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1 제출문 농림부장관귀하 본보고서를 인삼근권토양미생물을이용한인삼생리활성물질 관한연구 과제의최종보고서로제출합니다. ginsenoside Rg3의생산에 2007 년 5 월 24 일 주관연구기관명: 경희대학교 총괄연구책임자 : 교수 : 양덕춘 연구원: 박종산 연구원: 김도완 연구원: 성락금 연구원: 이준원 연구원: 김호빈 연구보조원 : 나주련 협동연구기관명: KAIST 협동연구책임자 : 교수 : 이성택 연구원: 안동선 연구원 : 이창수 - 1 -

2 요약문 Ⅰ. 제 목 인삼근권토양미생물을이용한인삼생리활성물질 Ginsenoside Rg3의생산 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 인삼의효능은 ginsenoside 라고불리는인삼사포닌때문에나타난다. 인삼사포닌은현 재까지 50 여종이발견되었는데, 실제인삼에는 major 사포닌이라고불리는몇개사포닌 즉 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re 만이대량으로존재한다. 최근에인삼의효능이 major 사포닌이가수분해되어생성된소량의 minor 사포닌에기인한다는사실이밝혀지 면서 minor 사포닌의뛰어난생리활성확인과생물전환기술에관심이모아지고있다. 이 러한연구가있기오래전부터우리선조들은홍삼을만들어복용했는데, 인삼을아홉번 찌고말리기를거듭하면서열에의한 major 사포닌의가수분해가일어났을것으로예상된 다. 현재까지 minor 사포닌 Rg3, Rh2, compound K, PPD(protopanaxadiol) 가주목받고있 다. Minor 사포닌중에서 Rg3는 major 사포닌들(Rb1, Rb2, Rc, Rd) 에서당이가수분해되 면서생성된다. Rg3는 major 사포닌이가지지못했던뛰어난항암, 치매, 면역증강등의 효과를가진다. 마우스내에서 tumer cell의 metastasis 를저해하고, in vitro에서 tumer cell의 invasion 을저해하며, 암세포 apoptosis 유발효과, 신경세포의치매억제효과, 혈관 확장을통한혈압강하, catecholamine 분비억제로인한신경안정제효과, 진통제활성이 확인되면서인삼이약효를가지게만드는궁극적인물질로여겨지고있다. Major 사포닌 (Rb1, Rb2, Rc, Rd) 을활성 minor 사포닌(Rg3, Rh2, PD) 으로의전환연구에서가장쉬운 방법은 acid를이용한가수분해인데선택성이낮아 Rg3, Rh2, PPD외의기타부산물들이 많이생성되고, 또한 S-form과 R-form의 racemic mixture가형성되어 R-form과 S-form 을분리하는번거로운과정을거쳐야한다. 효소는기질특이성으로말미암아정확히 S-form Rg3, Rh2, PPD 혹은 R-form Rg3, Rh2, PPD 만을생산할수있다. 따라서 β - 2 -

3 -glucosidase 활성을가지는다양한균주를스크린닝하고, 대량생산된효소를이용하여각 각의 major 인삼사포닌을약리활성이더욱우수한 Rg3로전환시키는연구를수행할필요 가있다. Ⅲ. 연구개발내용및범위 β-glucosidase 활성을가지는미생물을 200주 screening하여인삼의 major 사포닌을활 성이있는 minor 사포닌으로전환하는효소를탐색한다. 미생물발효를통하여사포닌전 환효소를대량생산한후, 을개발한다. 홍삼보다효능이좋은새로운인삼제품을생산할수있는기술 Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의 1. 연구개발결과 가. 전환대상사포닌결정및사포닌전환효소 type 탐색 인삼사포닌은구조적으로 steroid골격을갖고있는 triterpenoid에 glucose, arabinose, xylose, rhamnose 등당이결합되어생성된배당체로서 4환계사포닌인 protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT), 및 5환계사포닌인 oleanane계사포닌으로구분되며지금 까지약 50 여종이분리되었다. 인삼사포닌중 protopanaxadiol계사포닌에속하는 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 protopanaxatriol계사포닌에속하는 Rg1과 Re 등 6종 major 사포닌이전 체사포닌의 90% 이상을차지하지만인삼의효능이 major 사포닌이가수분해되어생성된 소량의 minor 사포닌에기인한다는사실이밝혀지면서 minor 사포닌의뛰어난생리활성 확인과생물전환기술에관심이모아지고있다. 본연구는 protopanaxadiol계중함량이가 장많고 Rd, F2, Rg3, Rh2, compound K로의전환이모두가능한 Rb1을실험대상으로 하여선정하였다. 인삼사포닌전환능력이있는균주의탐색을효율화하기위하여시판되는 β -galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase ( SIGMA 사) 효소를구입하여 Rb1을대상으 - 3 -

4 로예비실험을한결과 α-glucosidase, β-galactosidase는사포닌전환능력을나타내지못 하였고 β-glucosidase에서만 ginsenoside Rd로의사포닌전환활성을보여 β-glucosidase 발현미생물에초점을두고균주스크린닝을진행하였다. 나. 사포닌전환미생물선별 경기도연천인삼밭으로부터 esculin방법을이용하여 R2A배지에서 β-glucosidase 분비 미생물을총 758개 screening하였고그중에서 β-glucosidase 분비능력을재검사하여최 종적으로 211개균주를확보하였으며 β-glucosidase분비미생물로부터 DNA 추출, PCR 증폭및 16S rdna 염기서열분석을통하여 GeneBank에있는 database와계통학적위치 를확인한결과 8 개의주요한계통군: Proteobacteria α-subdivision (28 균주), proteobacteria Actinobacteria β-subdivision (10 균주), proteobacteria γ-subdivision (24 균주), (88 균주), Firmicutes (28 균주), Bacteroidetes (2 균주) 와 Deinococcus-Thermus (1 균주) 등을발견하였고, 신종인 Sphingopyrix granuli (1 균주) 도 발견하였다. 동정되지않은 29개의균주를제외한 182개균주들의 16S rdna 염기서열의 계통학적위치를확인한결과, 52개균주가데이터베이스화된참조균주와 90~97% 의상 동성을나타내어신종혹은신속으로제안하고이들균주중일부균주들에대한세균학 적특성을규명하여분류학적위치를결정하였다. 또한전국각지에서지역별, 종류별로 104개의김치시료를수집하여 MRS 배지를이용하여 155 개의유산균을분리하였으며, esculin agar plate에서 black complex 를형성한균주, 즉 β-glucosidase 분비활성을보이 는 111개의 strain 을찾아내었다. 김치로부터분리된유산균 155개의 16S rdna 염기서열 분석을통하여 GeneBank에있는 database 와계통학적위치를확인한결과, Lactobacillus 속에속하는균주들이가장많았으며 (54%), 그다음으로 Leuconostoc (27%), Weissella (11%), Bacillus (2%), Pediococcus (1%), 기타 (5%) 순으로분포되어있음을알수있었 다. 다. 사포닌전환미생물선별 인삼근권토양으로부터 211 개, 김치로부터 111개의 β-glucosidase 분비미생물을분리하 - 4 -

5 였으며 LB broth, nutrient broth 및 MRS broth에서현탁배양하여 major 사포닌 ginsenoside Rb1과각각반응시킨후전환산물은 TLC, HPLC 및 1 H-NMR 과 13 C-NMR 분 석을수행한결과각각 ginsenoside Rd, 20(S)-Rg3, F2, compound K 및 gypenoside XVII 로구조동정이되었다. 그중 Serratia fonticola FS6(2), Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Terrabacter tumescens DL6(1), Paenibacillus amylolyticus BB4(4)-b-1, Frateuria aurantia BB4(1)-b, Streptomyces bikiniensis BB5(7), Streptomyces galilaeus BB6(1), Streptomyces olivochromogenes BB6(2), Paenibacillus amylolyticus DB5(3), Sphing omonas echinoides BT4, Sphingomonas echinoides BT5, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT12, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Cellulomonas uda T7-06, Cellulosimicrobium cellulans GS235, Terrabacter tumescens GS 462, Microbacterium esteraromaticum GS508, Microbacterium esteraromaticum GS514, Terracoccus luteus GS610, Streptomyces ferralitis GS614, Terrabacter tumescens GS653, Microbacterium esteraromaticum GS836, Microbacterium esteraromaticum GS844, Microbacterium resistens GS1184, Lactobacillus brevis KC-72, Lactobacillus sp. CS1 KC-102. Bacillus subtilis KC-103, Lactobacillus sp. KC-104, Lactobacillus sp. CS1 KC-105, Lactobacillus sp. CS1 KC-106, Lactobacillus sp. CS1 KC-107, Bacillus subtilis KC-150, Lactobacillus sp. CS1 KC-153, Lactobacillus brevis KC-154 등균주들은 ginsenoside Rb1을 Rd 로의전환능력을, Burkholderia stabilis EM3(2)-a, Terrabacter tumescens GS342, Microbacterium esteraromaticum GS508, Microbacterium esteraromaticum GS514, Terracoccus luteus GS610, Lactobacillus sakei KC-01, Leuconostoc pseudomesenteroides KC-02, Lactobacillus arizonensis KC-03, Leuconostoc mesenteroides KC-04, Lactobacillus arizonensis KC-09, Lactobacillus sakei KC-14, Lactobacillus plantarum KC-16, Lactobacillus brevis KC-19, Lactobacillus sakei KC-20, Lactobacillus sakei KC-21, Lactobacillus sakei KC-22, Leuconostoc mesenteroides KC-28, Lactobacillus brevis KC-37, Leuconostoc citreum KC-38, Leuconostoc mesenteroides KC-39, Weissella cibaria KC-40, Leuconostoc citreum KC-41, Lactobacillus sakei KC-43, Leuconostoc citreum KC-50, Lactobacillus sakei KC-51, Lactobacillus sakei KC-52, Lactobacillus sakei KC-53, Lactobacillus sakei KC-57, Lactobacillus sakei KC-58, Lactobacillus sakei - 5 -

6 KC-59, Lactobacillus sakei KC-60, Lactobacillus sakei KC-61, Leuconostoc citreum KC-62, Leuconostoc mesenteroides KC-63, Lactobacillus brevis KC-64, Lactobacillus plantarum KC-66, Lactobacillus plantarum KC-67, Lactobacillus plantarum KC-68, Lactobacillus plantarum KC-69, Lactobacillus plantarum KC-70, Lactobacillus arizonensis KC-78, Lactobacillus plantarum KC-79, Leuconostoc pseudomesenteroides KC-81, Weissella cibaria KC-82, Weissella cibaria KC-96, Weissella cibaria KC-97, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KC-100, Lactobacillus plantarum KC-143 등은 Rb1을 Rg3 로의전환능력을, Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Frateuria aurantia BB4(1)-b, Sphingomonas yabuuchiae BT1, Caulobacter leidyia BT3, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terrabacter tumescens GS462, Microbacterium esteraromaticum GS508, Terracoccus luteus GS603, Terracoccus luteus GS 608, Terracoccus luteus GS 610, Lactobacillus plantarum KC-143 등균주들은 F2 로의전환능력을, Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Sphingomonas yabuuchiae BT1, Caulobacter leidyia BT3, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terracoccus luteus GS610 등균주들은 compound K로의전환활성을보였고 Burkholderia stabilis EM3(2)-a, Terrabacter tumescens DL6(1), Frateuria aurantia BB4(1)-b, Streptomyces galilaeus BB6(1), Caulobacter leidyia BT3, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terrabacter tumescens GS342, Terrabacter tumescens GS405, Terrabacter tumescens GS462, Terrabacter tumescens GS513, Streptomyces lienomycini GS516, Terracoccus luteus GS603, Terracoccus luteus GS608, Terracoccus luteus GS610, Terrabacter tumescens GS653 등균주들이 gypenoside XVII로의전환능력을나 타냈다. 균주에의한 지만지금까지 ginsenoside Rd, F2, Rh2, compound K로의전환연구는많이보고되고있 ginsenoside Rg3 로의전환연구에관한보고는없는상황이다. Ginsenoside Rg3 는산을처리하는방법으로쉽게생산할수있어산업체에서많이이루어지고있지만 부산물이많이생성되고중화과정을거치면서환경오염이야기되며 S-form과 R-form혼합 물이생성되어 S-form과 R-form 의순수분리에많은어려움이있다. 미생물이나동식물 의효소를이용한인삼사포닌의전환방법은비교적온화한조건에서반응시킬수있고기 - 6 -

7 질특이성으로인하여원하는사포닌만을생산할수있을뿐만아니라 S-form 혹은 R-form만생산이가능하여번거로운 S-form과 R-form의분리과정을거치지않아산처리 에비해우월성을나타내지만사포닌의 20번탄소의입체장애로인하여효소의접근이어 려워효소에의한 Rg3의생산은어렵다고인정이되었고또한지금까지 Rg3 생산효소에 관한분리연구는아직이루어지지않았다. 하지만본연구팀은대량의균 test를통하여처 음으로 Rg3를대량으로생산할수있는균주 Microbacterium esteraromaticum GS514 를 분리하였고또한활성이 GS514 보다는적지만역시 Rg3의생산능력이있는유산균 Lactobacillus plantarum KHU 를분리하였다. 이중 정한결과 Rg3로의전환활성이뛰어난 Microbacterium esteraromaticum GS514균를 20(S)-Rg3 로확인이되었다. 구조동 라. 인삼근권토양으로부터 ginsenoside Rg3생산효소분리및동정 Ginsenoside Rg3생산균주 Microbacterium esteraromaticum GS514 및 Lactobacillus plantarum KC-143 의최적배양조건을탐색하기위하여배지, 온도, ph 및유도물질의영 향을조사하였다. GS514균주를각각 LB broth (LB), Tryptic soy broth (TSB), Nutrient broth (NB) 에접종하여 Shaking Incubator에서같은조건으로배양하여 O.D 600 을측정한 결과 LB와 TSB배지에서가장잘자랐고 NB배지에서는거의자라지않았으며각각의 12 h 균주배양액을 ginsenoside Rb1과혼합하여시간별로반응시킨결과역시 LB와 TSB배 지에서양호한 Rg3생산활성을나타냈고 NB에서는 Rd 로의전환활성만보여주었다. GS514 균주는 LB배지에접종하여 22, 27, 32, 37 온도별로배양한후 O.D600을측정한결과 2 7 에서가장빠른생장속도를보였고 37 에서가장느린생장속도를보였으며 ph는 5.5 이하에서느린생장속도를보인외에 6.0에서 8.0까지유사한생장속도를보여 ph의영향 을크게받지않았다. KC-143번균주의경우에는 LB나 NB 등의배지에서는생장률이극 히저조하였으나, MRS 배지에서는매우잘자랐다. 또한 ph 6.5, 37 에서 16시간전후로 배양하였을때최적의생장률을보였다. LB broth에서유도물질을첨가하지않고배양한 GS514균주배양액을 control 로, 홍삼농 축액, 인삼잎사포닌, 인삼분말을첨가하여배양한 GS514균주배양액을 treatment로하여 비교실험을수행하였다. Control와 treatment의균주배양액을원심분리하여 cell을침전시 - 7 -

8 키고상층액은각각 ginsenoside Rb1과반응시킨결과 control에서는 ginsenoside Rd만확 인이되고 treatment에서는모두 ginsenoside Rg3가확인이되어 Rg3생산효소는유도물질 의첨가로인하여생성되는유도효소라는것을확인하였다. 또한인삼잎사포닌과인삼분 말의첨가구가홍삼농축액첨가구보다좋은 Rg3 생산효과를나타내는것을확인하였다. 사 포닌함량이높고수용성이좋은인삼잎사포닌을유도물질로선정하여 Rg3생산효소최적 생산조건을조사하였다. GS514균주를 LB broth배지에서 O.D 600 값이 이되게배양 후 LB배지양의 1.2% 를첨가( 많은양의인삼사포닌은균생장을억제) 하여 24시간배양할 때가장많은 Rg3생산효소가생산되며배양시간을더증가시키면 Rg3분해효소의대량생 성으로 Rg3분해를야기시켜 Rg3 생산에부적합하였다. Ginsenoside Rb1으로부터 ginsenoside Rg3로의전환은 Rb1의 20번탄소에연결된두 개의 glucose 중 terminal glucose가먼저가수분해되어 Rd가생성되고 Rd에서다시 20 번위치의 glucose가가수분해되어 Rg3가생성되는 Rb1 Rd Rg3로의 pathway를결정 하였고 ginsenoside Rd 및 Rg3생산효소의사포닌전환실험을통하여 ginsenoside Rg3생산 효소의금속의존성특성을밝혔다. GS514균주를유도물질첨가하에서 Rg3효소의최적생 산조건으로균을배양하고배양여액은 70% 황산암모늄포화, dialysis를통하여조효소액 을조제한후 DEAE 52 column으로 ginsenoside Rd생산효소를분리하고분자량을측정하 여 58.7kDa 에해당함을확인하였다. 조효소액은 Mono Q column에의한 ion exchange chromatography를이용하여효소를분리하고 Rg3생산활성이가장강하게나타나는 fraction은 SDS-PAGE, 2-D PAGE 등의방법으로 control과비교하여 Rg3생산효소로예 상되는 spot 10개를대전기초지원연구소에의뢰하여 MALDI-TOF MS/MS로 amino acid sequence 분석을하였다. 확인된 peptide는 에서상동 성분석을한결과이미알려진단백질과의유사성이매우낮아새로운단백질로추정된 다. 마. Rg3 생산균주조효소액에의한홍삼농축액, 인삼뿌리( 잎) 조사포닌의전환및사 포닌전환균주의발효기운전 GS514 균주를유도물질첨가하에서배양후산업화에유리한유기용매침전법으로단백 질을침전시키고먼저 Rb1 과반응시켜효소활성을체크하였다. 알코올침전에서는 Rd로의 - 8 -

9 전환활성만일부분남아있었고 Rg3로의전환활성은전부소실이되었으며 acetone침전에 서는 Rg3 생산효소활성이그대로보존되어있는것을확인할수있었다. 단백질에대한 acetone침전법은염석방법에비해시간을많이단축시킬수있을뿐만아니라 acetone용매 는증류법을통하여회수하여재활용할수있고휘발성이좋아잔류가거의없는장점을 가지고있다. 따라서 acetone 침전법의산업화가능성을고찰하기위하여고농도의홍삼농 축액(30 brix), 인삼뿌리사포닌(30 mg/ml) 및인삼잎사포닌(30 mg/ml) 과각각반응시키고 HPLC로분석한결과 ginsenoside Rg3만특이적으로많이생성되는좋은생산효과를나 타냈다. 특히인삼뿌리사포닌과잎사포닌에포함된 ginsenoside Rd는 100% Rg3로전환되 었고, Rb1은각각 61.8% 와 40.0% 전환되었으며 Rg3의전체양은효소처리전보다각각 4.2 배, 7.4배로증가하여높은 ginsenoside Rg3 생산성을나타내었다. GS514균주는 20L 가유사할뿐만아니라 배양기를이용하여대량배양할때소량배양에비하여균생장속도 ginseniside Rg3생산활성도소량배양과유사하게나타나전체적으 로균생장, ginsenoside Rg3 생산효소의활성이모두양호하였다. Ginsenoside Rg3생산효 소는 acetone 침전법으로쉽게침전이될뿐만아니라효소활성을그대로유지시킴으로서 효소생산의산업화에용이하며 acetone 침전법으로조제한 Rg3 생산효소는인삼농축액, 뿌 리사포닌및잎사포닌과의반응에서 diol계사포닌중 Rb1, Rd뿐만아니라 Rb2, Rc까지도 특이적으로 Rg3로전환시킬수있는 Rg3 생산효과를나타냈다. 따라서 ginsenoside Rg3생 산효소가가격이저렴하게생산이된다면 20(S)-Rg3 고함유인삼제품의생산및순수한 20(S)-Rg3 생산의산업화에있어서큰경제적효과를나타낼것으로사료된다. 2. 활용에대한건의 가. 본연구로부터분리된 Rg3생산균주 Microbacterium esteraromaticum GS514는특허 나. 출원을할예정이다. Rg3생산균주 Microbacterium esteraromaticum GS514는발효기를이용해활성효소 를대량생산하여인삼의 major사포닌을 Rg3만특이적으로많이함유하고있는물질 로전환시켜신소재인삼제품을생산한다. 다. Rg3의대량생산기술이완료되면기업으로이전하여인삼을대량으로재배하는지역 에공장을확보하고재배된인삼을원료로건강기능성식품, 의약품, 신소재인삼제품 - 9 -

10 등으로다양하게사용할수있다. 라. 본연구에서 Rg3생산효소는유도물질첨가하에서생산이되는유도효소로서단가가 비교적높다. 따라서인슐린의제조방법을참조하여 Rg3생산효소의 proteomics 및관 련유전자를확인하고 specific gene의 vector 재조합을이용하여대장균에 Rg3생산효 소관련유전자를형질전환시켜값싸게대량화할수있는방법이요구되고독성검 사가이루어져야한다

11 편집순서 4 SUMMARY ( 영문요약문) I. Title Production of ginsenoside Rg3 using soil microorganisms from rhizosphere of ginseng root II. Backgrounds Ginseng (the root of Panax ginsengc.a. Meyer) is one of the most popular medicinal plants, and it has been used for strengthening immunity, providing nutrition and recovering from fatigue. Ginseng saponins (ginsenosides) have been recognized as responsible for the biological and pharmacological activities of ginseng. For example, many studies have focused on their anti-tumor effects (inhibition of tumor-induced angiogenesis and prevention of tumor invasion and metastasis), along with their anti-diabetic, anti-fatigue, anti-stress and anti-oxidative activities. More than 40 ginsenosides have been isolated from ginseng roots, with five major ginsenosides (ginsenosides Rb 1, Rb 2, Rc, Rd, Re and Rg 1 ) constituting more than 90% of total ginsenosides. In recent decades, many studies have focused on the pharmacologicalactivities of the minor ginsenosides as their activities were found to be superior to those of the major ginsenosides. These minor ginsenosides are present in ginseng only in small percentages and can be produced by hydrolysis of the sugar moieties of the major ginsenosides. Therefore, many studies have aimed to

12 convert major ginsenosides to the more active minor ginsenosides with methods such as heating, acid treatment or enzymatic conversion. Heating and acid treatment, however, degrade other active minor ginsenosides and acidic polysaccharides by randomly hydrolyzing all glycosidic bonds, which deprive of the other pharmacological activities of ginseng. Therefore, enzymatic hydrolysis of appropriate sugar at a specific position is desirable for the production of active minor ginsenosides. This preference for enzymatic conversion has led to the development of biotransformation methods. Rb 1 is the most abundant compound (23%) of the ginsenosides, and its structure can be converted to 20(S)-PPD by hydrolyses of glucose moieties. Ginsenoside Rb 1 has a total of four glucose moieties at C-3 and C-20. The conversion of ginsenoside Rb 1 to PPD begins with cleavage of a terminal sugar moiety at either the C-3 or C-20 position leaving a hydroxyl group, and is followed by stepwise cleavage of the other sugars. III. Research scope We isolated 200 beta-galactosidase producing microorganisms from rhizosphere of ginseng root. Their Rb1-converting activites were analyzed. And we tried to search the enzymes to convert major ginsenosides to minor ginsenosides. After mass production of saponin-converting enzymes, new technique may be developed to produce new product with quality better than red ginseng

13 IV. Results and suggestions 1. Results A. Enzyme types converting saponins ß-glucosidase (sigma) was purchased commercially, and its ginsenoside Rb 1 -converting activity tested. 1U of ß-glucosidase and 1mM of ginsenoside Rb 1 were dissolved in 1.5 ml of phosphate buffer (50 mm, ph 7.0). The reaction mixture was incubated for 24 hours at 30 C and analyzed by TLC, as below. Microorganisms were initially screened, using the Esculin-R2A agar, for their ability to produce ß-glucosidase. The black colonies on the Esculin-R2A agar that showed ß-glucosidase activity were picked and transferred tothe fresh Esculin-R2A agar. Pure cultures were checked for shape, color and size of colonies. B. Screening of sponin-converting microorganisms All the isolated strains were identified using their 16S rrna gene sequences. 16S rrna partial sequences, with sizes around 700 bp, were blasted in the NCBI database, with the closest type strains discovered. Most strains are classified as Gram-positive Actinobacteria, Bacilli and Proteobacteria. More precisely, the isolated ß-glucosidase-producing bacteria belonged to Streptomyces, Bacillus, Paenibacillus, Sphingomonas, Enterobacter and Escherichiagenera. The sequence similarity of their 16S rrna genes to those of their closest type strains ranged from 96.0 to 100.0%. 8 major groups were found - Proteobacteria α-subdivision (28 isolates), Proteobacteria β-subdivision (10 isolates), Proteobacteria γ-subdivision (24 isolates), Actinobacteria (88 isolates), Firmicutes (28 isolates), Bacteroidetes (2 isolates), Deinococcus-Thermus (1 isolate) and

14 Sphingopyrix granuli (1 isolate). C. Selection of saponin-converting microorganisms From ginseng rhizosphere, 211 β-glucosidase producing bacteria were isolated and from kimch, 111 bacteria were isolated. As a result of NMR analysis, the conversion products were ginsenoside Rd, 20(S)-Rg3, F2, compound K and gypenoside XVII. Ginsenoside Rb1 was converted to Rd by Serratia fonticola FS6(2), Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Terrabacter tumescens DL6(1), Paenibacillus amylolyticus BB4(4)-b-1, Frateuria aurantia BB4(1)-b, Streptomyces bikiniensis BB5(7), Streptomyces galilaeus BB6(1), Streptomyces olivochromogenes BB6(2), Paenibacillus amylolyticus DB5(3), Sphingomonas echinoides BT4, Sphingomonas echinoides BT5, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT12, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Cellulomonas uda T7-06, Cellulosimicrobium cellulans GS235, Terrabacter tumescens GS 462, Microbacterium esteraromaticum GS508, Microbacterium esteraromaticum GS514, Terracoccus luteus GS610, Streptomyces ferralitis GS614, Terrabacter tumescens GS653, Microbacterium esteraromaticum GS836, Microbacterium esteraromaticum GS844, Microbacterium resistens GS1184, Lactobacillus brevis KC-72, Lactobacillus sp. CS1 KC-102. Bacillus subtilis KC-103, Lactobacillus sp. KC-104, Lactobacillus sp. CS1 KC-105, Lactobacillus sp. CS1 KC-106, Lactobacillus sp. CS1 KC-107, Bacillus subtilis KC-150, Lactobacillus sp. CS1 KC-153 and Lactobacillus brevis KC-154. Ginsenoside Rb1 was converted to Rg3 by Burkholderia stabilis EM3(2)-a, Terrabacter tumescens GS342, Microbacterium esteraromaticum

15 GS508, Microbacterium esteraromaticum GS514, Terracoccus luteus GS610, Lactobacillus sakei KC-01, Leuconostoc pseudomesenteroides KC-02, Lactobacillus arizonensis KC-03, Leuconostoc mesenteroides KC-04, Lactobacillus arizonensis KC-09, Lactobacillus sakei KC-14, Lactobacillus plantarum KC-16, Lactobacillus brevis KC-19, Lactobacillus sakei KC-20, Lactobacillus sakei KC-21, Lactobacillus sakei KC-22, Leuconostoc mesenteroides KC-28, Lactobacillus brevis KC-37, Leuconostoc citreum KC-38, Leuconostoc mesenteroides KC-39, Weissella cibaria KC-40, Leuconostoc citreum KC-41, Lactobacillus sakei KC-43, Leuconostoc citreum KC-50, Lactobacillus sakei KC-51, Lactobacillus sakei KC-52, Lactobacillus sakei KC-53, Lactobacillus sakei KC-57, Lactobacillus sakei KC-58, Lactobacillus sakei KC-59, Lactobacillus sakei KC-60, Lactobacillus sakei KC-61, Leuconostoc citreum KC-62, Leuconostoc mesenteroides KC-63, Lactobacillus brevis KC-64, Lactobacillus plantarum KC-66, Lactobacillus plantarum KC-67, Lactobacillus plantarum KC-68, Lactobacillus plantarum KC-69, Lactobacillus plantarum KC-70, Lactobacillus arizonensis KC-78, Lactobacillus plantarum KC-79, Leuconostoc pseudomesenteroides KC-81, Weissella cibaria KC-82, Weissella cibaria KC-96, Weissella cibaria KC-97, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KC-100 and Lactobacillus plantarum KC-143 Ginsenoside Rb1 was converted to F2 by Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Frateuria aurantia BB4(1)-b, Sphingomonas yabuuchiae BT1, Caulobacter leidyia BT3, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terrabacter tumescens GS462, Microbacterium esteraromaticum GS508, Terracoccus luteus GS603, Terracoccus luteus GS 608, Terracoccus luteus GS 610 and Lactobacillus

16 plantarum KC-143. Ginsenoside Rb1 was converted to compound K by Paenibacillus kobensis EM6(6)-a, Sphingomonas yabuuchiae BT1, Caulobacter leidyia BT3, Sphingomonas echinoides BT9, Sphingomonas echinoides BT14, Streptomyces tauricus BT5(6)-a and Terracoccus luteus GS610. Ginsenoside Rb1 was converted to gypenoside XVII by Burkholderia stabilis EM3(2)-a, Terrabacter tumescens DL6(1), Frateuria aurantia BB4(1)-b, Streptomyces galilaeus BB6(1), Caulobacter leidyia BT3, Streptomyces tauricus BT5(6)-a, Terrabacter tumescens GS342, Terrabacter tumescens GS405, Terrabacter tumescens GS462, Terrabacter tumescens GS513, Streptomyces lienomycini GS516, Terracoccus luteus GS603, Terracoccus luteus GS608, Terracoccus luteus GS610 and Terrabacter tumescens GS653Y. Major ginsenosides such as ginsenoside Rb1, Rb2, Rc and Rd can be easily converted into a mixture of 20(R)- and 20(S)-ginsenoside Rg3 by acid treatment or heating. But the isolation of each isomer from the racemic mixture is a time-consuming and complicated process. 20(S)-Rg3 has also been prepared by chemical synthesis from 20(S)-dammer-24-en-3α, 12β, 20-triol (betulafolienetriol), but the synthetic steps were complicated and the overall yield was low. The enzymatic conversion through sugar hydrolysis at a specific position of ginsenoside is desirable for the production of 20(S)-Rg3. Until now no one has reported the production of ginsenoside Rg3 by using microbial enzymes. In this study, we isolated β-glucosidase-producing microorganism GS514 from soil around ginseng roots in a field using esculin-r2a agar, investigated the activity transforming ginsenoside Rb1 into Rg3, and identified its related metabolites

17 D. Isolation and identification of Rg3-converting crude enzyme Growth of the strain GS514 was very slow in nutrient broth and the activity producing Rg3 was very weak. In order to compare the effect of various media, the strain GS514 was cultured in LB broth, tryptic soy broth and nutrient broth for 24 h. Samples were collected at 6, 12, 18 and 24 h,and O.D was measured at 600 nm. The O.D of LB broth, tryptic soy broth and nutrient broth samples at 24 h were 2.346, and 0.910, respectively. The growth rates in LB broth and tryptic soy broth were significantly higher than in the nutrient broth. Each suspension culture of the strain GS514 at 12 h was mixed with the same volume of ginsenoside Rb1 and then incubated for 10 h in a shaking incubator. We observed that cultures in LB broth and tryptic soy broth converted ginsenoside Rb1 into Rg3, but the culture innutrient broth only converted Rb1 to Rd. This suggested that LB broth and tryptic soy broth were suitable for the growth of the strain GS514 and also for production of Rg3. Therefore, LB broth, which costs low price than other media, was chosen for more study. When the ginsenoside Rb1 was added to the culture broth of the strain GS514, the content of ginsenoside Rb1 and Rd gradually decreased and that of Rg3 gradually increased from 2 h to 8 h. This proved that metabolite Rd is a precursor of the ginsenoside Rg3. Similarly, when ginsenoside Rd was added to the culture broth of the strain GS514, the

18 Rg3 was also produced and the content of the Rg3 remarkably decreased after 4 h. Conversion of Rd into Rg3 was faster than conversion of Rb1 into Rg3. This suggested that Rb1 was converted by different enzymes secreted by the strain GS514 in the following sequence: Rb1 d g3. The enzymes hydrolyzed the terminal glucose and consecutively inner glucose at the C-20 position. Interestingly, after 10 h, the content of the ginsenoside Rg3 rapidly decreased. This may have occurred due to the decrement of the precursors (Rb1 and Rd) converted to ginsenoside Rg3 so the rate of production of Rg3 was slower than the rate of degradation of Rg3. 2. Suggestions A. The Rg3 producing Microbacterium esterarmaticum GS514 will be applied to patent. B. The Rg3 producing Microbacterium esterarmaticum GS514 can be used to produce the active enzyme in mass production. C. After completing mass production, the production technique can be transferred to companies to produce functional food, medical product, etc. D. The Rg3-converting enzyme was induced by inducer. Appling gene transformation technique, more cheap method for the production of Rg3 should be developed

19 CONTENTS Part 1. The Outline for Research & Development Chapter 1. The purpose for research & development Chapter 2. The need for research & development Chapter 3. The contents and limit for research & development Part 2. The Present States of Technology and Development at Home and Abroad Chapter 1. Current situation in domestic and foreign technology Chapter 2. Future prospect Chapter 3. Validity of technology Part 3. The Results of Research & Development Chapter 1. Introduction Chapter 2. Decide on target ginsenoside and research of enzyme type transforming ginsenosides 1. Decide on target ginsenoside 2. Research of efficient extraction method for ginsenosides

20 3. Research of enzyme type transforming ginsenosides Chapter 3. Screening of β-glucosidase-producing microorganism 1. Isolation and identification of β-glucosidase-producing microorganism from ginseng field 2. Isolation and identification of β-glucosidase-producing microorganism from kimchi Chapter 4. Selection of microorganism transforming ginsenosie 1. Materials and Methods 2. Results and Discussion 1) Decide on reaction time transforming ginsenoside 2) TLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by β-glucosidase -producing strains 3) HPLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by β-glucosidase -producing strains 4) Structural identification of conversion product of ginsenoside Rb1 by NMR analysis Chapter 5. Isolation and identification of the enzyme producing Ginsenoside Rg3 1. Materials and Methods 2. Results and Discussion

21 1) The optimum production condition of enzyme producing ginsenoside Rg3 by Microbacterium esteraromaticum GS514 2) Isolation of the enzyme producing ginsenoside Rd and Rg3 (1) Research of the pathway from ginsenoside Rb1 to Rg3 (2) Isolation of a enzyme producing ginsenoside Rd (3) Isolation of a enzyme producing ginsenoside Rg3 Chapter 6. Transformation of ginseng extract and crude ginseng saponins by using a enzyme produced from Microbacterium GS 514 and operation of fermenter transforming ginsenosides 1. Materials and Methods 2. Results and Discussion 1) Mass production of a enzyme producing ginsenoside Rg3 2) Transformation of ginseng extract and crude ginseng saponins by using a enzyme produced from Microbacterium GS 514 3) Operation of 20L-fermenter Part 4 Achievements of Purpose and Contribution for Relative Field Chapter 1. Purpose of Research & Development and Achievement Chapter 2. Contribution of for Relative Field Part 5 Results of Research & Development and Application Plan

22 Part 6. Collection of Technology information Part 7. References

23 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 제 2 절연구개발의필요성 제 3 절연구개발의내용및범위 제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국내외기술개발현황과문제점 제 2 절앞으로의전망 제 3 절기술도입의타당성 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절서론 제 2 절전환대상사포닌결정및사포닌전환효소 type탐색 1. 연구대상사포닌결정 2. 효율적인사포닌추출방법모색

24 3. 사포닌전환효소 type탐색 제 3 절 β-glucosidase 분비미생물선별 1. 토양에서 β-glucosidase 분비미생물분리및동정 2. 김치에서 β-glucosidase 분비미생물분리및동정 제 4 절사포닌전환미생물선별 1. 재료및방법 2. 결과및고찰 가. 인삼사포닌전환반응시간설정 나. β-glucosidase분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환 TLC분석결과 다. β-glucosidase분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환산물 HPLC분석결과 라. NMR분석에의한 Rb1전환산물의구조동정 제 5 절인삼근권토양으로부터 ginsenoside Rg3생산효소분리및동정 1. 재료및방법 2. 결과및고찰 가. Microbacterium esteraromaticum GS514균주에의한 ginsenoside Rg3생산효소

25 의생산최적조건 나. Ginsenoside Rd, Rg3생산효소의분리 1). Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway 탐색 2). Ginsenoside Rd 생산효소분리 3). Ginsenoside Rg3 생산효소분리 4). Ginsenoside Rg3생산효소를이용한 ginsenoside Rb1전환율측정 제 6 절 Microbacterium esteraromaticum GS514 조효소액에의한홍삼농축액, 조사 포닌의전환및사포닌전환균주의발효기운전 1. 재료및방법 2. 결과및고찰 가. Rg3생산조효소대량생산 나. Microbacterium esteraromaticum GS514 조효소액에의한홍삼농축액, 닌의전환 조사포 다. 2L, 5L, 20L-fermenter를이용한발효기운전 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절연구개발의목표달성도

26 제 2 절관련분야에의기여도및기대효과 제 5 장연구개발결과의활용계획 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장참고문헌

27 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 인삼에는질소화합물( 단백질, 아미노산, 펩티드, 핵산, 알칼로이드등), 지용성성분( 지질, 지방산, 정유, 유기산, 페놀계화합물, 폴리아세칠렌등), 사포닌, 탄수화물( 다당류, 2 당류, 3 당류, 조섬유펙틴등), 비타민, 회분등성분이광범위하게포함되어있지만효능은주로 ginsenoside 라고불리는인삼사포닌때문에나타난다. 인삼사포닌은현재까지 50여종이발 견되었지만인삼의효능은 major 사포닌이가수분해되어생성된소량의 minor 사포닌에 기인한다는사실이밝혀지면서 minor 사포닌의뛰어난생리활성확인과생물전환기술에 관심이모아지고있으며그중에서도 minor 사포닌 Rg3, Rh2, compound K, PPD(protopanaxadiol) 가주목받고있다. Minor 사포닌 Rg3는 major 사포닌들(Rb1, Rb2, Rc, Rd) 에서 20번위치의당이전부가수분해되면서생성되며 major 사포닌이가지지못 했던뛰어난항암, 치매, 면역증강등의효과를가진다. Ginsenoside Rg3생산은지금까지 주로산가수분해방법을사용하였다. 하지만산을이용한사포닌가수분해는 Rg3외의 기타부산물들이많이생성되고, 또한 S-form과 R-form의 racemic mixture가형성되어 R-form과 S-form을분리하는번거로운과정을거쳐야하며반응후염기중화과정을거치 면서환경오염이야기되는등문제가있다. 효소반응은비교적온화한조건에서반응시킬 수있고기질특이성으로인하여 S-form 혹은 R-form 만을생산할수있어산처리에비 해우월성을나타내지만지금까지효소에의한 Rg3생산의어려움으로아직전문적인연구 가되어있지않고산업화도되어있지않았다. 따라서인삼근권토양미생물에의한 ginsenoside Rg3 연구는학문적연구, 고부가가치인삼제품의생산및의약품생산에있어서 모두중요한가치를가지고있다. 제 2 절연구개발의필요성 1. 기술적측면 가. 인삼을복용하면정신이바싹들고 ( 각성효과 arousal), 스태미나가생기며, 각종

28 스트레스에대한저항성이생긴다. 최근에는생명과학기술을이용한인삼사포닌의 tranquilizing ( 안정) 효과와치매치료효과가밝혀져서 21세기에도변함없이가치있는 특용작물로여겨지고있다. 나. 1967년소련의약리학자인 Brekhman에의해인삼사포닌이인삼의유효성분이라 고암시한이래인삼사포닌에대한각종약리활성에대한연구가활발히진행되었다. 특 히 major 사포닌대사산물인 ginsenoside Rg3, Rh2, compound K 등의항암, 항암전이, 면역증강, 항피로등약리활성이입증됨에따라 major 사포닌에대한전환연구가각별한 주목을받고있다. 홍삼의특이성분으로알려진 ginsenoside Rg3는마우스내에서 tumer cell의 metastasis 를저해하고, in vitro에서 tumer cell의 invasion 을저해하며 (Mochizuki et al. 1995, Shinkai et al. 1996), 암세포 apoptosis 유발효과 (Liu et al. 2000), 신경세포 의치매억제효과 (Kim et al. 1998), 혈관확장을통한혈압강하 (Kim et al. 1999), catecholamine 분비억제로인한신경안정제효과 (Tachikawa et al. 2001, 1999), 진통제 활성 (Rhim et al. 2002) 등을나타낸다. Ginsenoside Rg3는 20번탄소의수산기위치가 다름에따라 R-form과 S-form이성질체로나뉘며어떤면에서는서로다른약리활성을 나타낸다. 예를들면수용성, 전류의존성 Ca 2+, K + 및 Na + 채널억제효과 (Jeong et al., 2004), L1210 및 P388 tumor cell line의 in vitro 에서의세포독성(Bae et al., 2002) 은모두 20(S)-Rg3가 20(R)-Rg3 에비해높았다. 과 다. Ginsenoside Rg3의 R-form과 S-form은서로다른기능을하기때문에 R-form S-form을분리하여각각의효능에맞게사용하여야만제일큰효과를발휘할수있 다. 지금까지 Rg3의생산은주로열처리나산처리에의해진행되어왔지만제일큰문제 는 R-form과 S-form 혼합물이생성되어번거로운분리과정을걸쳐야한다. 라. 효소에의한 minor 사포닌의생산은산처리나열처리에비해반응조건이나특정 사포닌생산에서우월성을가지고있으며또한미생물이생산하는 β-glucosidase를이용 하여 Rb1으로부터 Rd, F2, compound K 등사포닌으로의전환연구는많이되어있다. 하 지만효소에의한 ginsenoside Rg3의생산은이론적으로산처리에비해어려워지금까지 Rg3생산효소의분리및동정이되어있지않았다. 따라서 20(S)-Rg3생산효소를대량생

29 산할수있는균주의개발, 경제적인 Rg3생산효소의대량생산및고부가가치인삼제품 개발이필요한실정이다. 2. 경제 산업적측면 가. 홍삼은인삼보다휠씬높은가격으로거래가된다. 인삼을구증구포 ( 아홉번찌고 말림) 하는번거러운과정이더해지기때문이기도하지만무엇보다홍삼이인삼보다약효 가뛰어나기때문이다. 홍삼의대표적인성분인 minor 사포닌(Rg3) 을대량함유한기능성 인삼을개발할수있다면, 홍삼보다나은약효를가지면서보다저렴한상품을개발할수 있다. 나. 우리나라및중국, 일본등해외에서다양한전환방법 ( 열처리, 산처리등) 을이 용하여미량사포닌을생산하는연구및제품개발이활발한추세이다. 하지만국내에출시 된제품들은 ginsenoside Rg3가 5% 이하로소량함유된것이대부분이며, 각각의미량사 포닌이주성분으로들어있는제품은아직확인된바가없다. 중국에서는산처리를이용하 여 S-form과 R-form이섞인 ginsenoside Rg3 다량함유제품( 參一胶囊 ) 이판매되고있지 만아직효소처리를이용한제품은시중에없는것으로알려져있다. 또한 ginsenoside Rg3 및 Rh2 가주성분인주사액이판매되고있다. Ginsenoside Rg3는매우고가로거 래되는인삼성분물질로실제로순도 99% 의 Rg3는 1g당 2500 달러에달한다. 따라서미 생물효소를이용하여홍삼의대표적인성분인 minor 사포닌(Rg3, Rh2), 혹은 compound K 가대량함유한기능성인삼이나고순도제품을개발할수있다면국내의인삼산업의 시장을넓혀줄수있고, 수출까지가능하다. 나아가인삼종주국으로서의한국의위상을 굳건히하게될것이다. 3. 사회 문화적측면 인삼은약용식물중에서가장다양한효능을가지고있는한국을대표하는작물중 의하나이다. 한때수출기간산업으로많은외화를획득하였으나현재는제품이표준화가 되지않았고, 또한저가의중국, 미국, 캐나다등의인삼이대량으로생산됨으로서한국인 삼의위기를초래하고있을뿐만아니라한국못지않은, 어떤면에서는한국보다앞선 인삼연구가이미각국에서이루어지고있다. 따라서다시인삼의종주국의면모를일신

30 하기위해서는고부가가치, 표준화기능성인삼제품의생산이절대적으로필요하다. 따라 서프로테옴기술을이용하여저가의인삼사포닌을변화시켜고가의인삼사포닌으로변 환시킬수있는효소를찾아제품을표준화함으로서해외수출을극대화할수있을것이 다. 제 3 절연구개발의목표및범위 1. 연구개발의목표 β-glucosidase 활성을가지는미생물을 screening하여인삼의 major 사포닌을활성이 있는 minor 사포닌 Rg3 로전환하는효소를탐색한다. 미생물발효를통하여사포닌전환 효소를대량생산한후, 개발한다. 홍삼보다효능이좋은새로운인삼제품을생산할수있는기술을 2. 연구개발의범위 가. 전환대상사포닌결정및사포닌전환효소 type 탐색 1) Major사포닌 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1 중전환대상사포닌결정 2) Major 사포닌의효율적인추출방법모색 3) 시판효소 β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase를이용하여사포닌전환 활성을분석하여사포닌분해효소 type설정 나. β-glucosidase분비미생물분리및동정 1) 인삼근권토양으로부터색소기질을이용한 β-glucosidase 활성균주 200주분리 2) β-glucosidase 활성을가지는미생물균주동정 (1) DNA 추출및정제 (2) Molecular taxonomy: 16S rdna G+C content, DNA-DNA hybridization

31 (3) Chemotaxonomy: MIDI, Quinone (4) Polyphasic taxonomy: Phenotypic test, API (5) 계통도작성 (6). β-glucosidase 활성균주의 diversity 분석 3) 김치로부터색소기질을이용한 β-glucosidase 활성균주 100주분리및동정 다. Ginsenoside Rg3로의전환사포닌선발 1) 인삼사포닌에대한 β-glucosidase 분비미생물의전환활성확인 2) 1H-NMR, 13C-NMR 분석에의한전환사포닌구조동정 3) Ginsenoside Rg3 로의전환균주선발 4) Ginsenoside Rg3 로의전환균주기질특이성분석 5) Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway결정 라. Ginsenoside Rg3생산효소분리 1) Ginsenoside Rg3 전환미생물의발효조건확립 (1) 발효배지결정 (2) 배양온도가균생장및 ginsenoside Rg3생산에미치는영향 (3) ph조건이균생장및 ginsenoside Rg3생산에미치는영향 (4) 유도물질의첨가가 ginsenoside Rg3생산에미치는영향 2) 사포닌전환활성효소분리 (1) ginsenoside Rd생산효소분리및동정 (2) ginsenoside Rg3생산효소분리 (3) ginsenoside Rg3생산효소의 amino acid sequencing 및동정 (4) ginsenoside Rg3생산효소를이용하여 ginsenoside Rb1가수분해전환율측정 마. 사포닌전환효소의산업용정제방법및인삼농축액, 인삼조사포닌전환 1) 사포닌전환효소의산업용정제방법

32 (1) (2) 에탄올에의한단백질침전법 아세톤에의한단백질침전법 2) Rg3생산효소에의한홍삼농축액, 인삼조사포닌의전환 (1) Rg3 생산효소에의한홍삼농축액의전환 (2) Rg3 생산효소에의한인삼조사포닌의전환 3) 2L, 5L, 15L fermenter 를이용한발효기운전

33 제 2 장국내외기술개발현황 1. 국내 외관련기술의현황과문제점 가. 국내외관련기술의현황 인삼사포닌의다양한효능을확인하는연구는주로한국, 일본, 중국, 미국에서발표되 며항암 (Im et al., 1995), 항암전이(Mochizuki et al., 1995), 면역증강(Wang et al., 1999), 간기능보호 (Lee et al., 2005), 혈관확장(Kim et al., 2003), 항피로(Wang et al., 1983), 항 스트레스 (Saito et al., 1974), 항당뇨(Xie et al., 2005), paraquat 유도산화적스트레스에 대한항산화작용 (Kim et al., 2004) 등여러가지다양한약리활성이입증되었다. 하지만 인삼을경구투여시 Rb1, Rb2는위액에의해극소량이 oxygenation되는외에대체로분 해되기어렵고 (Karikura et al., 1991) 장내에서의생물학적이용가능성은 Rb1이 %, Rb2가 3.7%, Rg1이 1.9%-18.4% 로대부분은소변을통해체외로배출되어(Takino et al, 1994; Tanizawa et al., 1993; Xu et al., 2003) major 사포닌의생체내에서의흡수는아 주미비하다. 따라서기존에많이존재하는 major사포닌을상대적으로잘흡수될수있고 약효도더우월한 minor 사포닌으로의전환연구가국내외에서활발히진행되고있다. 인삼 사포닌의전환연구는산처리 (Han et al., 1982), 염기처리(Im et al., 1995), 열처리(Park et al., 2004), 및효소처리(Yu et al., 2002; Ko et al, 2003a, 2003b) 에의한여러가지전환 방법이있지만효소에의한전환이다른방법에비해비교적온화한조건에서진행되고 효소의기질특이성으로특정사포닌의생산이가능하여가장많은연구가이루어졌으며 (Chi et al, 2005; Chi et al, 2005; Park et al, 2001; Zhang et al., 2001) 그중, 미생물효 소를이용한 minor 사포닌전환연구는국내연구가전세계에서가장앞서있고 Rb1에서 Rd를거쳐사포닌 K 로전환되는연구도국내에서이루어졌다 (Park et al. 2001, Hasegawa et al. 1996). 나. 국내외관련기술의문제점 미생물효소를이용한 minor 사포닌전환연구들은미생물효소의이용가능성을확인 하는데에그쳤다. 원하는 β-glucosidase 활성을가지는균주들의분리가장내세균에제 한되어서대규모의스크린닝이전문적으로이루어지지않았다. 실제로토양이나김치에

34 존재하는젖산균과그외의세균에서도 β-glucosidase 활성이많이나타나고있다. 아직 이용가능한균주들이묻혀있는상태라고할수있다. 더구나, Rb1을 Rg3로전환하는연 구는아직발표된바가없어서연구의진행이요구되고있다. 2. 앞으로의전망 본연구를추진하는경희대학교와 KAIST의전문미생물분리팀은앞으로다양한종류 의 β-glucosidase 생산균주의분리가계속이루어질것이며, 이중에서 β-glucosidase의 활성정도와효소다양성에따라서원하는기질특이성을가지는효소의선택이가능할 것으로전망되어진다. 또한 vector재조합기술을이용하여원하는사포닌전환효소를저렴 한가격으로대량생산하여고부가가치인삼제품의산업화를추진하고인삼산업의시장 을넓혀줄수있고, 나아가인삼종주국으로서의한국의위상을굳건히하게될것이다. 3. 기술도입의타당성 가. 미생물효소에의한인삼사포닌의전환연구, 특히 compound K에대한연구및사포 닌전환효소의분리동정연구는국내에서이미많이이루어졌다. 나. 인삼근권토양미생물을이용한인삼생리활성물질 ginsenoside Rg3의생산에관한연구 는 비록처음시도하는연구이지만본연구실은지금까지인삼성분과유전자에대한연구 를수행해왔고사포닌추출과사포닌전환이후분석에대한충분한노하우가있으며 KAIST 의환경및응용미생물연구실 ( 지도교수: 이성택) 의위탁연구를통해충분한수의 미생물균주 screening이이루어질것으로예상되며이중에서원하는광범위한기질특 이성과목표사포닌으로의완전한전환활성을갖는균주를선별하는것이가능하다고 여겨진다. 다. 미생물효소를이용한인삼사포닌의전환기술은결코어려운것이아니며, 균주의충분한스크리닝이가장크게요구된다. 지금한국의생명과학기술로서충분히가능하며현재한국의연구결과가전세계적으로가장앞서고있으므로외국의기술도입이없이경

35 희대학교연구실과 다. KAIST의연구실의시설과지금까지쌓은노하우로실험을수행하였

36 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절서론 전세계적으로경제가발전하고국민소득이증가함에따라건강증진에관심을모으고 있는사람들이점점많아지고있다. 인삼은 2000년전부터신비의영약으로동아시아국가 에서광범위하게사용되어왔으며지금은아메리카, 유럽, 오세아니아( 대양주) 등여러지역 에서도널리재배되고인삼제품까지많이출시되고있다. 인삼은중추신경계에대한작용, 뇌기능항진작용, 항발암작용과항암작용, 항당뇨작용, 면역기능조절작용, 간기능항진작 용, 심혈관장해개선및항동맥경화작용, 혈압조절작용, 항스트레스및항피로작용, 항위궤 양및항염증작용등( 남기열등 1996) 많은약리활성을나타낸다. 1967년소련의약리학자 인 Brekman에의해인삼사포닌이인삼의주요약효성분이라는것을제시한이래인삼사포 닌에대한연구가본격적으로진행이되었고특히최근에는인삼의약효는 major사포닌이 분해되어생성된 minor사포닌에기인한다는사실이밝혀지면서 major사포닌으로부터 minor 사포닌으로의전환연구가활발히진행되고있다. Minor 사포닌 Rg3는 major 사포닌Rb1, Rb2, Rc, Rd의 20번위치의당이완전히가수 분해되면서생성된 sapogenin 으로서최초홍삼에서분리되었다. Rg3는 major 사포닌이 가지지못했던뛰어난항암, 항암전이, 치매, 면역증강, 항피로등효과를가진다. 마우스 내에서 tumer cell의 metastasis 를저해하고, in vitro에서 tumer cell의 invasion을저해하 며 (Mochizuki et al. 1995, Shinkai et al. 1996), 암세포 apoptosis 유발효과 (Liu et al. 2000), 신경세포의치매억제효과 (Kim et al. 1998), 혈관확장을통한혈압강하 (Kim et al. 1999; kim et al., 2003), catecholamine 분비억제로인한신경안정제효과 (Tachikawa et al. 2001, 1999), 진통제활성 (Rhim et al. 2002), 면역증강(Wang et al., 2005) 등활성이보고되고있다. Ginsenoside Rg3는지금까지주로산이나열처리에의해 생산되었지만사포닌전환에많이쓰이는효소에의한생산은아직연구되지않았다. 본연 구는 ginsenoside Rg3를생산할수있는효소에 target를두고인삼근권토양미생물로부터 β-glucosidase 분비미생물을 screening 하여인삼사포닌전환능력, 특히 ginsenoside Rg3로 의전환능력이있는균주를선발하고효소를분리하여최종적으로 생산을시도하였다. Rg3 고함유인삼제품의

37 제 2 절전환대상사포닌결정및사포닌전환효소 type 탐색 1. 연구대상사포닌결정 인삼이포함하고있는 ginsenoside는약 50여종에이르며그중일반적으로가장많은양 을차지하고있는사포닌은 protopanaxadiol계사포닌인 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 protopanaxatriol계사포닌인 Rg1과 Re 등 6 종사포닌이다. 인삼사포닌은인삼의재배지 역, 연근, 인삼사포닌의추출방법등에따라다소차이가있지만대체로유사한양상을나 타냈다. 인삼뿌리에서 protopanaxadiol계사포닌 Rb1, Rb2, Rc, Rd중사포닌의함량은 Rd (0.15%), Rb2 (0.34%), Rc (0.35%), Rb1 (0.63%) 순으로함량이많이존재하고 protopanaxatriol계사포닌 Rg1과 Re중 Rg1 (0.40%) 의함량이 Re (0.35%) 보다약간많이 존재한다( 김석창등 1987). 본연구는 인삼근권토양미생물을이용한인삼생리활성물질 ginsenoside Rg3의생산에관한연구 로서 protopanaxadiol계중에서함량이가장많고 Rg3, Rh2, compound K로의전환이모두가능한 Rb1(Fig. 1) 을실험대상으로선정하였다. Glc(1-6)Glc-O OH Glc-O Glc(1-6)Glc-O OH Glc(1-2)Glc-O Rb 1 OH Glc(1-2)Glc-O Rd G lc-o Gyp XVII OH HO Glc-O OH Glc(1-6)Glc-O OH Glc(1-2)Glc-O Rg3 Glc-O F2 HO Gyp LXXV HO OH Glc-O OH HO OH Glc-O Rh2 HO Compounnd K HO PPD Fig. 1. Transformation pathway of ginsenoside Rb1 to protopanaxadiols

38 Ginsenoside Rb1 및주요전환산물의화학구조식과분자식, 분자량은 Fig. 2에표시하 였다

39 HOCH 2 O O OH HO OH CH 2 O OH O HO O H OH 20 3 HOCH 2 O O OH HO OH Product Name: Gypenoside-XVII Molecular Formula: 48 C H 82 O 18 Molecular Weight: 947 Storage Temp: -8 C 2 Fig. 2 The structure, molecular formula and molecular weight of ginsenoside Rb1 and main metabolites

40 2. 효율적인사포닌추출방법모색 인삼사포닌은 triterpenoid계의 dammarane계사포닌으로 aglycone부분에 glucose, arabinose, xylose, rhamnose 등당이결합되어생성된배당체로서물이나극성이비교적 강한에탄올, 메탄올에잘용해한다. 따라서인삼사포닌의추출에는물, 에탄올, 메탄올, 부 탄올등용매가많이사용되는데추출과정에서가열여부에따라상온추출( 신지영등 2001) 과가열추출( 신지영등 2001; 성종환등 1985, 1986); 추출용매에따라물추출( 주현규등 1979; 성종환한국식품영양과학회지등 1985), 에탄올추출( 성종환등 1985a, 1985b; 고성룡 등 1992), 메탄올추출( 신지영등 2001); 기기사용에따라초음파추출(Wu et al., 2001; Zhang et al., 2006), 마이크로파추출( 이새봄등 1999; 권증호등 1999), 초임계추출( 오상오 등, 1989) 과 Waring blendor 를이용한인삼사포닌화합물의추출( 곽이성등 1997); 조사포닌 조제방법에따라부탄올추출 (Shibata et al, 1966), HP-20 흡착법( 김시관등 1998; 김천석 등 1998: 신지영등 2001), AG-50W 흡착법( 신지영등 2001) 등여러가지방법이정립되어 보고되었다. 초음파추출, 마이크로파추출및초임계추출방법은기기원인과단가등의원인으로인하 여인삼사포닌의대량추출에는사용하지않고물추출은알코올추출에비해더많은양의 추출물을얻을수있지만사포닌함량이떨어진다. 따라서인삼사포닌의추출에는에탄올 혹은메탄올을이용한환류추출이가장많이사용되는데에탄올이나메탄올추출물에는 사포닌외의기타성분즉유리당, 단백질, 아미노산, 지용성성분등여러가지잡물질들이 상당량포함되어있어에테르나헥산으로지용성물질과같은저극성물질들을추출한후 다시부탄올추출혹은 HP-20수지흡착법에의해조사포닌을조제하고최종으로 column 을이용하여단일사포닌으로분리한다. 본연구에서는부탄올추출과 HP-20수지흡착법에 의한조사포닌의조제비교를통해효율적인인삼사포닌추출방법을선정하였다. 부탄올추출과 HP-20흡착에의한인삼사포닌의추출과정은주로 Fig. 3과같은방법으로 진행한다. Fig. 3의 A는부탄올추출에의한조사포닌의조제방법이고 B는 HP-20수지에 의한조사포닌의조제방법이다

41 Ginseng powder extracted with MeOH or EtOH Ginseng extract added H 2 O Aqueous solution extracted with ether Ginseng powder extracted with MeOH or EtOH Ginseng extract added H 2 O Aqueous solution extracted with ether Ether layer Aqueous layer extracted with BuOH saturated with H 2 O Ether layer Aqueous layer adsorbed to HP-20 eluted with H 2 0 Aqueous layer Butanol layer Eluent Residue evaporated eluted with EtOH and evaporated Crude saponin Crude saponin A B Fig. 3. Schematic representation for extraction of crude ginseng saponin (A: by BuOH extraction, B: by Diaion HP-20 adsorption). 부탄올추출과 HP-20수지흡착법은모두인삼으로부터메탄올이나에탄올로환류추출을 통해인삼사포닌을일차적으로추출하고감압농축하여엑기스를조제한후다시물에용 해시켜에테르나헥산으로탈지시킨다. 부탄올추출법은탈지시킨인삼엑기스수용액을 수포화부탄올로반복추출하여조사포닌을조제하지만 HP-20수지흡착법은인삼엑기스수 용액을 HP-20수지에흡착시켜먼저물로 elution하여당과같은극성이인삼사포닌보다 큰물질들을먼저제거한후에탄올의농도를증가시키면서 elution하여인삼사포닌을 계사포닌, diol계사포닌순으로분리하고최종적으로부탄올방법과같은방법으로 silica gel 칼럼혹은 C18 칼럼을이용하여단일사포닌을분리정제한다. 인삼사포닌의추출에있어서부탄올추출과 triol HP-20흡착법은아래와같은특징을갖고있

42 다 (Table 1). Table 1. Comparison of extraction by butanol and adsorption of Diaion HP-20 부탄올추출법 조사포닌수율은높지만순도가 떨어진다. 단백질, 유리아미노산의함량이 비교적상대적으로낮다. 비해 유리당의함량은 HP-20방법에 40 배높다. 농축이불완전하고분말화하기가 어렵다. 식용혹은약용으로직접이용할 수없다. HP-20수지흡착법 조사포닌수율은다소떨어지지만 순도가상대적으로높다. 단백질, 유리아미노산의함량이 상대적으로높다. 유리당이거의제거된다. 사포닌농축이간편하고분말화가 용이하다. 식용혹은약용으로직접이용할 수있다. Diaion HP-20 흡착법은부탄올추출법에비해조사포닌수율이다소떨어지지만사포닌 순도가높고농축이간편하여본연구에서는 Diaion HP-20 흡착법에의한조사포닌조제 방법을선정하였다. 즉메탄올이나알코올에의해추출된인삼엑기스를에테르로탈지시킨 후증류수에용해시켜 ethyl acetate로극성이낮은사포닌을따로추출하고극성이높은 Rb1이들어있는물분획을 HP-20수지에흡착시켜알코올농도별로 elution한후 ptotopanaxatriol계사포닌 Re와 Rg1이제거된 Rb1분획을다시 silica gel 칼럼을이용하여 순수분리하였다. 3. 사포닌전환효소 type 탐색 인삼사포닌전환능력이있는균주의탐색을효율화하기위하여시중에판매되는효소 를사용하여 Rb1 을대상으로예비실험을진행하였다. 효소는 SIGMA사의 β -galactosidase, α-gulucosidase, β-gulucosidase를이용하였고 table 2와같은조건으로반 응을수행하였다

43 Table 2. The reaction condition of enzyme on the market 효소 unit PH 반응온도반응시간 α-glucosidase 시간 β-glucosidase 시간 β-galactosidase 시간 buffer 조성 sodium phosphate sodium phosphate sodium phosphate 반응혼합물은수포화부탄올로추출한후 해시켜 한후 40 에서감압농축하고잔유물은메탄올에용 TLC에점적하고 CHCl 3/MeOH/H 2 O 혼합용매(65:35:10, v/v/v, 하층) 로 5 cm 전개 10% 황산을분무하여가열하는방법으로발색시켰다 (Fig. 4). C - K R h2 R g 3 R d R b1 S α - g lu β - g lu β-gal Fig. 4. TLC analysis of reaction between ginsenoside Rb1 and enzyme on the market. 실험결과 α-glucosidase, β-galactosidase 에서는아무런반응이나타나지않았고 -glucosidase에서만반응을보였으면반응산물을 standard Rb1, Rd, Rg3, Rh2, Compound K와비교분석한결과 ginsenoside Rd 로확인되었다(Fig. 4). 따라서균주스크 리닝을 β-glucosidase 발현미생물에초점을두고진행하였다. β

44 제 3 절사포닌전환미생물선별 1. 토양및김치시료로부터 β-glucosidase 분비미생물분리및동정 가. 재료및방법 1) Esculin Agar를이용한 β-glucosidase 분비미생물의선발원리 인삼근권토양및김치에서의 β-glucosidase 분비미생물의분리는 table 3과같은 esculin이들어있는 agar plate 를이용하여분리하였다(Atlas, 1993). Table 3. The component and contents of esculin agar medium Contents Pancreatic digest of casein (Casamino acids) NaCl Yeast Extract Heart muscle, solids from infusion Esculin Amount/L 13g 5g 5g 2g 1g Ferric citrate 0.5g Agar 15g Esculin은미생물이분비하는 β-glucosidase에의해 glucose와 esculetin으로가수분해 된다. 분해된 esculetin은철이온과반응하여 Fig. 5와같이 colony 주위에 black complex 를형성하는데검게보이는 colony 들만선택하여인삼사포닌의전환실험에사용하였다

45 HO HO HO HO O O O HO beta-glucosidase HO OH + O HO O HO O HO Esculin Glucose Esculetin O HO HO O O Ferric ion Dark brown colony Esculetin Fig. 5. The principle of esculin method. 2) β-glucosidase 분비미생물의분리방법 인삼근권의토양은경기도연천인삼밭에서취하여 polyethylene vinyl bag에넣은후 실험실로운반하였다. 시료는 4 에서보존하면서 6 시간이내에실험되었다. 멸균수를이 용하여 serial dilution 한시료를 esculin agar plate에 spreading 하여 28 에 서배양하였다. Black complex를형성한 single colony들은 R2A agar plate에서같은조건 에서순수배양될때까지계대배양하였다. 유산균분리를위해시료로사용된김치는약 100 여종으로, 서울을비롯한경기, 충 북, 충남, 경북, 전남지역등전국각지에서배추김치, 총각김치, 깍두기, 열무김치, 갓김치 등지역별 종류별로다양하게수집하였다. 김치시료의국물을원심분리하여얻은상등 액은멸균수를이용하여 까지 serial dilution하여유산균분리에적합한 MRS agar plate에 100 μ l씩 spreading 한후 37 incubator에서 48 시간배양하였다. Serial dilution한김치시료각각의 MRS plate에나타난서로다른 single colony를 10개씩선택 하여멸균된이쑤시개로 selection 후 esculin agar plate에옮겨색깔의변화를관찰하였 다. Black complex를형성한 single colony들을 MRS agar plate에서같은조건으로순수 배양될때까지계대배양하였다. 최종적으로순수배양된 β-glucosidase 분비균주들을 esculin agar plate에 streaking 함으로써 β-glucosidase 분비능력을다시한번확인한

46 후 15% glycerol stock solution을만들어급속냉각시켜 -70 의 deep freezer에보관하 였다. 3) Polyphasic taxonomy를이용한 β-glucosidase 분비미생물의동정방법 (1) DNA 의추출 Chromosomal DNA의분리는 CoreOne bacterial DNA extraction kit (Coretech. Co. Ltd. Korea) 을이용하여수행하였다. Plate에서순수배양된균주를 1.5 ml tube에 현탁하여일회세척후사용하였다. 추출한 DNA 는전기영동으로확인하였다. (2) 16S rdna의 PCR 증폭 ( 가) 16S rdna 증폭을위해서, Primer 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGC TCAG-3') 와 1512R(5'-ACGG(H)TACCTTGTTACGACTT-3'), Pre-Mix(Taq-polymerase + dntp + 10X reaction buffer), 증류수를사용하였다. 각물질의조성과함량은 table 4 에나타냈다. Table 4. Pre-Mix Primers The composition and contents of PCR materials 재료 Taq-polymerase(5 units/ μl) 양 2 units(0.4 μl ) 10 mm dntp(2.5 mm/each) 5 μl 10X reaction buffer 9F(10 pmol/ μl) 1512R(10 pmol/ μl) Template DNA(10 ng/ ml) 증류수 5 μl 5 μl 5 μl 1-5 μm μm ( 나) Pre-Mix를 10 μl, Primer를 10 μl, Template DNA를 1-5 μl, 증류수를 μl를 넣어서총부피를 50 μl으로맞춰준다. ( 다) ( 나) 에서준비된용액을 Programmable Thermal Controller (MJ Research Inc., USA) 에서증폭한다. 이때시행해야할 cycle의 setting 은다음과같다(Table 5)

47 Table 5. Cycle setting of PCR 과정온도 ( ) 시간 Pre-denaturation 94 5분 Denaturation 94 1분 33 Annealing 60 1분 Polymerimerization 72 1분 30초 Last Polymerization 72 7분 Store 8 cycl e PCR로증폭된 16S rdna는 1% agarose gel 에전기영동을하여확인하였다. (3) DNA 정제 DNA 정제를위해서, PCR Purification Kit(Bioneer, Korea) 을이용하였다. (4) 16s rdna 염기서열분석 DNA Purification을통해정제된 16s rdna의염기서열은 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit(applied Biosystems) 와 sequencer(model 3700, Applied Biosystems) 을이용하여분석하였다. Automatic DNA (5) 계통도작성 GeneBank에있는자료를이용하여분리된균주의가장가까운 type strain을결정하 였다. 분리된균주의계통수를그리기위해서, 균주들의 16S rdna 염기서열을 Clustal X program (Thompson et al, 1994) 을이용하여일정하게정렬하였다. 염기서열을정렬한다 음생길수있는 Gap은 BioEdit program (Hall et al, 1999) 을이용하여삭제하고편집하 였다. 균주들의진화과정을추적하는작업은 Kimura two-parameter model (Kumar et al, 2001) 을이용하였고, MEGA 2 Program (Kimura et al, 1983) 의 neighbor-joining 방법으 로환경토양과김치로부터분리된 β-glucosidase 분비균주의계통분류학적위치를결정 하였다 (Fig. 6)

48 DNA Extraction PCR amplification Amplified 16S rdna Bacterial cell DNA Cycle Sequencing Analysis 16S rdna data from NCBI/DDBJ 16S rdna data Alignment by Clustal X neighbor-joining phylogenetic tree Fig. 6. The pathway of analyzing of 16S rdna. (6) Genomic DNA의 G + C mol% 측정 Genomic DNA는 Nuclease P1으로분해하여 phosphatase처리를하여 HPLC 방법으 로측정하였다. (7) Whole cell fatty acid ( 총균지방산측정) 측정 용하였다. 총균지방산측정은상용적으로쓰이는 MIDI (Microbial Identification system) 을사 (8) Quinone 분석 Chloroform과 methanol 혼합용액으로전체지방을추출한후, TLC에서원하는지질 (Ubiquinone 또는 Menaquinone) 을분리하여긁어낸후 HPLC 로측정하여분석하였다

49 (9) Peptidoglycan 아미노산분석 Cell-wall을부분가수분해하여생성된아미노산을 TLC에전개하여 standard와비교 하여분석하였다. (10) DNA-DNA hybridization test Probe DNA에 photobiotin을반응시킨것과 96well 바닥에붙은 target DNA의붙는 정도를 streptavidin과 biotin의특이성결합성질을이용한형광기질발광반응을이용한 방법을이용하였다. (11) 기질테스트및각종분류에필요한테스트 기질 test는 API 20NE 및 API ID 32GN 스트립테스트나일반미생물실험서에있는 기본적인방법을이용하여실험하였다. 나. 결과및고찰 1). Polyphasic taxonomy를이용한 β-glucosidase 분비미생물의동정결과 본연구에서는인삼근권토양으로부터 1차적으로 β-glucosidase 분비미생물을 758개 screening하였고그중에서 β-glucosidase 분비능력을다시한번체크하여최종적으로 211 개균주(1차년도 100 주, 2차년도 111 주) 를확보하였으며, 각종김치로부터도 100개이상 의 β-glucosidase 분비균주를선발하였다(Table 6). 확보된 β-glucosidase분비세균들의 DNA 추출, PCR 증폭및 16S rdna 염기서열분석을통하여 GeneBank에있는 database 와계통학적위치를확인한결과인삼근권토양으로부터분리한균주들의경우 8개의주 요한계통군 : Proteobacteria α-subdivision (28 균주), proteobacteria β-subdivision (10균 주 ), proteobacteria γ-subdivision (24 균주), Actinobacteria (88 균주), Firmicutes (28 균주), Bacteroidetes (2 균주) 와 Deinococcus-Thermus (1 균주) 등을발견하였고, 신종인 Sphingopyrix granuli (1 균주) 도발견되었다. 이외의 29 개균주는아직미동정상태이다

50 동정되지않은 29개의균주를제외한 182개균주들의 16s rdna 염기서열의계통학적위 치를확인한결과, 52개균주가데이터베이스화된참조균주와 90~97% 의상동성을나타 내어신종혹은신속으로제안하고이들균주중일부균주들에대한세균학적특성을규 명하여분류학적위치를결정하였다. 또한김치로부터분리된유산균 127개의 16S rdna 염기서열분석을통하여 GeneBank 에있는 database 와계통학적위치를확인한결과, Lactobacillus 속에속하는균주들이가 장많았으며 (56%), 그다음으로 Leuconostoc (25%), Weissella (10%), Pediococcus (4%), Bacillus (4%), Arthrobacter (1%) 순으로분포되어있음을알수있었다 (Fig. 7). proteoba c teria β -subd ivision 5% 토양균분포도 proteoba cteria γ -subd ivision 13% 기타 2% Ac tinoba c teria 49% Proteoba c teria α -subd ivision 15% Firmic utes 16% A ctinob a cteria Proteob a cteria α -sub d ivision proteob a cteria β -sub d ivision Firmicutes proteob a cteria γ -sub d ivision 기타 Fig. 7. Distribution of bacteria presented in ginseng soil. 또한김치로부터분리된유산균 155개의 16S rdna 염기서열분석을통하여 GeneBank 에있는 장많았으며 database 와계통학적위치를확인한결과, Lactobacillus 속에속하는균주들이가 (54%), 그다음으로 Leuconostoc (27%), Weissella (11%), Bacillus (2%),

51 Pediococcus (1%), 기타 (5%) 순으로분포되어있음을알수있었다 (Fig. 8). 김치속유산균분포도 Ba cillus 2% Ped iococcus 1% Weissella 11% Not d etermined 5% Leuc onostoc 27% La ctob a cillus 54% La c tob a c illus Leuc onostoc Weissella Ped iococcus Ba cillus Not d etermined Fig. 8. Distribution of lactic acid producing bacteria presented in Kimchi. Table 6. The list of β-glucosidse bacteria isolated from ginseng field. year No Sample Name Blast search result high score cultured strain Similarity (%) Soil bacteria First year 1 FS6(2) Serratia fonticola DSM 4576T FS6(6) Paenibacillus glycanilyticus DS-1T FS5(4) Not determined 4 FS5(2) Not determined 5 FS5(7) Microbacterium resistens DMMZ 1710T FS4(1)-a Bacillus subtilis IAM 12118T

52 7 FS4(1)-b Buttiauxella izardii DSM FS4(1)-b(1) Streptomyces galbus DSM FS4(1)-c-b Not determined 10 FS4(4) Not determined 11 EM6(1) Bacillus megaterium IAM 13418T EM6(2)-b Streptomyces lincolnensis NRRL2936T EM6(6)-a Paenibacillus kobensis DSM 10249T EM6(6)-b Paenibacillus kobensis DSM 10249T EM6(6)-c-1 Paenibacillus kobensis DSM 10249T EM3(2)-a Burkholderia stabilis LMG 14294T EM4(1) Bacillus simplex DSM1321T EM4(2) Bacillus sp. Fa EM5(2)-a Streptomyces lincolnensis NRRL2936T EM5(5)-b Paenibacillus naphthalenovorans PR-N1T EM5(6)-a Paenibacillus naphthalenovorans PR-N1T DL6(1) Terrabacter tumescens DSM 20308T DL6(4) Arthrobacter nitroguajacolicus G DL6(6) Paenibacillus kobensis DSM 10249T DL6(6)-1 Streptomyces nodosus ATCC 14899T DL5(4) Buttiauxella izardii DSM 9397T DL3(2)-a Bacillus megaterium IAM 13418T DL3(2)-b Terrabacter tumescens DSM 20308T BB4(1)-a Paenibacillus macerans IAM 12467T BB4(3) Streptomyces tauricus JCM 4837T BB4(4)-b-1 Paenibacillus amylolyticus JCM 9906T BB4(4)-b-2 Paenibacillus pabuli HSCC 492T BB4(1)-b Frateuria aurantia IFO 3245T BB5(8) Arthrobacter methylotrophus DSM BB5(7) Streptomyces bikiniensis DSM40581T BB5(5) Streptomyces tauricus JCM 4837T BB3 Enterobacter asburiae JCM6051T BB6(1) Streptomyces galilaeus JCM 4757T BB6(2) Streptomyces olivochromogenes DSM 40451T

53 40 DB5(3) Paenibacillus amylolyticus JCM 9906T DB4(1) Not determined 42 DB5(1) Cellulomonas flavigena DSM 20109T BT1 Sphingomonas yabuuchiae GTC 868T BT2 Sphingomonas stygialis SMCC B0712T BT3 Caulobacter leidyia ATCC 15260T BT4 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT5 Sphingomonas echinoides ATCC 14820T BT7 Sphingomonas echinoides ATCC 14820T BT8 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT9 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT10 Sphingomonas stygialis SMCC B0712T BT11 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT12 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT14 Sphingomonas echinoides DSM 1805-T BT6(1) Enterobacter asburiae JCM6051T BT6(2) Enterobacter asburiae JCM6051T BT6(5) Not determined 58 BT4(1) Paenibacillus amylolyticus JCM 9906T BT4(1)-b Escherichia vulneris ATCC 33821T BT4(2) Escherichia vulneris ATCC 33821T BT4(2)-a Not determined 62 BT4(4)-a Streptomyces olivochromogenes DSM 40451T BT4(4)-b Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468T BT4(6)-b Paenibacillus validus JCM 9077T BT5(2)-a Planococcus antarcticus CMS 26T BT5(4)-a Kluyvera cochleae ATCC 51609T BT5(2) Paenibacillus validus JCM 9077T BT5(5) Enterobacter asburiae JCM6051T BT5(6)-a Streptomyces tauricus JCM 4837T BT5(6)-b Enterobacter asburiae JCM6051T BT5(7) Enterobacter asburiae JCM6051T BT5(9) Not determined

54 74 S5(1) Bacillus megaterium KL S3(2) Bacillus subtilis KL S5(2) Pseudomonas nitroreducens IAM1439 T ADS1 Escherichia fergusonii ATCC 35469T ADS2 Bacillus megaterium KL-197T GC1 Sphingomonas echinoides ATCC 14820T WT1 Raoultella planticola ATCC 33558T WT2 Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae ATCC11296T WT6 Raoultella planticola ATCC 33558T WT7 Klebsiella pneumoniae JCM1662T T5-08 Arthrobacter gandensis R5812T TR6-04 Flavobacterium mizutaii ATCC 33299T TR6-07 Arthrobacter gandensis R5812T T7-06 Cellulomonas uda DSM 20107T T7-09 Pseudoxanthomonas broegbernensis B1616/1 T Jip08 Starkeya novella IAM12100T Jip07 Bosea thiooxidans DSM 9653T Kw07 Sphingopyrix granuli ( 신종 ) DaeR-4 Deinococcus indicus Wt/1aT A.Slu04 Rhizobium galegae NBIMTC Jip14 Flavobacterium mizutaii DSM 11724T A.Slu09 Rhizobium huautlense strain SO2 T Jip02 Roseomonas gilardii strain ATCC 49956T Chim01 Pseudomonas stutzeri strain DSM 5190T Ho-01 Sphingobacterium comitans BT6(9) Cytophaga arvensicola IAM 12650T BT4(4)-c Flexibacter sp. MDA GS0157 Bradyrhizobium liaoningense LMG T GS0188 Brevibacterium epidermidis NCDO 2286 T 98.2 second year 3 GS0199 Streptomyces griseoaurantiacus DSM 40430T GS0203 Not determined 5 GS0206 Streptomyces griseoaurantiacus DSM 40430T GS0208 Streptomyces griseoaurantiacus DSM 40430T

55 7 GS0209 Not determined 8 GS0216 Not determined 9 GS0224 Streptomyces filipinensis NRRL 2437T GS0229 Lentzea albida IFO16102 T GS0235 Cellulosimicrobium cellulans GS0240 Ochrobactrum tritici P GS318 Bradyrhizobium japonicum GS334 Rhodanobacter lindaniclasticus GS335 Dactylosporangium roseum DSM 43916T GS341 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS342 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS404 Not determined 19 GS405 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS413 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS414 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS442 Dermatophilus congolensis DSM 44180T GS447 Dermatophilus congolensis DSM 44180T GS461 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS462 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS464 Agreia pratensis P 229/10 T GS505 Not determined 28 GS506 Streptomyces lienomycini LMG 20091T GS507 Bacillus luciferensis LMG 18422T GS508 Microbacterium esteraromaticum DSM 8609T GS510 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS513 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS514 Microbacterium esteraromaticum DSM 8609T GS516 Streptomyces lienomycini LMG 20091T GS519 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS520 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS521 Microbacterium esteraromaticum DSM 8609T GS522 Streptomyces lienomycini LMG 20091T GS529 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T

56 40 GS537 Kibdelosporangium aridum DSM T GS545 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS548 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS551 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS552 Streptomyces lienomycini LMG 20091T GS577 Curtobacterium herbarum P 420/07T GS601 Burkholderia glathei LMG14190 T GS603 Terracoccus luteus DSM 44267T GS607 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS608 Terracoccus luteus DSM 44267T GS610 Terracoccus luteus DSM 44267T GS612 Terracoccus luteus DSM 44267T GS614 Streptomyces ferralitis SFOp68T GS638 Mycobacterium rhodesiae DSM 44223T GS652 Burkholderia glathei GS653 Terrabacter tumescens DSM 20308T GS668 Mycobacterium moriokaense DSM T GS670 Mycobacterium moriokaense DSM T GS810 Arthrobacter chlorophenolicus A GS812 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS814 Bradyrhizobium liaoningense LMG T GS836 Microbacterium esteraromaticum DSM 8609T GS838 Microbacterium esteraromaticum DSM 8609T GS844 Microbacterium esteraromaticum DSM 8609T GS849 Variovorax paradoxus GS850 Dyella japonica GS851 Afipia broomeae GS852 Dyella japonica GS858 Pseudonocardia spinospora GS904 Not determined 70 GS950 Microlunatus phosphovorus DSM 10555T GS961 Streptomyces scabrisporus

57 72 GS963 Not determined 73 GS967 Actinoplanes aurantiacus GS970 Not determined 75 GS972 Mesorhizobium amorphae GS973 Mesorhizobium amorphae GS1003 Mesorhizobium amorphae GS1012 Cupriavidus necator ATCC T GS1110 Not determined 80 GS1119 Not determined 81 GS1121 Paenibacillus barcinonensis BP-23 T GS1162 Mycobacterium mucogenicum ATCC T GS1177 Streptomyces ferralitis SFOp68T GS1182 Streptomyces avellaneus NRRL B-3447T GS1184 Microbacterium resistens DMMZ 1710T GS1414 Bacillus simplex DSM1321 T GS1418 Kytococcus schroeteri Muenster 2000T GS1542 Not determined 89 GS1543 Cupriavidus necator ATCC T GS1546 Pseudomonas fluorescens strain S GS3007 Streptomyces violaceolatus DSM 40438T GS3049 Not determined 93 GS3055 Arthrobacter oxydans DSM 20119T GS3060 Streptomyces griseodotifer GS3061 Arthrobacter chlorophenolicus A GS3066 Microbacterium esteraromaticum DSM 8609T GS3071 Arthrobacter stackebrandtii CCM 2783T GS3072 Arthrobacter tumbae LMG 19501T GS3099 Bacillus luciferensis LMG 18422T M1-215 Not determined 101 M1-213 Not determined Not determined 103 M2-328 Not determined 104 M3-221 Not determined

58 Lactic acid bacteria third year 105 B13 Not determined 106 B12 Not determined 107 B9 Not determined 108 B8 Not determined 109 B6 Not determined 110 KCTC12 Lactobacillus equi KCTC KCTC27 Lactobacillus reuterikctc KC-01 Lactobacillus sakei KC-02 Leuconostoc pseudomesenteroides KC-03 Lactobacillus arizonensis KC-04 Leuconostoc mesenteroides KC-05 Not determined 6 KC-06 Not determined 7 KC-07 Not determined 8 KC-08 Leuconostoc pseudomesenteroides KC-09 Lactobacillus arizonensis KC-10 Leuconostoc citreum KC-11 Leuconostoc citreum KC-12 Not determined 13 KC-13 Not determined 14 KC-14 Lactobacillus sakei KC-15 Weissella cibaria KC-16 Lactobacillus plantarum KC-17 Not determined 18 KC-18 Not determined 19 KC-19 Lactobacillus brevis KC-20 Lactobacillus sakei KC-21 Lactobacillus sakei KC-22 Lactobacillus sakei KC-23 Lactobacillus sakei KC-24 Leuconostoc mesenteroides KC-25 Not determined 26 KC-26 Leuconostoc mesenteroides KC-27 Not determined 28 KC-28 Leuconostoc mesenteroides

59 29 KC-29 Not determined 30 KC-30 Leuconostoc mesenteroides KC-31 Not determined 32 KC-32 Leuconostoc mesenteroides KC-33 Not determined 34 KC-34 Lactobacillus sakei KC-35 Lactobacillus sakei KC-36 Lactobacillus sakei KC-37 Lactobacillus brevis KC-38 Leuconostoc citreum KC-39 Leuconostoc mesenteroides KC-40 Weissella cibaria KC-41 Leuconostoc citreum KC-42 Not determined 43 KC-43 Lactobacillus sakei KC-44 Lactobacillus sakei KC-45 Leuconostoc citreum KC-46 Leuconostoc citreum KC-47 Not determined 48 KC-48 Weissella cibaria KC-49 Not determined 50 KC-50 Leuconostoc citreum KC-51 Lactobacillus sakei KC-52 Lactobacillus sakei KC-53 Lactobacillus sakei KC-54 Lactobacillus sakei KC-55 Not determined 56 KC-56 Lactobacillus sakei KC-57 Lactobacillus sakei KC-58 Lactobacillus sakei KC-59 Lactobacillus sakei KC-60 Lactobacillus sakei KC-61 Lactobacillus sakei KC-62 Leuconostoc citreum KC-63 Leuconostoc mesenteroides

60 64 KC-64 Lactobacillus brevis KC-65 Not determined 66 KC-66 Lactobacillus plantarum KC-67 Lactobacillus plantarum KC-68 Lactobacillus plantarum KC-69 Lactobacillus plantarum KC-70 Lactobacillus plantarum KC-71 Not determined 72 KC-72 Lactobacillus brevis KC-73 Lactobacillus plantarum KC-74 Lactobacillus plantarum KC-75 Lactobacillus plantarum KC-76 Not determined 77 KC-77 Lactobacillus plantarum KC-78 Lactobacillus arizonensis KC-79 Lactobacillus plantarum KC-80 Not determined 81 KC-81 Leuconostoc pseudomesenteroides KC-82 Weissella cibaria KC-83 Not determined 84 KC-84 Lactobacillus sakei KC-85 Leuconostoc mesenteroides KC-86 Not determined 87 KC-87 Lactobacillus sakei KC-88 Weissella cibaria KC-89 Weissella cibaria KC-90 Leuconostoc garlicum KC-91 Leuconostoc paramesenteroides KC-92 Leuconostoc citreum KC-93 Leuconostoc citreum KC-94 Weissella sp. KLB KC-95 Lactobacillus paraplantarum KC-96 Weissella cibaria KC-97 Weissella cibaria KC-98 Lactobacillus alimentarius

61 99 KC-99 Weissella cibaria KC-100 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KC-101 Not determined 102 KC-102 Lactobacillus sp. CS KC-103 Bacillus subtilis KC-104 Lactobacillus sp KC-105 Lactobacillus sp. CS KC-106 Lactobacillus sp. CS KC-107 Lactobacillus sp. CS KC-108 Not determined 109 KC-109 Not determined 110 KC-110 Not determined 111 KC-111 Not determined 112 KC-112 Not determined 113 KC-113 Not determined 114 KC-114 Not determined 115 KC-115 Not determined 116 KC-116 Not determined 117 KC-117 Not determined 118 KC-118 Not determined 119 KC-119 Not determined 120 KC-120 Not determined 121 KC-121 Not determined 122 KC-122 Not determined 123 KC-123 Not determined 124 KC-124 Not determined 125 KC-125 Not determined 126 KC-126 Not determined 127 KC-127 Not determined 128 KC-128 Not determined 129 KC-129 Not determined 130 KC-130 Not determined 131 KC-131 Not determined 132 KC-132 Not determined 133 KC-133 Not determined

62 134 KC-134 Not determined 135 KC-135 Not determined 136 KC-136 Not determined 137 KC-137 Not determined 138 KC-138 Not determined 139 KC-139 Not determined 140 KC-140 Not determined 141 KC-141 Not determined 142 KC-142 Not determined 143 KC-143 Lactobacillus plantarum KC-144 Not determined 145 KC-145 Not determined 146 KC-146 Not determined 147 KC-147 Not determined 148 KC-148 Not determined 149 KC-149 Not determined 150 KC-150 Bacillus subtilis KC-151 Not determined 152 KC-152 Not determined 153 KC-153 Lactobacillus sp. CS KC-154 Lactobacillus brevis KC-155 Not determined Total 366 그중인삼근권토양으로부터분리된균주 BB4(1)-b와균주 DB5(1) 에관해서 Genomic DNA의 G + C mol% 측정, Whole cell fatty acid ( 총균지방산측정) 측정, Quinone 분 석, Peptidoglycan 아미노산분석, DNA-DNA hybridization test, 기질테스트및각종분 류에필요한테스트를통하여세균학적특성및분류학적위치를결정하였다. 또한김치로 부터분리된유산균 Lactobacillus plantarum KC-143에대해서 phylogenetic tree를통해 분류학적위치를결정하였다

63 2-1) 인삼근권토양으로분리된균주의세균학적특성및분류학적위치 (1) 균주 BB4(1)-b에대한연구결과 ( 가) Benzyl chloride 방법을이용한 chromosomal DNA의전기영동 D N A m a k e r 1 1,2 0 0 b p Chrom osom al D N A Fig. 9. Electrophoresis of chromosomal DNA by benzyl chloride method. Benzyl chloride 방법을이용하여 chromosomal DNA의전기영동결과 11,200bp 위에 chromosomal DNA 를확인할수있었다. ( 나) 16S rdna의증폭및전기영동결과 PCR maker 1,500bp 16S rdna Fig. 10. Electrophoresis of 16S rdna amplified

64 Primer 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGC TCAG-3') 와 1512R(5'-ACGG(H)TACCTTGTT ACGACTT-3') 을이용하여 16S rdna를증폭하고전기영동을수행한결과 1,500bp에서 16S rdna 를확인할수있었다. ( 다) 계통도작성 균주 BB4(1)-b의 16S rdna의염기서열은 NCBI database를이용하여계통분류학적위 치를결정하였다 (Fig. 12). Fig. 11. Phylogenetic tree based on 16S rdna gene sequences, showing the phylogenetic relationships among strain BB4 producing β-glucosidase and related species in family Xanthomonadaceae. 균주 BB4(1)-b의 16S rdna의염기서열을통하여유연관계를분석한결과 BB4 T 와계 통학적으로가장가까운균주는 Dyella Japonica XD53 T 이었고 다. 97.6% 상동성을나타내었 ( 라) 균주 BB4 T 와계통학적으로인접한 "Xanthomonaceae" 과균주들간의특성비교및계통학적으로가까운균주들간의지방산비교 Table 7과 table 8은각각 BB4 T 와계통학적으로인접한 "Xanthomonaceae" 과균주들간의특성비교및계통학적으로가까운균주들간의지방산비교결과이다

65 Table 7. Differential physiological characteristics of strain Dyella koreensis BB4 T and the type strain of recognized members of the related species in family Xanthomonadaceae. Characteristic Motility Oxidase Catalase Acid from: D-Glucose D-Ribose D-Xylose D-Galactose D-Mannose L-Arabinose Fructose Growth on: Maltose N-Acetyl-glucosamine + W - - D-Malate D-Mannose D-Sucrose Acetate L-Fucose Valerate Caprate Citrate D-Arabinose D-Ribose Hydrolysis of: Cellulose Starch Casein DNA Growth at 4% NaCl W Sensitive for Kanamycine (mg/ml) Beta-glucosidase + W - + Beta-galactosidase Hydroxy fatty acid composition (3OH) 11:0 iso, 13:0 iso, 17:0 iso 11:0 iso, 13:0 iso 17:0 iso 12:0 11:0 iso, 13:0 iso, 12:0 iso DNA G+C content (mol%) Strains: 1, Dyella koreensis BB4 T 2, Dyella Japonica XD53 T 3, Frateruria aurantia LMG 1558 T 4, Fulvimonas soli LMG T [data for taxa 1-4 from Nalin et al. (1999)] +, Positive; -, negative. All strains were positive for assimilation of glucose and negative for assimilation gluconate and mannitol, and the production of urease

66 Table 8. Cellular fatty acid profiles of strain Dyella koreensis BB4 T and the type strain of recognized members of the related species in family Xanthomonadaceae. Fatty acid :0 iso Unknown :0 iso 3OH : :0 2OH :0 3OH :0 iso 3OH :0 iso 3OH : :0 iso :0 anteiso :0 iso : :1 iso 9c :0 iso :0 anteiso :0 iso 3OH :0 cyclo :1 6c : :0 iso Summed features

67 Strains: 1, Dyella koreensisi BB4 T [data from this study] 2, Dyella japonica XD53 T [data from Xie et al.(2004)] 3, Frateruria aurantia LMG 1558 T [data from this study] 4, Fulvimonas soli LMG T [data from Mergaert et al. (2004)]. Unknown 은 초때에나타나는 Peak 임. 0.5% 보다적은양의지방산 은표시되지않음. Summed features는 GLC 로분리가되지않는두개나세개의지방산그룹. Summed feature 3은 iso-c15:0 2OH 이나 C16:1 7c 또는둘다포함함. BB4 T 와계통학적으로가까운균주들인 Dyella Japonica XD53 T, Frateruria aurantia LMG 1558 T, Fulvimonas soli LMG T 과의지방산비교분석을통하여 15:0 anteiso과 17:1 iso 9c 지방산이가장많은퍼센트함량을차지하고 Dyella koreensisi BB4 T 균주의 세포막에존재하는지방산조성은 Dyella japonica XD53 T 와유사하며 Frateruria 와다른 조성을보이고있는것을확인하였다. 따라서 Dyella koreensisi BB4 T 균주가 Dyella에속 한다는것을확인할수있었다. (2) DB5(1) 에대한연구결과 ( 가) chromosomal DNA의전기영동및 16S-rDNA의전기영동 BB4 T 균주와마찬가지로 Benzyl chloride 방법을이용하여 chromosomal DNA의 전기영동을수행한결과 11,200bp 위에 chromosomal DNA를확인할수있었고 Primer 9F(5'-GAGTTT GATCCTGGCTCAG-3') 와 1512R(5'-ACGG(H)TACCTTGTTACGACT T-3') 을이용하여 16s rdna를증폭하고전기영동을수행하여 1,500bp에서 16s rdna를 확인할수있었다 (Fig. 9, Fig. 10). ( 나) 계통도작성 DB5(1) 의 16S rdna의염기서열을 NCBI database를이용하여계통분류학적위치를 결정하였다 (Fig. 11)

68 Fig. 13. Phylogenetic tree based on 16S rdna gene sequences, showing the phylogenetic relationships among strain DB5 producing β-glucosidase and related species in genus Cellulomonas. 유연관계를분석한결과 DB5(1) 은 Cellulomonas xylanilytica와가장가까운 유연관계를나타내었고 C. xylanilytica 균주와 속으로판정이되었다. 98.3% 상동성을나타내어 Cellulomonas ( 다) DB5 T 와계통학적으로인접한 "Cellulomonas 속" 균주들간의특성비교및계통학 적으로가까운균주들간의지방산비교 Table 9과 table 10은각각 DB5 T 와계통학적으로인접한 "Cellulomonas속" 균주들간 의특성비교및계통학적으로가까운균주들간의지방산비교결과이다

69 Table 9. Differential physiological characteristics of strain Cellulomons terrae DB5 T and the type strain of recognized members of the related species in genus Cellulomonas. Characters Catalase Growth on: Acetate ND Lactose Lactate ND Mannose ND Rhamnose (+) Hydrolysis of: Cellulose ND Xylan ND ND ND ND Casein ND ND ND ND Starch ND ND ND ND Peptidoglycan composition L-Orn-D-Glu L-Orn-D-Glu L-Orn-D-Glut L-Orn-D-Glu L-Orn-D-Glu L-Orn-D-Glu L-Orn Cell-wall sugars* Rha, Gla, Glu Rha, Man, Fuc Rha, Fuc, Glu Rha, Man, 6-deoxy-Tal Rha, Gluco, Gal, 6-deoxy-Tal Rha, Fuc, Gluco, Glu Others ND, NO Fuc G+C content (mol%) ND 균주들 : 1, C. terrae sp. nov. DB5 T 2, C. xylanilytica 3, C. humilata (data for taxa 1-3 from this study) 4, C. cellasea [data from Rivas et al. (2004)] 5, C. biazotea [data from Rivas et al. ( 2004)] 6, C. fimi [data from Rivas et al. (2004)] 7, C. hominis [data from Rivas et al. (2004)]. +, Positive; (+), positive, week or delayed response; -, negative; ND, not defined

70 Table 10. Cellular fatty acid profiles of strain DB5 T and the type strain of recognized members of the related species in genus Cellulomonas. Fatty acid C14: C16: C17: C18: C14:0 iso C15:0 iso C15:0 anteiso C15:1 anteiso A C16:0 iso C17:0 iso C17:0 anteiso Unknown 분류군 : 1, C. terrae DB5 T 2. C. xylanilytica 3. C. humilata. Unknown 은 초때나타나는 peak 임. 0.5% 보다적은양의지방산은표시되지않음. C. terrae DB5 T 균주의세포막에존재하는지방산중에서 C15:0 anteiso 지방산이가장 많은 % 를차지하는것을확인하였고, 이것은다른 Cellulomonas 종들의세포막지방산조

71 성과유사한조성을보이는것이며 C. terrae DB5 T 가 Cellulomonas 에속한다는것을확인 할수있다. ( 라) 2차원 TLC (thin-layer chromatography) 를이용한균주 DB5 T 의 polar lipids 분석 Fig. 14는 2차원 TLC (thin-layer chromatography) 를이용한균주 DB5 T 의 polar lipids 분석으로서 A, B, C, D는각각 5% ethanolic molibdatophosphoric acid, Periodate-Schiff, Ninhydrin, Zinzard reagent 로사용하였다. Fig. 14. Polar lipids analysis of strain DB5 T by two-dimensional TLC (thin-layer chromatography). First direction: Chloroform-methanol-water (65:25:4), second direction: chloroform-acetic acid-methanol-water (40:7.5:6:2)

72 Plates: A, 5% ethanolic molibdatophosphoric acid를 spray reagent 로사용 ( 모든 lipids 검 출용) B, Periodate-Schiff를 spray reagent 롤사용 (vicinal hydroxyl 그룹검출용) C, Ninhydrin을 spray reagent 로사용 (free amonio 그룹을함유한 polar lipids 검출용); D, Zinzard reagent 를 spray reagent 로사용 (phosphorus polar lipids 검출용). 약자: DPG, diphosphatidylglycerol; NP, NPG, nihydrin postive glycolipid PG, phosphatidylglycerol; PE, phosphatidylethanolamine; PIMs, phosphatidylinositol mannosids. DB5 T 균주의 Polar lipid 분석결과 DPG 함량이가장크게나타났다. 이것은 DB5 T 균주가 Cellulomonas 종에속한다는것을뒷받침하는증거이다. 2-1) 김치로부터분리된유산균주의세균학적특성및분류학적위치 (1) KC-143 번균주에대한연구결과 1. chromosomal DNA의전기영동및 16S-rDNA의전기영동 Sequencing 결과 KC-143번균주의 16S rdna영역은 1355bp의염기로구성되어 있었으며 (Fig. 15 ), Lactobacillus plantarum DSM T (X52653) 와 97.7% similarity를 보여 Lactobacillus 속에속하는균주로확인되었다

73 Fig. 15. The nucleotide sequence of 16S rdna of lactic acid producing strain KC 계통도작성 NCBI의 Blast search를통해 Lactobacillus genus 내에 KC-143 균주와유연관계가 가까운 species 들을찾고 nucleotide sequence search를통하여 type strain들의 염기서열을조사하였다. Bioedit program (Hall, 1999) 과 Clustal X program (Thompson et al, 1997) 이용하여염기서열을 alignment (Fig. 16) 한후 similarity를조사해본결과 Lactobacillus plantarum DSM T (X52653) 와 97.7%, Lactobacillus zymae LMG T (AJ632157) 와 93.5%, Lactobacillus spicheri LTH 5753 T (AJ534844) 와 93.4%, Lactobacillus brevis DSM T (M58810) 와 93.2%, Lactobacillus acidifarinae LMG T (AJ632158) 와 93.2% 의상동성을보였다 (Fig. 17). 109 균주의계통학적위치를 결정하는일은 MEGA3 program (Kumar et al, 2004) 의 neighbor-joining 방법으로 행하였으며, phylogenetic tree는 Fig. 17 에나타내었다

74 Fig. 16. Comparison of the KC-143 with other strain sequences were aligned using the CLUSTAL X program

75 Fig. 17. Phylogenetic tree of Rg3 producing strain KC-143 from Rb1. KC-143번균주의 16S rdna의염기서열을 GeneBank의 database와유연관계를분석한 결과 KC-143은 Lactobacillus plantarum DSM T 와가장가까운유연관계를 나타내어 Lactobacillus 속에속하는균주로확인되었다

76 제 3 절사포닌전환미생물선별 1, 재료및방법 가. 재료 균은 Difco사의 nutrient media, trypticase soy media, Luria- Bertani media, R2A media 및 MRS 배지( 조성및함량은 Table 에나타냈음) 에서배양하였다. 화기삼으 로부터분리한 ginsenoside Rb1은반응기질용으로사용하였고 KT&G로부터분양받은 Rb1, Rd, Rg3, Rh2, C-K는 standard 로사용하였다. Table 11. Approximate formular of Luria-Bertani (LB) media. Contents Trypton NaCl Yeast Extract Distilled water Amount(g/L) 10g 10g 5g 1000ml Table 12. Approximate formular of nutrient media. Contents Amount(g/L) Peptone 5.0g Beef exract 3.0g Sodium chloride 8.0g Distilled water 1000ml

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78 - 78 -

79 Fig. 21. TLC pattern of modified Rb1 by soil-born microorganisms isolated in ginseng field at first year. Table 13. Approximate formular of tryptic soy media. Contents Amount(g/L) Trypticase peptone 15.0g Phytone poptone 5.0g Sodium chloride 5.0g Distilled water 1000ml

80 Table 14. Approximate formular of R2A media. Contents Amount(g/L) Yeast Extract 0.5g Protese Peptone 0.5g Casamino Acids 0.5g Dextrose 0.5g Soluble starch 0.5g Sodium Pyruvate 0.3g Dipotassium Phosphate 0.3g Magnesium Sulfate 0.05 Distillde water 1000ml Table 15. Approximate formular of MRS media. Contents Amount(g/L) Proteose Peptone No. 3 Beef Extract Yeast Extract Dextrose Polysorbate 80 Ammonium Citrate Sodium Acetate Magnesium Sulfate Manganese Sulfate Di-potassium Phosphate

81 나. 방법 1) β-glucosidase 분비미생물에의한인삼사포닌의전환실험 (1) β-glucosidase 분비미생물의액체배양배지선정 Esculin agar법을이용하여분리된 β-glucosidase 분비미생물은아래와같은방법으로 균을배양하고균주별로가장생장이양호한배지를선정하였다 (Fig. 18). 배양방법 ( 가) 고체배지에균을 streaking 후 30 Incubater 에서배양한다. ( 나) colony가확인되면 single colony를멸균증류수 100μl 에희석한다. ( 다) 균체가희석된멸균수를각각 nutrient media, trypticase soy media, Luria- Bertani media, R2A media 및 MRS media 각각의배지에동일한량을분주하여 30 Shaking Incubater 에서현탁배양한다. ( 라) 12h, 24h 배양후스펙트로포토메터를이용해 600nm에서 O.D값을측정하여흡광 도가높은처리군의배지를반응실험용배지로사용하였다 Fig. 18. Selection procedure of suitable media

82 (2) 반응시간설정 인삼사포닌전환반응시간의설정을위한예비실험은 DL3(2)-a 균주와 BB4(4)-b-1 균 주를이용하여전배양후 ginsenoside Rb1과동일량을혼합한후각각 12h, 24h, 36h, 48h 반응을시키고수포화부탄올로추출하여 TLC로확인하고반응이일어난균주의시간 별반응정도를분석하여적절한반응시간을설정하였다. (3) 인삼사포닌의전환 ( 가) 미생물에의한인삼사포닌 Rb1의전환방법 색소기질을이용해분리한 β-glucosidase 분비미생물은선발배지에서현탁배양후 ( 증식 이빠른균주는 36 시간, 중간정도인균주는 3 일, 늦은균주들은 4일 5일간배양하여균 증식곡선의대수기말정도에반응을시킨다) 배양액 200 μl와 0.2 μm filter 로멸균한 1 mm 농도의 ginsenoside Rb1 수용액 200 μ l를혼합하여 30 Shaking Incubater에서 48 h 동안현탁배양하였다. 반응혼합물은 200 μl 수포화부탄올로 2회반복추출하고감압농축 한후 MeOH에용해시켜 TLC 분석에사용하였다(Fig. 19). 200 μl μl (1mM Rb1) Fig. 19. Schematic representation for transformation of ginsenoside and extraction of reaction product

83 ( 나) TLC분석 MeOH에용해시킨반응산물은 TLC plate에일정량점적하고 chloroform/methanol/ water ( 65:35:10, by vol, 하층) 혼합용매로전개한후 10% H 2SO 4 을분무하여 110 에서 10 min 가열하는방법으로발색시켰다. ( 다) HPLC 분석 HPLC 분석은순상과역상두가지방법으로분석하였다. 1 순상 HPLC 조건 (ELSD detector를이용한 HPLC 분석): 칼럼 : Alltech Prevail Carborhydrate ES, 5μm, mm Flow rate: 0.8ml/min ELSD detector 이동상조건은 Table 16 에나타냈다. Table 16. The composition of mobile phase in HPLC analysis using ELSD detector Time (min) ACN : H2O : Prophanol 80 : 5 : 15 Solvent ACN : H2O : Prophanol 80 : 20 : % 30% 20 0% 100% 55 0% 100% 65 70% 30%

84 2 역상 HPLC 조건(UV detector를이용한 HPLC 분석): Column: C18 column ( mm, ID 5 μm) Flow rate: 1ml/min UV detector: 203nm 이동상조건은 Table 17 에나타냈다. Table 17. The composition of mobile phase in HPLC analysis using UV detector Time (min) Solvent A: Acetonitrile (100%) B: Water (100%) 0 15% 85% 5 15% 85% 25 21% 79% 65 45% 55% 75 90% 10% 85 90% 10% 87 15% 85% % ( 라) 전환사포닌의구조동정 TLC와 HPLC 분석을통하여인삼사포닌을효율적으로분해할수있는균주에의한 ginsenoside Rb1의전환산물은 silica gel 60 column으로순수분리하여 13 1 H-NMR 과 C-NMR 을통하여화학적구조를동정하였다. NMR 분석기기는 FT-NMR spectrometer (Varion Inova AS 400, Varion USA. 400 MHz) 를사용하였다

85 2. 결과및고찰 가. 인삼사포닌의전환반응시간설정 DL3(2)-a 균주(27 번) 와 BB4(4)-b-1 균주(31 번) 의배양액과 ginsenoside Rb1을시간별 로반응시킨후 TLC로분석한결과를 Fig. 20 에나타냈다. C-K Rh2 Rg3 Rd Rb1 12h 24h 36h 48h 12h 24h 36h 48h S 27 번 31 번 Fig. 20. TLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by reaction time. 반응시간이증가함에따라기질 Rb1의함량은감소하고 Rd 함량은증가하며반응 48h 에 Rb1 이대부분가수분해되는것을관찰할수있었다. 따라서 β-glucosiase 분비미생물 과 ginsenoside Rb1의반응시간을 24 시간으로설정하였다. 나. β-glucosidase 분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환 TLC 분석결과 1) 1차년도 β-glucosidase 분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환 TLC분석 1차년도인삼근권토양으로부터 esculin배지를이용하여총 100주분리된 β-glucosidase 분비미생물을각각 Rb1과반응시킨 TLC분석결과를 Fig. 21 에나타냈다

86 TLC 분석을통하여 ginsenoside Rd만으로의전환활성을갖는균주는 FS6(6), BB4(4)-b-1, BB5(7), BB6(2), DB5(3), DB4(1), BT(4), BT(5), BB5(7), T7-06등 9 균주였 으며, Rd 및 Rd 보다 R f 값이낮은물질을동시에생산하는균주는 DL6(1), BB6(1) 두균 주였다. Rd와 Compound K 및 Rg3보다 R f 값이조금높은물질(Rg3 ) 을동시에생산하 는균주는 EM6(6)-a, BT1, BT9, BT14등 4 균주이며이와더불어 Rd보다 R f 값이조금낮 은물질(Rd ) 을동시에생산하는균주는 45 번, 70 번균주이다. 또한비록적지만 Rg3와 Rd, 그리고 Rd보다 R f 값이조금낮은물질(Rd ), (Rg3 ) 을생산하는균주가확인되었다 (Table 18). 균주는이름대신 table 6의 1차년도번호에따라사용하였으며분석을통하여 나타난미지물질은 R f 값에따라근접지표물질을기준으로화살표( ) 를이용하여구 분하였다. Table 18. The strains number converting ginsenoside Rb1 Secondary metabolite Rd Rd Rg3 Rg3 Rh2 Compound K 2, 13, 16, 22, Strain No. 31, 33, 35, 38, 39 40, 41, 46, 47, 50, 53, 54, 16, 22, 33, 38, 45, , 33, 43, 45, 50, 54, 70 13, 43, 45, 50, 54, 70 70, 87 2) 2차년도 β-glucosidase 분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환 TLC분석 2차년도인삼근권토양으로부터 esculin배지를이용하여총 111주분리된 β-glucosidase 분비미생물을각각 Rb1과반응시킨 TLC분석결과를 Fig. 22 에나타냈다

87 TLC 분석결과 GS235, GS342, GS404, GS462, GS508, GS514, GS603, GS608, GS610, GS658, GS836, GS844, GS973, GS1184, GS3066, M2-328 등균주들이각각 Rg3, Rd, F2, Rh2, Compound-K 등의반응을보였으며, 이중 GS514 균주가가장뚜렷하게 Rd와 Rg3를 생성할수있는활성을나타내었으므로 GS514 균주를이용하여 Rg3를생산하고자실험을 진행하였다(Table 19). 균주는이름대신 table 6의 2차년도번호에따라사용하였으며분석 을통하여나타난미지물질은 R f 값에따라근접지표물질을기준으로화살표( ) 를이 용하여구분하였다. Table 19. The strains number converting ginsenoside Rb1 Secondary metabolite Rd Rd Rg3 Rg3 Rh2 Compound K Strain No. 11, 18, 25, 30, 33, 50, 52, 55, 61, 63, 85, , 19, 25, 32, 34, 47, 49, 50, 55, 77 17, 30, 33, 50 25, 30, 47, 49, TLC 분석에서 ginsenoside Rb1을 Rd, Rg3, Rh2, C-K 및 Rg3보다 R f 값이조금높은 물질(Rg3 ), Rd보다 R f 값이조금낮은물질(Rd ) 등유의할만한처리구를따로취해 HPLC 를이용하여정밀분석을하였다. (3). 3차년도 β-glucosidase 분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환 TLC분석 결과 3차년도각종김치시료로부터 esculin배지를이용하여총 155주분리된유산균을각 각 Rb1과반응시킨 TLC분석결과를 Fig. 23 에나타내었다

88 - 88 -

89 - 89 -

90 - 90 -

91 - 91 -

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94 Fig. 23. TLC pattern of modified Rb1 by lactic acid bacteria isolated in Kimchi at third year

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97 TLC 분석결과 KC-68, KC-78, KC-79, KC-81, KC-82, KC-83, KC-138, KC-143 균주 들이특히뛰어난 ginsenoside Rg3 로의전환반응을보였으며, 그중 KC-143번균주를이 용하여 Rg3 를생산하고자시험을진행하였다(Table 20). Secondary metabolite 균주번호 Table 20. The strains number converting ginsenoside Rb1 Rd Rd Rg3 Rg3 Rh2 Compound K 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 13, 14, 16, 17, 19, 5, 12, 72, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 20, 21, 22, 27, 28, 29, 31, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 119, 120, 121, 53, 55, 57, 122, 124, 126, 127, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, , 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 78, 79, 81, 82, 83, 96, 97, 100, 101, 113, 115, 123, 125, 138, 143, 155 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 27, 28, 29, 31, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 78, 79, 81, 82, 83, 113, 115, 123, 125, 138, 143, 155 TLC분석에서 ginsenoside Rb1을 Rd, Rg3, Rh2, C-K 및 Rg3보다 R f 값이조금높은 물질(Rg3 ), Rd보다 Rf값이조금낮은물질(Rd ) 등유의할만한처리구를따로취해 HPLC 를이용하여정밀분석을하였다

98 다. β-glucosidase 분비미생물에의한 ginsenoside Rb1의전환산물 HPLC분석결과 TLC분석에서 ginsenoside Rb1을 Rd, Rg3, Rh2, C-K 및 Rg3보다 R f 값이조금높은 물질(Rg3 ), Rd보다 R f 값이조금낮은물질(Rd ) 등물질들로전환시킬수있는처리 구를다시 HPLC 분석을통하여사포닌분자구조를확인하고자하였다. HPLC 분석에서각 각의인삼사포닌의머무름시간을확인하기위하여 11 종인삼사포닌(Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2) 및 ginsenoside Rb1의가능한분해산물 Rd, Rg3, Rh2, compound K 를지표물질로분석하였다.(Fig. 24, Fig. 25). Rb1 Fig 24. HPLC analysis of 11 kinds of ginsenoside standards (ELSD detector)

99 Fig. 25. HPLC analysis of standards Rg3, Rd, Rh2, compound K (ELSD detector). Fig. 24과 Fig. 25는 ELSD detector를이용한인삼사포닌지표물질의 HPLC분석으로서 11종인삼사포닌에 compound K를포함한총 12종사포닌의머무름시간을 table 21에나 타냈다. Table 21. Retention time of 12 kinds of ginsenoside standards (ELSD detector) Ginsenoside Rb1 Rb2 Rc Rd Re Rf Rg1 Rg2 Rg3 Rh1 Rh2 C-K Retention Time (min)

100 Fig. 26과 27은 UV detector를이용한인삼사포닌지표물질에대한 HPLC 분석결과이다. Fig 26. HPLC analysis of 7 kinds of ginsenosides including Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1 (UV detector). Fig. 27. HPLC analysis of ginsenoside Rb1, Rd, Rg3, F2, Rh2, C-K (UV detector)

101 각각의머무른시간은 Table 22 와같다. Table 22. Retention time of 11 kinds of ginsenoside standards(uv detector) Ginsenoside Rb1 Rb2 Rc Rd Re Rf Rg1 Rg3 F2 Rh2 C-K Retention Time (min) 균주 BT4 (Fig. 28), BT5(Fig. 29) 및 BT12 (Fig. 30) 은 TLC 분석(Fig. 18, 57 번) 에서보 다시피 Rd 로만특이적으로전환된처리구이다. Fig. 28. HPLC analysis of the strain BT4 ( ELSD detector). Fig. 29. HPLC analysis of the strain BT5 (ELSD detector)

102 Fig. 30. HPLC analysis of the strain BT12 (ELSD detector). HPLC 분석에서도 TLC 분석결과와마찬가지로머무름시간 25.7min에 Rd peak가나 타나는것을관찰할수있었다 (Fig ). 과 균주 EM6(6)-a과 BT3은 TLC 분석(Fig 번) 에서 R f 값이 Rd보다약간작은물질 Rg3보다 R f 값이약간높은미지물질이대량검출된처리구이다. HPLC 분석에서머 무름시간 25.7 min과 26.2 min에나타난 peak는 ginsenoside Rd 로, 14.9 min과 14.8 min 에나타난 peak는 ginsenoside Rg2 로인식이되었다(Fig. 31, Fig. 32). Fig. 31. HPLC analysis of the strain EM6(6)-a (ELSD detector)

103 Fig. 32. HPLC analysis of the strain BT1 (ELSD detector). HPLC 결과를 TLC 분석결과(Fig. 21) 와비교하여볼때 ginsenoside Rd로인식된 peak 는 Rd가아닌극성이유사한물질즉 gypenoside XVII 로추정된다. 또한 TLC 분석에서 Rg3보다 R f 값이약간높게나타난미지물질은 HPLC분석에서 Rg2로인식이되어나타 났지만 Fig. 33에나타낸구조식을보면반응에사용한인삼사포닌은 aglycone의 3번과 12 번에 OH기가 2개인 protopanaxadiol 계사포닌인 ginsenpside Rb1으로서 aglycone의 3 번, 6번및 12번에 OH기가 3개결합되어있는 protopanaxatriol계사포닌인 ginsenoside Rg2 가될가능성이전혀없다. 즉 HPLC 분석에서 Rg2로인식되어진것은 Rg2, Rg3가다아 닌극성이유사한 F2 로사료된다. HO OH HO OH HO 3 HO 3 6 OH Aglycone-protopanaxadiol Aglycone-protopanaxatriol

104 HOCH 2 O CH 2 O O OH OH O HO HO OH 20 OH OH 12 HO OH HOCH 2 O O OH HO HOCH 2 O O OH HO OH Ginsenoside Rb1 3 6 HO HOCH 2 O O OH HO O OH O CH 3 OH OH Ginsenoside Rg2 Fig. 33. The structure of aglycone-protopanaxadiol, aglycone-protopanaxatriol, ginsenoside Rb1 and ginsenoside. BT3, BT9, BT14 균주는 TLC상에서 ginsenoside Rd, Rg3보다 R f 값이약간높게나타 난미지물질및 compound K 가동시에나타난처리구이다. BT9와 BT14 균주에서머무 Fig. 34. HPLC analysis of the strain BT3 ( ELSD detector)

105 Fig.35. HPLC analysis of the strain BT9 (ELSD detector). Fig. 36. HPLC analysis of the strain BT14 (ELSD detector). 름시간 26.1 min과 25.7 min에 ginsenoside Rd peak가나타났고 BT3과 BT14 균주에서 머무름시간 14.9 min에 Rg2로감지된 Rg3보다 R f 값이약간높게나타난미지물질의 peak가나타났으며 BT3, BT9와 BT14 균주에서머무름시간 6.5 min, 6.9 min과 6.3 min 에서 compound K의 peak 가나타났다(Fig ). BT9 균주에서 Rd 및 compound K의 peak는 BT3과 BT14 균주에비해약간높게나타냈는데이것은 peak가전체적으로약간 뒤로미루어진원인으로볼수있다. EM3(2)-a 균주는 1차년도균주들중유일하게 TLC상에서 Rg3가확인이된균주이 다. EM3(2)-a 균주의 HPLC 분석결과 TLC (Fig. 21) 에서와마찬가지로상당량의 Rd가감

106 지되었다 (Fig. 37). 아 앞부분의 3.5min에서적지않은물질이감지되었지만극성이매우낮은것으로보 ginsenoside PPD Fig. 37. HPLC analysis of the strain EM3(2)-a (ELSD detector). 일가능성도배제할수없지만당한분자차이에따른극성차이가 너무크기때문에단정지을수없으며지표물질과의비교가요구되어진다. Fig. 38는 GS 514의 HPLC 분석결과이다. TLC 분석결과(Fig ) 에서 ginsenoside Rg3의농도가작아반응시간을연장시켜 HPLC 분석을수행하였다. Rg3 Fig. 38. HPLC analysis of the strain GS514 (UV detector)

107 HPLC 분석에서비록 peak는아주작지만머무름시가 min에 ginsenoside Rg3를 확인할수있었다. 만 대부분의 HPLC 분석은 TLC 분석결과와비교하였을때유사한결과를나타냈다. 하지 ginsenoside Rg3보다 R f 값이조금높게나타난물질과 ginsenoside Rd보다 R f 값이조 금낮게나타난미지물질은 HPLC 분석에서각각극성이유사한 ginsenoside Rg2, ginsenoside Rd 로감지되었다. 따라서이미확정이되었다고판정되는물질, TLC 상에서 나 HPLC 분석에서확정이되지않은미지물질들, 나아가서 ginsenoside Rg3와같이 20 번수산기의위치가다름에따라 R-form과 S-form의 Rg3로구분되는물질들의더욱정 학한구조동정을위하여 NMR 분석을수행하였다. 라. NMR분석에의한 Rb1전환산물구조동정 1) Ginsenoside Rd, F2, Compound K 의구조동정 BT3 균주를 LB배지에서배양한후 ginsenoside Rb1과시간별로반응시켜 TLC (Fig. 39) 로확인한후각각의전환산물을 silica gel column 을이용하여분리하였다. C-K Rh2 Rg3 III II Rd I Rb1 S S Fig. 39. TLC analysis of reaction between strain BT3 and ginsenoside Rb1 by reaction time

108 (1) Ginsenoside Rd 구조동정 Fig. 40과 41은각각 BT3 균주와 ginsenoside Rb1 의반응전환산물Ⅰ(standard Rd와같 은 R f 값에나타남) 의 1 H-NMR 과 13 C-NMR 분석이다. Fig H-NMR analysis of metaboliteⅠconverting ginsenoside Rb1 by strain BT MHz; solvent, pyridine-d 5. Fig C-NMR analysis of metaboliteⅠconverting ginsenoside Rb1 by strain BT MHz; solvent, pyridine-d

109 전환산물Ⅰ: white powder; mp.: 204~206 C; 1 H-NMR (pyridine-d 5, 400 MHz, δ): 0.73 ppm (3H, s, H-19), 0.88 ppm (3H, s, H-30), 0.89 ppm (3H, s, H-18), 1.05 ppm (3H, s, H-29), 1.22 ppm (3H, s, ʹ-28), 1.56 ppm (6H, s, H-26, H-27), 1.58 ppm (3H, s, H-21), 4.87 ppm [1H, d, J=7.6Hz, Hˊ-1], 5.14 ppm [1H, d, J=7.6Hz, Hʹʹʹ-1], 5.34 ppm [1H, d, J=7.6Hz, Hʹʹ-1]. 13 C-NMR (pyridine-d 5, 100 MHz, δ): 39.1 (C-1), 26.6 (C-2), 88.9 (C-3), 39.7 (C-4), 56.3 (C-5), 18.4 (C-6), 35.1 (C-7), 40.0 (C-8), 50.1 (C-9), 36.8 (C-10), 30.8 (C-11), 70.2 (C-12), 49.3 (C-13), 51.4 (C-14), 30.8 (C-15), 26.7 (C-16), 51.7 (C-17), 16.3 (C-18), 15.9 (C-19), 83.3 (C-20), 22.5 (C-21), 36.0 (C-22), 23.3 (C-23), (C-24), (C-25), 25.8 (C-26), 17.8 (C-27), 28.1 (C-28), 16.6 (C-29), 17.3 (C-30), (C-1), ʹ 83.1 (C-2), ʹ 77.9 (C-3), ʹ 71.6 (C-4), ʹ 78.2 (C-5), ʹ 62.6 (Cʹ-6), (Cʹʹ -1), 77.0 (Cʹʹ -2), 79.1 (Cʹʹ -3), 71.4 (Cʹʹ -4), 78.0 (Cʹʹ -5), 62.6 (Cʹʹ -6), 98.2 (Cʹʹʹ -1), 75.1 (Cʹʹʹ -2), 78.2 (Cʹʹʹ-3), 71.6 (Cʹʹʹ-4), 78.2 (Cʹʹʹ-5), 62.8 (Cʹʹʹ-6). BT3 균주와 ginsenoside Rb1의반응전환산물Ⅰ의 1 H-NMR과 13 C-NMR 분석결과는 ginsenoside Rd의 NMR data (Dong et al. 2003) 와유사한위치에서나타나 ginsenoside Rd 로구조동정되었다. (2) Ginsenoside F2 구조동정 Fig. 42과 43은각각 BT3 균주와 ginsenoside Rb1 의반응전환산물Ⅱ(standard Rg3보다 R f 값이약간높게나타난미지물질) 의 1 H-NMR 과 13 C-NMR 분석이다

110 Fig H-NMR analysis of metaboliteⅡconverting ginsenoside Rb1 by strain BT MHz; solvent, pyridine-d 5. Fig C-NMR analysis of metaboliteⅡconverting ginsenoside Rb1 by strain BT MHz; solvent, pyridine-d 5. 전환산물Ⅱ: white powder; mp.: 184~186 C; 1 H-NMR (pyridine-d 5, 400 MHz, δ): 0.81 ppm (3H, s, H-19), 0.95 ppm (3H, s, H-30), 0.97 ppm (3H, s, H-18), 1.00 ppm (3H, s, H-29), 1.31 ppm (3H, s, H-28), 1.60 ppm (3H, s, H-26, H-27), 1.63 ppm(3h, s, H-21),

111 4.95 ppm (1H, d, J=7.6Hz, Hʹ-1), 5.20 ppm (1H, d, J=7.6Hz, Hʹʹʹ-1). 13 C-NMR (pyridine-d 5, 100 MHz, δ): 39.2 (C-1), 26.8 (C-2), 88.8 (C-3), 39.9 (C-4), 56.4 (C-5), 18.5 (C-6), 35.2 (C-7), 40.1 (C-8), 50.2 (C-9), 37.0 (C-10), 30.8 (C-11), 70.1 (C-12), 49.5 (C-13), 51.5 (C-14), 31.0 (C-15), 26.7 (C-16), 51.7 (C-17), 16.4 (C-18), 16.0 (C-19), 83.3 (C-20), 22.5 (C-21), 36.2 (C-22), 23.3 (C-23), (C-24), (C-25), 25.8 (C-26), 17.8 (C-27), 28.2 (C-28), 16.9 (C-29), 17.4 (C-30), (C-1), ʹ 75.7 (C-2), ʹ 78.7 (Cʹ-3), 71.6 (C-4), ʹ 78.3 (Cʹ-5), 62.8 (Cʹ-6), 98.2 (Cʹʹʹ -1), 75.1 (Cʹʹʹ -2), 79.2 (Cʹʹʹ -3), 71.8 (Cʹʹʹ-4), 78.4 (Cʹʹʹ-5), 63.0 (Cʹʹʹ-6). BT3 균주와 ginsenoside Rb1의반응전환산물Ⅱ의 1 H-NMR과 13 C-NMR 분석결과는 ginsenoside F2의 NMR data(dou et al. 1997) 와유사한위치에서나타나 ginsenoside F2 로구조동정되었다. (3). Compound K 의구조동정 Fig. 44과 45는각각 BT3 균주와 ginsenoside Rb1 의반응전환산물Ⅲ(standard compound K와같은 R f 값에나타남) 의 1 H-NMR 과 13 C-NMR 분석이다. Fig H-NMR analysis of metaboliteⅢ converting ginsenoside Rb1 by strain BT MHz; solvent, pyridine-d

112 Fig C-NMR analysis of metaboliteⅢ converting ginsenoside Rb1 by strain BT MHz; solvent, pyridine-d 5. 전환산물Ⅲ: white powder; mp.: 220~222 C; 1 H-NMR (pyridine-d 5, 400 MHz, δ): 0.83 ppm (3H, s, H-19), 0.90 ppm (3H, s, H-18), 0.94 ppm (3H, s, H-30), 1.00 ppm (3H, s, H-29), 1.19 ppm (3H, s, H-28), 1.57 ppm (6H, s, H-26, H-27), 1.59 ppm (3H, s, H-21), 5.16 ppm (1H, d, J=7.6Hz, Hʹʹʹ-1). 13 C-NMR (pyridine-d 5, 100 MHz, δ): 39.4 (C-1), 28.3 (C-2), 78.0 (C-3), 39.6 (C-4), 56.3 (C-5), 18.8 (C-6), 35.2 (C-7), 40.1 (C-8), 50.3 (C-9), 37.4 (C-10), 30.8 (C-11), 70.3 (C-12), 49.4 (C-13), 51.4 (C-14), 30.9 (C-15), 26.7 (C-16), 51.7 (C-17), 16.4 (C-18), 16.1 (C-19), 83.3 (C-20), 22.5 (C-21), 36.1 (C-22), 23.4 (C-23), (C-24), (C-25), 25.9 (C-26), 17.9 (C-27), 28.8 (C-28), 16.4 (C-29), 17.4 (C-30), 98.3 (Cʹʹʹ -1), 75.2 (Cʹʹʹ -2), 79.2 (Cʹʹʹ-3), 71.5 (Cʹʹʹ-4), 78.4 (Cʹʹʹ-5), 62.8 (Cʹʹʹ-6). Caulobacter leidyia. BT3과 ginsenoside Rb1의반응전환산물Ⅲ의 1 13 H-NMR과 C-NMR분 석결과는 compound K의 NMR data(sung et al. 1995) 와유사한위치에서나타나 compound K 로확인할수있었다

113 2) Gypenoside XVII 의구조동정 GS 603 균주를 LB배지에서배양한후 ginsenoside Rb1과 48h 반응시켜 TLC로확인한 후각각의전환산물을 silica gel column 을이용하여분리하였다 (Fig. 46). C - K R h 2 R g 3 Ⅱ R d R b 1 Ⅰ Fig. 46. TLC analysis of reaction between strain GS603 and ginsenoside Rb1 by reaction time. Fig. 47와 48는각각 GS603 균주와 ginsenoside Rb1 의반응전환산물Ⅰ(standard ginsenoside Rd보다 Rf 값이약간낮게나타난미지물질) 의 1 H-NMR 과 13 C-NMR 다. 분해산물 Ⅱ는이미위에서 gisenoside F2 로동정이되었다(Fig. 42, Fig. 43). 분석이 Fig H-NMR analysis of metaboliteⅠconverting ginsenoside Rb1 by strain GS MHz; solvent, pyridine-d

114 Fig C-NMR analysis of metaboliteⅠconverting ginsenoside Rb1 by strain GS MHz; solvent, pyridine-d 5. 분해산물 Ⅰ: 1 H-NMR (pyridine-d 5, 400MHz, δ): 0.75ppm(3H, s, H-19), 0.91ppm(3H, s, H-18), 0.93ppm(3H, s, H-30), 0.94ppm(3H, s, H-29), 1.25ppm(3H, s, H-28), 1.56ppm(3H, s, H-26), 1.61ppm(3H, s, H-21), 1.61ppm(3H, s, H-27), 4.89ppm[1H, d, j=8.0 Hz, Hʹ-1], 5.03ppm[1H, d, j=7.6 Hz, Hʹʹʹ-1], 5.08ppm[1H, d, j=7.6 Hz, Hʹʹ-1]. 그중 H-21번메틸기의 3개수소의 signal은 H-27번메틸기의 3개수소의 signal 에겹쳐나타났다. 13 C-NMR (pyridine-d 5, 100 MHz) :39.1 (C-1), 26.6 (C-2), 88.8 (C-3), 39.6 (C-4), 56.3 (C-5), 18.4 (C-6), 35.1 (C-7), 40.0 (C-8), 50.1 (C-9), 36.9 (C-10), 30.7 (C-11), 70.1 (C-12), 49.4 (C-13), 51.3 (C-14), 30.7 (C-15), 26.7 (C-16), 51.6 (C-17), 16.0 (C-18), 16.3 (C-19), 83.4 (C-20), 22.4 (C-21), 36.2 (C-22), 23.2 (C-23), (C-24), (C-25), 25.8 (C-26), 17.9 (C-27), 28.1 (C-28), 16.8 (C-29), 17.4 (C-30), (C-1), ʹ 75.6 (C-2), ʹ 78.6 (Cʹ-3), 71.8 (C-4), ʹ 78.2 (Cʹ-5), 63.0 (Cʹ-6), 98.0 (Cʹʹʹ -1), 74.8 (Cʹʹʹ -2), 79.0 (Cʹʹʹ -3), 71.4 (Cʹʹʹ -4), 76.9 (Cʹʹʹ -5), 70.1 (Cʹʹʹ-6), (Cʹʹʹʹ -1), 75.1 (Cʹʹʹʹ -2), 78.2 (Cʹʹʹʹ -3), 71.6 (Cʹʹʹʹ-4), 78.2 (Cʹʹʹʹ-5), 62.7 (Cʹʹʹʹ-6). GS603 균주와 ginsenoside Rb1의반응전환산물Ⅰ의 1 H-NMR과 13 C-NMR 분석결과는 gypenoside XVII의 NMR data(teng et al. 2002) 와유사한위치에서나타나 gypenoside XVII 로구조동정이되었다

115 3) Ginsenoside Rg3 의구조동정 GS 514 균주를 LB배지에서배양한후 ginsenoside Rb1과 10h 반응시켜 TLC로확인한 후각각의전환산물을 silica gel column 을이용하여분리하였다 (Fig. 49). C-K Rh2 Rg3 Ⅰ Rd Rb1 Fig. 49. TLC analysis of reaction between strain GS514 and ginsenoside Rb1 by reaction time. Fig. 50과 51은각각 GS514 균주와 ginsenoside Rb1 의반응전환산물Ⅰ(standard ginsenoside Rg3와같은 Rf값에나타남) 의 1 H-NMR 과 13 C-NMR 분석이다. Fig H-NMR analysis of metabolite converting ginsenoside Rb1 by strain GS MHz; solvent, pyridine-d

116 Fig C-NMR analysis of metabolite converting ginsenoside Rb1 by strain GS MHz; solvent, pyridine-d 5. 분해산물 : 1 H-NMR (pyridine-d 5, 400 MHz, δ): 0.77 ppm (3H, s, H-19), 0.93 ppm (6H, s, H-18, H-30), 1.08 ppm (3H, s, H-29), 1.26 ppm (3H, s, H-28), 1.44 ppm (3H, s, H-21), 1.59 ppm (3H, s, H-27), 1.62 ppm (3H, s, H-26), 4.91 ppm [1H, d, J=6.8Hz, Hʹ -1], 5.36 ppm [1H, d, J=7.2Hz, Hʹʹ-1]. 13 C-NMR (pyridine-d 5, 100 MHz) 는 Table 23 에나타냈다. Table C-NMR Chemical shift of material Rg3 (100 MHz, solvent: pyridine-d 5). Carbon site Aglycone moiety C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 20(R)-Rg3 (ppm)* (S)-Rg3 (ppm)* sample (ppm) Carbon site Aglycone moiety C-27 C-28 C-29 C-30 sugar 20(R)-Rg3 (ppm)* (S)-Rg3 (ppm)* sample (ppm)

117 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 C-21 C-22 C-23 C-24 C-25 C moiety Cʹ-1 Cʹ-2 Cʹ-3 Cʹ-4 Cʹ-5 Cʹ-6 Cʹʹ-1 Cʹʹ-2 Cʹʹ-3 Cʹʹ-4 Cʹʹ-5 Cʹʹ , Ginsenoside Rg 3 는 Fig. 52와같이 20번탄소의 OH기위치가다름에따라 R-form과 S-form으로나뉘며 R-form과 S-form은 13 C-NMR에서 C-17, 21, 22위치에서큰차이를 나타낸다 (Teng et al., 2000). 즉 C-17과 C-21의 signal은 S-form이 R-form에비해훨씬 저자장에서나타나고 C-22의 signal은 S-form이 R-form에비해훨씬고자장에서나타난 다

118 HO OH 20 OH OH 20 O 3 O 3 HOCH 2 O OH HO O HOCH 2 O OH HO OH HOCH 2 O OH HO O HOCH 2 O OH HO OH 20(S)-ginsenoside Rg3 20(R)-ginsenoside Rg3 Fig. 52. The structure of 20(S) and 20(R)-ginsenoside Rg3 Ginsenoside Rb1과 β-gulucosidase 활성균주와의반응에서생성된 Rg3는 Table 23에서 보다시피 C-17, 21, 22위치의탄소 signle이 S-form 과완전히일치하였다. 따라서이대사 산물은 20(S)-ginsenoside Rg 3 로구조동정하였다. 제 4 절인삼근권토양으로부터 ginsenoside Rg3생산효소분 리및동정 Ginsenoside Rb1과 esculin방법으로분리한 β-glucosidase 분비미생물의반응을통하여 ginsenoside Rd, Rg3, F2, compound K 및 gypenoxide XVII등사포닌으로의전환능력을 TLC, HPLC 및 NMR 분석을통하여확인하였다. 본연구과제는 인삼근권토양미생물을이 용한인삼생리활성물질 ginsenoside Rg3의생산에관한연구 로서 GS 514균주에서 ginsenoside Rg3 생산효소의분리에초점을두었다

119 1. 재료및방법 가. 재료 균은 Difco사의 Nutrient media, trypticase soy media, Luria-Bertani media 배지( 조성 및함량은표 11~15 에나타냈음) 에서배양되었다. 화기삼으로부터 HP-20수지흡착법을이 용하여분리한 ginsenoside Rb1은반응기질용으로사용하였고 KT&G에서분양받은 Rb1, Rd, Rg3, Rh2, C-K는 standardr 로사용하였다. 유도물질로사용된홍삼엑기스는정관장을, 인삼분말은부여홍삼을, 잎사포닌은중국 Fusong에서구입하여사용하였고 2-D용 IPG Buffer(pH 3-11 NL) 은 Amersham Biosciences 의제품을구입하여사용하였다. TLC (Thin Layer Chromatography, 60 F-254 Silica gel plate) 는 Merck사의것을구입하여사 용하였고효소분리에사용한 DEAE -cellulose DE-52수지는 Whatman 사, Mono Q column은 Pharmacia 사, gel chromatography에는 superdex 200(No )FPLC기기는 Phamacia LKB-Programmer GP-250 Plus Biosciences SE 250 Mini-format Vertical Unit for two gels 모델, 단백질전기영동기기는 Amersham 및 Amersham Biosciences US/ Ettan DALT Six large Vetical system을사용하였고 silver 염색은 ( 주) 바 이오세상의 EZ-Silver Staining Kit for protein 을사용하였다. 나. 방법 1) GS514균주에의한 ginsenoside Rg3생산효소의생산최적조건 (1) 배지선별 GS514 균주를 nutrient agar에배양한후 single colony를 5ml씩 culture 한후 LB, SB, NB, PY(Pepton + yeast + Nacl) 액체배지에접종하고 27, 150rpm조건으로 Shaking Incubator에서 48 h 배양하였다. 균배양액은 spectrophotometer로 600nm에서 0.5, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48 h 간격으로 O.D값을측정하여균의생장속도를비교하고 12h 배양액은각 각 ginsenoside Rb1과반응시켜 ginsenoside Rg3 생산여부를확인하였다

120 (2) 배양온도가균생장에미치는영향 GS 514 균주를 LB broth에같은조건으로접종후각각 22, 27, 32, 37 에서 24시간배 양하고 600nm에서 O.D 값을측정하여적정한균배양온도를확립하였다. (3) PH 조건이균생장에미치는영향 LB broth를 HCl과 NaOH수용액으로각각 PH 5.5, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.5, 8.0으로 조절한후 27 에서 48시간배양하고 600nm에서 O.D값을측정하여적절한 ph조건을확 립하였다. (4) 유도물질의첨가가 Rg3생산효소생산에미치는영향 LB broth에균을일정량접종후각각 LB배지양의 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5% (w/w, E1 E5) 홍삼농축액, 5, 6%(w/w, P1, P2)) 인삼분말, 0.4, 0.5, 0.6, %(w/w, C1~C5) 잎 조사포닌을첨가하여 27 와 32 에서 48 h 배양하였다. 균이자란처리구는 g에서 5분간원심분리한후 ginsenside Rb1과반응시켜 TLC 분석을통하여 Rg3생산효소활성 을확인하였다. (5) 균주배양시 O.D값에따른유도물질의첨가시기가 Rg3생산효소생산에미치는 영향 LB broth에균을일정량접종후 27, 160 rpm에서시간별로배양하여 O.D600값을측 정하고 O.D값별로유도물질잎사포닌을 LB배지양의 % 양으로첨가하여 24 h 배 양하였다. 균배양액은 g에서 5분간원심분리한후 ginsenside Rb1과반응시켜 TLC 분석을통하여 Rg3 생산효소활성을확인하였다. (6) 균주배양시유도물질의첨가함량및유도물질첨가후균주배양시간이 Rg3생산효소생산에미치는영향

121 LB broth에균을일정량접종후 27, 160 rpm에서 O.D600값이 정도로배양후 유도물질잎사포닌을 LB배지양의 0.6, 0.8, 1.0, 1.2% 양으로첨가하여각각 24, 36, 48 h 배양하였다. 균배양액은 g 에서 5분간원심분리한후 ginsenside Rb1과반응시켜 TLC 분석을통하여 Rg3 생산효소활성을확인하였다. (7) Ginsenoside Rb1과 GS 514 균주배양여액과의반응산물에대한 HPLC분석 GS 514 균주를 LB배지에서 O.D 600 값이 정도로배양후유도물질잎사포닌을 LB 배지양의 1.2% 를첨가하고 24 h 배양하였다. 균배양액은 g에서 5분간원심분리한 후배양여액은 ginsenside Rb1과반응시킨후수포화부탄올로 2회반복추출하고감압농 축하였다. 잔여물은 HPLC용 MeOH에용해시키고아래와같은분석조건으로 HPLC 분석 을수행하였다 (Table 24). HPLC 분석조건: HPLC 기기: Watere-2695, 2996 DAD Column: Hypersil ODS2 (250*4.6 mm, 5 µm) Flow rate: 1.0ml/min Mobiler phase: A-acetonitrile (Merck); B-water (MiliQ) Table 24. The composition of mobile phase in HPLC analysis Time (min) A(%) B(%) ) Ginsenoside Rg3 생산효소의분리 (1) Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway

122 ( 가) Rg3생산균주조효소액의조제 1 균주배양여액조제 GS514 균주를앞서언급한 GS514균주에의한 ginsenoside Rg3생산효소의생산최적조 건, (7) Ginsenoside Rb1과 GS 514 균주배양여액과의반응산물에대한 HPLC분석 의배 양방법으로유도물질을처리하여 LB배지에서 1L 배양한후 9000 g, 4 에서 1 h 원심분리 하였다. 상층액은조심히 1L 삼각플라스크에넣고 4 에서방치하여배양여액을만든다. 배양여액은 ginsenoside Rb1과반응시켜 Rg3 생산효소활성을체크한다. 2 염석 활성이체크된배양여액 가하여 1L 에 (NH 4) 2SO g을 stirring하면서 4 환경에서조심히첨 70% 포화용액을만든다. (NH 4 ) 2 SO 4 가완전히용해되면냉장고의냉장실(4 ) 에서 overnight 하여단백질을침전시킨다. 3 투석 70% (NH 4) 2SO 4 포화용액의단백질침전은 4 에서 g로 1시간원심분리하여상 층액은버리고침전단백질은소량의 20mM sodium phosphate buffer(ph 7.0) 에용해시킨 다. 단백질용액은 MWCO 3000 membrane을이용하여 1L의 20mM sodium phosphate buffer에 2 일투석하여염과작은분자량의펩티드를제거한다 ( 투석과정중 20mM sodium phosphate buffer를 4 번교체해준다). 투석액은원심분리를통하여불용성물질을제거하고 0.45 µm membrane filter로여과하여 column 분리용조효소액으로하였다. ( 나) Mono Q TM column에의한조효소의분리 염석과투석을통한조효소액은 Mono Q TM FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) 를수행하였다. column을이용하여아래와같은조건으로

123 FPLC 분석조건: Column: Mono Q TM Elution buffer: A: 20mM Tris-HCl, PH 8.0 B: 20mM Tris-HCl, PH 8.0, 1M NaCl Flow rate: 1ml/min Detector: UV, 280nm ABS Unit: 1 Injection volume: 0.5ml Fraction volume : 1ml Table 25. The composition of mobile phase in HPLC analysis Time (min) A(%) B(%) ( 다) Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway 탐색 Mono Q TM column을통하여받은각각의분액은각각 ginsenoside Rb1 및 Rd와반응 시키고 TLC 분석을통하여 Rg3생산효소를확인하고 ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의 전환 pathway 를결정하였다. (2) Ginsenoside Rd 생산효소의분리 ( 가) Ginsenoside Rd생산효소의생산 GS 514 균주를 ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway 결정 1균주배양여 액조제 와같은방법으로조효소액을조제한다

124 ( 나) Ginsenoside Rd생산효소의분리 조효소액은 분리한다. 효소분리조건 : DEAE-cellulose DE-52 column에흡착시키고아래와같은조건으로효소를 Column: DEAE-cellulose DE-52 column (Φ 1.8 Elution buffer: A: 20mM NaOAc-HAc, PH cm) B: 60, 120, 180, 240, 300, 400, 500 mm KCl의 20mM sodium acetate buffer Flow rate: 1ml/min Detector: UV, 280nm Injection volume: 12 ml. Fraction volume: 5 ml. 80 ml의 20mM NaOAc-HAc (ph 5.0) buffer로먼저 elution한후각각 45 ml의 60, 120, 180, 240, 300, 400, 500, 600 mm KCl(20mM NaOAc-HAc, ph 5.0 을포함한) buffer 를순차적으로 elution 한다. fraction collector를이용하여분취한짝수번호의 fraction(5 ml) 은 ginsenoside Rb1과반응시켜 Rd 생산효소활성을체크한다. ( 다) Ginsenoside Rd생산효소분자량측정 DEAE-cellulose DE-52 column을통하여분취한각각의 fraction에서 ginsenoside Rd생 산효소활성이가장강하게나타나는 fraction에대해 electrophoresis, 5% stacking gel) 를실시하고 였다. 15% SDS-PAGE (polyacrylamide gel ginsenoside Rd생산효소의분자량을측정하 SDS-PAGE에사용되는 acrylamide stock solution (solution A), 4 separating gel buffer (solution B); 4 stacking gel buffer (Solution C), 10% ammonium persulfate (APS), electrorhoresis buffer), 5 sample buffer, staining solution 및 destaining solution 은 Protein Methods (Daniel et al. 1996) 를참고하여조제하였다

125 (3) Ginsenoside Rg3 생산효소분리 GS514 균주는 ginsenoside Rb1을 Rd뿐만아니라 Rg3로까지전환시킬수있는능력을 나타냈다. Ginsenoside Rg3생산효소는유도물질의첨가하에서생성된효소로서유도물질 을첨가하지않은처리구를대조구로하여 Fig. 53과같은방법으로 Rg3생산효소를찾고 자하였다. Strain producing Rg3 Culture No elicitor Elicitor Filteration : centrifugation S/N + 70% AS PPt. Dialysis ㅡ MWCO 3000 Mono Q negative exchange Checking of the fraction producing Rg3 by TLC assay SDS-PAGE, IEF and 2-D gel electrophoresis In search of the enzyme producing Rg3 Fig. 53. Schematic representation for isolation of enzyme producing Rg3. ( 가) Ginsenoside Rg3생산효소의생산 Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway결정에서의 1균주배양여액조제 와 같은방법으로유도물질을첨가하여균을배양하고염석, 투석을거쳐조효소액( 이후

126 treatment 로대체) 을조제하고동일한조건에서유도물질을첨가하지않고균을배양하여 조효소액( 이후 control 로대체) 을조제하였다. ( 나) Ion exchange chromatography에의한 ginsenoside Rg3생산효소의분리 대부분의단백질은음이온차질을띄고있다. 따라서 ginsenoside Rg3생산효소의분리는 Mono Q TM column 을통하여분리하였다. Mono Q TM column에의한효소의분리조건은 위의 ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway 결정에서의 2염석 의 로하였다. 분리조건으 Treatment와 control에서 Mono Q TM column을통하여분취한각각의 faction은 ginsenoside Rb1 및 Rd와반응시켜활성 fraction을찾고 ginsenoside 전환활성이가장다 양하고강한 fraction은 gel chromatography 로다시효소분리하였다. ( 다) Gel chromatography 에의한 Rg3 생산효소분리 위의활성 fraction은아래와같은조건으로 gel filtration chromatography 를수행하였다. 분석조건 : column: superdex 200(No ) elution buffer: 10mM Na 2HPO 4/NaH 2PO 4, PH 7.0; flow rate: 0.4ml/min; detector: UV, 280nm; ABS Unit: 2 injection volume: 0.5ml. 각각의 fraction은 Rb1 및 Rd 와반응시켜활성효소를체크하였다. ( 라) 전기영동에의한 Rg3생산효소의분리 1 PAGE 영동및 slice반응 TLC 분석을통하여활성이보이는분액은 10% PAGE(16 18cm) 를수행하였다. PAGE

127 에사용되는 acrylamide stock solution (solution A), 4 separating gel buffer (solution B); 4 stacking gel buffer (Solution C), 10% ammonium persulfate (APS), electrorhoresis buffer), 5 sample buffer, staining solution 및 destaining solution은 Protein Methods (Daniel et al. 1996) 를참고하여조제하였다. 전기영동이완료후 separating gel은 0.5 cm간격으로 slice를만들어 20mM sodium phosphate buffer(ph 7.0) 로분리된단백질을추출한후 Rb1, Rd와반응시켜 Rg3생산효 소의 native 상태의분자량위치를판정하였다. 2 2-Dimensional gel electrophoresis Mono Q column을통하여분취한 Rg3생산효소활성이가장큰 fraction은투석을거쳐 염을제거한후 centricon 으로농축(150 mg/ml) 하여 2-D 전기영동 sample 로하였다. 1 차원전기영동(IEF: Isoelectric focusing): 100 µl sample에 250 µl 재수화용액(rehydration buffer) 을잘혼합하고깨끗한 strip hold 에조심스럽게주입한다. Nonlinear gradient strip(18 cm, ph 3 11) 은붙어있는필 름을제거한후 sample 혼합액이골고루묻도록위에부착시키고미네랄 oil 로덮어준다. Strip hold는뚜껑을덮은후상온에서 over night( 약 16 시간) 하고 IPGphor를이용하여각 각 500V 1 시간, 1000V 1 시간, 8000V 6시간 focusing 을실시한다. 2 차원전기영동 12.5% SDS-PAGE (20 26 cm) 를만든다. ph 조정용액 Ⅰ(IPG Buffer 10ml + DTT 0.1 g) 을제조하여 focusing이끝난 strip이담겨있는 tube에 5 ml씩첨가하여 10분간천천히 교반하여준다. ph조정용액 Ⅰ을버리고 ph 조정용액 Ⅱ(IPG Buffer 10ml + iodoacetamide 0.25 g) 를조제하여 strip tube에 5 ml씩첨가하여 10 분천천히교반하여준다. Strip은 3차 증류수에세척하여이미만들어진 gel 판위에올리고기포를제거한다. 단백질 marker를 흡수시킨 filter paper를올리고밀폐 agar를천천히주입하여 strip을고정시킨후 Gel 전

128 기영동을실시하고 silver 염색법으로염색한다. Treatment와 control의 2-D전기영동에서차이나는 spot를 picking하여 amino acid sequencing 을하였다. (4) Ginsenoside Rg3생산효소를이용한 ginsenoside Rb1전환율측정 1 mm Ginsenoside Rb1수용액 72 ml 에 Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway 탐색, ( 가) Rg3생산균주조효소액의조제 방법으로조제한 ginsenoside Rg3생산 균주조효소액 10 ml과 5 M NaCl 용액 5 ml을혼합하고 30, 160 rpm에서 12 h 반응 시켰다. 반응혼합물은동량의수포화부탄올로반복 3 회추출하고추출액은 40 에서감 압농축한후 율을측정하였다. silica gel 60 column을이용하여분해산물을각각분리하고분해산물의전환 2. 결과및고찰 가. GS 514균주에의한 ginsenoside Rg3생산효소의생산최적조건 1) 배지선별 GS514 균주를각각 LB broth (LB), Tryptic soy broth (TSB), Nutrient broth (NB) 에 접종하여 Shaking Incubator에서배양하여 O.D 600 을측정한결과 table 26와같이 LB와 TSB배지에서가장잘자랐고 NB 배지에서는거의자라지않았다. Table 26. Value of O.D by spectrophotometer for detection of cell growth according to cultured media Time (h) LB TSB NB PY

129 각각의배지에서 12 h 배양액을 ginsenoside Rb1과같은체적으로혼합하여시간별로 반응시킨결과는 Fig. 54 와같다. C-K Rh2 Rg3 Rd Rb1 C-K Rh2 Rg3 Rd Rb1 C-K Rh2 Rg3 Rd Rb1 S S S hr hr hr A B C Fig. 54. TLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by strain GS514 cultured in different media, (a) LB broth, (b) Tryptic soy broth and (c) Nutrient broth. Developing solvent: CHCl 3/MeOH/H 2O (65:35:10, by vol., lower phase). S: saponin standards. GS514 균주는 LB배지와 SB배지에서생장이양호할뿐만아니라 ginsenoside Rb1과의 반응 TLC분석에서 standard Rg3와같은 Rf값위치에 Rg3 band를명확히확인할수있었 지만 NB배지에서는다만 ginsenoside Rd band만확인이되고 Rg3 band는나타나지않았 다. 이것은 GS514 균주가 NB 배지에서잘자라지않은원인으로추정된다. 따라서 Rg3 생산효소에적합한배지로는 LB배지와 SB배지선정이적합하지만 LB배지의가격이더욱 저렴하기때문에 GS514 균주배양은 LB 배지를선정하였다

130 2) 배양온도가균생장에미치는영향 GS514 균주를 LB배지에서 22, 27, 32, 37 온도별로배양한후 O.D600값을측정하여배 양온도가균생장에미치는영향을조사하였다 (table 27). Table 27. Valu7e of O.D by spectrophotometer for detection of cell growth according to cultured temperature and media Temp. ( ) O.D 실험결과 GS514 균주는 37 에서생장속도가가장느리고 27 에서가장빠른생장속도 를보였다. 따라서 GS514 균주의온도배양조건을 로선정하였다. 3) ph조건이균생장에미치는영향 서 LB배지의 ph를 6.0에서 8.0까지조절한후 27 에서같은조건으로배양하고 600nm에 O.D 값을측정하였다. Table 28. Value of O.D 600 by spectrophotometer for detection of cell growth according to cultured ph, temperature and media LB배지 Table 28에서보다시피 ph 5.5에서균생장이약간떨어질뿐기타 ph조건에서는 O.D 600 값이 사이로서유사한생장속도를보였다. 따라서 LB배지의 ph는조절하지않고 자체의 ph 조건(pH 7.0 ± 0.2) 을직접사용하였다

131 4) 유도물질의첨가가 Rg3생산효소생산에미치는영향 GS 514 균주를 LB배지에서 27, 160 rpm조건으로 36 h 배양후균배양액을 g에 서 5분간원심분리하여배양여액과동량의 1mM Rb1수용액과 12 h 반응시켰다. 반응혼합 물은수포화부탄올로추출한후 TLC plate에점적하고 chloroform/methanol/water ( 65:35:10, by vol., 하층) 혼합용매로전개한후 10% H 2SO 4 을분무하여 110 에서 10 min 가열하여발색시켰다 (Fig. 54). GS 514 균주의배양여액과 ginsenoside Rb1 의반응결과(Fig. 55) 는배양액과 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 Fig. 55. TLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by culture filtrates of strain GS514. C: control(no elicitor). ginsenoside Rb1 의반응결과(Fig. 49) 와서로다른양상을보였다. Fig. 49에서보다시피 균배양액과 ginsenoside Rb1의반응에서명확히 Rg3 band가나타났고 NMR분석을통하여 20(S)-Rg3로화학구조가동정되어 GS 514 균주의 ginsenoside Rg3의생산능력즉 Rg3생 산효소를분비할수있는능력을확인하였다. 하지만 Rb1과균배양여액과의반응에서는 예상과는달리 ginsenoside Rg3는생성되지않았고약간의 ginsenoside Rd만생성되어 Rg3 생산효소가존재하지않거나혹은극히적게존재하는것으로사료된다. GS 514 균주 배양액및배양여액의 Rb1과의반응에서나타난이러한모순은 GS 514 균주가생산한 Rg3생산효소는인삼사포닌 Rb1의첨가로인해유발된효소로서유도효소라고인정할수 있다. 즉 GS 514 균주의배양액과 Rb1의반응에서균주는 Rb1을영양원으로하기위하여 Rb1의 glucose 를분해하는효소 (Rg3 생산효소포함) 를분비하여 Rg3를생산할수가있었 고 GS 514 균주배양여액에서는배양과정에서 Rb1의첨가가없었기때문에 Rg3생산효소

132 를생산할수없어 Rg3 가생성되지않은것으로사료된다. GS 514 균주가 Rg3생산효소를 많이발현하게하기위하여 LB 배지에홍삼농축액, 인삼분말, 인삼잎사포닌등유도물질을 첨가하여배양하고다시균배양여액과 ginsenoside Rb1 을반응시켰다. 인삼사포닌의균생 장억제작용( 곽이성등, 2002) 으로인하여홍삼농축액, 인삼분말, 인삼사포닌의첨가는그 함량이증가함에따라균생장억제작용이증가하여조사포닌을 0.7과 0.8% (C4, C5) 첨가하 였을때균이자라지않았고홍삼농축액의경우에서도 2.0, 2.25, 2.5% 를첨가하였을때균 이늦게자라는것을관찰할수있었다. 균이자라지않은처리구 C4, C5를제외한기타 처리구를원심분리를통하여 cell를제거한후 Rb1과반응시킨 TLC분석결과를 Fig. 56에 나타냈다. C-K Rh2 Rg3 Rd Rb1 S C1 C2 C3 E1 E2 E3 E4 E5 P1 P2 Fig. 56. TLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by culture filtrates of strain GS514. C1~C3: 0.4, 0.5 and 0.8% of crude saponin was added to LB broth; E1~E5: 1.5, 1.75, 2.0, 2,25 and 2.5% of red ginseng extract was added to LB broth; P1~P2: 5 and 6% of ginseng powder was added to LB broth. TLC 분석을통하여홍삼농축액, 인삼분말및조사포닌첨가처리구에서모두 ginsenoside Rg3 band 를확인할수있었다. 이것은홍삼농축액, 인삼분말, 조사포닌은모 두 Rg3생산효소를유발할수있는능력을가지고있다는것을말해주며그중조사포닌과 인삼분말의유도효과가홍삼농축액에비해강하게나타남을관찰할수있었다. 조사포닌의 첨가중 0.5% 첨가하였을때 Rg3가가장많이생성되고 0.6% 첨가하였을때 Rg3가적게 생성된것은 0.6% 첨가구에서인삼사포닌의함량증가로인한균의생장억제효과가더욱

133 강하게나타나균생장이많이저해된원인으로사료된다. 조사포닌은인삼분말에비해수 용성이좋고사포닌함량이많아적게넣어도월등히좋은유도효과를나타낼수있어조 사포닌을 Rg3 생산효소유도물질로선정하였다. 5) 균배양액의 O.D값에따른유도물질의첨가시기가 Rg3생산효소생산에미치는영향 균배양시유도물질의첨가는 GS 514 균주로하여금 Rg3 생산효소를유발시킨다. 균배 양초기조사포닌을유도물질로첨가하면인삼사포닌의항균작용으로말미암아 LB배지양 의 0.6% 첨가구에서균생장이이미많이억제된다. 따라서더욱많은양의유도물질을 첨가하여더욱많은양의 Rg3생산효소를생산하고자 균배양액의 O.D 600 값에따른유도물 질의첨가시기를고찰하였다. LB배지에 GS 514 균주를접종하고 O.D 600 값이 0.111, 0.417, 1.387, 1.745가되게키운후각각 LB배지양의 0.6%, 0.8% 의잎조사포닌을첨가하여 24 h 배양하였다. Cell를제거한균배양여액은 ginsenoside Rb1과반응시킨후 TLC분석을통 하여 Rg3 생산효소를확인하였다(Fig. 57). C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 S C1 C1 C2 C2 C3 C3 C4 C4 Fig. 57. TLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by culture filtrates of strain GS514. C1, C1': 0.6 and 0.8% of crude saponin was added to suspension culture (O.D 600 : 0.111); C2, C2': 0.6 and 0.8% of crude saponin was added to suspension culture (O.D 600: 0.417); C3, C3': 0.6 and 0.8% of crude saponin was added to suspension culture (O.D 600: 1.387); C4, C4': 0.6 and 0.8% of crude saponin was added to suspension culture (O.D 600 : 1.745)

134 Fig. 57에서보다시피균배양액의 O.D 600 값이 0.417일때유도물질을첨가하면다른시기 에첨가하는것보다 ginsenoside Rg3가많이생성되는것을관찰할수있었고조사포닌의 첨가량은 0.8% 첨가구가 0.6% 보다 Rg3생산효소를더많이유도시키는것을관찰할수 있었다. 이들결과로부터유도물질의첨가시기는 O.D 600 값이 사이가적합하다는 것과균을일정한 O.D 600 값으로배양후유도물질을첨가하면더욱많은유도물질의첨가 가가능하여더욱많은 Rg3 생산효소를생산할수있음을알수있다. 6). 균주배양시유도물질의첨가함량및유도물질첨가후균주배양시간이 Rg3생산 효소생산에미치는영향 유도물질의첨가함량은 Rg3 생산효소의생산량에직접적인영향을준다. GS 514 균주를 LB배지에서 O.D 600 값이 0.606이되게배양한후인삼잎조사포닌을 LB배지양의 0.6%, 0.8%, 1.0%, 1.2% 를각각첨가하여각각 24, 36, 48 h 배양하였다. 균배양여액은 ginsenosidde Rb1과각각반응시키고 TLC 분석을수행하였다. C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 S S S 24 h 36 h 48 h Fig. 58. TLC analysis of transformation of ginsenoside Rb1 by culture filtrates of strain GS514. 1~4: 0.6, 0.8, 1.0, 1.2% of crude saponin was added to suspension culture (O.D 600: 0.606). Fig. 58에서보다시피유도물질조사포닌의첨가함량이증가할수록 ginsenoside Rg3의 생산양은증가하여첨가 1.2% 에서가장많은 Rg3가생성이되고유도물질첨가후배양 시간은 24 시간이적합한걸로나타났다

135 7) Ginsenoside Rb1과 GS 514 균주배양여액과의반응산물의 HPLC분석 (1) 지표물질 F2, 20(R)-Rg3, compound K, 20(S)-Rh2 및 20(R)-Rh2의 HPLC분석 Fig. 59는 standard F2, 20(R)-Rg3, compound K, 20(S)-Rh2 및 20(R)-Rh2의 HPLC 분석결과이다. F2 20(R)-Rg3 Compound K 20(S)-Rh2 20(R)-Rh2 Fig. 59. The HPLC analysis of standard F2, 20(R)-Rg3, compound K, 20(S)-Rh2 and 20(R)-Rh

136 20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Fig. 60. The HPLC analysis of standard 20(S)- and 20(R)-ginsenoside Rg3. Ginsenoside F2, 20(R)-Rg3, compound K, 20(S)-Rh2 및 20(R)-Rh2의머무름시간은 각각 47.3 min, 49.9 min, 54.6 min, 55.6 min 및 56.1 min에 peak 가나타난다. (2). 지표물질 20(S)-Rg3, 20(R)-Rg3 의 HPLC분석 20(S)-Ginsenoside Rg3와 20(R)-ginsenoside Rg3는 Fig. 52에서보다시피다만탄소20 번위치에연결되어있는 OH기와 CH 3 기의공간위치가바뀌어서이루어진이성질체로서 TLC 분석에서구분이되지않는다. 본 HPLC분석조건에서는 S-form과 R-form Rg3가구 별되며머무름시간은각각 49.3 min과 49.8 min 에나타났다(Fig. 60). (3) GS 514 균주배양여액과 ginsenoside Rb1의반응산물 HPLC분석 GS 514 균주를 LB배지에서배양후배양액을직접 ginsenoside Rb1과반응시키면 20(S)-Rg3 가생성이되었다(Fig ). LB배지에유도물질을처리하여균을배양하고 다시원심분리를통해균을제거한후 ginsenoside Rb1과반응시켰을경우 TLC분석을통 하여 Rg3를확인하였지만 R-form과 S-form 의구별은불가능하였다. 따라서 R-form과 S-form Rg3구분이가능한 HPLC 분석을수행하였다(Fig. 61). HPLC분석을통하여 ginsenoside Rb1은주로 ginsenoside Rd ( 머무름시간 41.8 min) 및 20(S)-gisenoside Rg3 ( 머무름시간 49.2 min, standard S-Rg3 의머무름시간: 49.3 min) 로확인이되었다

137 Rb1 Rd 20(S)-Rg3 Fig. 61. The HPLC analysis of reaction mixture of ginsenoside Rb1 and filtrates of strain GS514 (added elicitor). culture 따라서 GS514 균주는유도물질조사포닌의첨가로인하여 ginsenoside Rb1을 20(S)-Rg3 로전화시킬수있는효소를발현하는것을알수있다. 나. Rg3생산효소의분리 1) Ginsenoside Rb1으로부터 Rg3로의전환 pathway 탐색 Ginsenoside Rb1으로부터 재한다 (Fig. 62). ginsenoside Rg3로의전환은아래와같은두가지경로가존

138 HOCH 2 O CH 2 O O OH O OH HO HO OH OH OH 20 HOCH 2 O O OH HO OH OH 20 HO 20 Glc O HOCH 2 O O HOCH 2 O O HOCH 2 O OH HO O HOCH 2 O OH HO OH OH HO HOCH O 2 O OH HO OH OH HO O HOCH 2 O OH HO OH or OH 20 Rb1 Rd Rg3 Pathway A HOCH 2 O CH 2 O O OH O OH HO HO OH OH OH 20 HO 20 3 O Glc- Glc-Glc- 3 O HOCH 2 O HOCH 2 O OH HO O HOCH 2 O OH HO OH OH HO O HOCH 2 O OH HO OH or OH 20 Rb1 Rg3 Pathway B Fig. 62. Biotransformation pathway for production of ginsenoside Rg3 from Rb1. Pathway (A) is that ginsenoside Rg3 was produced after forming ginsenoside Rd and pathway (B) is that ginsenoside Rg3 produced directly. Pathway A는 ginsenoside Rb1의탄소 20번위치에결합되어있는두개의 glucose중 에서 terminal glucose가먼저가수분해되어 Rd가생성되고다시 Rd로부터 20번탄소의 glucose를가수분해하여 Rg3를생성하는경로이고 pathway B는 ginsenoside Rb1의 20번 탄소의두개의 glucose를동시에가수분해하여 Rg3 를생성하는경로이다. GS514균주가 ginsenoside Rb1을 20(S)-Rg3로전환시킬수있는능력을지니고있음은이미 TLC, HPLC 및 NMR 분석을통하여확인하였다. Rg3생산효소가 Rd를 Rg3로전환시키는효소인 지아니면 Rb1을직접 Rg3로전환시키는효소인지확인하기위하여유도물질을처리하여 균을대량배양한후염석, 투석을거쳐조효소액을조제하고 Mono Q column을이용하여 FPLC 분석을하였다(Fig. 63). 각각의 fraction은 ginsenoside Rb1 및 Rd와 10 h 반응시키 고 TLC분석을통하여 Rg3 생산효소활성을확인하였다

139 Absorbance (280nm) Fraction (1ml/Fraction) FPLC분석에서 2번 fraction에나타난큰 peak는 column에흡착되지못하고직접세척되 어나온단백질들이고 fraction 8번부터 fraction 20번까지가분리된단백질 fraction 들이다. 따라서 ginsenoside Rg3생산효소확인실험은 2 번, 8 20번 fraction을선택하여수행하였 다. Fig. 63. Purification of β-glucosidase on Mono Q Column. C-K Rh2 F2 Rg3 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rd Rb1 Rb1 Fig. 64. TLC analysis of reaction between ginsenoside Rb1 and fraction collected from Mono Q column

140 C-K Rh2 F2 Rg3 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rd Rb1 Rb1 Fig. 65. TLC analysis of reaction between ginsenoside Rd and fraction collected from Mono Q column. Fig. 64과 Fig. 65에서보다시피분리가되지않은 2번 fraction을제외한기타 fraction에 서 15, 16, 17번에서만 β-glucosidase 활성을나타내었다. Ginsenoside Rb1과의반응에서는 15번과 16번 fraction에서활성을나타냈고그중 15번 fraction은 ginsenoside Rb1을주로 ginsenoside Rd 및 gypenoside XVII로전환시킨것외에약간의 ginsenside Rg3를생성하 였으며 16번 fraction에서는세가지사포닌중 Rg3 를가장많이생성하였다. Ginsenoside Rd와의반응에서는 16번과 17번 fraction에서 ginsenoside Rg3 band를확인할수있었고 그중 16번 fraction에서가장강한 Rg3 생산효소활성을확인할수있었다. Fig. 64과 Fig. 65을종합하여분석하면 15번 fraction에는 ginsenoside Rb1을 Rd, Rg3, gypenoside XVII 로전환시키는효소가모두존재하고그중 ginsenoside Rd로의전환효소가가장많이존 재하며 16번 fraction에는 15번과마찬가지로 ginsenoside Rb1을 Rd, Rg3, gypenoside XVII로전환시키는효소가모두존재하지만 15번 fraction에비해 ginsenoside Rg3로의전 환효소가더욱많이존재하고 17번 fraction은 Rb1과의반응에서 Rb1외의 band가나타나 지않은것으로보아 ginsenoside Rb1을 Rd 및 gypenoside XVII로의전환효소는존재하 지않거나극히소량존재하고다만 ginsenoside Rd를 Rg3로전환시키는효소만소량존 재한다는것을알수있다. 17번 fraction의 Rd와의반응에서 Rg3 band가나타나고 Rb1과의반응에서 Rg3 band가 나타나지않았다는사실은 GS 514 균주가발현한 ginsenoside Rg3생산효소는 Rd를 Rg3 로전환시킬수있지만 Rb1을 Rg3로전환시킬수없다는것을말해주며 ginsenoside

141 Rb1에서 Rg3로의전환은 Rd를통한 pathway 1 과정이라는것을판단할수있었다. 따라서인삼에서가장많이존재하는 protopanaxadiol계열사포닌 Rb1을 Rg3로전환시 키려면 Rg3생산효소뿐만아니라 Rd 생산효소도필요로한다는것을확인할수있었다. 2) Ginsenoside Rd 생산효소의분리 (1) Ginsenoside Rd 생산효소의분리 조효소액은 DEAE-cellulose DE-52 column을통하여총 79개 fraction 을분취하였다. Fraction과 Rd와의반응 TLC분석결과를 Fig. 66 에나타냈다. F2 Rg3 Rd Rb1 Rb1 원액 Rd Rg F2 Rg3 Rd Rb1 Rb1 원액 Rd Rg Fig. 66. TLC analysis of reaction between ginsenoside Rd and fraction collected from DEAE-cellulose DE-52 column. Fraction과 ginsenoside Rb1 의반응결과, fraction 35번에서 Rd생산효소할성이가장강

142 하게나타났고 fraction 45번과 51 번에서약간의활성이나타났다. Ginsenoside Rd생산효소 활성이가장강하게나타난 35번 fraction을중심으로양쪽옆으로 fraction 순서대로 33번 부터 37번 fraction 까지 Rb1 과반응시켰다. 반응결과 Fig. 67과같이 35번과 36번 fraction 에서가장강한할성을보였다. Rg3 Rd Rb1 Rd Rg3 Rb Fig. 67. TLC analysis of reaction between ginsenoside Rd and fraction from No. 33 to 37 collected from DEAE-cellulose DE-52 column. 35번 fraction과 36번 fraction은 SDS-PAGE 에서유사한결과를나타냈다(Fig. 68). 각각분자량 66.2 kda과 45.0 kda사이에두개의뚜렷한 band 를나타냈다. 따라서본연 구에서는 35번 fraction을분자량측정전기영동 sample 로하였다. Fig % SDS-PAGE of fraction 35 and 36 collected from DEAE-cellulose DE-52 column. 1, No. 36 fraction; 2, No. 35 fraction, M, protein marker (97.4 kda, phosphorylase b; 66.2 kda, albumin; 45 kda, ovalbumin; 30kDa, carbonic anhydrase; 20.1 kda, trypsin inhibitor; 14.4 kda, -lactalbumin)

143 (2) Rd 생산효소분자량측정 Fig. 68의 SDS-PAGE를통하여 35번 fraction에서두개의단백질 band를확인할수 있었다. 두개의 band 중 ginsenoside Rd생산효소의 band를확인하기위하여 35번 fraction 에대해 PAGE를실시하고일부분은 CBB (Coomassie Gel Stain Stock) 염색을하고기타 부분은발색된 band의위치에근거하여 gel 을자른다. Slice는 buffer로단백질을추출한 후 Rb1과각각반응시켜활성을체크하는동시에 SDS-PAGE 를수행하였다. kda Enzyme producing Rd M Fig % SDS-PAGE of gel slice of PAGE of fraction 35 collected from DEAE-cellulose DE-52 column. 1, Slice 1; 2, No. 35 fraction, 3, Slice 2; M, protein marker (97.4 kda, Phosphorylase b; 66.2 kda, Albumin; 45 kda, Ovalbumin; 30kDa, Carbonic anhydrase; 20.1 kda, Trypsin inhibitor; 14.4 kda, -Lactalbumin). Rb1과의반응에서활성을보이지않은 slice 추출액(Fig 69-1번 line), DEAE-cellulose DE-52 column을통해받은 35번 fraction(fig 69-2번 line), 활성을보인 slice 추출액(Fig 69-3번 line) 및단백질 marker순으로 15% SDS-PAGE 를수행하였다. Fig. 69에서보다시 피 ginsenoside Rd생산활성을보인 3번 line에서단백질은하나의 band로나타났으며 35 번 fraction의두개의 band 중아래쪽 band 임을확인할수있었다. Fig. 69의단백질전기영동결과에근거하여단백질 marker의 Rf 값(Table 29) 과분자량

144 에근거하여단백질분자량 curve (Fig. 70) 를작성하였다. Table 29. R f value of protein marker in 15% SDS-PAGE Protein Phosphorylase b Albumin Ovalbumin Carbonic anhydrase Trypsin inhibitor Trypsin inhibitor M.W(kDa) R f Molecular Weight of the enzyme producing Rd (M. W kda) Molecular Weight (kda) Relative Mobility Fig. 70. Molecular weight of the enzyme producing ginsenoside Rd on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. 1, phosphorylase b (97.4 kda); 2, albumin (66.2 kda); 3, ovalbumin (45 kda); 4, carbonic anhydrase (30kDa); 5, trypsin inhibitor (20.1 kda); 6, -lactalbumin (14.4 kda). Ginsenoside Rd생산효소의 R f 값은 0.233으로서분자량측정결과 58.7kDa 에해당하였다

145 3) Ginsenoside Rg3 생산효소의분리 (1) Treatment와 control 조효소액의 Rg3생산효소활성확인 ( 가) Treatment와 control 배양여액의 Rg3생산효소활성확인 유도물질을첨가한 treatment와유도물질을첨가하지않은 control의 GS514 균주의 LB 배지배양액을원심분리하여 cell을제거하고동량의 ginsenoside Rb1과반응시킨결과를 Fig. 71 에나타냈다. C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 S T C Fig. 71. TLC assay of reaction between ginsenoside Rb1 and culture filtrates of strain GS514. T, treatment; C, control. TLC분석결과 treatment에서는 ginsenoside Rg3가생성이되고 control에서는약간의 Rd 만생성이되고 Rg3 는생성이되지않았다. ( 나) Treatment와 control 조효소액의 Rg3생산효소활성확인 GS 514 균주배양여액은염석( 황산암모늄으로 70% 포화), 투석을거쳐(MWCO 3000 투 석막) 30배농축하고다시 ginsnoside Rb1과반응시켜 ginsenoside Rg3생산효소활성을체 크하였다 (Fig. 72)

146 C-K Rh2 Rg3 F2 Rd Rb1 s T1 T2 T3 C1 C2 C3 Fig. 72. TLC assay of reaction between ginsenoside Rb1 and dialysis solution of strain GS514. T, treatment; C, control; 1~3, volume of dialysis solution (1, 5 µl; 2, 10µl; 3, 20µl) Treatment와 control 각각의 1, 2, 3은 1mM Rb1수용액 100 µl에투석액을각각 5, 10, 20 µl( 각각배양여액의 1.5 배, 3 배, 6 배) 를첨가하여반응시킨것으로서투석액의증가에따 라 treatment와 control에서 ginsenoside Rd의함량이증가되는경향을관찰할수있었으 나 treatment의배양여액에서원래확인되었던 ginsenoside Rg3의 band는 T1, T2에서는 나타나지않았고 T3 에서만약간나타났다. 이것은 Rg3생산효소가염석과정에서침전되지 않았거나염석및투석과정에서변성이되었을가능성이크다는것을말해준다. 따라서 70% 황산암모늄염석과정에서 Rg3생산효소의침전여부및효소변성여부를확인하기위 하여황산암모늄으로 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 포화하고 4 에서 overnight한다음원심 분리하여침전물을 20mM ph 7.0인 sodium phosphate buffer에용해하여 Rb1과반응시켜 Rg3 생산효소의활성을체크하였다(Fig. 73)

147 C-K Rh2 Rg3 F2 Rd Rb S 포화 (%) Fig. 73. The effect of (NH 4) 2SO 4 on precipitation of enayme producing Rg3. TLC분석결과 40% 80% 포화에서모두 Rg3 band가확인이되고 60% 포화에서가장 많은양의 Rg3 가생성되었다. 이것은 Rg3생산효소는 70% 황산암모늄염석과정에서충분 히침전이되었으며변성이되지않았다는것을말해준다(70%, 80% 에서 Rg3함량이떨어 지는원인은황산암모늄염의농도증가로인하여더욱많은단백질이침전이되고따라서 같은양의 buffer에용해되는 Rg3생산효소의양이적어져 Rg3생산량이감소되었다고사료 된다). 따라서투석액에서 Rg3생산효소활성이나타나지않은원인은투석과정에서일어난 어떤변화에의해일어난것으로확인할수있다. 염석을통한단백질용액중각종무기 염, 사포닌분해산물, 분자량이작은 peptide등물질들이동시에존재하는데분자량이 3000(±20%) 보다작은저분자물질들은농도차이로인한확산작용에의해투석막을통하여 빠져나가게된다. 만약투석과정중 4 온도의영향( 이온도에서 Rg3 생산효소안정), ph 의영향(pH 7.0인 20 mm sodium phosphate buffer 에투석, 균주배양 ph 조건과유사) 을 배제하면 MWCO 3000 투석막에의한영향으로서한가지원인은 Rg3생산효소는단백질 이아니고분자량이 3000좌우인 peptide이거나또다른한가지원인은 Rg3 생산효소는염, 확실하게말하면금속에의존하는효소일가능성이크다. 지금까지알려진 β-glucosidase 분자량은대부분몇십kD에달하는단백질들이고또한저농도황산암모늄포화에서효소 가침전이되었다는것은(Fig. 73) Rg3생산효소는 peptide 가아니라는것을말해준다. 따라 서 Rg3생산효소의금속의존성을확인하기위하여투석액을 ginsenoside Rb1과반응시키 고 NaCl 을처리하여반응시켰다(Fig. 74)

148 C-K Rh2 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 F2 Rg3 Rd Rb1 S T1 T2 C1 C2 S A B Fig. 74. The effect of NaCl on activity of enzyme producing Rg3. A, Treatment (T1, not added NaCl; T2, added NaCl); B, Control(C1, not added NaCl; C2,added NaCl). 균배양시유도물질을첨가하지않은 control의투석액은 NaCl의첨가와무첨가에서별 차이가없는것으로보아 ginsenoside Rd생산효소는금속에의존하지않는다는것을말 해주고유도물질을첨가하여배양한 treatment의투석액은 NaCl의첨가와무첨가에서 C-K Rh2 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 F2 Rg3 Rd Rb1 A B Fig. 75. TLC analysis of reaction between ginsenosides and fraction (treatment) collected from Mono Q column. A, Rb1 as substrate ; B, Rd as substrate

149 큰차이가나타났다. 즉 NaCl의무첨가에서는 Rd만생성이되었지만 NaCl의첨가에서는 Rg3 가대량생성되었다. 이러한실험결과는 ginsenoside Rg3생산효소는금속의존성효소 라는것을말해준다. ( 다) Rg3 생산효소분리 1 Mono Q column에의한 Rg3 생산효소분리 활성이체크된투석액은 Mono Q column을통하여 gradient 조건(A buffer, 20mM Tris-HCl, ph 8.0; B buffer, 20mM Tris-HCl, ph 8.0, 1M NaCl) 으로 elution 하여총 30 개의 fraction을받고 13번 fraction부터 20번 fraction까지 ginsenoside Rb1, Rd와반응시켜 활성 fraction 을찾았다(Fig. 75, Fig. 76). C-K Rh2 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 F2 Rg3 Rd Rb1 A B Fig. 76. TLC analysis of reaction between ginsenosides and fraction (control) collected from Mono Q column. A, Rb1 as substrate; B, Rd as substrate. 실험결과 Rb1과의반응에서 treatment( 유도물질첨가) 의 16번 fraction이가장강한 Rg3 생산활성을나타냈고 Rd와의반응에서는 17번과 18번 fraction에서가장강한 Rg3생산 활성을나타내었으며 control( 유도물질무첨가) 에서는 16번 fraction에서만 Rb1과의반응

150 시약간의 Rd 가생성이되었다. 이것은 ginsenoside Rd 생산효소는주로 16번 fraction에 집중되었다는것을말해주고 Rg3생산효소는주로 17번과 18번 fraction에집중되었다는것 을말해준다. Rb1과의반응에서 treatment의 16번 fraction이 17번보다더욱강한 Rg3생산 활성을보여준것은역시 Rd의생산효소가 17번보다 16번 fraction에더욱많이집중되어 있기때문에 16번 fraction은 17번보다더욱많은 Rd를생산할수있었고따라서더욱많 은 Rg3 를생산할수있었다고해석할수있다. 2 Gel chromatography 에의한 Rg3 생산효소분리 Treatment( 유도물질첨가) 의활성이가장다양하게나타난 16번 fraction 및 control의 16번 fraction은 Centricon으로농축한후 gel chromatography를수행하여총 80개 fraction 을받았다(Fig. 77). 15 ABS (280nm) Fraction No. Fig. 77. Purification of β-glucosidase on superdex 번 fraction부터 60번 fraction까지 Rb1, Rd와반응시켜활성이보이는부분을 Fig. 78,

151 Fig. 79 에나타냈다. C-K Rh2 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rd F2 Rg3 Rd Gyp XVII Rb1 Rb1 A, Rb1 as substrate C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 F2 B, Rd as substrate Fig. 78. TLC analysis of reaction between ginsenosides and fraction (treatment) collected from superdex 200. A, Rb1 as substrate ; B, Rd as substrate. Fig. 78는 NaCl을첨가하지않고직접 Rb1, Rd와반응시킨후 TLC 로분석한결과이다. Fraction 23번부터 30번까지 ginsenoside Rd band, 30번부터 35번까지 gypenoside XVII band, 31번부터 38번까지약간의 F2의 band를관찰할수있었으나 superdex 200으로분리 하기전활성이가장강하게보였던 Rg3 band 는확인되지않았다. superdex 200은분자량 의크기에따라분리하는 gel chromatography로서염과같은저분자물질들은초기에대 부분분리되어금속의존성 Rg3생산효소의활성에영향을주었다고사료되어 NaCl을첨가 하여다시반응시켰다 (Fig. 79)

152 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 Rg3 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 Gyp XVII A, Rb1 as substrate C-K Rh2 C-K Rh2 F2 Rg3 Rg3 F2 Rg3 Rg3 F2 Rd Rd Rb1 Rb1 B, Rd as substrate Fig. 79. TLC analysis of reaction between ginsenosides, sodium chloride and fraction (treatment) collected from superdex 200. A, Rb1 as substrate ; B, Rd as substrate. NaCl을첨가한후각각의 fraction과 Rb1, Rd 반응결과는 NaCl을첨가하기전과큰차 이를나타냈다. NaCl 첨가전에는 Rd의 band가나타났지만 Rg3의 band가나타나지않았 고 NaCl첨가후에는 Rg3의 band가나타났지만 Rd의 band 가나타나지않았다. 따라서 ginsonoside Rg3 생산효소는금속이온보조인자(cofactor) 를필요로하는효소임을재확인 할수있었고 Rd band가나타나지않은원인은 ginsenoside Rd생산효소에의해생성된 Rd가 ginsenoside Rg3생산효소에의해다시전부 Rg3 로전환되었다는것을말해준다. Rg3생산활성을나타낸 fraction 및 control의 fraction은 10% PAGE 를수행하였다(Fig. 77)

153 kda M kda M A B Fig % PAGE of fraction collected from superdex 200. A, treatment; B, control. M, protein marker (272 kda, urease trimer; 132kDa, albumin dimer, 66.0 kda, albumin; 45 kda, ovalbumin. Treatment와 control에서단백질 band의 pattern은매우유사하게나타났으며유의할만 한 band 차이가나타나지않았다. Rg3생산효소활성이 29번부터 32번 fraction에서가장 강하게나타난것을감안하면 Rg3생산효소는분자량 marker 132와 45사이에존재한다는 것을알수있다. 3. 전기영동에의한 Rg3생산효소의분리 정확한 Rg3생산효소의위치를파악하기위하여 Rg3생산효소활성이가장강하게나타 난 17번 fraction에대해 10% PAGE(16 18 cm) 를수행하고 separating gel은아래위로활 성이없는부분 2 cm씩을제외하고 0.5 cm간격으로 gel을자른후 buffer로추출하여 Rb1 및 Rd 와반응시켰다(Fig. 81)

154 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 S S A, Rb1 as sustrate. C-K Rh2 C-K Rh2 F2 Rg3 F2 Rg3 Rd Rd Rb1 Rb1 S S B, Rd as substrate. Fig. 81. TLC analysis of reaction between ginsenosides, sodium chloride and slices of 10% PAGE of TLC분석결과 gel slice의 buffer 추출액은 Rb1을전혀전환시키지못하였지만 10번 gel slice(fig. 82) 는 Rd에서 Rg3 로전환시키는것을관찰할수있었다. 즉 Rg3생산효소는 Rd 를 Rg3로전환시킬수있는능력이있지만 Rb1을 Rg3로전환시킬수없다는것을말해주 며 10% PAGE gel에서분자량약 kda 에위치한다는것을확인할수있었다

155 KD M Fig % PAGE of fraction collected from Mono Q column. 13~20, fraction number of treatment; M, protein marker (272 kda, urease trimer; 132kDa, albumin dimer, 66.0 kda, albumin; 45 kda, ovalbumin.) 조효소액은 Mono Q column에의한 ion exchange chromatography 및 superdex 200에 의한 gel chromatography 를거치면서많이희석이된다. gel Slice 반응을통하여 Rg3생산 효소의대략위치를파악한후 Rg3생산효소의농도를확보하기위하여 Mono Q column 을통하여분취한 treatment와 control의 17번 fraction을직접 2-D(IPG strip, 18 cm, PI 3-11NL) 전기영동하였다(Fig. 83)

156 A Fig Dimensional gel electrophoresis of No. 17 fraction collected from Mono Q column. A, treatment; B, control. Protein marker: 200kDa, Albumin trimer; 97.4 kda, Phosphorylase b; 66.7 kda, Albumin; 45 kda, Ovalbumin; 30kDa, Carbonic anhydrase; 20.1 kda, Trypsin inhibitor; 14.4 kda, B -Lactalbumin 2-D전기영동은 1-D전기영동과달리 treatment와 control에서 spot상의차이가많이 나타났다. Treatment의 PAGE전기영동에서 Rg3생산효소는분자량약 kda에위치 한다는것을확인한후 2-D전기영동에서 monomer와 dimer인경우를감안하여단백질분 자량 60과 30을중심으로차이나는 spot를 10개선정하여대전기초지원연구소에의뢰하여 TOF-MS/MS로 amino sequencing 을수행하였다( 부록1). spot 6과 10은양이적어결과를 얻을수없었고기타단백질 spot 는내부서열분석만이루어졌다. 확인된 peptide를 에서 Search for short, nearly exact matches로상동 성분석을하였지만이미알려진단백질과의비교에서유사성이매우낮아단백질의동정 을할수없었다. Rg3생산효소를생산하는본미생물은데이터베이스가구축된것이없고 기타미생물과의연관성도적어효소의분리동정에큰어려움을주었다. 따라서보다많 은 Rg3생산효소의정제과정을거쳐 fraction의농축을통하여단백질의동정이이루어져야 할것으로사료된다

157 4) Ginsenoside Rg3생산효소에의한 ginsenoside Rb1의 Rg3로의전환율측정 Ginsenoside Rg3생산조효소액과 ginsenoside Rb1의반응산물에대한 TLC분석결과를 Fig. 84 에나타냈다. C-K Rh2 Rg3 Rd Rb1 S R(E) Fig. 84. TLC analysis of reaction between ginsenosides and crude enzyme producing ginsenoside Rg3. TLC분석을통하여 Rg3생산조효소에의하여대부분의 ginsenoside Rb1이 Rg3로전환 되고소량만이 Rh2 및 aglycone 으로추정되는물질로전환됨을관찰할수있었다. 반응 산물의부탄올추출물은농축후 silica gel 60 column (Φ cm) 에흡착하여 CHCl 3/MeOH/H 2 O (65:35:10, v/v, 하층) 혼합용매로 20 ml씩 elution하여각각의전환산물 을분리한결과, ginsenoside Rg3는 48.3 mg (85.24%), Rh2는 3.32 mg (7.38%) 이생성되 어높은 Rg3 생산효과를나타냈다. 이것은유기합성방법(12.8%, Anufriev et al., 1997) 이나 산처리에의한 Rg3 생산(42.4%, Bae et al., 2002) 보다훨씬높은수율을나타냈다

158 제 5 절 GS 514 균주조효소액에의한홍삼농축액, 조사포 닌의전환및사포닌전환균주의발효기운전 1. 재료및방법 가. 재료 홍삼농축액은정관장사의시판되는제품을, 잎사포닌과뿌리사포닌은중국 Fusong사의 것을구입하여사용하였다. 나. 방법 1) 유기용매에의한 Ginsenoside Rg3생산조효소조제 1L LB broth배지에 O.D 600 값이 1이되게배양한 GS 514 균주배양액을 10 ml 접종하여 25, 160 rpm 에서배양한다. 균배양액이 O.D 이될때유도물질로잎사포닌 을 LB배지양의 1.2% 를첨가하여같은조건에서하룻동안배양한다. 균주배양액은 g에서원심분리하여 cell를버리고상등액은냉각후 4배의 acetone을혼합하여단백질을 침전시킨다. 침전된단백질은 20 mm sodium phosphate buffer (ph 7.0) 에용해하여조효 소액으로하였다. 2) 홍삼농축액, 조사포닌의전환 홍삼농축액, 잎사포닌, 뿌리사포닌을각각 30 brix, 30 mg/ml, 30 mg/ml의농도로만든 후 Rg3생산효소가함유된 GS 514 균주조효소액과반응시키고 TLC와 HPLC분석을통하 여 Rg3 생산성을확인하였다

159 3) 20L 발효기운전 20L fermenter에 10L LB broth를넣고 Autoclave를이용하여 121 온도에서 30 min 멸균후 O.D 600 값이 1이되게배양한 GS514균주배양액을 1%(100 ml) 접종하여 25 에 서배양하였다. 균주배양액의 O.D 600 값이 일때유도물질로인삼잎사포닌 stock(10 mg/ml) 을 300 ml 첨가하여같은조건에서하룻동안배양하였다. 균주배양액은원심분리 를통하여 cell를제거하고상층액은 Rb1과 1:1로혼합하여 30 에서 12 h 반응시켜대량 배양시 Rb1에대한 Rg3 로의전환활성을확인하였다. 2. 결과및고찰 가. Rg3생산조효소대량생산 GS 514 균주가유도물질첨가하에서균배양시 Rb1을 Rd로전환시킬수있는효소를 생산하는것은이미확인하였다. 앞의연구에서균배양여액은황산암모늄으로염석하고 다시투석을거치는번거로운과정을거쳐조효소액을조제하였다. 조효소생산단가를낮 추기위하여유기용매침전법을시도하였다. 4 로냉각된균배양여액에각각유기용매인 에탄올과 acetone(-20 ) 을 1:4의비율로섞은후 4 에서 30 분간방치한다. 용액은원심분 리하여상층액은다시감압증류를통하여회수하고침전단백질은 20 mm sodium phosphate buffer 에용해하여조효소액으로하였다. Fig. 85은조효소액과 Rb1, Rd 의반응결과이다

160 Rb1 Rd Rg3 C-K Rh2 1 2 Fig. 85. TLC analysis of reaction between ginsenosides and crude enzyme. 1, precipitated by ethanol; 2, precipitated by acetone. 실험결과, 에탄올침전에서는약간의 Rd생산활성만나타내고 Rg3생산활성을상실하였 지만 acetone침전에서는 ginsenoside Rg3생산활성을그대로유지하는것을관찰할수 있었다. Acetone 침전법은황산암모늄염석법에비해시간이많이단축될뿐만아니라조 작이간편하고증류법으로 acetone을회수하여반복사용이가능하여단가도낮출수있 다. 따라서 acetone 침전법에의한조효소의생산은산업적으로가능하다고사료된다. 나. GS 514 균주조효소액에의한홍삼농축액, 조사포닌의전환 1) 홍삼농축액의전환 정관장에서시판하고있는홍삼농축액은이미증숙과건조과정및가열추출과정을거친 인삼제품으로서이미많은양의 diol계사포닌이분해되어 Rg3 가생성되었다(Fig. 84). 30 Brix 홍삼농축액 50 µl를각각 acetone 침전법으로조제한조효소액(50 배농축) 10(fig 번), 25(fig 번), 50(fig 번), 75(fig 번), 100(fig 번), 125 µl(fig 번) 과반응시킨결과를 Fig. 86 에나타냈다

161 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 S Cont Fig. 86. TLC analysis of reaction between red ginseng extract and crude enzyme. S, standard; cont., control. 홍삼농축액에는여러가지극성이유사한사포닌성분들이많이들어있어한가지전 개용매로는각각의사포닌을모두분리하기는어렵다. 하지만 TLC분석을통하여조효소와 반응을시키지않은 control와비교시조효소양의증가에따라 standard Rg3 아래쪽에 있는 band 들, 특히 Rb1, Rd, Rb2, Rc등의양이많이감소하는것을관찰할수있고 Rg3 및 compound K 위쪽에위치한미지의사포닌들이많이생성되는것을관찰할수있었다. Fig. 87는홍삼농축액의 control와조효소와의반응산물의 HPLC 분석결과이다. 반응산물 은 Control에비해 triol계사포닌인 Re, Rg1은다분해가되고 diol계사포닌인 Rb1, Rb2, Rc, Rd등이많이감소되는동시에 할수있었다. ginsenoside Rg3 peak가현저하게증가되는것을관찰

162 A B Fig. 87. HPLC analysis of reaction mixture of red ginseng extract and enzyme. crude 2) 뿌리사포닌의전환 30 mg/ml 농도로증류수에용해시킨뿌리사포닌 50 µl에각각 acetone침전법으로조제

163 한조효소액(50 배농축) 10(Fig. 88-1), 25(Fig. 88-2), 50(Fig. 88-3), 75(Fig. 88-4), 100(Fig. 88-5) µl를혼합하여반응시킨결과를 Fig. 88 에나타냈다. C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 S Cont Fig. 88. TLC analysis of reaction between root crude saponins and crude enzyme. S, standard; Cont., control. 뿌리사포닌과조효소와의반응은조효소의증가에따라 Rb1, Rd, 및 standard Rh2 아래 쪽에나타난 Rh1으로추정되는사포닌이현저하게감소되고 Rg3 band가현저하게증가하 는것을관찰할수있다. Fig. 89의 A, B는뿌리사포닌및조효소로전환시킨뿌리사포닌 의 HPLC 분석결과이다

164 A Fig. 89. HPLC analysis of reaction mixture of root saponins and B crude enzyme. Fig. 89 의 A에서보다시피뿌리사포닌은이미가열과정을거쳐추출하였기에일정한 양의 Rg3 가함유되어있는상태이다. A와 B의비교에서 triol계사포닌 Rg1 및 Re는대부 분분해되었고 diol계사포닌 Rb1과 Rd는현저하게감소되는동시에 Rg3가현저하게증가 하였다. 뿌리사포닌에함유되어있는사포닌을 100% 로보면 Rb1은 61.8%, Rd는 100% 전 부분해되었고 Rg3는원래의 4.2 배로증가하였다. Fig. 90는뿌리사포닌의반응전과반응후의비교분석그래프로서 Rg3와 Rh1외에기타 peak 의증가가보이지않았다. 따라서 triol계사포닌인 ginsenoside Re, Rg1은분해되어 Rh1으로전환되고 diol계사포닌인 Rb1, Rd등은분해되어대부분새로운사포닌 Rg3로전 환되었다는것을알수있다

165 Fig. 90. Comparison of root saponin with the root saponin converted by enzyme. Blue colour, root saponin; Red colour, root saponin converted by enzyme 3) 잎사포닌의전환 30 mg/ml 농도로증류수에용해시킨잎사포닌 50 µl에각각 acetone침전법으로조제한 조효소액(50 배농축) 10(Fig. 91-1), 25(Fig. 91-2), 50(Fig. 91-3), 75(Fig. 91-4), 100(Fig. 91-5) µl를혼합하여반응시킨결과를 Fig. 91 에나타냈다. C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 S Cont Fig. 91. TLC analysis of reaction between leaf crude saponins and crude enzyme. S, standard; Cont., control

166 잎사포닌은뿌리사포닌에비해 Rb1이적고 Rd, Rg1, Re 가많이들어있다. 잎사포닌과 조효소와의반응은조효소의증가에따라 standard Rg3 아래쪽에위치한사포닌의 band 색상이점차적으로옅어지는경향을관찰할수있지만잎사포닌에대량함유되어있는 Re(TLC에서 Rd 위치), Rg1(TLC에서 Rg3 위치) 의영향으로뿌리사포닌에비해변화되는 경향을적게나타냈다. Fig. 92의 A, B는잎사포닌및조효소로전환시킨잎사포닌의 HPLC 분석결과이다. Fig. 92. HPLC analysis of reaction mixture of leaf saponins and crude enzyme

167 Fig. 92 의 A에서보다시피잎사포닌에는뿌리사포닌에비해다량의 Rd, Rg1이함유되 어있다. A와 B의비교에서 triol계사포닌 Re는모두분해되어 Rg1으로전환되었고 diol 계사포닌 Rb1과 Rd, 특히는 Rd가전부분해된동시에 Rg3 가대폭증가하였다. 잎사포닌 에함유되어있는사포닌을 100% 로보면 Rb1은 40.0%, Rd 100%, Re 100%, Rg1은 19.6% 분해되었고 Rg3는원래의 7.4 배로증가하였다. Fig. 93은잎사포닌의반응전과반응후의비교분석그래프로서 diol계사포닌 Rb1, Rd 등이분해되어새로운사포닌 Rg3 로전환되었다는것을알수있다. Fig. 93. Comparison of leaf saponins with the leaf saponins converted by enzyme. Blue colour, leaf saponins; Red colour, leaf saponins converted by enzyme. 위의 HPLC분석을통하여 GS 514 균주에의해생산되는효소는인삼농축액, 뿌리사포닌 및잎사포닌과의반응에서 diol계사포닌중 Rb1, Rd 뿐만아니라 Rb2, Rc까지도모두특 이적으로 Rg3로만전환시키는아주좋은 Rg3 생산효과를나타냈다. Ginsenoside Rg3생산효소는 acetone침전법으로쉽게침전이될뿐만아니라효소활성을 그대로유지시킴으로서효소생산의산업화에용이하다. 또한가격이저렴한인삼잎사포닌 이나미삼을원료로 acetone침전법으로조제한 Rg3생산효소를이용한 20(S)-Rg3 고함 유인삼제품의생산및순수한 로사료된다. 20(S)-Rg3생산의산업화에큰경제적효과를나타낼것으

168 나. 20L-fermenter를이용한발효기운전 20L-fermenter 는하부에공기를공급할수있는스파자부분과상부에는공기가배출 될수있는밴트시스템으로구성되었으며공기이동시에는모두 membrane filter를사용하 여잡균의오염을제거할수있는매우간단한형태로만들어진발효기이다. 20L-fermenter 를사용하면대규모의균주배양및효소생산을쉽게할수있다. Fig. 94은 working volume 20L 대형발효기를사용하여균주를배양한모습이다. A Fig. 94. Mass culture of strain GS514 by 20L fermenter. GS514 균주는 20L fermenter에서배양시삼각플라스크에서의소량배양에비해균생 장속도가다소떨어졌다. 주요한원인은거품의대량생성으로인하여 aeration속도를늦추 어준원인으로사료된다. 20L fermenter에서발효시킨균배양액을원심분리하고배양여액 을 Rb1과반응시킨결과를 Fig. 95 에나타냈다

169 C-K Rh2 F2 Rg3 Rd Rb1 S R Fig. 95. TLC analysis of reaction between ginsenoside Rb1 with crude enzyme producing mass culture. Fermenter에서의대량배양은소량배양과마찬가지로역시 Rb1을 Rd, Rg3로의전환활성 을보여주었으며균주생장속도의저하로인하여전환활성이소량배양에비해역시약간 떨어지는것으로나타냈다. 따라서균주의대량배양시 aeration속도를높여균주의생장속 도를증가시키기위하여 antifoamer 실리콘(40 ppm) 의첨가하에서대량배양을시도하였 다. Table 30은 GS514균주를 100 ml와 10 L LB배지에서 16 h 배양및유도물질인삼잎사 포닌을 1.2% 첨가하여 15 h 배양후측정한 O.D 600 값수치이다. Table 30. O.D 600 detection of 0.1L and 10 L culture. Culture volume Culture for 16 h Culture for 15 h after adding inducer 100 ml L

170 A B Fig. 96. Mass culture of 33 strain by 20L fermenter. A: 0.1L culture; B: 10L culture Antifoamer의첨가한후 GS514균주의 10 L 대량배양과 0.1L 소량배양의 O.D 600 값을측 정한결과, 유도물질첨가전 후의대량배양은소량배양과유사한균의생장속도를나타냈 다. Fig. 96은 GS514균주를 0.1L LB배지와 10 L LB배지에서유도물질첨가후 15 h 배양한 사진으로소포제첨가전(Fig. 96) 보다많이균이잘성장한것을관찰할수있었다. 0.1L 소량배양과 1 L 대량배양의 Rg3생산활성을비교하기위하여 cell을제거후각각 의균배양액을 acetone침전하여동량의 20 mm sodium phosphate buffer, ph 7.0에용해 하고 1 mm ginsenoside Rb1수용액과 30 에서 12 h 반응시켰다. Fig. 97와 Fig 98은반 응전환산물에대한 TLC 및 HPLC 분석결과이다