(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2011년07월20일 (11) 등록번호 10-1050690 (24) 등록일자 2011년07월14일 (51) Int. Cl. G01N 33/68 (2006.01) G01N 33/53 (2006.01) G01N 33/48 (2006.01) (21) 출원번호 10-2008-0085799 (22) 출원일자 2008 년 09 월 01 일 심사청구일자 2008 년 09 월 01 일 (65) 공개번호 10-2009-0026060 (43) 공개일자 2009 년 03 월 11 일 (30) 우선권주장 1020070090742 2007 년 09 월 07 일대한민국 (KR) (56) 선행기술조사문헌 US20020128234 A1 KR1020060094516 A US6706161 B1 (73) 특허권자 광주과학기술원 광주북구오룡동 1 번지 (72) 발명자 전상용 광주북구첨단과기로 261 광주과학기술원생명과학과 박상진 광주북구첨단과기로 261 광주과학기술원생명과학과 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 양부현, 이문섭 KR1020080017809 A 전체청구항수 : 총 22 항 심사관 : 김승범 (54) 다기능성고분자막및그의용도 (57) 요약 본발명은다음의단계를포함하는표면상에중합체막이코팅되어있고항 - 바이오파울링특성을나타내며공유결합을형성할수있는반응기를포함하는고상기질의제조방법에관한것이다 : (a) (ⅰ) 상기고상기질의표면에결합되는표면 - 앵커링부위를포함하는중합체의제 1 단량체, (ⅱ) 항 - 바이오파울링특성을나타내는중합체가결합된제 2 단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을형성할수있는반응기를포함하는제 3 단량체를반응시켜표면 - 앵커부위, 단백질 - 저항성부위및반응성부위를포함하는중합체를생성하는단계 ; 및 (b) 상기중합체를상기고상기질의표면에코팅하는단계. 대표도 - 도 3-1 -
(72) 발명자 성대경 광주북구첨단과기로 261 광주과학기술원생명과학과 양해식 부산연제구거제 1 동쌍용아파트 102-1501 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 다음의단계를포함하는표면상에중합체막이코팅되어있고항-바이오파울링특성을나타내며공유결합을형성할수있는반응기를포함하는고상기질의제조방법 : (a) (ⅰ) 상기고상기질의표면에결합되는표면-앵커링부위를포함하는중합체의제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링특성을나타내는중합체가결합된제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을형성할수있는반응기를포함하는제 3단량체를반응시켜표면-앵커부위, 단백질-저항성부위및반응성부위를포함하는중합체를생성하는단계 ; 및 (b) 상기중합체를상기고상기질의표면에코팅하는단계. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기제1단량체는메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체이고, 제1단량체에있는표면-앵커링부위는치환또는비치환된실란기, 치환또는비치환된알킬기또는치환또는비치환된아릴기인것을특징으로하는방법. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기치환된실란기는알콕시기로치환된실란기인것을특징으로하는방법. 청구항 4 제 2 항에있어서, 상기알킬기는 C 6-30 알킬기인것을특징으로하는방법. 청구항 5 제 2 항에있어서, 상기치환된알킬기는 F, Cl 또는 Br 로치환된것을특징으로하는방법. 청구항 6 제 1 항에있어서, 상기제2단량체는메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체이고, 제2단량체에있는항- 바이오파울링특성을나타내는중합체는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌옥사이드, 덱스트란또는폴리비닐피롤리돈인것을특징으로하는방법. 청구항 7 제 1 항에있어서, 상기제 3 단량체는메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체이고, 제 3 단량체에있는반 응기는카르복실기인것을특징으로하는방법. 청구항 8 제 7 항에있어서, 상기카르복실기는석시너마이드, 석시너미딜에스테르, 설포-석시너미딜에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀에스테르, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀에스테르, 알데하이드, 산무수화물, 아자이드, 아졸리드, 카보이마이드, 에폭사이드, 에스테르, 글리시딜에테르, 할라이드, 이미다졸또는이미데 - 3 -
이트에의해활성화되어있는것을특징으로하는방법. 청구항 9 제 1 항에있어서, 상기중합체는다음화학식 1 로나타내는것을특징으로하는방법 : 화학식 1 상기화학식에서, R 1 은실릴알킬기, 알콕시실릴알킬기, 하이드록시실릴알킬기, 치환또는비치환된알킬기, 치환또는비치환된아릴기, 치환또는비치환된아랄킬기, 또는치환또는비치환된알카릴기이고 ; R 2 는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌옥사이드, 폴리페닐렌옥사이드, PEG와폴리알킬렌옥사이드의공중합체, 폴리 ( 메톡시에틸메타크릴에이트 ), 폴리 ( 메타크릴로일포스파티딜콜린 ), 과불화된폴리에테르, 덱스트란또는폴리비닐피롤리돈이며 ; R 3 는알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기또는히드록실기이며 ; R 4, R 5 및 R 6 는서로독립적으로, H 또는 C 1 -C 5 알킬기이며 ; X, Y 및 Z는서로독립적으로산소, 황또는질소원자이고 ; l, m 및 n은서로독립적으로 1-10,000의정수이다. 청구항 10 제 1 항에있어서, 상기중합체는고상기질상에자가-조립단일막 (self assembled monolayer) 형태로존재하는것을특징으로하는방법. 청구항 11 제 1 항또는제 8 항에있어서, 상기방법은단계 (c) 상기고상기질에코팅된중합체막의제3단량체로부터유래된반응기에화학물질, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드또는당을공유결합시키는단계를추가적으로포함하는것을특징으로하는방법. 청구항 12 다음의단량체의중합반응에의해형성된중합체가코팅되어있고, 표면-앵커링, 항-바이오파울링및반응성부위를포함하는이중기능성고상기질 : (ⅰ) 상기고상기질의표면에결합되는표면-앵커링부위를포함하는제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링특성을나타내는중합체가결합된제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을형성할수있는반응기를포함하는제3단량체. 청구항 13 제 12 항에있어서, 상기제1단량체는메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체이고, 제1단량체에있는표면-앵커링부위는치환또는비치환된실란기, 치환또는비치환된알킬기또는치환또는비치환된아릴기인것을특징으로하는고상기질. 청구항 14-4 -
제 13 항에있어서, 상기알킬기는 C 6-30 알킬기인것을특징으로하는고상기질. 청구항 15 제 13 항에있어서, 상기치환된알킬기는 F, Cl 또는 Br 로치환된것을특징으로하는고상기질. 청구항 16 제 12 항에있어서, 상기제2단량체는메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체이고, 제2단량체에있는항 -바이오파울링특성을나타내는중합체는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌옥사이드, 덱스트란또는폴리비닐피롤리돈인것을특징으로하는고상기질. 청구항 17 제 12 항에있어서, 상기제 3 단량체는메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체이고, 제 3 단량체에있는반 응기는카르복실기인것을특징으로하는고상기질. 청구항 18 제 17 항에있어서, 상기카르복실기는석시너마이드, 석시너미딜에스테르, 설포-석시니미딜에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀에스테르, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀에스테르, 알데하이드, 산무수화물, 아자이드, 아졸리드, 카보이마이드, 에폭사이드, 에스테르, 글리시딜에테르, 할라이드, 이미다졸또는이미데이트에의해활성화되어있는것을특징으로하는고상기질. 청구항 19 제 12 항에있어서, 상기반응성부위는화학물질, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드또는당이결합되어있는 것을특징으로하는고상기질. 청구항 20 제 12 항에있어서, 상기중합체는다음화학식 1 로나타내는것을특징으로하는고상기질 : 화학식 1 상기화학식에서, R 1 은실릴알킬기, 알콕시실릴알킬기, 하이드록시실릴알킬기, 치환또는비치환된알킬기, 치환또는비치환된아릴기, 치환또는비치환된아랄킬기, 또는치환또는비치환된알카릴기이고 ; R 2 는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌옥사이드, 폴리페닐렌옥사이드, PEG와폴리알킬렌옥사이드의공중합체, 폴리 ( 메톡시에틸메타크릴에이트 ), 폴리 ( 메타크릴로일포스파티딜콜린 ), 과불화된폴리에테르, 덱스 - 5 -
트란또는폴리비닐피롤리돈이며 ; R 3 는알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기또는히드록실기이며 ; R 4, R 5 및 R 6 는서로독립적으로, H 또는 C 1 -C 5 알킬기이며 ; X, Y 및 Z는서로독립적으로산소, 황또는질소원자이고 ; l, m 및 n은서로독립적으로 1-10,000의정수이다. 청구항 21 상기제 12 항내지제 20 항중어느한항의고상기질을포함하는바이오칩또는바이오센서. 청구항 22 다음화학식 1 로표시되는중합체 : 화학식 1 상기화학식에서, R 1 은실릴알킬기, 알콕시실릴알킬기, 하이드록시실릴알킬기, 치환또는비치환된알킬기, 치환또는비치환된아릴기, 치환또는비치환된아랄킬기, 또는치환또는비치환된알카릴기이고 ; R 2 는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌옥사이드, 폴리페닐렌옥사이드, PEG와폴리알킬렌옥사이드의공중합체, 폴리 ( 메톡시에틸메타크릴에이트 ), 폴리 ( 메타크릴로일포스파티딜콜린 ), 과불화된폴리에테르, 덱스트란또는폴리비닐피롤리돈이며 ; R 3 는알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기또는히드록실기이며 ; R 4, R 5 및 R 6 는서로독립적으로, H 또는 C 1 -C 5 알킬기이며 ; X, Y 및 Z는서로독립적으로산소, 황또는질소원자이고 ; l, m 및 n은서로독립적으로 1-10,000의정수이다. 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야 본발명은고상기질의제조방법, 고상기질, 바이오칩또는바이오센서및고상기질을코팅하는데이용되는 신규한중합체에관한것이다. 배경기술 [0002] 생물학적활성물질 ( 예컨대, 바이오틴, DNAs, 당류, 펩타이드및단백질 ) 1 및세포를고상의기질상 2 에패턴을생성시키는것은큰관심의대상이되고있는데, 그이유는이와같은패턴이바이오센서 3 또는고속스크리닝용 분석시스템에이용되어우수한응용성을갖고있기때문이다 4. 특히, 프로테옴의연구또는질환의진단에현 재이용되고있는 SiO 2 -계기질상의단백질마이크로어레이를구축하는것은관심이크게집중되는분야이다 5. 일반적으로, 두개의작용기성 (functionality) 가단백질어레이의성공적인구축에요구된다 : ⅰ) 프로브단백질을고정화하는생활성표면 ; 및 ⅱ) 낮은시그널-대-노이즈비율 (S/N 비율 ) 를야기하는원치않는단백질의비특이적흡착을최소화하는생물학적비활성 ( 항바이오파울링 ) 표면 6. 이러한목적을달성하기위한종래의전략은, 한쪽말단에표면반응성그룹 ( 즉, 트리메톡시또는트리클로로실란 ) 및다른쪽말단에작용기 ( 즉, - 6 -
아민, 알코올, 올리고에틸렌글라이콜 ) 를포함하는모노밸런트화합물에의해형성되는자가-조립단일막 [selfassembled monolayers(sams)] 에의존한다 7. 그러나, 금표면상에 SAMs가직접적으로형성 8 되는것과는다르게, 모노밸런트실리콘화합물을이용하여 SiO 2 기질상에 SAMS를형성시키는것은, 종종표면상에응집체 ( 중합체화돈실록산 ) 를생성할뿐만아니라많은결점을초래하며, 이는분석결과의나쁜재현성을초래한다 9. 따라서, 비특이적흡착을억제하면서 SiO 2 기질상에서생물학적물질을특이적으로고정화할수있는새로운플랫폼을개발하는것이매우중요하다. [0003] 본명세서전체에걸쳐다수의논문및특허문헌이참조되고그인용이표시되어있다. 인용된논문및특허문헌의개시내용은그전체로서본명세서에참조로삽입되어본발명이속하는기술분야의수준및본발명의내용이보다명확하게설명된다. 발명의내용 [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 해결하고자하는과제본발명자들은바이오센서및바이오칩의기반기술인기질표면코팅을개선하려는시도를하였다. 특히, 비특이적흡착을억제면서도기질표면에생체분자를효율적으로고정화하여, 시그널-대-노이즈 (signal-tonoise) 를크게개선하여, 우수한분석능및재현성을갖는바이오센서및바이오칩을제공하고자노력하였다. 그결과, 표면-앵커링, 항-바이오파울링및반응성부위를각각갖는 3종의단량체를이용하여중합체를제조하고이를고상기질에코팅하고, 생체분자를고정화하여우수한특성을확인함으로써, 본발명을완성하게되었다. 따라서본발명의목적은표면상에중합체막이코팅되어있고항-바이오파울링특성을나타내며공유결합을형성할수있는반응기를포함하는고상기질의제조방법을제공하는데있다. 본발명의다른목적은표면-앵커링, 항-바이오파울링및반응성부위를포함하는이중기능성고상기질을제공하는데있다. 본발명의또다른목적은바이오칩또는바이오센서를제공하는데있다. 본발명의다른목적은고상기질을코팅하는데이용되는신규한중합체를제공하는데있다. [0009] 본발명의다른목적및이점은하기의발명의상세한설명, 청구범위및도면에의해보다명확하게된다. [0010] [0011] [0012] 과제해결수단본발명의일양태에따르면, 본발명은다음의단계를포함하는표면상에중합체막이코팅되어있고항-바이오파울링특성을나타내며공유결합을형성할수있는반응기를포함하는고상기질의제조방법을제공한다 : (a) (ⅰ) 상기고상기질의표면에결합되는표면-앵커링부위를포함하는중합체의제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링특성을나타내는중합체가결합된제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을형성할수있는반응기를포함하는제 3단량체를반응시켜표면-앵커부위, 단백질-저항성부위및반응성부위를포함하는중합체를생성하는단계 ; 및 (b) 상기중합체를상기고상기질의표면에코팅하는단계. [0013] 본발명의다른양태에따르면, 본발명은다음의단량체의중합반응에의해형성된중합체가코팅되어있고, 표면-앵커링, 항-바이오파울링및반응성부위를포함하는이중기능성고상기질을제공한다 : (ⅰ) 상기고상기질의표면에결합되는표면-앵커링부위를포함하는제1단량체, (ⅱ) 항-바이오파울링특성을나타내는중합체가결합된제2단량체, 및 (ⅲ) 공유결합을형성할수있는반응기를포함하는제3단량체. - 7 -
[0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] 본발명자들은바이오센서및바이오칩의기반기술인기질표면코팅을개선하려는시도를하였다. 특히, 비특이적흡착을억제면서도기질표면에생체분자를효율적으로고정화하여, 시그널-대-노이즈 (signal-tonoise) 를크게개선하여, 우수한분석능및재현성을갖는바이오센서및바이오칩을제공하고자노력하였다. 그결과, 표면-앵커링, 항-바이오파울링및반응성부위를각각갖는 3종의단량체를이용하여중합체를제조하고이를고상기질에코팅하고, 생체분자를고정화하여우수한특성을확인하였다. 바이오센서또는바이오칩에이용되는고상기질의표면에는생체분자 ( 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드또는당 ) 또는화학물질 (chemicals) 을부착하여분석에이용된다. 본발명은이러한고상기질의표면에생체분자등을부착하는기술에관한것으로서, 중합체를기질표면에코팅하여실시된다. 본발명의중합체는 3가지단량체를이용하여제조된다. 그리고 3종의단량체는각각 (ⅰ) 표면-앵커링부위, (ⅱ) 항-바이오파울링부위및 (ⅲ) 반응성부위를포함하며, 이를통하여이중기능성, 즉항-바이오파울링및생체분자의부착을달성한다. 3가지단량체중에서, 제1단량체는고상기질의표면에결합되는표면-앵커링부위를포함한다. 제1단량체로이용가능한것은, 중합체의다양한단량체들이이용될수있으며, 예를들어, 아크릴산, 아크릴로니트릴, 알릴아민, 메타크릴산, 알킬아크릴레이트, 알킬메타크릴레이트, 부타디엔, 카보메틸실란, ( 카보네이트 ) 우레탄, 폴리디메틸실록산의아크릴레이트, 폴리디메틸실록산의메타크릴레이트, 에틸렌, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, ( 에테르 ) 우레탄, 우레탄, 비닐클로라이드, 비닐알코올, 말레산무수물, 셀룰로오스클로라이드, 비닐알코올, 셀룰로오스니트레이트, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 덱스트란설페이트, 프로필렌, 에스테르, 카보네이트, 에테르, 부텐, 말레산, 플루오로폴리머모노머단위, 불포화폴리머모노머, 이소프렌, 멜라민, 설폰, 생물학적폴리머모노머단위, 단백질, 젤라틴, 단백질, 젤라틴, 엘라스틴, 부틸메타크릴레이트, 부틸메타크릴레이트, 하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜디글라이시달에테르, 폴리프로필렌글리콜디글라이시딜에테르, N-아크릴옥시석니너마이드, 글라이시딜메타크릴레이트, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 아크로레인, 글리세롤모노메타클리레이트, 헤파린메타크릴레이트, 메타크릴로일에틸포스포릴콜린, 부틸아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜모노메타크릴레이트, 이소부틸메타크릴레이트, 사이클로헥실메타크릴레이트, 에틸아크릴레이트, 2-하이드록시에틸아크릴레이트, 2-에틸헥실메타크릴레이트, 에틸메타크릴레이트, 메틸아크릴레이트, 헥사데실메타크릴레이트, 옥타데실메타크릴레이트, 스틸렌, 메틸스틸렌, 비닐톨루엔, 터트-부틸아크릴레이트, n-비닐피롤리돈, 글리코라이드, 락타이드, 부티로락톤, 카프로락톤, 하이드록시알카노에이트, 3-하이드록시부티레이트, 4-하이드록시부티레이트, 3-하이드록시발러레이트및 3-하이드록시헥사노에이트를포함하나, 이에한정되는것은아니다. 바람직하게는, 본발명의제1단량체는아클릴계또는메타크릴계단량체이며, 예를들어, 메타크릴산, 아크릴산, 알킬메타크릴레이트 ( 예컨대, 메틸메타크릴레이트, 에틸메타크릴레이트, 부틸메타크릴레이트, 이소부틸메타크릴레이트, 헥사데실메타크릴레이트, 옥타데실메타크릴레이트및사이클로헥실메타크릴레이트 ), 알킬아크릴레이트 ( 예컨대, 메틸아크릴레이트, 에틸아크릴레이트및터트-부틸아크릴레이트 ), 아릴아크릴레이트 ( 예컨대, 벤질아크릴레이트 ), 아릴메타크릴레이트 ( 예컨대, 벤질메타크릴레이트 ), 2-에틸헥실메타크릴레이트, 라우릴메타크릴레이트, 하이드록실에틸메타크릴레이트, PEG 아크렐레이트, PEG 메타크릴레이트, 하이드록시프로필메타크릴레이트, 하이드록시프로필메타크릴아미드, 3-트리메틸실릴프로필메타크릴레이트, 3-트리메톡시실릴프로필메타크릴레이트, 아크릴로니트릴, 폴리디메틸실록산의아크릴레이트, 폴리디메틸실록산의메타크릴레이트, 글라이시딜메타크릴레이트, 글리세롤모노메타클리레이트, 헤파린메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜모노메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸아크릴레이트및 2-에틸헥실메타크릴레이트를포함하나, 이에한정되는것은아니다. 본발명의바람직한구현예에따르면, 본발명의제1단량체는표면-앵커링부위로서, 치환또는비치환된실란기, 치환또는비치환된알킬기또는치환또는비치환된아릴기를포함한다. 제1단량체에있는치환또는비치환된실란기는고상기질 ( 예컨대, Si/SiO 2 웨이퍼 ) 의하이드록실기와공유결합 [0022] 을형성하여고상기질에중합체막을앵커링시킨다. 제 1 단량체에는비치환된실란기, 즉 SiH 4 가있을수있으며이는고상기질표면에앵커링된다. 바람직하게 는, 제 1 단량체에는치환된실란기가있으며, 이치환된실란기를통하여중합체가고상기질표면에앵커링된 - 8 -
다. [0023] 제 1 단량체에서표면 - 앵커링부위가치환된실란기인경우에는, 바람직하게는알콕시기로치환된실란기 ( 즉, 알 콕시실릴기 ), 보다바람직하게는 C 1 -C 6 알콕시기로치환된실란기이다. 본명세서용어알콕시는 -O 알킬기를 의미한다. 용어알콕시실릴은알콕시치환된실릴기를의미하며, 바람직하게는트리메톡시실릴및트리에톡실 릴, 보다바람직하게는트리메톡시실릴이다. [0024] 제 1 단량체에는하이드록시기로치환된실란기 ( 즉, 하이드록시실릴기 ) 가있을수있다. 하이드록시 - 치환된실릴기를의미하며, 바람직하게는트리하이드록시실릴기이다. 용어하이드록시실릴은 [0025] 본발명의바람직한구현예에따르면, 제1단량체는치환또는비치환된알킬기를포함할수있다. 이러한알킬기는제1단량체에소수성을부여하여중합체가고상기질 ( 예컨대, 소수성표면을갖는폴리스틸렌기질 ) 에소수성상호작용및 / 또는다이폴 (dipole) 상호작용을통해서앵커링되도록한다. [0026] 바람직하게는, 제 1 단량체에있는알킬기는 C 6-30 알킬기, 보다바람직하게는 C 8-30 알킬기이다. 용어알킬은지 정된탄소수를갖는직쇄또는분쇄포화탄화수소기를의미한다. 알킬기가치환되는경우, 바람직하게는 F, Cl 또는 Br, 보다바람직하게는 F 로치환된다. [0027] 본발명의바람직한구현예에따르면, 제1단량체는치환또는비치환된아릴기를포함할수있다. 이러한아릴기는 p-p 상호작용을통하여중합체가고상기질 ( 예컨대, 소수성표면을갖는폴리스틸렌기질 ) 에앵커링되도록한다. 용어, 아릴은전체적으로또는부분적으로불포화된치환또는비치환된모노사이클릭또는폴리사이클릭탄소고리를의미하며, 바람직하게는모노아릴또는비아릴이다. 모노아릴은탄소수 5-6을갖는것이바람직하며, 비아릴은탄소수 9-10을갖는것이바람직하다. 가장바람직하게는상기아릴은치환또는비치환된페닐이다. 모노아릴, 예컨대, 페닐이치환되는경우에는, 다양한위치에서다양한치환체에의해치환이이루어질수있으나, 바람직하게는, 할로, 히드록시, 니트로, 시아노, C 1 -C 4 치환또는비치환된직쇄또는 가지쇄알킬, C 1 -C 4 직쇄또는가지쇄알콕시, 알킬치환설파닐, 페녹시, C 3 -C 6 사이클로헤테로알킬또는치환 또는비치환아미노기에의해치환될수있다. [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 본발명에서이용되는제2단량체의기본적인구조는제1단량체와동일하다. 바람직하게는제2단량체는메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체이다. 메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체에대한설명은제1단량체에대한설명을인용한다. 제2단량체에는항-바이오파울링특성을나타내는중합체가결합되어있다. 바람직하게는, 항-바이오파울링특성을나타내는중합체는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌옥사이드 [ 예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌또는이들의공중합체 ( 예컨대, 폴리에틸렌옥사이드- 폴리프로필렌옥사이드- 폴리에틸렌옥사이드공중합체 )], 폴리페닐렌옥사이드, PEG와폴리알킬렌옥사이드의공중합체, 폴리 ( 메톡시에틸메타크릴에이트 ), 폴리 ( 메타크릴로일포스파티딜콜린 ), 과불화된폴리에테르, 덱스트란또는폴리비닐피롤리돈이고, 보다바람직하게는 PEG, 폴리알킬렌옥사이드또는 PEG와폴리알킬렌옥사이드의공중합체이며, 가장바람직하게는 PEG이다. 본발명에서이용되는제3단량체의기본적인구조는제1단량체와동일하다. 바람직하게는, 제2단량체는메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체이다. 메타크릴레이트계또는아크릴레이트계단량체에대한설명은제1단량체에대한설명을인용한다. 제3단량체에는반응기가결합되어있다. 이반응기는단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA), 당또는화학물질과반응하여공유결합을형성할수있는것이다. 따라서, 제3단량체에있는반응기는다양한반응기를포함한다. 예를들어, 제3단량체에있는반응기는, 알데하이드 ; 에폭시 ; 할로알킬 ; 1차아민 ; 티올 ; 말레이미드 ; 에스테르 ( 바람직하게는 N-하이드록시석시너마이드에스테르작용기 ); 그리고카르복실기 ( 하이드록시-석시너마이드에스테르형성에의해활성화됨 ) 와히드록실기 ( 사이아노겐브로마이드로활성화됨 ) 와같은활성화되는반응기를포함하나, 이에한정되는것은아니다. 가장바람직하게는, 제3단량체는반응기로서카르복실기를포함한다. 제3단량체가반응기로서카르복실기를포함하는경우, 바람직하게는, 이카르복실기는석시너마이드, 석시너미딜에스테르, 설포-석시너미딜에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀에스테르, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀에스테르, 알데하이드, 산무수화물, 아자이드, 아졸리드, 카보이마이드, 에폭사이드, 에스테르, 글리시딜에테르, 할라이드, 이미다졸또는이미데이트에의해활성화되어있다. 가장바람직하게는, 반응기로서의 - 9 -
카르복실기는석시너마이드또는석시너미딜에스테르에의해활성화되어있다. [0033] 본발명의바람직한구현예에따르면, 고상기질에코팅되는중합체는다음화학식 1 로나타낸다 : 화학식 1 [0034] [0035] 상기화학식에서, R 1 은실릴알킬기, ( 알콕시실릴 ) 알킬기, ( 하이드록시실릴 ) 알킬기, 치환또는비치환된알킬기, 치환또는비치환된아릴기, 치환또는비치환된아랄킬기, 또는치환또는비치환된알카릴기이고 ; R 2 는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌옥사이드, 폴리페닐렌옥사이드, PEG와폴리알킬렌옥사이드의공중합체, 폴리 ( 메톡시에틸메타크릴에이트 ), 폴리 ( 메타크릴로일포스파티딜콜린 ), 과불화된폴리에테르, 덱스트란또는폴리비닐피롤리돈이며 ; R 3 는알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기또는히드록실기이며 ; R 4, R 5 및 R 6 는서로독립적으로, H 또는 C 1 -C 5 알킬기이며 ; X, Y 및 Z는서로독립적으로산소, 황또는질소원자이고 ; l, m 및 n은서로독립적으로 1-10,000의정수이다. [0036] 상기화학식 1 에서 R 1 의정의에사용되는용어실릴알킬은알킬기로치환된실릴기로치환된알킬기를의미한다. 예를들어, 실릴알킬은실릴메틸, 실릴에틸, 실릴프로필및실릴부틸을포함한다. 용어 ( 알콕시실릴 ) 알킬은알콕시-치환된실릴알킬기를의미한다. 예를들어, ( 알콕시실릴 ) 알킬은트리메톡시실릴에틸, 트리메톡시실릴프로필, 트리메톡실릴부틸, 트리메톡실릴펜틸, 트리에톡시실릴에틸, 트리에톡시실릴프로필, 트리에톡실릴부틸, 트리메톡실릴펜틸, 메틸디메톡시실릴에틸, 메틸디메톡시실릴프로필, 디메틸메톡시실릴에틸및디메틸메톡시실릴프로필을포함한다. 용어 ( 하이드록시실릴 ) 알킬은하이드록실-치환된실릴알킬을의미하며, 예컨대, 트리하이드록시실릴에틸, 트리하이드록시실릴프로필, 트리하이드록시실릴부틸및트리하이드록시실릴펜틸을포함한다. [0037] [0038] 용어 아랄킬 은하나또는그이상의알킬기에의한구조에결합된아릴기를의미하며, 예컨대벤질기및페닐프로필기이다. 용어, 알카릴 은하나또는그이상의아릴기로이루어진구조에결합된알킬기를의미한다. 바람직하게는, 화학식 1에서 R 1 은 ( 알콕시실릴 ) 알킬기, 치환또는비치환된 C 6-30 알킬기, 치환또는비치환된아 릴기, 치환또는비치환된아랄킬기, 또는치환또는비치환된알카릴기이고, 보다바람직하게는 (C 1-6 알콕시실릴 )C 1-10 알킬기, 치환또는비치환된 C 6-30 알킬기, 치환또는비치환된페닐기, 치환또는비치환된아랄킬기로서 C 1-5 알킬기에페닐기에결합된것, 또는치환또는비치환된알카릴기로서페닐기에 C 1-5 알킬기가결합된것이며, 가장바람직하게는 (C 1-3 알콕시실릴 )C 1-5 알킬기, 치환또는비치환된 C 8-20 알킬기, 치환또는비치환된페닐기, 치환또는비치환된아랄킬기로서 C 1-5 알킬기에페닐기에결합된것, 또는치환또는비치환된알카릴기로서페닐기에 C 1-5 알킬기가결합된것이다. [0039] [0040] [0041] [0042] 상술한 3가지단량체에의해제조된중합체를고상기질표면에코팅하는것은당업계에공지된다양한방법을통하여실시할수있다. 예를들어, 상기중합체의용액에고상기질을적합한시간동안함침시켜코팅할수있다. 본발명의바람직한구현예에따르면, 고상기질상에코팅되는중합체는고상기질상에자가-조립단일막 (self assembled monolayer) 형태로존재한다. 고상기질상에형성된자가-조립단일막은, 0.8-2 nm, 바람직하게는 0.9-1.3 nm의두께를갖는다. 본발명의바람직한구현예에따르면, 본발명의방법은단계 (c) 상기고상기질에코팅된중합체막의제3단량체로부터유래된반응기에화학물질, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA), 펩타이드핵산 (PNA) - 10 -
또는당을결합시키는단계를추가적으로포함한다. [0043] 고상기질에코팅된중합체막의제 3 단량체로부터유래된반응기에단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA), 당또는화학물질을공유결합시킨다. [0044] 예컨대, 반응기가활성화된카르복실기인경우에는단백질등의아민기를통하여공유결합시킬수있다. 기가아민기인경우에는단백질등의카르복실기를통하여공유결합시킬수있다. 반응 [0045] [0046] [0047] 또한, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드및당은간접적으로반응기에결합시킬수있다. 예를들어, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드또는당에친화성을갖는물질을우선반응기에결합시킨다음, 단백질 ( 예컨대, 스트렙타비딘또는아비딘 ) 등을친화성물질 ( 바이오틴 ) 에결합 ( 바람직하게는, 비공유결합 ) 시켜간접적으로반응기에결합시킬수있다. 생체분자등을자기조립막을통하여고상기질에고정화하는경우, 생체분자는다음과같은방법에의해고정화될수있다 : 접촉핀프린팅, 잉크젯프린팅과에어로졸프린팅과같은비접촉프린팅, 모세관프린팅, 마이크로접촉프린팅, 패드프린팅, 스크린프린팅, 실크스크리닝, 마이크로파이펫팅또는스프레이잉. 본발명에서이용될수있는고상기질은표면특성에무관하게어떠한것도이용가능하다. 예를들어, 고상기질은, 금속 ( 예컨대, 금, 금과구리의합금, 알루미눔 ), 금속옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO 2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머 ( 예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드 ), 세파로스, 아가로스및콜로이드를포함하나이에한정되는것은아니다. [0048] 제 1 단량체에있는표면 - 앵커링부위가치환또는비치환된실란기인경우에는, 유리, 금속옥사이드, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체및 Si/SiO 2 웨이퍼기질을이용하는것이바람직하다. 제 1 단량체에있는표면 - 앵커링 부위가치환또는비치환된알킬기또는치환또는비치환된아릴기인경우에는, 카본, 탄소나노튜브및폴리머 ( 예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드 ) 기질을이용하는것이바람직하다. [0049] 본발명에따르면, 고상기질상에중합체성자가-조립단일막을안정되게코팅할수있고, 항-바이오파울링특성에의해원하는생체분자이외에다른분자들이흡착되는것을억제하여시그널-대-노이즈를크게향상시킬수있을뿐만아니라, 중합체에있는반응기를통하여원하는생체분자를안정되면서도패턴화된형태로고상기질에고정화할수있다. [0050] [0051] [0052] [0053] 본발명의또다른양태에따르면, 본발명은상술한본발명의고상기질을포함하는바이오칩또는바이오센서를제공한다. 본발명의바이오칩또는바이오센서에서, 자기조립단일막중합체의반응기를통하여생체분자가고상기질에고정화된다. 본발명의바이오칩은바람직하게는, DNA 마이크로어레이또는단백질칩이다. 본발명의바이오칩에적용될수있는일반적인설명은, 미국특허제5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,412,087, 5,424,186, 5,451,683, 5,482,867, 5,491,074, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716, 5,831,070, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,659, 5,889,165, 5,936,324, 5,959,098, 5,968,740, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,147,205, 6,262,216, 6,269,846, 6,310,189 및 6,428,752호게상세하게기재되어있다. 본발명의바이오센서에적용될수있는일반적인내용은, Myska, J. Mol. Recognit, 12:279-284(1999); J. Dubendorfer et al. Journal of Biomedical Optics, 2(4):391-400(1997); 및 O'Brien et al. Biosensors & Bioelectronics, 14:145-154(1999) 에기재되어있다. [0054] [0055] 본발명의다른양태에따르면, 본발명은다음화학식 1 로표시되는중합체를제공한다 : 화학식 1-11 -
[0056] [0057] 상기화학식에서, R 1 은실릴알킬기, ( 알콕시실릴 ) 알킬기, ( 하이드록시실릴 ) 알킬기, 치환또는비치환된알킬기 또는치환또는비치환된아릴기이고 ; R 2 는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌옥사이드, 폴리페닐렌옥사이드, PEG와폴리알킬렌옥사이드의공중합체, 폴리 ( 메톡시에틸메타크릴에이트 ), 폴리 ( 메타크릴로일포스파티딜콜린 ), 과불화된폴리에테르, 덱스트란또는폴리비닐피롤리돈이며 ; R 3 는알데하이드, 에폭시, 할로알킬, 1차아민, 티올, 말레이미드, 에스테르, 카르복실기또는히드록실기이며 ; R 4, R 5 및 R 6 는서로독립적으로, H 또는 C 1 -C 5 알킬기이며 ; X, Y 및 Z는서로독립적으로산소, 황또는질소원자이고 ; l, m 및 n은서로독립적으로 1-10,000의정수이다. [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] 본발명의특징및이점을요약하면다음과같다 : (a) 본발명은 3가지기능성, 표면-앵커링, 항-바이오파울링및반응성부위를갖는중합체를이용한다. (b) 본발명에따르면고상기질상에중합체성자가-조립단일막을안정되게코팅할수있다. (c) 본발명은우수한항-바이오파울링특성을가지고있어, 시그널-대-노이즈를크게향상시킬수있다. (d) 본발명에따르면이용되는중합체의반응기를통하여원하는생체분자를안정되면서도패턴화된형태로고상기질에고정할수있다. (e) 본발명에따르면, 사용되는 3가지단량체의양을조절함으로써, 생체분자의결합을위한반응기성 (bioreactive functionality) 및항-바이오파울링작용기성 (antibiofouling functionality) 를조절할수있다. (f) 본발명에따르면, 기질의종류에무관하게 SAM을고체기질표면상에형성시킬수있으며, 특히폴리머기질표면에 SAM을우수한효율로형성시킬수있다. (g) 본발명에따르면시그널-대-노이즈가크게향상된바이오센서또는바이오칩을제공할수있다. [0066] 효과위에서상세히설명한바와같이, 본발명은 3가지기능성, 표면-앵커링, 항-바이오파울링및반응성부위를갖는중합체를이용한다. 본발명에따르면고상기질상에중합체성자가-조립단일막을안정되게코팅할수있으며, 우수한항-바이오파울링특성을가지고있어, 시그널-대-노이즈를크게향상시킬수있다. 본발명에따르면이용되는중합체의반응기를통하여원하는생체분자를안정되면서도패턴화된형태로고상기질에고정할수있고, 사용되는 3가지단량체의양을조절함으로써, 생체분자의결합을위한반응기성 (bioreactive functionality) 및항-바이오파울링작용기성 (antibiofouling functionality) 를조절할수있다. 또한, 본발명에따르면, 기질의종류에무관하게 SAM을고체기질표면상에형성시킬수있으며, 특히폴리머기질표면에 SAM을우수한효율로형성시킬수있다. 본발명에따르면시그널-대-노이즈가크게향상된바이오센서또는바이오칩을제공할수있다. [0067] 발명의실시를위한구체적인내용 이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하고자한다. 이들실시예는오로지본발명을보다구체적 으로설명하기위한것으로, 본발명의요지에따라본발명의범위가이들실시예에의해제한되지않는다는 - 12 -
것은당업계에서통상의지식을가진자에있어서자명할것이다. [0068] 실시예 [0069] [0070] [0071] 실험방법실험물질 N-아크릴옥시석시나마이드 (NAS 99%) 를 ACROS Organics (Noisy-le-Grand, 프랑스 ) 로부터구입하였다. 3-( 트리메톡시실릴 ) 프로필메타크릴레이트, 폴리 ( 에틸렌글리콜 ) 메틸에테르메타크릴레이트 ( 평균 Mn = ca. 475), 도데실메타크릴레이트, Zonyl TM TM 플루오로모노머 ( 평균 Mn = ca. 534), 벤질메타크릴레이트, 메타크릴산및 2,2'-아조비스이소부티로니트릴 (AIBN) 을 Aldrich Chemical Co.(Milwaukee, WI) 로부터구입하였다. (+)-바이오티닐-3,6,9-트리옥사운데칸디아민 ( 바이오틴-NH 2 ) 및플루오레신-결합스트렙토마이신을 Pierce (Rockford, IL) 로부터구입하였다. 모든유기용매는추가적인정제없이구입한그대로사용하였다. Si/SiO 2 웨이퍼, 폴리 ( 디메틸실록산 ) (PDMS) 및유리슬라이드와같은실험에서이용된모든기질은세정제로세정한다음, 탈이온수및메탄올로수회세척하였다. 폴리머필름을형성하기전에, 모든기질을 O 2 플라즈마로 1분동안처리하여표면을세정하고 -OH 그룹을형성시켰다. [0072] 측정 1 H NMR (300 MHz) 스펙트럼을 JEOL JNM-LA300WB FT-NMR (Tokyo, Japan) 로기록하였다. Waters 1515 시리즈 [0073] 등용매펌프, 0.4 ml/min 의유속으로 100 μl주입루프를가지는 Rheodyne 모델 7725 주입기를이용하여, 유기 상젤투과크로마토그래피 (GPC) 를실시하였다. 단일막필름의두께는 Gaertner L116A ellipsometer (Gaertner Scientific Corporation, IL) 를이용하여 70 o 입사각으로측정하였다. 모든필름에대하여 1.46의굴절률을이용하였고, 3-상모델을이용하여두께를계산하였다. 비데오카메라및모니터가장착된 phoenix300, 접촉각 & 표면장력분석기 (Surface electro optics, Kyonggi, Korea) 를이용하여접촉을측정하였다. X-선광전자스펙트로스코피 (XPS) 스펙트럼은, 모노크로마틴화된 Al K X-선소스가있는 Kratos AXIS Ultra Imaging X-선광전자스펙트로미터를이용하여얻었다. [0074] [0075] 폴리 (TMSMA-r-PEGMA-r-NAS) 의합성중합반응전, 니트 PEGMA를억제제제거컬럼 (Aldrich Chemical Co.) 에통과시켰다. PEGMA (1.425 g, 3 mmol, 1 equiv) 및 TMSMA (0.744 g, 3 mmol, 1 equiv), NAS (0.507 g, 3 mmol, 1 equiv), 및 AIBN (16.5 mg, 0.1 mmol, 0.01 equiv) 바이알에넣고, 테트라하이드로퓨란 ( 무수, 억제제결여, 99.9%, 10 ml) 에녹였다. Ar 가스스트림을이용하여 20분동안상기혼합물로부터탈가스화시킨다음, 테프론-라이닝스크루-캡으로바이알을봉입하였다. 중합반응은 70 에서 24시간동안실시하였다. 진공하에서용매를증발시킨다음, 중합체를접착성액체상태로얻었다. 생반응성그룹의상이한몰비 (NAS: 33%, 20%, 및 10%) 를갖는공중합체가제조되었다. 3가지모노머의초기피딩비율은, 폴리 1, 폴리 2 및폴리 3에대하여각각 1:1:1, 2:2:1 및 4:5:1 이었다. 최종공중합체에들어가있는 3가지중합체의실질적인비율을계산하기위하여, 1 H NMR 스펙트럼에서 δ = 4.13 (CO 2 -CH 2 at PEGMA) 에서의피크의통합수치, δ = 3.92 (CO2-CH 2 at TMSMA) 에서의피크의통합수치를 δ = 2.82 (CO-CH 2 -CH 2 -CO at NAS) 에서피크의통합수치와비교하였다. 폴리 1의 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ = 4.13 (br, 2H, CO 2 -CH 2 of PEGMA), 3.92 (br, 2H, CO 2 -CH 2 of TMSMA), 3.66 (s, 30H), 3.63-3.55 (s, 9H; m, 2H), 3.40 (s, 3H), 2.82 (br, 4H, CO-CH 2 CH2-CO of NAS) 2.0-1.71 (br, 6H), 1.04 (br, 2H), 0.87 (br, 4H), 0.66 (br, 2H). 폴리 1 (Mn = 15784 with Mw/Mn = 1.58), 폴리 2 (Mn = 17245 with Mw/Mn = 1.71), 폴리 3 (Mn = 16571 with Mw/Mn = 1.67). [0076] [0077] 양극성 (amphipathic) 중합체의합성 앵커링위치에도데실메타크릴레이트를이용하여폴리 -4 를합성하였다. 도데실메타크릴레이트 (4 mmol, - 13 -
1.016 g, 2 equiv), PEGMA (4 mmol, 1.9 g, 2 equiv) 및메타크릴산 (2 mmol, 0.172 g, 1 equiv) 을 THF ( 무수, 99.9%, 억제제-결여 ) 에용해하였다. 혼합물을 N 2 로 15분동안버블링하여탈기체화하였다. 0.1 mmol AIBN (16.4 mg, 0.05 equiv) 을라디칼개시제로첨가한다음, 바이알을테프론-라이닝스크루-캡으로봉입하였다. 중합반응은 70 에서 24시간동안실시하였다. 최종산물은 4 에서보관하였다. 플루오로모노머및벤질메타크릴레이트를이용하여앵커리지위치에서도데실메타크릴레이트를치환하여폴리 5 및폴리 6을제조하였다. 폴리-4 (Mn = 19581 with Mw/Mn = 1.88), 폴리-5 (Mn = 21831 with Mw/Mn = 1.97), 폴리-6 (Mn = 16255 with Mw/Mn = 1.91). 1 H NMR (300.40 MHz, CDCL 3 ): poly-4 δ = 4.05 (br, 2H, CO2-CH2 of PEGMA), 3.82 (br, 2H, CO 2 -CH 2 of dodecylma), 3.66 (s, 30H), 3.40 (s, 3H), 2.0-1.71 (br, 10H), 1.5-1.1 (br, 20H), 0.87 (br, 3H); poly-6 δ = 7.30 (s, 5H), 4.93 (br, 2H, CO 2 -CH 2 of benzylma), 4.05 (br, 2H, CO 2 -CH 2 of PEGMA), 3.66 (s, 30H), 3.40 (s, 3H), 2.0-1.71 (br, 10H), 0.87 (br, 3H), 0.72 (br, 4H). [0078] [0079] 양극성 (amphipathic) 중합체를이용한폴리스틸렌계플라스틱표면의변형 THF를진공펌프를이용하여증발시켰다. 증발후, 점성액상의중합체를얻었다. 폴리 4-6 중합체는물에잘용해되는데, 그이유는다수의 PEG기가존재하기때문이다. 폴리스틸렌기질을양극성중합체 (20 mg/ml) 의수용액에주위온도에서함침시키고, 순수한물로세척하여폴리스틸렌계기질상에양극성중합체의 psams를형성시켰다. [0080] [0081] 중합체코팅된플라스틱표면의항-바이오파울링효과플라스틱표면상에단백질의비특이적결합은소수성상호작용에의해주로발생한다. 중합체 ( 폴리-4, 폴리- 6) 코팅의단백질-저항성을평가하기위하여, 중합체코팅된플라스틱표면을우혈청알부민 (BSA) 용액 (0.25 mg/ml in PBS, ph 7.4) 에 2시간동안함침시켰다. 플라스틱표면상에단백질의비특이적흡착정도는고해상 N (1s) XPS 스펙트럼으로분석하였다. [0082] [0083] EDC/NHS를이용한중합체코팅표면의활성화생체분자의특이적고정화를위하여, 중합체코팅플라스틱표면을활성화시켰다. 폴리 4-6의카르복실산그룹을 EDC/NHS를이용하여 NHS 에스테르기로전환시켰다. 증류수내의 EDC (0.4 M) 및 NHS (0.1 M) 의 1:1 혼합물을 20분동안적용시켜중합체코팅된플라스틱표면 COOH 그룹을활성화시켰다. [0084] [0085] 생물학적리간드의마이크로접촉프린팅 (Microcontact printing: μcp) 잉킹후, 아민 - 말단바이오틴리간드 ( 바이오틴 -NH 2, 10mM in 에탄올 ) 를, PSAMS 상에 PDMS 스탬프를접촉시켜 60 초동안프린팅하였다. 이어, 시료를보레이트완충액 (ph 9.0) 에즉시 2시간동안함침시켰다. 바이오틴의패턴생성후, 시료를인산완충염수 (PBS, ph 7.4) 내의테트라메틸로다민이소티오시아네이트 (TRITC)-결합스트렙타비딘용액 (0.1 mg/ml) 에실온에서함침시켰다. 60분후, 시료를제거하고 PBS 및증류수로수회세척하였다. 폴리 1-3의경우, 40, 100, 200(1.4 NA) 오일오브젝티브및 TRITC-최적화필터세트 (Omega Optical Inc, Brattleboro, VT, U.S.A.) 가장착된 Leica DMRBE 현미경 (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany) 을이용하여스트렙타비딘의패턴 (λ ex = 488 nm, λ em = 520 nm) 을가시화하였다. MetaMorph 이미징소프트웨어 (Universal Imaging Co, Downingtown, PA, U.S.A.) 에의해작동되는 CoolSNAPfx CCD 카메라를이용하여이미지를얻었다. 폴리 4-6의경우, 200x, 400x 오브젝티브및 TRITC-최적화필터세트 (Omega Optical Inc, Brattleboro, VT, U.S.A.) 가장착된 Leica DMRBE 현미경 (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany) 을이용하여스트렙타비딘의패턴 (λ ex = 547 nm, λ em = 572 nm) 을가시화하였다. [0086] 양친성중합체에의한변형플라스틱표면의 ELISA 응용 - 14 -
[0087] 96 웰플랫-저부분석플레이트를이용하여양친성중합체의표면코팅을실시하였다. 물내의양친성중합체 100 μl (20 mg/ml) 를각각의웰에첨가하고 1시간동안주위온도에서방치하였다. 이어, 탈이온수 150 μl로 웰을 4회세척하였으며, 각각의세척사이에 30초동안담그는과정을실시하였다. 반응성부위의 -COOH 기를 활성화시키기위하여, 100 μl EDC (400 mm) 및 NHS (100 mm) 를각각의웰에첨가하고 27 2시간동안방치한 다음, 4회세척하였다. 아민-말단바이오틴리간드 ( 바이오틴-NH 2, 10 mg/ml in 에탄올 ) 100 μl를각각의웰에 첨가하고 1시간동안 27 에서반응시키고 150 μl에탄올로 3회세척하였으며, 각각의세척사이에 30초동안담그는과정을실시하였다. 보레이트완충액 (ph 9.0) 150 μl를각각의웰에즉시첨가한다음 27 에서 2시간동안방치하였다. 보레이트완충액을제거한다음, PBS 내의스트렙타비딘 100 μl (10 μg /ml) 을각각의웰에첨가하고 27 에서 1시간동안반응시킨다음, 150 μl PBS로 3회세척하였다. 100 μl바이오틴-결합마우스항-토끼 IgG 단일클론항체를다른농도로각각의웰에첨가하고 27 에서 1시간동안반응시킨다음 Immuno Washers (Nunc A/S, Roskilde, Denmark) 를이용하여 150 μl PBST (0.1% Tween 20) 로 3회세척하였다. HRP 결합항-마우스 IgG 항체 (1 μg /ml) 100 μl를각각의웰에첨가하고 27 에서 1시간동안반응시킨다음 3회세척하였다. 최종적으로, 기질용액 (TMB) 100 μl를각각의웰에첨가한다음, 30분후 1 M HCl 100 μl를첨가하여효소반응을정지시켰다. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 리더를이용하여 450 nm에서의흡광값으로부터세기를계산하였다. [0088] [0089] 중합체코팅된표면상에단백질 A에의한항체고정화양친성중합체의수용액 (20 mg/ml) 에기질을주위온도에서함침시킨다음물로세척하여양친성중합체코팅된플라스틱표면을준비하였다. 중합체코팅된플라스틱표면을 EDC/NHS 시약으로활성화시켰다. 증류수내의 EDC (400 mm) 와 NHS (100 mm) 의 1:1 혼합물을 20분동안적용시켜중합체코팅된플라스틱표면의 -COOH 기를활성화시켰다. 이어, μcp를실시하여단백질 A를고정화하였다. PDMS 스탬프를중합체코팅플라스틱표면에 1시간동안접촉시켜단백질 A (100 μg /ml in PBS) 를프린팅하였다. 이어, 시료를즉시보레이트완충액 (ph 9.0) 에서 2시간동안함침시켰다. 단백질 A의패턴을생성시킨다음, 시료를실온에서 1시간동안항-BSA 용액 (10 μg /ml in PBS) 에첨가하였다. PBS로세척한다음, 시료코팅된플라스틱표면에 FITC-표지 BSA (50 μg /ml in PBS) 를최종적으로첨가하였다. 1시간후, 시료를 PBS로여러번세척하였다. 200x, 400x 오브젝티브및 TRITC-최적화필터세트 (Omega Optical Inc, Brattleboro, VT, U.S.A.) 가장착된 Leica DMRBE 현미경 (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany) 을이용하여 BSA의패턴 (λ ex = 494 nm, λ em = 521 nm) 을가시화하였다. [0090] [0091] 실험결과 실험에이용된트리플작용기성공중합체의화학적구조는하기반응식 1 에기재되어있다 : 반응식 1 [0092] [0093] 폴리 (TMSMA-r-PEGMA-r-NAS) 로명명된공중합체는라디칼중합반응에의해 3가지단량체로부터합성되었다 : 표면-앵커부위로서의 ( 트리메톡시실릴 ) 프로필메타크릴레이트 (TMSMA); 단백질-저항성부위로서의폴리에틸렌글리콜메타크릴레이트 (PEGMA); 및생반응성부위로서의 N-아크릴로일석시나마이드 (NAS). 생반응성및항바이오 - 15 -
파울링작용기성의표면밀도는, 중합합성반응에서각각의단량체의초기피딩비율을간단하게변화시켜조 절할수있기때문에, 본발명자들은반응식 1 에기재된바와같이 3 가지상이한 NAS 농도를가지고일련의랜 덤공중합들을합성하였다 : 폴리 1 = 1: 1: 1, 폴리 2= 2: 2: 1 및폴리 3 = 4: 5: 1. 1 H NMR 스펙트럼에서의통합수치 ( 도 2) 에기초하여얻은각각의공중합체에서의실질적 NAS 양은폴리 1, 폴리 [0094] 2 및폴리 3 에대하여각각 35%, 21% 및 12% 로분석되었다. 공중합체의조성은초기피딩비율과잘일치되었 다. 합성된 3 가지공중합체의분자량은 15,000-17,000 이며, 약 1.6 의다분산성을나타내었으며, 이는단분산 성폴리스틸렌표준물질에대한상대적인값으로서젤투과크로마토그래피 (GPC) 로측정된것이다. [0095] 상기공중합체의용액 (10 mg/ml in 메틸렌클로라이드 ) 에 Si/SiO 2 웨이퍼를주위온도에서 1 시간동안함침시 키고용매로세척하여, 중합체성자가-조립단일막 (polymeric self-assembled monolayers : psams) 를제조하였다. 이어, psams를 110 에서 5분동안큐어링하여탈수시킴으로써공중합체의실란기와산소플라즈마처리후에형성된기질의하이드록실기사이에공유결합을추가적으로형성시켰다 10. [0096] Si/SiO 2 표면상에형성된자가 - 조립구조및생체분자의특이적고정화는도 1 에나타나있다. 폴리 1-3 에 의해형성된 psams 의두께및소수성을각각엘립소메트리 (ellipsometry) 및접촉각측정으로분석하였다 ( 표 1). [0097] 표 1 엘립소메트리및접촉각과표면장력분석기로측정된 Si/SiO 2 웨이퍼상에구축된자가 - 조립중합체성단일막의 두께및정적수접촉각 분석항목 폴리 1 폴리 2 폴리 3 두께 (A ) 9.9 ± 0.1 10.4 ± 0.1 10.7 ± 0.1 정적 CA( ) 35.6 ± 0.4 35.3 ± 0.3 33.7 ± 0.5 [0098] [0099] NAS 부위가없는공중합체의 psams에대하여종래에발표 10 된것과유사하게, 공중합체의단일초박막이표면전체에걸쳐생성되었으며, 두께는약 1 nm 정도이었고, 이는엘립소메트리로측정되었다. 이와같은결과는, 박막이중합체성단일막 ( 중합체성다층막이아님 ) 으로존재한다는것을의미한다. psams의젖음성 (wettability) 을주위온도에서정적수접촉각측정으로분석하였다. 공중합체에서의친수성 PEG가증가할수록접촉각이감소하였다. 중합체막의존재를 X-선광전자스펙트로스코피로추가적으로확인하였다 ( 도 3 및표 2). [0100] 표 2 Si/SiO 2 웨이퍼상의폴리 1 의 PSAMs 의 XPS 로측정된원소조성 기질 원소조성 (%) C1s N1s O1s Si2p 폴리 1의 PSAM 22.7 1.21 33.38 42.71 [0101] 이중기능성표면 ( 생반응성 / 생불활성 ) 으로서의 psams 의작동성을조사하기위하여, 소프트리소그래픽기술, 마 이크로접촉프린팅 (μcp) 12 을이용하여생체분자의마이크로패턴을제조하였다 ( 도 4). 우선, 50 x 50 μm원형패턴을가지는포지티브 PDMS 스탬프를이용하여폴리 1의 psams 상에아민-말단바이오틴잉크 ( 바이오틴-NH 2, 10 mm in 에탄올 ) 를접촉-프린팅하였다. 단백질의아민기는 psams의반응성 NAS에쉽게반응하기때문에, 스탬프를제거한이후의바이오틴-패턴화 psams를보레이트완충액 (ph 8.5) 에 1시간동안함침시켜표면상의비반응성 NAS를가수분해시킨다음, 이어 TRITC-표지스트렙타비딘용액 (0.1 mg/ml PBS 완충액, ph 7.4) 과반응시켰다. 도 4는 TRITC-표지스트렙타비딘의패턴에대한형광이미지이다. 기대한대로, 스트렙타비딘은바이오틴-작용기성부위에만결합하였으며, 이결과는스트렙타비딘과바이오틴사이의특이적상호작용을보여주는것이다. 흥미롭게도, 바이오틴없이단지가수분해된중합체막이존재하는부위에서는스트렙타비딘의비 - 16 -
특이적흡착이검출되지않았으며, 이는시그널 - 대 - 노이즈의높은콘트라스트를초래한다. [0102] [0103] 보다작은 PDMS 스탬프 ( 원형패턴을가지는 25 μm x 25 μm ) 를사용한경우, 비슷한결과를얻을수있었다. PEG의백프린팅 13 또는우혈청알부민 (BSA) 의프리코팅 14 이, 표면상에단백질의비특이적흡착을최소화하기위하여필요로하지만, 본발명의중합체시스템은공중합체에이미 PEG 그룹이있기때문에이러한추가적인공정이필요없다. psams의가수분해형태의단백질-저항성을조사하기위하여 15, BSA를모델혈장단백질로이용하여단백질흡착정도를평가하였다. Si/SiO 2 웨이퍼상의 psams의가수분해형태를 BSA 용액 (0.1 mg/ml in PBS 완충액, ph 7.4) 에 1 시간처리한다음, 세척하고공기 - 건조시켰다. 표 3 은 BSA 흡착전 / 후에엘립소메트리로측정된폴리 1-3 의 psams 의두께에대한데이터이다. [0104] 표 3 우혈청알부민흡착전및후의 Si/SiO 2 웨이퍼상의 psam 의대조군 ( 비변형 ) 및가수분해물의두께 항목 대조군 폴리 1 폴리 2 폴리 3 두께 (A ) ( 전 ) 얻을수없음 10.6 ± 0.6 11.5 ± 0.6 11.9 ± 0.6 (not available) 두께 (A ) ( 후 ) 44.7 ± 0.1 11.5 ± 0.1 11.6 ± 0.1 11.6 ± 0.1 [0105] BSA 흡착후의 psams 의두께는초기두께와거의동일하였다. 그러나, 대조군으로서의실리콘웨이퍼의두께 는상당하게증가하였다. X-선광전자스펙트로스포프에의해측정된 psams 및대조군 ( 비변형 Si/SiO 2 웨이퍼 ) 상의고해상능질소 (1s) 에대한분석결과에따르면, 대조군과비교하여 psams는 dir 3% 의 BSQ 흡착 (97% 저항성 ) 을나타내었다. 이결과는, NSA-가수분해된 psams가비특이적단백질흡착에대하여높은저항성을나타낸다는것을명확하게보여주는것이다. 상술한모든데이터에따르면, 특이적으로그리고비특이적흡착이거의없이목적의생체분자는폴리 (TMSMA-r-PEGMA-r-NAS) 의 psams 상에고정화될수있다는것을알수있다. [0106] 표면에고정화된생체분자들사이의스페이싱이타겟분자와의상호작용에영향을미치기때문에, 바이오칩의 최적화를위하여표면상에생반응성기의밀도를조절하는것은매우중요하다 16. 따라서, 생반응성기 (NAS) 의상이한몰비율을가지는일련의폴리 (TMSMA-r-PEGMA-r-NAS) 공중합체 [ 폴리 1(35%), 폴리 2(21%) 및폴리 3(12%)] 를이용하여스페이싱효과를조사하였다. 도 5는, 상술한마이크로접촉프린팅의방법과동일하게제조된 psam 상의 TRITC-표지스트렙타비딘의패턴에대한형광현미경사진이다. 스트렙타비딘은각각의 psam 에효과적으로고정화되어표면상의생반응성기의밀도에따라상이한형광세기를가지면서높은시그널-대- 노이즈비율을가지는마이크로패턴을제공하였다. 보다명확한비교를위하여, 각각의 psam의사진에있는원형부위의상대적시그널세기에대한데이터를얻었고, 이는표 4에정리되어있다. 표 4 [0107] 항목 폴리 1 폴리 2 폴리 3 평균형광세기 231.77 ± 15.04 156.67 ± 45.82 99.01 ± 57 [0108] 35% 의 NAS 함량을가지는폴리 1은 232± 15 a.u의형광세기를나타내었고, 폴리 2 및폴리 3는각각 157 ± 46 및 99 ± 57로서보다낮은세기를나타내었다. 중합체의 psams 상에 NAS 함량이증가할수록, 고정화된스트렙타비딘이점진적으로증가하였다. 이결과는, 각각의단량체의초기피딩비율을변화시켜생반응성부위의간단한밀도조절을할수있는본발명공중합체시스템의또다른장점을보여주는것이며, 이는바이오칩의최적화에서유용하다. [0109] [0110] 한편, 합성된본발명의양극성중합체의화학구조는다음과같다 : 양극성중합체의화학구조 - 17 -
[0111] [0112] [0113] 각각의중합체는 2:2:2의몰피딩비율로하여해당되는 3가지단량체로부터라디칼중합반응으로합성하였다. 폴리-4에서는도데실, 폴리-5에서는플루오로알킬및폴리-6에서는벤질이플라스틱표면에대한앵커링그룹으로선택되었으며, 폴리-4는소수성상호작용, 폴리-6는소수성상호작용과다이폴상호작용, 그리고폴리-6은 π-π 스태킹상호작용에의해폴리스틸렌플라스틱표면에앵커링된다. 모든 3가지중합체는물에대하여용해도가우수하였고, 이는 PEG 그룹에의한것으로판단된다. 플라스틱표면의젖음성 (wettability) 을측정하기위하여실온에서정적물접촉각분석기로폴리-4 및폴리- 6이코팅된플라스틱표면을분석하였다 ( 표 5). 표 5 [0114] 분석항목 대조군 폴리 4 폴리 6 정적 CA( ) 130 ± 7 74 ± 1 79 ± 2 [0115] [0116] [0117] 양친성중합체로 1시간동안코팅함으로써폴리-4 및폴리-6의물접촉각은 130±7 로부터 74±1 및 79±2 로상당히감소하였다. 접촉각의상당한감소는, 공중합체내의친수성 PEG가증감함에따라플라스틱표면이보다친수성으로변화되었음을나타내는것이다. 중합체코팅된플라스틱표면이기능성표면으로이용될수있는지를평가하기위하여, 마이크로-접촉프린팅방식으로생분자의마이크로패턴을제조하였다. 도 7은 TRITC-표지스트렙타비딘의패턴에대한형광현미경이미지이다. 결과적으로, 스트렙타비딘은각각의중합체코팅플라스틱표면에효율적으로고정화되어높는시그널-to-노이즈비율로마이크로패턴을형성하였으며, 이경우각각의중합체의앵커링위치 ( 폴리-4 도데실기, 폴리-6 벤질기 ) 에따라다른형광세기를나타내었다. 폴리-4 및폴리-6을보다정확히비교하기위하여, 각각의중합체코팅된플라스틱표면의이미지에서원부위의상대적시그널세기를측정하였다 ( 표 6). 표 6 [0118] 중합체 폴리 4 폴리 6 형광세기 149.9 ± 24.4 179.7 ± 34.3 [0119] [0120] 도데실기를갖는폴리-4의경우 149.9 ± 24.4 a.u. 의형광세기를나타내었고, 폴리-6은 179.7 ± 34.4 a.u. 의형광세기를나타내었다. 폴리-4는앵커링위치로서알킬체인을가지고있어소수성상호작용과반데르발스상호작용을통하여플라스틱표면에결합된다. 한편, 폴리-6은벤질기의방향족고리를가지고있어, 소수성상호작용과반데르발스상호작용뿐만아니라 π-π 스태킹상호작용을통하여플라스틱표면에강하게결합한다. 바이오틴이없고가수분해된중합체표면만있는부위에서백그라운드시그널이거의관찰되지않았으며, 이는높은시그널-to-노이즈비율을초래한다. 종래기술에따르면, PEG의백프린팅또는우혈청알부민 (BSA) 의프리코팅단계는, 표면상에단백질의비특이적흡착을최소화시키기위하여필수적으로실시한다. 그러나, 본발명의중합체표면은이러한단계를필요로하지않는다. 폴리 4-6에대하여항바이오파울링을분석하였다. 폴리 4-6이코팅된폴리스틸렌기질을 BSA 용액 (0.25 mg/ml in PBS, ph 7.4) 에 2시간함침시켰다. psams 상에비특이적단백질흡착의정도를고해상능 N(1s) XPS 스펙트럼으로부터얻었다 ( 도 6). 도 6에서볼수있듯이, 본발명의중합체가코팅된폴리스틸렌기질에대하 - 18 -
여대조군과비교하여약 1% 의 BSA 흡착정도 ( 즉, 99% 저항성 ) 를나타내었다. [0121] [0122] 이어, 본발명의중합체를이용하여 96-웰플레이트를표면처리하고, ELISA를실시하였다 ( 도 8a). 본발명의중합체가코팅된스트렙타비딘플레이트와구입한시중의스트렙타비딘플레이트를비교하였다. 구입한스트렙타비딘플레이트의경우에는블록킹완충액인밀크단백질용액 100 μl를 2시간동안처리하였다. 그러나, 본발명의중합체가코팅된스트렙타비딘플레이트는이러한과정이필요없었으며, 이는 PEG기가단백질의비특이적결합을차단시키기때문이다. 도 8b는바이오틴-IgG의농도에따른흡광곡선을나타낸다. 중합체코팅된스트렙타비딘플레이트는동일농도에서종래의스트렙타비딘플레이트보다보다강한세기를나타내었다. 이러한결과는, 본발명의중합체가코팅된스트렙타비딘플레이트가동일농도에서종래의플레이트보다바이오틴-IgG를잘캡처링한다는것을보여주는것이다. 본발명의중합체시스템의경우블록킹완충액을처리하지않았음에도불구하고, 바이오틴-IgG의 0 ng/ml 농도에서대조군과유사한세기를나타내었으며, 이는 PEG 부분에의한것이다. 중합체코팅된플라스틱표면상의단백질 A를이용하여항체의고정화를실시하였다. 단백질 A는많은면역분석에서항체를고정화하는데이용된다. 단백질 A는항체의 Fc 부위에특이적으로결합하여항체의배향성을제공한다. 단백질 A-매개항체고정화는항체의변형을요구하지않는다. 따라서, 종래의공유결합또는물리적흡착과같은항체고정화방법와비교하여본발명은매우우수한항체검출방법을제공한다. 도 9a 는중합체코팅된플라스틱표면상의단백질 A를이용하여항-BSA 항체의고정화에대한모식도이고, 도 9b는 FITC-표지 BSA의형광현미경이미지이다. 예상한바와같이, FITC-표지 BSA는항-BSA 기능화부위에만침적되었고, 이는이들사이의특이적상호작용을나타낸다. 항-BSA 항체없이단지가수분해된중합체층만이존재하는부위에서는, BSA의비특이적흡착이관찰되지않았다는것은매우주목할만한결과이며, 이에의해높은시그널-to-노이즈비율이초래된다. 각각의중합체코팅된플라스틱표면의이미지에서원형이미지의상대적시그널세기를측정하였다. 도데실기를갖는폴리-4는 98.7 ± 15 a.u. 의형광세기를나타내었고, 폴리-6은 42.6 ± 6.9 a.u. 의형광세기를나타내었다. 따라서본발명의중합체시스템은플라스틱표면에단백질 A를이용한항체고정화의배양성에매우유리하며, 이는단백질칩개발에이용될수있다. [0123] 결론적으로, 본발명은신규한 PEG 공중합체를이용하여중합체성자가 - 조립단일막 (psams) 을형성시킴으로써, SiO 2 - 계및플라스틱기질상에이중기능성표면 ( 생반응성및생불활성 ) 을쉽게제조할수있다는것을보여준 다. 생체분자는높은특이성으로 psams상에효과적으로고정화될뿐만아니라, 최소화된비특이적흡착을나타낸다. 또한, 중합체합성에서초기피딩비율을간단하게조절함으로써, 생반응성및항바이오파울링작용기성의밀도를조절할수있다. 종합적으로, 본발명의이중기능성 psams 플랫폼은바이오센서및바이오칩분야에서우수한응용성을갖는다. [0124] 이상으로본발명의특정한부분을상세히기술하였는바, 당업계의통상의지식을가진자에게있어서이러한 구체적인기술은단지바람직한구현예일뿐이며, 이에본발명의범위가제한되는것이아닌점은명백하다. 따라서, 본발명의실질적인범위는첨부된청구항과그의등가물에의하여정의된다고할것이다. [0125] [0126] [0127] [0128] 참조문헌 (1) Leonard, E. F.; Turitto, V. T.; Vroman, L. Blood in Contact with Natural and Artificial Surfaces; New York Academy of Sciences: New York, 1987; Vol. 516. (1) (a) Niemeyer, C. M.; Blohm, D. Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 2865. (b) Pirrung, M. C. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 1276. (c) Templin, M. F.; Stoll, D.; Schrenk, M.; Traub, P. C.; Vohringer, C. F.; Joos, T. O. Trends Biotechnol. 2002, 20, 160. (d) Zhu, H.; Snyder, M. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 40. (e) Mitchell, P. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 225. (2) (a) Khademhosseini, A.; Yeh, J.; Eng, G.; Karp, J.; Kaji, H.; Borenstein, J.; Farokhzad, D. C.; Langer, R. Lab Chip. 2005, 12, 1380. (b) Peterbauer, T.; Heitz, J.; Olbrich, M.; Hering, S. Lab Chip., 2006, 6, 857. - 19 -
[0129] [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] (3) (a) Mann, M.; Wilm, M. S. Anal. Chem., 1994, 66, 4390. (b) Yates, J. R.; Speicher, S.; Griffin, P. R.; Hunkapiller, T. Anal. Biochem., 1993, 214, 397. (c) MacBeath, G.; Schreiber, S. L. Science, 2000, 289, 1760. (d) Schweitzer, B.; Roberts, S.; Grimwade, B.; Shao, W.; Velleca, M.; Kingsmore, S. F. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 359. (4) (a) Houseman, B. T.; Huh, J. H.; Kron, S. J.; Mrksich, M. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 270. (b) Funeriu, D. P.; Eppinger, J.; Denizot, L.; Miyake, M.; Miyake, J. Nat Biotechnol. 2005, 23, 622. (c) Kingsmore, S. F. Nat. Rev. Drug Discov. 2006, 5, 310. (5) (a) Sieber, S. A.; Cravatt, B. F. Chem. Commun. 2006, 14, 2311. (b) Zhu, H.; Hu, S.; Jona, G.; Zhu, X.; Kreiswirth, N.; Willey, B. M.; Mazzulli, T.; Liu, G.; Song, Q.; Chen, P.; Cameron, M.; Tyler, A.; Wang, J. Wen,J.; Chen, W.; Compton, S.; Snyder, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2006, 103, 4011. (c) Chen, C. S.; Zhu, H. Biotechniques. 2006, 40, 423. (6) (a) Sauer, U.; Preininger, C.; Krumpel, G.; Stelzer, N.; Kern, W. Sens Actuators B Chem. 2005, 107, 178. (b) Schweitzer, B.; Kingsmore, S. F. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 14. (c) Sun, J.; Zhang, H.; Tian, R.; Ma, D.; Bao, X.; Su, D. S.; Hanfa, Z. Chem. Commun. 2006, 12, 1322. (7) (a) Lorenz, C. D. Chandross, M. Grest, G. S. Stevens, M. J. Webb, E. B. Langmuir 2005, 21, 11744. (b) Killampalli, A. S. Ma, P. F.; Engstrom, J. R. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6300. (8) (a) Sun, F.; Castner, D. G.; Mao, G.; Wang, W.; Mckeown, P.; Grainger, D. W. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 1856. (b) Xia, N.; HuD, Y.; Grainger, W.; Castner, D. G. Langmuir, 2002, 18, 3255. (c) Bearinger, J. P.; Terrettaz, S.; Michel, R.; Tirelli, N.; Vogel, H.; Textor, M.; Hubbell, J. A. Nat. Mater. 2003, 2, 259. (9) (a) Srinivasan, U.; Houston, N. R.; Howe, T. R.; Maboudian, R. J Microelectromech. Syst. 1998, 7, 252. (b) Cave, N. G.; Kinlock, A. J. Polymer, 1992, 33, 162. (c) Dishner, M. H.; Feher, F. J.; Hemminger, J. C. J. Am. Chem. Soc. 1996, 7, 1971. (10) (a) Jon, S.; Seong, J.; Khademhosseini, A.; Tran, T. T.; Laibinis, P. E.; Langer, R. Langmuir, 2003, 19, 9989. (b) Park, S.; Chi, Y. S.; Choi, I. S.; Seong, J.; Jon, S. J. Nanosci. Nanotechnol. 2006, 6, 1. (11) Lee, B. S.; Park, S.; Lee, K.-B.; Jon, S.; Choi, I. S. XXX submitted. (12) (a) Duffy, D. C.; Mcdonald, J. C.; Schueller, O. J. A.; Whitesides, G. M. Anal. Chem. 1998, 70, 2974. (b) Kane, R. S.; Takayama, S.; Ostuni, E.; Ingber, D. E.; Whitesides, G. M. Biomaterials 1999, 20, 2363; K.B. Lee, D.J. Kim, Z. Lee and I.S. Choi, Langmuir 2004, 20, 2531. (c) Park, T. J.; Lee, K. B.; Lee, S. J.; Lee, Z.; Lee, S. Y.; Choi, I. S. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10512. (13) Whitesides, G. M.; Ostuni, E.; Takayama, S.; Jiang, X.; Ingber, D. E. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2001, 3, 335. (b) Zhu, X. Y.; Jun, Y.; Starrup, D. R.; Major, R. C.; Danielson, S.; Boiadjiev, V.; Gladfelter, W. L.; Bunker, B. C.; Guo, A. Langmuir 2001, 17, 7798. (14) (a) Sethuraman, A.; Han, M.; Kane, R. S.; Belfort, G. Langmuir 2004, 20, 7779. (b) Kim, N.; Lee, S.; Kim, K. Chem. Commun. 2003, 6, 724. (15) (a) Rundqvist, J.; Hoh, J. H.; Haviland, D. B. Langmuir 2005, 21, 2981. (b) Wirth, M.J.; Fairbank, R. W.; Fatunmbi, H. O. Science 1997, 275, 44. (b) Zhou, C.; Khlestkin, V. K.; Braeken, D. Keersmaecker, D.; Laurevn, W.; Engelborghs, Y.; Borghs, G. Langmuir 2005, 21, 5988. (16) (a) Eppinger, J.; Funeriu, D. P.; Miyake, M.; Denizot, L.; Miyake, J. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 3806. (b) Kodadek, T. Chem. Biol. 2001, 8, 105. (c) Zhu, H.; Bilgin, M.; Bangham, R.; Hall, D.; Casamayor, A.; Bertone, P.; Lan, N.; Jansen, R.; Bidlingmaier, S.; Houfek, T. Mitchell, T.; Miller, P.; Dean, R. A.; Gerstein, M.; Snyder, M. Science 2001, 293, 2101. 도면의간단한설명 - 20 -
[0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] 도 1은항바이오파울링특성을갖는본발명의자가-조립중합체단일막 (PSAM) 상에생체분자를특이적으로고정화하는것을보여주는도면이다. 도 2는본발명의폴리 1, 폴리 2 및폴리 3에대한 1 H NMR 스펙트럼이다. 도 3은 Si/SiO 2 웨이퍼상에형성된폴리 1의 PSAM에대한고해상능 C(1s) X-선광전자스펙트럼이다. 도 4는 (a) 50 x 50 μm및 (b) 25 x 25 μm원형패턴화스탬프를이용하여폴리 1의 PSAMs 상에바이오틴- EO-아민의마이크로접촉프린팅을하여제조된 TRITC-표지스트렙타비딘패턴에대한형광현미경사진이다. 도 5는 50 x 50 μm원형패턴화스탬프를이용하여제조된폴리 1-3의 PSAMs 상에형성된 TRITC-표지스트렙타비딘패턴에대한형광현미경사진이다도 6은폴리스틸렌기질상에형성된폴리 4-6의 PSAM에대한고해상능 N(1s) X-선광전자스펙트럼이다. 도 7은 50 x 50 μm원형패턴화스탬프를이용하여중합체코팅된플라스틱표면상에바이오틴-아민의마이크로접촉프린팅에의해형성된 TRITC-표지스트렙타비딘패턴에대한형광현미경이미지이다. 도 8a는바이오틴-결합마우스항-토끼 IgG를검출하기위하여이용되는본발명의중합체에의하여스트렙타비딘코팅된 96 웰플레이트에대한모식도이다. [0151] 도 8b 는흡착캡처링된바이오틴화마우스 IgG 의 EILSA 검출결과이다. HRP 결합항 - 마우스 IgG 로검출하였다. 고정화된바이오틴화마우스 IgG 를 [0152] [0153] 도 9a 는중합체코팅된플라스틱표면상에단백질 A 를이용한항 -BSA 항체의배향에대한모식도이다. 도 9b 는 50 x 50 μm원형패턴화스탬프를이용하여중합체코팅된플라스틱표면상에단백질 A 의마이크로접 촉프린팅및항 -BSA 항체의첨가에의해형성된 FITC- 표지 BSA 패턴에대한형광현미경이미지이다. 도면 도면 1-21 -
도면 2 도면 3-22 -
도면 4 도면 5 도면 6-23 -
도면 7 도면 8a - 24 -
도면 8b 도면 9a - 25 -
도면 9b - 26 -