(72) 발명자 베노이트, 디디어지. 미국 캘리포니아새너제이왈넛블로섬드라이브 5595 #20 크리즈베, 래인에이. 미국 캘리포니아레드우드시티뉴캐슬드라이브 392 토, 웨인 미국 캘리포니아프레몬트린포드테라스 6189 자디크, 린다제이. 미

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C08F 20/10 ( ) C08F 30/02 ( ) C08F 26/06 ( ) A61K 8/81 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2011 년 04 월 15 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2012 년 11 월 14 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2011/ (87) 국제공개번호 WO 2011/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2011 년 10 월 20 일 61/324, 년 04 월 15 일미국 (US) 전체청구항수 : 총 29 항 (54) 발명의명칭고분자량쌍성이온 - 함유중합체 (11) 공개번호 (43) 공개일자 2013년09월03일 (71) 출원인 올리가시스 미국캘리포니아팔로알토웨스트베이쇼어로드 3350 슈트 150 ( 우 : 94303) (72) 발명자 찰스, 스티븐에이. 미국 캘리포니아새너제이트레스틀우드레인 1257 펄로트, 빅토르디. 미국 캘리포니아팔로알토코넬스트리트 2345 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인남앤드남 (57) 요약 본발명은친수성기및하나이상의기능성작용제를함유하는멀티 - 아암고 MW 중합체, 및이러한중합체를제조하는방법을제공한다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자 베노이트, 디디어지. 미국 캘리포니아새너제이왈넛블로섬드라이브 5595 #20 크리즈베, 래인에이. 미국 캘리포니아레드우드시티뉴캐슬드라이브 392 토, 웨인 미국 캘리포니아프레몬트린포드테라스 6189 자디크, 린다제이. 미국 캘리포니아팔로알토세인트프란시스드라이브 2385 프라트, 잔느엠. 미국 캘리포니아레드우드시티허드슨스트리트

3 특허청구의범위청구항 1 각각독립적으로아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈및비닐-에스테르로이루어진군으로부터선택되는다수의단량체를각각포함하는 2 이상의중합체아암 ; 중합체아암의근위말단에연결된개시제단편 ; 및중합체아암의원위말단에연결된말단기를포함하는중합체로서, 각각의단량체는친수성기를포함하고, 개시제모이어티는라디칼중합에적합하고, 개시제단편및말단기중하나이상은기능성작용제또는연결기를포함하는중합체. 청구항 2 제 1 항에있어서, 각각의친수성기가쌍성이온기를포함하는중합체. 청구항 3 제 2 항에있어서, 각각의쌍성이온기가포스포릴콜린을포함하는중합체. 청구항 4 제 3 항에있어서, 단량체가 2-( 아크릴로일옥시에틸 )-2'-( 트리메틸암모늄에틸 ) 포스페이트를포함하는중합체. 청구항 5 제 3 항에있어서, 단량체가 2-( 메타크릴로일옥시에틸 )-2'-( 트리메틸암모늄에틸 ) 포스페이트 (HEMA-PC) 를포함하는중합체. 청구항 6 제 1 항에있어서, 개시제단편이 2 내지약 100개의중합체아암의근위말단에연결된중합체. 청구항 7 제 6 항에있어서, 중합체가약 2.0 미만의다분산성지수를갖는중합체. 청구항 8 제 6 항에있어서, 개시제단편이 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 또는 12개의중합체아암의근위말단에연결된중합체. 청구항 9 각각독립적으로아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈및비닐-에스테르로이루어진군으로부터선택되는다수의단량체를각각포함하는 2 이상의중합체아암, 중합체아암의근위말단에연결된개시제단편, 및중합체아암의원위말단에연결된말단기를포함하는하나이상의중합체 ; 및개시제단편또는말단기에연결된, 생물활성작용제또는진단작용제를포함하는하나이상의기능성작용제를포함하는컨쥬게이트로서, 각각의단량체는친수성기를포함하고, 개시제모이어티는라디칼중합에적합한컨쥬게이트. 청구항 10 제 9 항에있어서, 생물활성작용제가약물, 항체, 항체단편, 단일영역항체, 아비머, 아드넥틴, 디아바디, 비타민, 보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드및핵산으로이루어진군으로부터선택되는컨쥬게이트. 청구항 11 제 9 항에있어서, 진단작용제가방사성표지, 조영제 (contrast agent), 형광단 (fluorophore) 및염료로이루어진군으로부터선택되는컨쥬게이트

