(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/73 (2006.01) A61K 36/185 (2006.01) C12N 5/077 (2010.01) A61P 19/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2010-0081478 (22) 출원일자 2010 년 08 월 23 일 심사청구일자 2010 년 08 월 23 일 (65) 공개번호 10-2012-0018556 (43) 공개일자 2012 년 03 월 05 일 (56) 선행기술조사문헌 JP2009256270 A* KR1020060123886 A* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2013년04월03일 (11) 등록번호 10-1249930 (24) 등록일자 2013년03월27일 (73) 특허권자 윤유석 서울특별시성동구매봉길 24, 101 동 1201 호 ( 금호동 4 가, 브라운스톤금호 ) (72) 발명자 윤유석 서울특별시성동구매봉길 24, 101 동 1201 호 ( 금호동 4 가, 브라운스톤금호 ) 김선여 서울특별시강남구대치 1 동삼성아파트 113-901 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 리앤목특허법인 전체청구항수 : 총 7 항심사관 : 윤소라 (54) 발명의명칭마가목및현지초추출물을포함하는파골세포분화억제용또는연골세포분화촉진용조성물 (SG-Ⅱ) (57) 요약 본발명은마가목추출물또는현지초추출물또는이들의혼합물을유효성분으로함유하는골및연골조직손상질환의예방, 개선또는치료용조성물에관한것이다. 본발명의조성물은파골세포의분화억제활성및 / 또는연골세포의분화촉진활성을나타냄으로써골조직또는연골조직의보호및재생효과를가지므로, 연골및뼈손상을동반하는질환의예방또는치료를위한용도로광범위하게응용될수있다. 대표도 - 도 2-1 -
(72) 발명자 오명숙 서울특별시송파구올림픽로 135, 260 동 2601 호 ( 잠실동, 리센츠 ) 소윤조 전라북도전주시완산구홍산로 390, 아이파크 10 1 동 301 호 ( 효자동 3 가 ) - 2 -
특허청구의범위청구항 1 마가목추출물을유효성분으로포함하는골절, 골다공증, 치주질환, 골종양, 파제트씨병, 골연화증, 다발성골수종, 백혈병, 구루병, 섬유성골염, 무형성골질환, 대사성골질환, 암세포의골전이에의한뼈의손상, 골용해, 뼈의기형, 고칼슘혈증, 및신경압박증후군으로이루어진군으로부터선택되는질환또는병태의예방또는치료용약학적조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 현지초추출물을더포함하는약학적조성물. 청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 제1항또는제2항에있어서, 상기추출물은물, 탄소수 1-4의무수또는함수저급알코올, 상기저급알코올과물과의혼합용매, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산, 디에틸에테르및이들의혼합물로이루어진군으로부터선택된추출용매를사용하여추출된것인약학적조성물. 청구항 6 삭제청구항 7 마가목추출물을유효성분으로포함하는, 골밀도개선용건강기능성식품조성물. 청구항 8 제7항에있어서, 현지초추출물을더포함하는건강기능성식품조성물. 청구항 9 제7항또는제8항의조성물및식품학적으로허용가능한식품보조첨가제를포함하는, 골질환의예방또는개선용건강기능성식품. 청구항 10 제9항에있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는음료의형태인것인건강기능성식품. 명세서 [0001] 기술분야본발명은마가목추출물 (SC), 현지초추출물 (GN) 또는이들의혼합물 (SG-Ⅱ) 을유효성분으로포함하는골및연골조직손상의억제및치료용약학적조성물에관한것이다. 본발명의약학적조성물은파골세포의분화를억제하고연골세포의분화를촉진하여골조직또는연골조직의보호및재생효과를가지므로, 연골및뼈파괴를동반하는질환의예방또는치료를위한용도로광범위하게응용될수있다. - 3 -
[0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 배경기술뼈는인체의연조직과체중을지탱해주고내부기관을둘러싸서내부장기를외부의충격으로부터보호한다. 또한근육이나장기를구조적으로지탱할뿐만아니라체내의칼슘이나다른필수무기질즉인이나마그네슘과같은물질을저장하는인체의중요한부분중하나이다. 따라서성장이끝난성인의뼈는오래된뼈는제거하고새로운뼈로대체하는생성과흡수과정을역동적, 지속적으로반복재생하면서균형을유지하게되는데, 이를골재형성 (bone remodeling) 이라고한다 (Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl):664-669(2005)). 이러한뼈의순환 (turnover) 은성장과스트레스에의해서일어나는뼈의미세한손상을회복시키고그기능을유지하는데필수적이다 (Cohen-Solal M. et al., Therapie., 58:391-393 (2003)). 성인에서는매년골격의약 10-30 % 가골흡수-골형성의리모델링을통하여재형성된다. 골재형성에는크게두종류의세포, 뼈를생성하는조골세포 (osteoblast) 및뼈를파괴하는파골세포 (osteoclast) 가관여하며서로밀접한연관성으로골의항상성이유지된다. 예를들어, 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κb ligand), 및그의유도수용체인 OPG(osteoprotegerin) 과같은물질의분비를통해골흡수를담당하는파골세포의분화를조절함으로써체내의골항상성을유지한다. 