 접목함으로써 광우병에 대한 저항성 유전 형질 을 가지는 복제 소를 효율적이고 경제적으로 생산할 수 있다. (57) 청구의 범위 청구항 1. 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 PrP 변이 체를 코딩하는 DNA가 도입된 소 유래 체세포 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 소의 핵 이식란 청구항 2. 제 1항에 있어서, 상기 세포주가 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포, 난구세포 및 태아 섬유아셈포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포주. 청구항 3. 제 1항에 있어서, 상기 핵 이식란이 KCTC 10556BP인 것을 특징으로 하는 핵 이식란. 청구항 4. 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 PrP 변이 체를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소. 청구항 5. 제 4항에 있어서, 상기 복제 소의 형질이 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 핵 이식란의 형질과 동일한 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소. 청구항 6. (1) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 작제하는 단계; (2) 소에서 유래한 체세포주에 상기 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 도입시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; (3) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제 1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; (4) 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 수핵 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계를 포함하는 PrP 변이 체를 발현하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항

15 제 6항에 있어서, 상기 단계 (1)의 체세포주가 성숙한 소에서 유래된 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 8. 제 6항에 있어서, 상기 단계 (2)의 소에서 유래한 체세포주에 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 도입시키는 단계를 포함하 는 공여핵 세포를 준비하는 단계가 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 작제하여 수행되는 것을 특징으 로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 9. 제 8항에 있어서, 상기 벡터가 PrPmut-pCMS/GFP인 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 10. 제 8항에 있어서, 상기 벡터가 PrPmut-pIRESpuro2인 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 11. 제 8항에 있어서, 상기 벡터는 생화학적 방법을 사용하여 도입되는 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 12. 제 11항에 있어서, 상기 생화학적 방법이 FuGene를 사용하는 것임을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 13. 제 6항에 있어서, 상기 체세포주가 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포 또는 난구 세포 로부터 유래된 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 14. 제 10항에 있어서, 상기 핵 이식란이 KCTC 10556BP인 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 15. 제 6항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소의 PrP 변이체가 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르기닌으로 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제방법. 청구항 16. (1) 소의 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 작제하는 단계; (2) 소에서 유래한 체세포주에 PrP 변이체를 코딩하는 DNA를 도입시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; (3) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제 1극체 를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; (4) 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계 및 (5) 상기 핵 이식란을 대리모에 이 식하여 산자를 출산하는 단계를 포함하는 소의 PrP 변이체를 발현하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항

16 제 16항에 있어서, 상기 (1) 내지 (4) 단계가 제 7항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하 는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 18. 제 16항에 있어서, 상기 핵 이식란이 KCTC 10556BP인 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 19. 제 16항에 있어서, 상기 (1) 단계가 세포주를 계대 배양, 혈청기아 배양 또는 동결에 의해 보존하는 과정을 추가로 포함 하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 20. 제 16항에 있어서, 상기 (2) 단계의 난자를 탈핵하는 과정은 미세작업장치를 이용하여 전처리된 난자의 투명대를 절개하 여 절개창을 형성시킨 후, 절개창을 통하여 난자의 제 1 극체를 포함한 세포질을 10 내지 15% 제거하는 것을 특징으로 하 는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 21. 제 16항에 있어서, 상기 (3) 단계의 수핵 난자의 난구 세포는 수핵 난자를 하이알루로니다제로 처리한 다음, 물리적으로 제거되는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 22. 제 16항에 있어서, 상기 (3) 단계의 공여핵 세포를 탈핵 난자에 이식하는 과정이 공여세포를 난자의 투명대에 형성된 절 개창으로 주입하는 것임을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 23. 제 16항에 있어서, 상기 (3) 단계가 작제된 핵 이식란을 대리모에 이식하기 전에 활성화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 24. 제 23항에 있어서, 상기 핵 이식란의 활성화가 전기 융합을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생 산방법. 청구항 25. 제 24항에 있어서, 상기 전기 융합이 직류전압을 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간을 10 내지 20μs, 횟수는 0.01초 내지 10초 간격으로 1 내지 5회에 걸쳐 실시하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 26. 제 23항에 있어서, 상기 단계가 사이클로헥시미드 용액 또는 DMAP 용액에 핵 이식란을 침지하고 배양하는 후활성화 단 계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항

17 제 26항에 있어서, 상기 핵 이식란의 후 활성화 단계가 활성화된 핵 이식란은 msof 배지에서 배양하는 체외배양 단계 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 28. 제 16항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 소의 PrP 변이체가 소의 PrP 아미노산 서열 중 179번째 글루타민이 아르 기닌을 및/또는 230번째 글루타민이 리신으로 치환된 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법. 청구항 29. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 형질전환 복제 소로부터 유래된 정육(meat) 및 가공식품. 도면 도면1 도면2-17 -

18 도면3 도면4-18 -

19 도면5a 도면5b

20 도면6 도면7 도면8-20 -

21 공개특허 도면9 도면10 도면11 <110> <120> <160> <170> Seoul National University Industry Fundation Transgenic cloned cow expressing the prion variant and method for producing the same 3 KopatentIn

22 <210> 1 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant <400> 1 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Arg Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 260 <210> 2 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant <400> 2 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His

23 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Lys Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 260 <210> 3 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant <400> 3 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Arg Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met

24 Cys Ile Thr Gln Tyr Lys Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly