1) 대한한방부인과학회지 THE JOURNAL OF ORIENTAL OBSTETRICS & GYNECOLOGY VOL.23 NO.3 : 091-100 (2010) 하고초열수추출물이대식세포면역만응에미치는영향 경원대학교한의과대학부인과학교실 차지혜, 김윤상, 임은미 ABSTRACT Effects of Prunellae Spica Water Extract on Immune Response in Macrophage Cells Ji-Hea Cha, Yoon-Sang Kim, Eun-Mee Lee Dept. of Gynecology, College of Oriental Medicine, Kyung-Won University Purpose: The purpose of this study was to investigate the effects of Prunellae Spica Water Extract(PSE) on immune response in macrophage cells. Methods: We had devided two group the one is normal group; not treated with PSE, and the other is experimental group; treated with PSE. We measured the cell viability of PSE on RAW 264.7 cells and investigated production of nitric oxide(no) and cytokines such as interleukin(il)-1 β, IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-α with sample PSE. Results: 1. Cell viability of PSE on RAW 264.7 cells was significantly decreased in both 24 hr and 48 hr incubation. 2. NO production of PSE on RAW 264.7 cells was significantly increased in both 24 hr and 48 hr incubation. 3. IL-1β production of PSE on RAW 264.7 cells was significantly increased under concentration over 50 μg/ ml in 24 hr incubation. 4. IL-6 production of PSE on RAW 264.7 cells was significantly increased under concentration over 50 μg/ ml in 24 hr incubation. 5. TNF-α production of PSE on RAW 264.7 cells was significantly increased under concentration over 50 μg/ ml in 24 hr incubation. Conclusion: NO, IL-1 β, IL-6 and TNF-α production of PSE on RAW 264.7 cells was significantly increased. This study suggest that PSE stimulates the macrophage and enhances the immune response. Key Words: Prunellae Spica, macrophage, immune response, NO, cytokine 이연구는 2010 년도경원대학교지원에의한결과임. 교신저자( 김윤상) : 인천시중구용동 117번지경원대학교부속길한방병원한방부인과 전화 : 032-770-1227 이메일 : komy@kyungwon.ac.kr 91
하고초열수추출물이대식세포면역만응에미치는영향 Ⅰ. 서 론 여성에게陰血은생리적 병리적인측 면에서모두중요하며, 陰血이부족하면 衝任이영양을받지못하고 內熱이발생 하여질병치료시우선적으로고려되므 로補血하는本草들은부인과적질환에 다용된다 1). 이와같은맥락에서본연구 의대상이되는하고초 ( 夏枯草 : Prunellae Spica) 역시淸熱解毒하는효능 2) 이외에 補養血脈하는효능 3) 을중심으로여성의 陰血을다스림으로서부인과질환의면 역력증강에효능이있을것으로사료되 어본연구를진행하게되었다. 하고초는꿀풀과 ( 脣形科 : Labiatae) 에속한다년초본초인꿀풀 (Prunella vulgaris var. lilacina Nakai) 의꽃이삭으 로 淸熱瀉火藥에속하여일반적으로 淸 火, 明目, 散結및消腫하는작용을가지 고있으나 2) 이외에補養血脈하는효능 도있다 3). 기존의연구를통해하고초는대식세 포의반응산소중간물질의생성능과대식 세포의탐식능을유의하게증가시켜세 포성및체액성면역과선천적면역능을 증가시키는것으로보고된바있어 4) 본 연구에서는마우스대식세포를이용하여 하고초가세포생존률및면역매개물질 생성에미치는영향을조사하였다. 하고초열수추출물 (Prunellae Spica Water Extract, PSE) 로마우스대식세 포에전처리한다음 cell viability 및 nitric oxide(no) 생성과 interleukin(il) -1 β, IL-6 및 tumor necrosis factor(tnf)- α 등의 cytokine 생성에미치는영향을관 찰하여유의한결과를얻었기에補養血 脈하는효능을중심으로한하고초에관 한본연구를통해부인과질환의면역 력증강효능을제시하는바이다. Ⅱ. 1. 재 1) 연구방법 료 약재및시료 실험에사용된하고초( 옴니허브, Korea) 는 2009 년 2 월에구입(NO : 2009-02-0011) 하였고, 사용전 ultrasonic cleaner를이 용하여불순물을제거하였다. 하고초 50 g을정확하게측정한뒤환류추출기에 1 차증류수 시점으로부터 한다음추출액을 2,000 ml와함께넣은후끓는 2시간동안가열하여추출 filter paper로감압여 과하고, rotary vacuum evaporator로농 축시켜농축액을얻었다. 이농축액을 동결건조기를이용하여건조시켜건조 추출물 8 g 을얻었으며, 수율은 16% 였다. 2) (1) 시약및기기 시 약 본실험을위해서 ethyl alcohol(samchun chemical, Korea), methyl alcohol(samchun chemical, Korea), fetal bovine serum (FBS), dimethyl sulfoxide(dmso, Sigma, USA), Dulbecco's modied essential medium (DMEM, Sigma, USA), 1 phosphate buffered saline(pbs, Sigma, USA), ethylenediaminetetraacetic acid(edta, Sigma, USA), acetic acid(sigma, USA), isopropanol(sigma, USA), trypsin-edta (Sigma, USA), MTT(Sigma, USA), NO assay kit(oxford biomedical research, USA) 및 Bio-Plex cytokine assay kit(panomics, USA) 등이사용되었다. 92
The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.23 No.3 August 2010 (2) 기 기 본실험에사용된기기는 filter paper (Advantec No.2, Japan), carbon dioxide (CO2) incuvator(nuaire, USA), flask (Falcon, USA), pulverizer(rong tsong, Taiwan), rotary vacuum evaporator(eyela, Japan), air compressor(tamiya, Japan), homogenizer(omni, USA), research microscope (Becton dickinson, USA), centriuge(hanil, Korea), fume hood(hanil, Korea), clean bench(jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner (Branson, USA), microplate reader(molecular devices, USA), microplate reader(bio-rad, USA), thermo aluminum bath(fine PCR, USA), vortex mixer(vision scientific co, Korea), water bath(intron biotech, Korea), ice-maker(vision scientific co, Korea) 및 Bioplex-200(Bio-rad, USA) 등이다. 2. 실험방법 1) 세포배양 실험에사용된대식세포는 mouse macrophage(raw 264.7 cell line) 로서, 한국세포주은행(KCLB, Korea) 에서 구입하였다. Raw 264.7 cells는 37, 5% CO 2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 U/ ml) 및 streptomycin(100 μg/ ml) 등이 첨가된 DMEM 배지에서배양되었다. Cells는 75 cm2 flask에서충분히증식된 후배양 3일간격으로배양세포표면을 PBS 용액으로씻어준뒤 50 ml flask 당 1 ml의 0.25% trypsin-edta 용액을넣 고실온에서 1분간처리한다음 trypsin 용액을버리고 37 에서 5분간보관하여 세포를탈착하여계대배양하였다. 탈착 된세포는 10% FBS가첨가된 DMEM 배양액 10 ml에부유시킨다음새로운 배양용기(50 ml culture flask) 에옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO 2 배양기 (37, 5% CO 2 ) 에서배양하였다. 2) MTT assay PSE 의세포독성유발효과를알아보 기위하여 하여 Mosmann 등 5) 의방법을응용 MTT assay 를실시하였다. 96 well plate에 1 10 4 cells/well 의 cells을 100 μl 씩넣고 37, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안배양한후배지를버린뒤배 양세포표면을 1 PBS 용액으로씻어주 었다. 같은양의배지와 0, 50, 100 및 200 μg/ ml등다양한농도의 PSE를각 well에처리하고 24 혹은 48시간동안배 양하였다. 배양이끝난후 PBS에녹인 1 mg/ ml MTT를 100 μl씩각 well에처리 하여알루미늄호일로차광시킨후 2시간 동안같은조건에서배양하였다. 배양액 을모두제거한후 DMSO를 100 μl처리 하고 37 에서 2시간방치후 microplate reader를이용하여 490 nm에서흡광도를 측정하였다. Cell viability는다음공식 으로계산되었다. Cell Viability(%) = 100 AT/AC AC - absorbance of control AT - absorbance of tested extract solution. 3) NO PSE의 NO 생성측정 생성효과를알아보기위 하여 Weissman 등 6,7) 의방법을응용하여 다음과같이실험을실시하였다. 세포배 양액중에존재하는 하기위해 NO의농도를추정 microplate reader 를이용, 540 nm에서흡광도를측정비교하였다. 이를 위해 0, 50, 100 및 200 μg/ ml등다양한 농도의 PSE를배지에담아각 well에처 93
하고초열수추출물이대식세포면역만응에미치는영향 리하고, 24 혹은 48시간동안 37, 5% CO 2 상등액 incubator에서배양한후세포배양 60 μl을채취하여여기에 Griess 시약 100 μl을혼합하여 15분동안반응 시킨다음 microplate reader를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 세포의 NO 생성은다음공식으로계산되었다. Productions of NO(%) = 100 AT/AC AC - absorbance of control AT - absorbance of tested extract solution. 4) Cytokine PSE의 cytokine 기위하여 생성측정 생성효과를알아보 Politch 등 8) 의방법을응용하 여다음과같이실험을실시하였다. 96 well plate에 1 105 cells/ ml의 cell을 100 μl씩넣고 37, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안배양한후배지를버리고배 양세포표면을 1 PBS 용액으로씻어준 뒤각 well에 0, 50, 100 및 200 μg/ ml등 다양한농도의 PSE와함께배지에담아 처리하고 24 시간동안배양하였다. 배양 이끝나면상등액을채취하여 Bio-Plex suspension assay system 을이용, quantitative multiplexed cytokine/chemokine assay 를 실시하여마우스대식세포의 IL-1 β, IL-6 TNF- α 등의 cytokine 생성을측정하였다. 5) 통계처리 및 본실험에서얻은결과에대해서는 mean±sd 로나타내었으며, 정상군과각 실험군과의평균의차이는 Student t-test 로분석하여 p-value 값이 0.05 미만일 때통계적으로유의한차이가있는것으 로판정하였다. Ⅲ. 결 과 1. 세포생존율의변화 PSE 가마우스대식세포의생존율에 미치는영향을살펴본결과 24시간배양 시정상군에비하여, 실험군 50, 100 및 200 μg/ ml등은각각 100.10±15.00, 81.51 ±17.44 및 82.02±15.73% 등의세포생존 율을보였고, 48시간배양시정상군에 비하여, 50, 100 및 200 μg/ ml등은각각 97.15±14.25, 93.24±6.78, 89.96±11.22% 등 의세포생존율을보였다 (Table 1, Fig. 1). Table 1. Effects of PSE on Cell Viability in RAW 264.7 Cells for 24, 48 hr Incubation PSE Concentration ( μg/ ml) Cell Viability (% of normal) Normal 24 hr 100.00±11.56 48 hr 100.00±7.22 50 24 hr 100.10±15.00 48 hr 97.15±14.25 100 24 hr 81.51±17.44 48 hr 93.24±6.78 200 24 hr 82.02±15.73 48 hr 89.96±11.22 represents p < 0.05 compared to the normal. Fig. 1. Effects of PSE on cell viability in RAW 264.7 cells for 24, 48 hr incubation represents p < 0.05 compared to the normal. 94
The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.23 No.3 August 2010 2. NO 생성의변화 PSE가마우스대식세포의 NO 미치는영향을살펴본결과 생성에 24시간배양 시정상군에비하여, 실험군 50, 100 및 200 μg/ ml등은각각 137.14±4.29, 182.16 ±19.75 및 252.30±21.87 등으로나타났고, 48 시간배양시정상군에비하여, 실험군 50, 100 및 200 μg/ ml등은각각 142.83 ±9.13, 211.85±19.90 및 292.62±16.02 등으 로나타나모든실험군에서정상군에비해 NO 생성이유의하게증가하였다 (Table 2, Fig. 2). Table 2. Effects of PSE on NO Production of RAW 264.7 Cells for 24, 48 hr Incubation PSE Concentration ( μg/ ml) NO Production (% of normal) Normal 24 hr 100.00±1.56 48 hr 100.00±4.73 50 24 hr 137.14±4.29 48 hr 142.83±9.13 100 24 hr 182.16±19.75 48 hr 211.85±19.90 200 24 hr 252.30±21.87 48 hr 292.62±16.02 represents p < 0.05 compared to the normal. represents p < 0.05 compared to the normal. 3. IL-1β 생성의변화 PSE가마우스대식세포의 IL-1β 성에미치는영향을살펴본결과 배양시정상군이 생 24시간 4.30±0.50 인데비하여, 실험군 50, 100 및 200 μg/ ml등은각각 5.8±0.50, 10.0±0.82 및 15.8±3.33 등으로 나타나모든실험군에서정상군에비해 IL-1 β 생성이유의하게증가하였다 (Table 3, Fig. 3). Table 3. Effects of PSE on IL-1β Production of RAW 264.7 Cells for 24 hr Incubation PSE Concentration IL-1β Production ( μg/ ml) (pg / ml) Normal 4.3±0.50 50 5.8±0.50 100 10.0±0.82 200 15.8±3.33 represents p < 0.05 compared to the normal. Fig. 2. Effects of PSE on NO production of RAW 264.7 cells for 24, 48 hr incubation Fig. 3 Effects of PSE on IL-1 β production of RAW 264.7 cells for 24 hr incubation represents p < 0.05 compared to the normal. 95
하고초열수추출물이대식세포면역만응에미치는영향 4. IL-6 생성의변화 PSE가마우스대식세포의 IL-6 에미치는영향을살펴본결과 배양시정상군이 생성 24시간 395.8±74.47인데비하 여, 실험군 50, 100 및 200 μg/ ml등은 496.5±19.12, 754.3±88.18 및 1442.8±202.11 등으로나타나모든실험군에서정상군 에비해 IL-6 생성이유의하게증가하였 다 (Table 4, Fig. 4). Table 4. Effect of PSE on IL-6 Production of RAW 264.7 Cells for 24 hr Incubation PSE Concentration ( μg/ ml) IL-6 Production (pg / ml) Normal 395.8±74.47 50 496.5±19.12 100 754.3±88.18 200 1442.8±202.11 represents p < 0.05 compared to the normal. PSE가마우스대식세포의 TNF-α 성에미치는영향을살펴본결과 배양시정상군이 생 24시간 14.3±3.4 인데비하여, 실험군 50, 100 및 200 μg/ ml등은 584.4 ±101.57, 1386.3±215.47 및 2601.3±250.19 등으로나타나모든실험군에서정상군 에비해 TNF-α 하였다 (Table 5, Fig. 5). 생성이유의하게증가 Table 5. Effects of PSE on TNF-α Production of RAW 264.7 Cells for 24 hr Incubation PSE Concentration ( μg/ ml) TNF- α(pg / ml) Normal 14.3±3.40 50 584.4±101.57 100 1386.3±215.47 200 2601.3±250.19 represents p < 0.05 compared to the normal. Fig. 4. Effects of PSE on IL-6 production of RAW 264.7 cells for 24 hr incubation represents p < 0.05 compared to the normal. 5. TNF-α 생성의변화 Fig. 5, Effects of PSE on TNF- α production of RAW 264.7 cells for 24 hr incubation represents p < 0.05 compared to the normal. Ⅳ. 고 찰 96
The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.23 No.3 August 2010 현대의질병관은질병현상을복잡다 양한육안수준에서보다단순한수준인 분자수준으로이해하려는시점에이르렀 고, 이와관련된대표적분야중하나가 면역반응에관여하는세포들에관한지 견으로오늘날에는면역의개념을내분 비학, 유전학, 종양생물학및수많은질 병의생물학에적용하고있으며 9), 한의 학에서도면역에관한다양한한약물의 실험적보고가이루어지고있다. 면역반응은체내의항상성을유지하기 위하여개체가비자기를항원으로인식 하고항체를생산하여생체자신을방어 하는것으로 10,11), 한의학에서는 眞氣從 止精神內守病安從來, 邪之所湊其氣 必虛 12) 및 風雨寒熱不得虛邪不能獨傷 人 13) 이라하였는데, 여기서正氣와病 邪 간의항쟁은면역반응과유사하며 14), 이는인체의氣血不足을補하여陰陽과 臟腑機能의실조를조정함으로써면역력 을증강시키는것으로해석해볼수있 다 15). 한약은세포성면역을촉진하거나세포 매개반응을조절하는것으로 16) 일반적으 로면역기능이저하된경우에는扶正法 을주로사용하고, 면역기능이과민한 경우에는 17) 祛邪法을주로사용하였으나 일부연구에서는하고초를비롯한오가 피, 의이인등祛邪하는약물들도면역 을강화시키는것으로보고되고있다 16). 특히여성의경우, 醫學入門 에서는 婦人以血爲主 라하고, 東醫寶鑑 에서 는 婦人者衆陰之所集, 七癥八瘕九 種心痛十二帶下共三十六病雖有名數 莫詳症狀推原其理無非血病 라하여 18,19) 여성에게陰血은생리적인측면과 병리적인측면에서모두매우중요하다 고볼수있다. 즉, 補養陰血하는것은 면역력증강의의미에서여성의건강을 지킴에있어기본이되는것으로, 본연 구의대상이되는 夏枯草 역시 補養血脈 하는본초로, 부인과적인질환에있어 다용할수있는본초이며특히, 治病이 아니未病의관점에서淸熱解毒하는夏 枯草의효능보다補血, 散結하는효능을 활용하여면역반응증진을위한夏枯草 의연구를진행하였다. 하고초는꿀풀과식물하고초의과수 로, 항고혈압효과, 다양한항균효과, 자 궁수축효과, 장관연동운동증강효과, 항암효과, 항지질효과및갑상선치료효 과등의약리적효과가있는것으로알 려져있으며 3,20-24), 부인과질환중에는난 관결핵, 혈붕, 생식기감염, 유방질환, 産 後血暈 및피부탄력개선등에효과적 인것으로알려져있다 3,25-27). 대식세포는백혈구로서인체내의불필 요한세포들을제거하고, 다양한 cytokine 등의면역매개물질을생성하여외부로부 터침입한항원을공격 제거하는등의 작용을함으로써선천성면역반응과염 증반응에있어서중요한역할을담당하 고있다 28-30). 본연구에서 PSE의세포독성여부를 확인하기위하여마우스대식세포의생 존율을조사한바전처리후 배양시 으며 24, 48시간 80-100% 의세포생존율을보였 PSE가대식세포에나타내는세포 독성에대해서는하고초를임상에서사 용시약물의용량과복용기간조절을 위한추가적인연구가필요한것으로사 료된다. PSE가마우스대식세포의 NO 생성에 미치는영향을알아보기위하여전처리 97
하고초열수추출물이대식세포면역만응에미치는영향 후 24, 48시간배양시 NO의생성은모 든실험군에서유의하게증가되었는데, 이는 PSE의투여가대식세포를활성화 시켰다는것을알수있다. Cytokine 이란면역담당세포를위시하 는여러가지세포에서생산되는생리활 성물질을총칭하는것으로 31), 특이적인 세포수용체에결합하여면역세포의활 성과성장을조절하고정상혹은병적인 염증반응과면역반응을매개한다 32). IL-1β는 monocyte와 macrophage계 세포에의해생산되는 cytokine 으로 helper T-cell 을활성화시키고, T-cell에서분비 되는 IL-2와같은 cytokine의활성을증 진시키는등 cytokine network에중요한 역할을한다 31,33). 본연구에서 PSE가마 우스대식세포의 IL-1β 생성에미치는 영향을알아보기위하여전처리후 24시 간배양시 IL-1β 생성은모든실험군의 농도에서유의하게증가하였다. IL-6 는면역반응, 조혈작용과염증을 조절하는데관여하는다양한기능을가 진 33,34) cytokine으로서 촉진시키며, B-cell 의분화를 면역글로불린의합성을증 진하고, 다른 cytokine과협동하여상승 작용을나타내는등다양한작용을한다 35). 본연구에서 PSE가마우스대식세포 의 IL-6 생성에미치는영향을알아보기 위하여전처리후 24시간배양시 IL-6 생성은모든실험군의농도에서유의하 게증가하였다. TNF-α 는암세포를선택적으로괴사 시키는 cytokine으로발견되었으나현재 는직접적인세포독성효과를나타내기 도하며, 세포의증식및분화를조절하 고, 만성염증이나감염에서도역할을하 는것으로알려져있다 31,33). 본연구에서 PSE가마우스대식세포의 TNF-α 생성 에미치는영향을알아보기위하여전처 리후 24시간배양시 TNF-α 생성은모 든실험군의농도에서유의하게증가하 였다. 이러한결과는 PSE가대식세포의 NO 와 IL-1 β, IL-6 및 TNF-α 등의면역매 개인자의증가를촉진함으로써, 면역반 응의변화를유도하고, 특히세포매개면 역반응에관계하여세포성면역에관계하 는것으로볼수있다. 따라서하고초는 補養陰血하는한의학적효능과관련하여 면역증강에유용한약물로이용될수 있으며, 특히陰血이중요시되는부인과 적질환과관련하여더욱유용하게활용 될수있을것이라는가능성을제시해주 었다. Ⅴ. 결 론 하고초를열수추출하여얻은시료 PSE 를마우스대식세포에전처리한다음배 양한후 cell viability 및 NO 생성과 IL-1 β, IL-6 및 TNF-α 등의 cytokine 생성을측정, 정상군과비교하여다음과 같은결론을얻었다. 1. PSE 전처리후세포를배양하여세포 생존율을살펴본결과 양시 다. 24, 48시간배 80-100% 의세포생존율을보였 2. PSE가마우스대식세포의 NO 생성 에미치는영향을알아보기위하여 전처리후 24, 48시간배양시 NO의 생성은모든실험군에서유의하게증 가하였다. 98
The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.23 No.3 August 2010 3. PSE가마우스대식세포의 IL-1β 생 성에미치는영향을알아보기위하여 전처리후 24시간배양시 IL-1β 생 성은모든실험군에서유의하게증가 하였다. 4. PSE가마우시대식세포의 IL-6 생성 에미치는영향을알아보기위하여 전처리후 24시간배양시 IL-6 생성 은모든실험군에서유의하게증가하 였다. 5. PSE가마우스대식세포의 TNF-α 생 성에미치는영향을알아보기위하여 전처리후 24시간배양시 TNF-α 생 성은모든실험군에서유의하게증가 하였다. 이러한결과는 PSE가대식세포의 NO 와 IL-1 β, IL-6 및 TNF-α 등의면역매 개인자의증가를촉진함으로써대식세포 면역반응의변화를유발하는것으로보 인다. 참고문헌 투고일 : 2010년 7월 29일 심사일 : 2010년 8월 3일 심사완료일 : 2010년 8월 10일 1. 韓方婦人科學會敎材編纂委員會. 韓醫 婦人科學 ( 上 ). 서울: 정담. 2002:62. 2. 韓醫科大學本草學編纂委員會編著. 本草學. 서울: 영림사. 2004:211-2. 3. 김창민외. 完譯中藥大辭典. 서울: 정 담. 1997:4604-8. 4. 송봉근. 수종한약재가면역반응에미 치는영향. 대한한의학회지. 1997;18(2) :43-57. 5. Ferrari M, Fornasiero MC, Isetta AM. MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity in vitro. J Immunol Methods. 1990;131(2):165-72. 6. Weissman BA, Gross SS. Measurement of NO and NO synthase. Curr Protoc Neurosci. 2001;Chapter 7:Unit 7.13. 7. Giustarini D, Rossi R, Milzani A, Dalle DI. Nitrite and nitrate measurement by Griess reagent in human plasma: evaluation of interferences and standardization. Methods Enzymol. 2008;440:361-80. 8. Politch JA, Tucker L, Bowman FP, Anderson DJ. Concentrations and significance of cytokines and other immunologic factors in semen of healthy fertile men. Hum Reprod. 2007;22(11) :2928-35. 9. 中島泉. 新免疫入門學. 서울: 지구문화 사. 1997:54-5. 10. 정태호, 김정철, 김문규. 최신면역학 강의. 대구: 경북대학교출판부. 1996:211. 11. 이연대. 최신면역학. 서울: 집문당. 1985 :33. 12. 楊維傑. 黃帝內經素問. 台聯 : 國風出 版社. 1991:3, 266. 13. 洪元植. 精矯黃帝內經靈樞. 서울: 동 양의학연구원. 1985:286. 14. 강대원, 강석봉. 固眞飮子가 methotrexate 로유발된흰쥐의 免疫機能低下에미 치는영향. 대한한방내과학회지. 2004 ;15(4):117-28. 15. 서형호외. 金水六君煎이마우스면 역반응에미치는영향. 대한한방내과 학회지. 2005;aut(1):89-99. 99
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