즉, RANKL이파골전구세포표면수용체인 RANK에결합하면파골전구세포가파골세포로성숙화되어골흡수가일어나며, OPG가 RANKL과결합하면 RANKL과 RANK간결합이차단되어파골세포의형성이억제된다 (Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20:795-823(2002); Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11:527-532(2001)). 전구세포로부터형성되는파골세포는오래된뼈를흡수또는파괴하며, 뼈에축적된소량의칼슘을혈류로방출시켜신체기능유지에사용한다 (William J. et al., Nature., 423:337342(2003)). 이러한대사는물리적영향, 호르몬체계및국소인자에의해조절되는데, 여러요인에의해골흡수가골형성을초과하여골량이한계이하로감소하게되면각종골질환이발생한다. 골다공증 (osteoporosis) 은뼈의질량이일정수준이하로감소하고뼈조직의미세구조의퇴화로골절위험이지속적으로증가하는질환으로뼈를구성하는미네랄 ( 특히칼슘 ) 과기질이감소한상태이며, 골재형성의균형이깨져서파골작용이조골작용보다증가된상태에서발생한다 (Iqbal MM., South Med J., 93(1):2-18(2000)). 골관절염은골과연골을침범하는관절염의가장일반적인형태로서, 염증반응에의해파골세포의분화를과도하게촉진하게된다. 이는 IL-1, TNFα, MMP와같은골흡수활성화인자의발현을증가시켜결국골손실과연골손상을유도한다. 암세포의골전이는유방암, 전립선암또는다발성골수종의경우빈번하게발생하는데 (Kozlow W. et al., J Mammary Gland Biol Neoplasia., 10(2):169-180(2005)), 특히골용해성골전이 (osteolytic metastasis) 는유방암세포등이파골세포를활성화시킴으로써일어나는것으로알려져있다 (Boyde A. et al., Scan Electron Microsc., 4:1537-1554(1986)). 활성화된파골세포는뼈주위의미세환경의균형을파괴시켜골용해및이로인한병적골절, 백혈구감소증, 뼈의기형, 고칼슘혈증, 통증, 신경압박증후군등뼈와관련된질환을발생시킨다 (Roodman GD., N Engl J Med., 350:1655-1664(2004)). 이러한골조직손상을동반한질환의치료와관련하여과거에는주로골무기질, 즉칼슘과인의대사이상만을중심으로연구가진행되어왔으며, 그기전규명에있어서진전을보지못하였다. 일반적으로, 골다공증의치료및예방을위하여칼슘이함유된식이요법이추천되며, 폐경기의여성들에게는에스트로겐또는비타민 D 투여가추천되고있다. 그외에, 포사맥스 (Fosamax) 와악토넬 (Actonel) 과같은비스포스포네이트 (bisphosphonate) 계열제제가파골세포를억제하고사멸을유도하는골흡수억제제로서새로운대체치료제로주목받고있다. 그러나, 골질환치료제로널리사용되는칼슘보강제는부갑상선호르몬의분비를억제하며골흡수에의한골량감소를방지하나, 골량유지의개인차이가심한것으로알려져있다 (Heandy.R.P. principles of bone biology, Academic press, 1007-1017, 1996). 또한, 에스트로겐이나칼시토닌을이용한호르몬요법의경우골밀도를증가시키고직장암의발생을감소시킨다는보고도있으나, 유방암, 심근경색, 정맥혈전증등의부작용이보고된바있다 (Nelson, H.D et al., JAMA, 288:872-881, 2002; Lemay, A., J.Obstet. Bynaecol. Can., 24:711-7152-3). 또한, 비스포스포네이트제제의경우, 최근복용하는환자에서턱뼈의괴사, 중증심방세동, 뼈나관절의무력화또는근골격의통증이발생하는사례가해마다증가되고있다 (Coleman RE., Br J Cancer, 98:1736-1740(2008). 따라서부작용발현이적으면서효과적으로골흡수를억제할수있는, 새로운골질환치료제의개발이당업계에요구되고있다. 연골세포 (chondrocyte) 는발생과정에서중간엽세포 (mesenchymal cell) 로부터분화되어연골조직을형성한다. 다른유형의조직과는달리연골은연골세포한종류만으로구성되어있으며, 형성된연골조직은관절연골과같이영구적인연골조직으로남아있거나발생과정에서경골형성을위한주형으로작용한다. 따라 - 4 -
서연골세포분화를촉진하는물질은일차적으로뼈 ( 경골 ) 조직형성속도를증가시켜골밀도증가에기여할수 있다. [0008] [0009] [0010] 관절연골은인체조직중체중의부하가가장큰조직으로마모로인한손상에쉽게노출된다. 관절내연골세포는세포외기질을합성분비하므로관절연골의유지에중요한역할을하며, 노화에따른연골세포수또는대사감소는골관절염의주된병인으로생각되고있다. 관절내연골세포는부착성세포로서혈관, 신경및림프조직이없으므로손상이되면생체내에서스스로재생이불가능한특징을갖고있다. 따라서현재의의학적방법으로는관절연골을정상적으로재생할수있는방법이매우제한적이다. 일반적으로, 정상적인연골조직일부를채취하여적절한배양배지에서이식에필요한수로연골세포를증폭하여연골결손부에이식하는방법으로환자의손상된관절연골을재생시키는방법이종종사용된다. 이를위해, 연골세포화된줄기세포의연골세포로의분화및증식을촉진하기위한물질개발의필요성이있다. 마가목 (Sorbus commixta, SN) 은장미과의낙엽활엽소교목으로, 주로우리나라와중국, 일본등지의해발 500-1200 m의심산산복에천연분포한다. 마가목의수피는마아피라고하여한방에서신장을보호하는약재, 기관지염, 중풍위염및골통에사용되었으며, 열매는신경통억제효과를갖는것으로알려져예로부터생식하였다. 마가목의생리활성으로는당뇨및비만억제효과, 항산화및광노화억제효과, 혈관염증억제효과및항동맥경화등이알려져있고, 구성성분으로는네오사쿠라닌 (neosakuranin), 루페올 (lupeol) 및루페논 (lupenone) 이알려져있으나, 골질환에있어서의생리활성에대한연구는미흡한실정이다. 현지초 (Geranium nepalense, GN) 는쥐손이풀과에속하는다년생초이다. 우리나라전역, 일본, 대만, 중국등에분포한다. 줄기와잎을말려서종기, 절상, 복통, 변비등에사용하였으며, 특히이질의특효약으로알려져있어이질풀이라고도한다. 그밖의활성으로항돌연변이, 항산화효과등이보고되어있으나, 골질환에있어서의생리활성에대해서는개시되거나교시된바없다. 발명의내용 [0011] 해결하려는과제본발명의목적은, 안전하고효과적인골또는연골조직손상질환및기타관련질환의예방또는치료방법및이를위한조성물을제공하는것이다. 이를위하여파골세포억제활성또는연골세포분화촉진활성을가져상기골질환의예방또는치료효과가우수한조성물을제공하고자하였다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] 과제의해결수단상기목적을위해, 본발명은마가목 (SC) 또는현지초추출물 (GN) 또는이들의혼합물 (SG-Ⅱ) 을포함하는, 파골세포분화억제활성또는연골세포분화촉진활성을갖는조성물을제공한다. 또한본발명은마가목또는현지초추출물또는이들의혼합물을포함하는, 파골세포의과다분화및활성화에기인한질환, 및골또는연골손상을동반하는기타질환의예방또는치료용약학적조성물을제공한다. 또한본발명은포유동물에상기조성물의유효량을투여하여상기질환을예방, 치료또는개선하는방법을제공한다. 본발명은또한상기조성물의유효량을포함하는, 상기질환의예방또는치료용의약의제조방법을제공한다. 또한본발명은파골세포분화억제또는연골세포분화촉진방법을제공한다. 이하본발명을상세히설명한다. 본발명의약학적조성물은마가목추출물, 현지초추출물또는이들의혼합물을유효성분으로함유한다. 상기추출물들은파골세포분화 (osteeogenesis) 를유의성있게억제함과동시에연골세포분화 (chondrogenesis) 를유의성있게증가시키므로, 각종골질환의예방및치료의용도로사용될수있다. 구체적으로, 마가목추출물, 현지초추출물또는이들의혼합물은상기추출물을투여하지않은세포에비해파골세포의표지효소인 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 활성을농도의존적으로감소시킨다 ( 도 2 및도 3). 따라서본발명의조성물은파골세포의형성을감소시키고, 파골세포에의한골흡수및골파괴를억제하는효능을나타낸다. 본명세서에서용어 " 골흡수 (bone resorption)" 는파골세포가뼈에강력한산및 - 5 -
단백질분해효소를분비하여뼈를분해하는대사과정을의미한다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] 이에따라, 마가목추출물, 현지초추출물또는이들의혼합물을포함하는약학적조성물은골질환의예방및치료에사용될수있다. 본명세서에서용어 " 골질환 " 은, 파골세포의과다분화및활성화로인해야기되는질환및골조직또는연골조직의손상을동반하거나동반할가능성이있는모든질환을포함하는광범위한의미로사용된다. 상기골질환은골절, 골다공증, 골관절염, 퇴행성연골및뼈파괴질환, 류마티스성질환, 치주질환, 골종양, 암세포의골전이에의한뼈손상, 파제트씨병, 대사성골염, 섬유성골염, 무형성골질환, 골연화증, 뼈의기형, 구루병, 백혈병, 고칼슘혈증, 신경압박증후군및다발성골수종등을포함하나, 이에한정되지않는다. 상기골다공증은원발성 ( 일차성 ) 골다공증과속발성 ( 이차성 ) 골다공증을포함한다. 원발성골다공증은칼슘과비타민 D를적절히섭취하지않거나폐경기이후여성또는노년기남성에게주로발생하는골다공증을의미하며속발성골다공증은특정질환이나약물에의해유발된경우이다. 후자의원인질환으로는갑상선기능항진증, 부갑상선기능항진증, 쿠싱증후군 ( 부신피질호르몬과다분비질환 ), 조기폐경, 인위적수술 ( 난소절제 ) 에의한폐경, 성기능저하증, 만성간질환 ( 간경화증 ), 류마티스관절염, 만성신부전증, 위절제수술등을들수있으며, 약물로는스테로이드 ( 부신피질호르몬제 ), 항경련제 ( 간질약 ), 헤파린등이있다. 상기암세포또는암조직의골전이에의한골질환에있어서, 상기암세포또는암조직은예를들면, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 직장암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 백혈병, non-hodgkin 임파선암, 부갑상선암및요관암세포또는조직을포함하나, 이에한정되는것은아니다. 또한마가목추출물, 현지초추출물및마가목과현지초의혼합추출물은연골전구세포의연골세포로의분화를농도의존적으로촉진시켜연골조직재생효과를나타낸다 ( 도 4). 이에따라, 상기추출물을포함하는약학적조성물은연골세포의생성을촉진함으로써연골조직의재생또는보호용의약으로사용될수있다. 구체적으로, 본발명의조성물은연골손상, 외상에의한관절손상및그외연골파괴를수반하는다른관절질환이나병태, 골관절염 ( 퇴행성관절염 ), 류마티스성관절염의예방또는치료용도로사용될수있다. 본명세서에서용어 " 마가목추출물 " 및 " 현지초추출물 " 은마가목또는현지초의다양한기관또는부분 ( 예를들면, 잎, 꽃, 열매, 껍질및줄기등 ) 으로부터추출하여얻은것을의미한다. 용어 " 추출물 " 은마가목또는추출물에추출용매를처리하여얻은추출결과물뿐만아니라마가목또는현지초자체를동물에게투여할수있도록제형화 ( 예컨대, 분말화 ) 된가공물도포함하는의미를갖는다. 또한상기 추출물 은상술한바와같이당업계에서조추출물 (crude extract) 로통용되는의미를갖지만, 광의적으로는추출물을추가적으로분획 (fractionation) 한분획물도포함한다. 즉, 마가목또는현지초추출물은상술한추출용매를이용하여얻은것뿐만아니라, 여기에정제과정을추가적으로적용하여얻은것도포함한다. 예를들면, 상기추출물을일정한분자량컷-오프값을갖는한외여과막을통과시켜얻은분획물, 다양한크로마토그래피 ( 크기, 전하, 소수성또는친화성에따른분리를위해제작된것 ) 에의해분리한분획물등, 다양한정제방법을통해얻어진분획물을포함한다. 본발명의조성물에서이용되는마가목또는현지초추출물을마가목또는현지초에추출용매를처리하여얻는경우에는, 극성용매및비극성용매를포함한다양한추출용매가이용될수있다. 극성용매로서적당한것은, 물, 알코올 ( 바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올또는에틸렌글리콜 ), 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide) 및 DMSO(dimethyl sulfoxide) 를포함한다. 적당한비극성용매로, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1- 클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸에테르, 디에틸설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소및 THF를포함한다. 보다바람직하게는, 본발명에서이용되는추출용매는물, 탄소수 1-4의무수또는함수저급알코올 ( 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올등 ), 상기저급알코올과물과의혼합용매, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산및디에틸에테르로부터선택된다. 가장바람직하게, 본발명의추출물은물, 부탄올, 에틸아세테이트또는이들의조합을마가목또는현지초에처리하여수득된것이다. - 6 -
[0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] 추출은 80 내지 120, 바람직하게는약 100 에서, 2 내지 6시간동안, 바람직하게는약 2시간동안수행될수있으나, 상기추출온도및추출시간은사용되는생약 ( 마가목또는현지초 ) 및추출용매의양에따라변경될수있다. 상기과정에더하여, 필요에따라농축및 / 또는건조하는단계를추가적으로포함할수있으며, 상기농축및 / 또는건조는통상의방법, 예를들면, 감압증류및동결건조또는분무건조에의해수행될수있다. 바람직하게, 본발명에서사용되는마가목및 / 또는현지초추출물은감압농축및동결건조에의해건조시킨분말의형태일수있다. 상기방법에의해얻어진약학적조성물은, 조성물총중량에대하여마가목추출물, 현지초추출물또는이들의혼합물을 0.1 내지 50 중량 % 로포함한다. 또한마가목추출물및현지초추출물의혼합물에있어서, 각추출물의배합비는중량기준으로 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:2 내지 2:1의범위인것이바람직하다. 보다바람직하게, 상기혼합물은마가목추출물과현지초추출물을 1:1의중량비로함유한다. 본발명에따른조성물에서, 상기추출물의약학적투여형태는이들의약학적으로허용가능한염의형태로도사용될수있고, 또한단독으로또는다른약학적활성화합물과의결합체나집합체의형태로도사용될수있다. 본발명에따른마가목및 / 또는현지초추출물을포함하는약학적조성물은본발명이속하는기술분야에공지되어있는통상적인약제학적제형으로제제화될수있다. 상기제형은경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및경비투여제제를포함하며이에한정되지않는임의의제형으로제제화되어투여될수도있으나, 바람직하게는액제, 현탁제, 시럽, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는엑스제와같은경구투여용제형으로제제화될수있다. 일구체예에서, 본발명의조성물은경구투여를위한고형제제로서, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등의형태일수있다. 이러한고형제제는상기마가목및 / 또는현지초추출물에적어도하나이상의약제학적으로허용가능한부형제, 예를들면, 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및방부제를포함할수있다. 구체적으로, 희석제로는유당, 옥수수전분, 젤라틴, 칼슘카보네이트, 대두유, 미정질셀룰로오스, 또는만니톨, 활택제로는마그네슘스테아레이트또는탈크, 결합제로는폴리비닐피롤리돈또는히드록시프로필셀룰로오스가사용될수있다. 또한, 붕해제로는카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는크로스포비돈, 감미제로는백당, 과당, 솔비톨, 또는아스파탐, 안정제로는카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는잔탄검, 방부제로는파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는솔빈산칼륨이사용될수있다. 다른구체예에서, 본발명의조성물은경구를위한액상제제로서, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등의형태일수있다. 흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 또한, 상기성분이외에도공지의첨가제로서미각을돋구기위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향등의천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드등의천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과같은감미성분, 또는구연산, 구연산나트륨과같은산미제를혼합하여사용할수도있다. 또다른구체예에서, 본발명의약제학적조성물은비경구투여를위한제제일수있으며멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제등이포함된다. 주사제의경우는이에한정되는것은아니나, 한크액 (Hank's solution), 링거액 (Ringer's solution), 생리식염완충액과같은생리학적으로적합한완충액을사용하여제조할수있다. 또한비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있으며, 그외에안정제, 분산제등을추가적으로포함할수있다. 또한본발명의조성물은분말형태로제조되어, 사용전에멸균수와같은적당한담체와함께사용될수있다. 좌제로제제화되는경우, 기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴등이사용될수있으나이에한정되지않는다. 본발명의마가목및 / 또는현지초추출물은쥐, 생쥐, 가축, 인간등의포유동물에다양한경로로투여될수있다. 투여의모든방식은예상될수있는데, 예를들면, 경구, 관절내, 정맥, 근육, 피하, 경피, 직장내, 비강내, 복강내투여등이가능하다. 상기조성물은또한당해기술분야에공지되어있는다른방법 ( 예를들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에기재된방법들 ) 을사용할수도있다. - 7 -
[0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] 본발명에따른조성물의적합한투여량및투여시기는제제화방법, 투여대상의연령, 성별, 체중, 질병증상의정도, 배설속도및반응감응성, 투여경로및기간에따라다르지만, 당업자가목적하는치료에효과적인투여량을적절하게선택할수있다. 예를들어, 성인을기준으로 1일 0.1 mg/kg 내지 10 g/kg, 바람직하게는 100mg/kg 내지 1 g/kg이되도록임의로수회나누어서투여할수있다. 본발명의조성물은단독의요법으로이용될수있으나, 수술, 호르몬치료, 약물치료, 생물학적반응조절제를사용하는방법, 식이요법등과병행하여사용할수있다. 본발명의또다른양태에서는, 마가목및 / 또는현지초추출물을포함하는조성물을개체에투여함으로써골밀도를개선하는방법을제공한다. 상기개체는인간을포함한각종포유동물일수있다. 마가목또는현지초추출물의파골세포분화억제활성으로골흡수를감소시킬수있으며, 골밀도의개선이란손실된뼈를재생시키는것을포함하여뼈손실가능성이있는개체 ( 예를들면, 폐경된여성, 노인, 호르몬치료를받고있는환자등 ) 에서골밀도감소를예방하는것을포함할수있다. 본발명의또다른양태에서는, 마가목및 / 또는현지초추출물을포함하는골또는연골조직손상질환의예방또는치료용의약의제조방법을제공한다. 상기방법은마가목또는현지초를적당한추출용매, 바람직하게는물을이용하여추출하는단계 ; 여과하여감압농축하는단계 ; 및선택적으로, 그로부터수득되는추출물의유효량을약학적으로허용가능한담체, 부형제, 및희석제중하나이상과혼합하는단계를포함한다. 마가목과현지초추출물의혼합물의경우, 상기방법으로농축된추출물을바람직하게는 1:1의중량비로혼합하는단계를추가적으로포함한다. 본발명의다른양태에서, 본발명은포유동물의연골세포와마가목추출물, 현지초추출물또는마가목과현지초추출물의혼합물의유효량을접촉시키는단계를포함하는, 연골세포의분화를촉진하는방법을제공한다. 일구체예에서, 상기접촉단계는손상된관절연골조직에서채취, 분리된연골세포의배양배지에상기조성물을첨가하는방법에의해수행될수있다. 본발명의방법에의해체외에서생산된분화된연골세포는세포나조직의이식을통한생물학적인방법으로연골손상질환을치료하는데유용하게사용될수있다. 보다상세하게는, 본발명의방법에의해생산된연골세포는세포대체요법용세포조성물의유효성분으로써공지의방법에따라환자의관절내로직접주입되거나, 3차원배양후스캐폴드 (scaffold) 와함께이식될수도있다 (Kim, G. et al, J. Vet. Med. Sci., 66:263, 2004, Lee,J.W. et al., Yonsei Med. J., 30:41, 2004). 다른구체예에서, 상기접촉단계는포유동물의연골조직내에마가목추출물또는혼합추출물을포함하는조성물을직접주입하는방법에의해이루어질수있다. 예를들면, 복부지방등에서적출, 배양한치유줄기세포또는치유재생세포를성장인자와함께환부에주사하여체내에서연골세포조직의재생을유도하는 ' 재생세포치료법 ' 에있어서, 본발명의조성물을함께주입하여상기세포의연골세포로의분화를촉진할수있다. 본발명의방법으로생산된연골세포를이용하여치료할수있는연골손상질환으로는퇴행성관절염, 류마티스성관절염, 외상에의한관절손상등이있으나, 이에한정되는것은아니다. 상기분화된연골세포는골세포등다른세포로분화할우려가적고, 자가유래의세포를사용하므로면역학적거부반응이없어보다안전하게치료에이용할수있다는장점이있다. 본발명의추가적인양태에서, 본발명은마가목추출물, 현지초추출물또는이들의혼합물및식품학적으로허용가능한식품보조첨가제를포함하는, 골질환의예방또는개선을위한건강기능성식품조성물을제공한다. 본명세서에서사용되는 " 건강기능성식품 " 은인체에유용한기능성을가진원료나성분을사용하여제조및가공한식품을의미하며, " 기능성 " 은인체의구조및기능에대해영양소를조절하거나생리학적작용등과같은보건용도에유용한효과를얻을목적으로섭취하는것을의미한다. 본발명의마가목또는현지초추출물을포함하는조성물은골조직또는연골조직손상을동반하는질환의예방및개선을위해건강기능성또는및음료로제제화되거나, 각종식품에첨가되어사용될수있다. 이러한건강기능성식품조성물은상기약학적조성물과동일한방식으로당해기술분야에공지되어있는통상적인건강기능성식품의제형으로제제화될수있다. 상기건강기능성조성물은예를들어산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는음료등으로제조될수있다. 상기식품학적으로허용가능한보조첨가제로는제조하고자하는제형의제조에당해기술분야에서사용가능한것으로 - 8 -
공지되어있는임의의담체또는첨가제가이용될수있다. [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] 본발명의조성물이다른식품에첨가되어사용되는경우, 첨가가능한식품류로는예를들어, 음료, 육류, 캔디, 초콜릿, 과자류, 껌, 차, 비타민복합제, 알코올음료류, 건강보조식품류등이있다. 이때, 식품또는음료중의상기조성물의양은, 일반적으로본발명의건강기능식품조성물의경우전체식품중량의 0.01 내지 15 중량 %, 바람직하게는 1 내지 5 중량 % 로가할수있으며, 건강기능음료조성물의경우 100 ml를기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의비율로가할수있다. 본발명의건강기능음료조성물의경우, 지시된비율로필수성분으로서상기추출물을함유하는외에는액체성분에는특별한제한은없으며, 통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등 ; 디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등 ; 폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 1 내지 20 g, 바람직하게는약 5 내지 12 g이다. 이외에유용하게는향미제로서천연향미제 ( 타우마틴, 스테비아추출물 : 예를들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진등 ) 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를사용할수있다. 또한, 본발명의조성물은여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제, 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의조성물들은천연과일쥬스및과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분들은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은제한적이지는않으나본발명의조성물총중량에대하여 0 내지 20 중량 % 의범위에서선택되는것이일반적이다. 본발명에서사용되는모든기술용어는달리정의되지않는이상, 본발명의관련분야에서통상의당업자가일반적으로이해하는바와같은의미로사용된다. 또한본명세서에는바람직한방법이나시료가기재되나, 이와유사하거나균등한것들도본발명의범주에포함된다. 본명세서에참고문헌으로기재되는모든간행물의내용은본발명에도입된다. [0057] [0058] 발명의효과본발명에따른조성물은마가목또는현지초추출물, 또는이들의혼합물을일정함량이상포함함으로써, 파골세포억제또는연골세포분화촉진활성에있어서당업자가예측할수없는정도로현저한효과를가지며, 천연물질로이루어져인체에부작용이거의없어바람직하다. 따라서, 본발명에따른조성물은파골세포의과다분화또는활성화에의해야기되는질환, 또는골또는연골조직손상질환의예방, 개선및치료목적으로사용가능한의약품또는건강기능식품의제조를위하여이용될수있다. 또한, 본발명의조성물은인비트로 (in vitro) 또는인비보 (in vivo) 에서연골세포의분화를촉진하는용도로사용되어, 연골조직결손부위의재생및인공관절의제조목적으로이용될수있다. [0059] 도면의간단한설명도 1은 MG-63 세포주에서본발명에따른마가목추출물, 현지초추출물및이들의 1:1 혼합물이 ALP 활성에미치는영향을비교하여나타낸그래프이다 (SC; 마가목추출물처리군, GN; 현지초추출물처리군, SG-Ⅱ; 마가목추출물및현지초추출물의 1:1 혼합물, EST; 베타-에스트라디올처리군 ). (*: p <0.05) 도 2는본발명에따른마가목추출물, 현지초추출물및이들의 1:1 혼합물을농도별로 Raw264.7 세포주에처리했을때, TRAP의활성도에미치는영향을비교한그래프이다 (NC; 음성대조군, PC; 양성대조군 (RANKL 50 ng/ml 처리 ), SC; 마가목추출물처리군, GN; 현지초추출물처리군, SG-Ⅱ; 마가목추출물및현지초추출물의 1:1 혼합물 ). 도 3은마가목추출물및마가목과현지초추출물의 1:1 혼합물 (10, 250 μg /ml) 과함께배양했을때, Raw264.7 세포의파골세포로의분화정도를나타낸현미경사진이다. 도 4는본발명에따른마가목추출물, 현지초추출물및이들의 1:1 혼합물을농도별로분화를유도한 ATDC5 연골전구세포에처리했을때, 연골세포로의분화정도를비교한그래프이다. (*: p <0.05) - 9 -
도 5 는마가목추출물, 현지초추출물및이들의 1:1 혼합물을 ATDC5 연골전구세포에농도별로처리한후, Alciain blue 로염색시켜연골세포로의분화정도를나타낸사진이다. [0060] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명을하기제조예및실시예에의해더욱구체적으로설명한다. 그러나이들실시예는본발명에대 한이해를돕기위한것일뿐, 어떤의미로든본발명의범위가이들에의해제한되는것은아니다. [0061] [0062] [0063] 재료및준비마가목 (Sorbus commixta, SC) 은옴니허브 ( 영천, 대한민국 ) 에서, 현지초 (Geranium nepalense, GN) 는대람약업사 ( 서울, 대한민국 ) 에서각각구입하였다. DMEM,-MEM 및 F-12 배지, 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), 페니실린-스트렙토마이신 (PS) 은 Gibco (NY, USA) 에서구입하였으며, LabAssay TM ALP 키트는 Wako ( 오사카, 일본 ) 에서, receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) 은 PeproTech (NJ, USA) 에서각각구입하였다. 그밖에 β-에스트라디올, 트랜스페린, 소듐셀레나이트, 소인슐린, 아질산나트륨및알시안블루 8GS와같은물질은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (MO, US A) 에서구입하여사용하였다. [0064] [0065] 마가목및현지초추출물의제조추출물을얻기위하여각시료 ( 마가목의경우열매, 현지초의경우잎 ) 를세척후, 각시료중량의 10배의증류수를가하고 100 에서 2시간동안환류추출후, 여과과정을 3회반복하였다. 이후여과하여얻어진추출액을감압농축하여동결건조하였다. 각시료의수율은마가목추출물은 8.10 %, 현지초추출물은 13.15 % 였으며, 마가목및현지초추출물시료를각각 1:1의비율로섞어서혼합시료 (MIX) 를제조하였다. [0066] [0067] 통계처리위의실험들은각각 3회에걸쳐서반복하여실험결과를얻었으며, 모든자료는대조군에대한백분율로계산하고평균 ± 표준편차로표시하였다. 스튜던트 t-검정 (Student s t test) 을이용하여실험군들을비교분석하였으며, 통계방법의유의수준은 p-값 < 0.05로정하였다. [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] 실시예 1. 염기성포스파타아제 (Alkaline phosphatase, ALP) 활성및세포생존율측정 ALP는조골세포에서생성되는당단백질로써, 골형성지표로서이용되는세포화학적표지효소이다. 골과연골의형성과재생을유도하는조절인자인뼈형성단백질 (bone morphogenetic protein, BMP) 에의해활성화되어조골세포의분화를촉진하고콜라겐합성을자극하는것으로알려져있다 (Wozney, J. M., et al., "Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities", Science, pp. 1528-1534, 1988). 마가목, 현지초및이들의 1:1 혼합시료가조골세포의 ALP 활성에미치는영향을알아보기위해 MG-63 세포주에각각의시료를 48시간동안처리한후, ALP가무색의 p-니트로페닐포스페이트를인산과노란색의 p-니트로페놀로분해시키는원리를이용하여세포내의 ALP 활성을측정하였다. 방법 1) ALP 활성측정인간조골세포-유사 MG-63 세포주 ( 서울, 한국세포주은행 ) 는 10 % FBS, 100 U/ml 페니실린및 100 μg/ml 스트렙토마이신이포함된 DMEM 배지를사용하여 37 의 5 % CO 2 인큐베이터에서배양하였다. 세포가배양용기에 85 ±5 % 정도자랐을때, 트립신을처리하여세포를이탈시키고, 6- 웰 (well) 배양용기에각웰당 1.5 10 5 개의 세포가포함되도록분주하였다. 24 시간후, 각각의시료 (10, 100 및 250 μg/ml) 를함께처리한후 48 시간동안 배양하였다. 이때, ALP 활성을증가시키는것으로알려져있는 β- 에스트라디올 (10 μm) 을양성대조군으로사 - 10 -
용하였다. [0074] [0075] [0076] 세포를 PBS로세척하고트립신을처리하여떼어낸후, 0.2 % 트리톤 X-100을각각 50 μl 씩넣고 4 에서 3분간초음파추출기를이용하여세포를용해시켰다. 세포용해액은 4 에서 14000 rpm으로 20분동안원심분리시키고, 상층액을취하여단백질을정량하고 ALP 활성을측정하였다. ALP 활성측정실험은 LabAssay TM ALP 키트를이용하여수행하였으며, 405 nm에서의흡광도변화를측정하였다. 또한세포내단백질을정량하고 ALP/ 단백량으로수치화하여시료의비활성 (relative activity) 을결정하였다. 결과각각의시료들은농도와무관하게 ALP 활성에영향을미치지않았다 ( 도 1). 그러나양성대조군인 β-에스트라디올은 10 μm을처리하였을때 ALP 활성을 138.3±5.8 % 증가시켰다. [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] 실시예 2. 타르트레이트-저항성산성포스파타아제 (Tartrate Resistant Acid Phosphatas, TRAP) 양성염색 TRAP은파골세포에의해분비되는효소로서파골세포의분화정도를측정할때이용되는세포화학적표지효소이다. 골흡수작용을할때분비가증가되어골기질의분해에관여하며 ( 신충호, "Clinical Utility of Biological Markers of Bone Turnover in Children and Adolescents", 대한소아내분비학회지, 제6권, 제1호, pp. 4-16, 2001.), ATP, 니트로페닐포스페이트가존재할때높은활성을갖는다. 한편, RANKL은파골세포의골파괴활성을증대시키고세포생존력을높이는효과가있어서 M-CSF와함께파골세포분화에필수적인사이토카인으로알려져있다. 본실험에서는마가목, 현지초추출물및이들의 1:1 혼합시료가마우스대식세포주유래인 RAW 264.7 세포주의파골세포분화에미치는영향을알아보기위하여 6일동안 RANKL을처리하여세포를분화시키면서각시료를함께처리하여 TRAP 염색에의해관찰하였다. 방법마우스단핵구 / 대식세포인 Raw 264.7 세포주 ( 서울, 한국세포주은행 ) 는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린및 100 μ g/ml 스트렙토마이신이포함된 α-mem 배지를사용하여 37 의 5 % CO 2 인큐베이터에서배양하였다. 세포가 배양용기에 85±5 % 정도자랐을때, 트립신처리하여세포를이탈시키고, 96- 웰배양용기에각웰당 1 10 3 개 의세포가포함되도록분주하였다. 24 시간후, Raw 264.7 세포의파골세포로의분화를촉진하기위해 50 ng/ml RANKL 을처리하였으며, 각각의시료를 6 일간함께배양하였다. [0082] [0083] [0084] [0085] 시료처리 6일후, TRAP 염색을하기위해세포의배지를제거한후, 고정용액 (fixing solution) ( 시트르산용액, 아세톤, 37 % 포름알데히드 ) 으로 10분간세포를고정시켰다. 0.1% Triton X-100을넣고 1분후에제거하고기질용액 (50 μl Fast Garnet GBC Base solution, 50 μl 아질산나트륨용액, 4.5 ml 증류수, 50 μl 나프톨 AS-BI 인산용액, 200 μl 아세테이트용액, 100 μl 타르트레이트용액 ) 을이용하여고정시킨세포에분주하고 37 에서 40분동안반응시켜상기세포를염색시켰다. 현미경으로분화된파골세포를관찰하고, 염색된다핵성세포 (3개이상의핵을갖는세포 ) 수를 counting하여 TRAP 활성을측정하였다. 결과파골세포가분화될수록세포형태가변하고핵의수가증가한다. 따라서모양이변하고핵이많아진파골세포수가감소할수록약물의효과가더크다는것을나타낸다. 본실험의경우 3개이상의핵이생긴세포수를세어서각샘플의파골세포분화정도및약물의효과를예측하였다. 관찰결과, 세시료모두농도의존적으로 TRAP 활성이감소하는경향을보였다. 마가목은 250 μg/ml의농도에서대조군과비교하여 TRAP 활성을 43.0±19.9 % 억제하였으며, 특히, 마가목과현지초의 1:1 혼합시료는 100 및 250 μg/ml의농도에서 23.0±2.9 % 및 95.0±3.8 % 를감소시키는것으로보아그효과가매우뛰어난것을확인할수있었다. 현지초추출물은 10 μg/ml의저농도에서 TRAP 활성에대하여높은감소율을보였고, 100 μ g/ml의농도에서는거의 TRAP 활성을완전히감소시켰다 ( 도 2). [0086] 실시예 3. 알시안블루 (Alcian-blue) 염색법 - 11 -
[0087] [0088] [0089] 마가목, 현지초의각각추출물및이들의 1:1로혼합한시료가연골세포분화촉진에미치는영향을알아보기위하여다음과같은연구를수행하였다. 알시안블루염색시, 연골세포로분화가이루어진경우교원질이염색되면서푸른색을띠게되는원리를이용하였다. 방법연골세포의전구체인 ATDC5 세포 (Riken Cell Bank, Japan 에서구입 ) 구입처기재요망 ) 를 DMEM과 F-12 가 1:1로섞여있는배지에 5 % FBS, 100 U/ml 페니실린및 100 μg/ml 스트렙토마이신이혼합된배지를사용해서 37 의 5 % CO 2 인큐베이터에서배양하였다. 세포가배양용기에 75±5 % 정도채워지면트립신을처리하여세포를이 탈시키고, 24-웰배양용기에각웰당 2 10 4 개의세포가포함되도록분주하였다. 24시간후, 10 μg/ml 트랜스페린및 3 10-8 M 소듐셀레나이트가포함된배지에서 14일동안세포분화를유도하였으며, 그기간동안각각의시료를 10, 100 및 250 μg/ml의농도로함께처리하였다. 양성대조군으로는 10 μg/ml 소인슐린을사용하였다. [0090] [0091] [0092] [0093] 14일후, 알시안-블루염색법을실시하기위해세포의배지를제거하고 1 인산완충염수 (PBS) 로세척한후, 95 % 메탄올로세포를고정시키고 1 % 알시안-블루 8GS로 16시간염색하였다. 염색용액제거후 3 % 아세트산으로 30초동안세번세척하고염색정도를확인하기위하여현미경으로관찰하고사진을찍었다. 10 % 아세트산으로염색을녹여낸후 650 nm에서흡광도를측정하였다. 결과실험결과, 마가목추출물및혼합시료는농도의존적으로연골세포분화를촉진하였다 ( 도 4). 마가목은 250 μg/ml의농도에서대조군과비교하여연골세포분화를 83.7±2.5 % 증가시켰으며, 이는소인슐린을처리한양성대조군보다도높은증가율 (31.2±2.0 %) 을가지는것이다. 현지초추출물은 100ug/ml 농도에서대조군과비교하여연골세포분화를 14.1±1.4 %( 음성대조군과비교 ) 유도하였다. 또한마가목및현지초의 1:1 혼합시료는 100 ug/ml 농도에서대조군과비교하여연골세포분화를 31.9±1.6 % 유도하여, 마가목추출물단독또는현지초추출물단독으로사용하였을때보다높은값을보였고, 250 μg/ml의농도에서대조군과비교하여연골세포분화를 70.92±1.23 % 유도하였다. 이하본발명의조성물을포함하는의약및건강기능성식품의일부제제예가제시되나이에제한되는것은아니다. 본발명의약학적조성물은과립, 현탁물, 용액, 캡슐, 정제등의형태로, 가능한가장우수한제제를얻기위하여당해기술분야에알려진모든방식으로제조될수있다. [0094] 제제예 1. 경구제제 - 정제의제조 표 1 [0095] 구성성분 함량 ( mg / 정제 ) 본발명의추출물 200 유당 150 히드록시프로필셀룰로오스 15 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 20 스테아린산마그네슘 5 글리세린 2 히드록시프로필메틸셀룰로오스 6 산화티탄 2 [0096] 본발명의추출물, 셀룰로오스유도체및유당을혼합한다. 얻어진선혼합물 (premix) 에스테아린산마그네슘과 글리세린을첨가하고, 혼합한다. 상기최종혼합물을통상의정제제조방법에따라서타정하고, 최종적으로산 화티탄으로피복한다. 1 일 3 회, 1 회 1 정씩복용한다. [0097] 제제예 2. 경구제제 - 과립제의제조 - 12 -
표 2 [0098] 구성성분 함량 ( mg / 사쉐 ) 본발명의추출물 400 부형제 적정량 미세결정셀룰로오즈 65 옥수수전분 15.5 소르비톨 2250 폴리비닐피롤리돈 47.5 시트르산 10 아스파탐 32 향미제 180 [0099] 본발명의추출물, 미세결정셀룰로오즈및옥수수전분을혼합한다. 이혼합물을물과폴리비닐피롤리돈으로이루어진결합제용액을사용하여니딩 (kneading) 한다. 상기혼합물이습윤하게되면, 2 mm 체를통해과립화한다. 과립을건조시키고, 이를강제로 0.8 mm 체를통과하게하여사분한다. 얻어진과립분말을소르비톨, 시트르산, 아스파탐및적당한향미제와혼합한다. 상기과립을사쉐 (sachet) 에채운다. [0100] [0101] 제제예 3. 주사용제제 (injectable formulation) 의제조 표 3 [0102] 구성성분 함량 (mg) 본발명의추출물 10 소듐메타비설파이트 3.0 메틸파라벤 0.8 프로필파라벤 0.1 주사용멸균증류수 2 ml까지적정량 [0103] 상기재료들을혼합하여통상의방법으로최종주사액부피가 2 ml 이되도록제조하고앰플에충전한다. 최종 용액은멸균및비발열성이어야한다. 또는, 상기주사용제제는동결건조된분말상태로제조하여사용전에 주사용매질에용해시켜투여될수있다. [0104] 제제예 4. 건강음료의제조 표 4 [0105] 구성성분 함량 (g) 본발명의추출물 1 구연산 1 올리고당 100 매실농축액 2 타우린 1 정제수 900 ml까지적정량 [0106] 통상의건강음료제조방법에따라상기성분들을혼합한다음, 약 1 시간동안 85 에서교반가열한후, 제조 된용액을여과하여멸균된 2 L 용기에취득하여밀봉멸균한뒤냉장보관한다. 본제제예에서는기호음료에 적합한성분을바람직한비율로서혼합조성하였지만, 그배합비를임의로변형실시하여도무방하다. - 13 -
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