4 청구항 12 제 9 항에있어서, 2 이상의중합체가작용제에연결된컨쥬게이트. 청구항 13 제 9 항에있어서, 2 이상의중합체가기능성작용제상의근위반응기를통해기능성작용제에연결되어슈도- 분지형구조를형성하는컨쥬게이트. 청구항 14 제 9 항에있어서, 컨쥬게이트가중합체에부착된 2 이상의기능성작용제를포함하는컨쥬게이트. 청구항 15 하기화학식의중합체 : 상기식에서, R 1 은 H, L 3 -A 1, LG 1 및 L 3 -LG 1 으로이루어진군으로부터선택되고 ; 각각의 M 1 및 M 2 는독립적으로아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈및비닐-에스테르로이루어진군으로부터선택되고 ; G 1 및 G 2 의각각은각각독립적으로친수성기이고 ; 각각의 I 및 I' 은독립적으로개시제단편으로, I-I' 의조합은라디칼중합을통해화학식 I의중합체의중합을위한, 개시제 I 1 이고 ; 대안적으로, 각각의 I' 은독립적으로 H, 할로겐및 C 1-6 알킬로이루어진군으로부터선택되고 ; L 1, L 2 및 L 3 의각각은독립적으로결합또는링커이고 ; 각각의 A 1 은기능성작용제이고 ; 각각의 LG 1 은연결기이고 ; 하첨자 x 및 y 1 은각각독립적으로 1 내지 1000 의정수이고 ; 각각의하첨자 z 는독립적으로 0 내지 10 의정수이고 ; 하첨자 s 는 2 내지 100 의정수이다

5 청구항 16 제 15 항에있어서, 중합체가하기화학식을갖는중합체 : 상기식에서, R 1 은 H, L 3 -A 1, LG 1 및 L 3 -LG 1 으로이루어진군으로부터선택되고 ; 각각의 M 1 및 M 2 는독립적으로아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈및비닐-에스테르로이루어진군으로부터선택되고 ; ZW 및 ZW 1 의각각은독립적으로쌍성이온성모이어티이고 ; 각각의 I 및 I' 은독립적으로개시제단편으로, I-I' 의조합은라디칼중합을통해화학식 I의중합체의중합을위한, 개시제 I 1 이고 ; 대안적으로, 각각의 I' 은독립적으로 H, 할로겐및 C 1-6 알킬로이루어진군으로부터선택되고 ; L 1, L 2 및 L 3 의각각은링커이고 ; 각각의 A 1 은기능성작용제이고 ; 각각의 LG 1 은연결기이고 ; 하첨자 x 및 y 1 은각각독립적으로 1 내지 1000의정수이고 ; 각각의하첨자 z 는독립적으로 0 내지 10의정수이고 ; 하첨자 s는 2 내지 100의정수이다. 청구항 17 제 15 항에있어서, 각각의친수성기가쌍성이온기를포함하는중합체. 청구항 18 제 15 항에있어서, 각각의친수성기가포스포릴콜린을포함하는중합체. 청구항 19 제 15 항에있어서, 하첨자 s가 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 또는 12인중합체. 청구항 20 제 15 항에있어서, 중합체가하기화학식을갖는중합체 :

6 청구항 21 제 15 항에있어서, 중합체가하기화학식을갖는중합체 : 상기식에서, R 2 는 H 및 C 1-6 알킬로이루어진군으로부터선택되고 ; PC 는포스포릴콜린이다. 청구항 22 제 15 항에있어서, 개시제 I 1 이하기화학식을갖는중합체 : 상기식에서, 각각의 I' 은독립적으로할로겐, -SCN 및 -NCS로이루어진군으로부터선택되고 ; L 4 및 L 5 는각각독립적으로결합또는링커로, L 4 및 L 5 중하나는링커이고 ; C는결합또는코어기이고 ; LG 2 는연결기이고 ; 하첨자 p는 1 내지 20이고, 여기서하첨자 p가 1일때, C는결합이고, 하첨자 p가 2 내지 20일때, C는코어기이다. 청구항 23 제 22 항에있어서, 개시제 I 1 의각각이하기화학식인중합체 : 상기식에서, 각각의 R 3 및 R 4 는독립적으로 H, CN 및 C 1-6 알킬로이루어진군으로부터선택된다. 청구항 24 제 22 항에있어서, 개시제 I 1 의각각이독립적으로하기로이루어진군으로부터선택되는중합체 : - 6 -

7 ,,,,,,,,,,,, - 7 -

8 , 및. 청구항 25 제 15 항에있어서, 하기로이루어진군으로부터선택되는화학식을갖는중합체 :,, - 8 -

9 ,, - 9 -

10 및 상기식에서, PC는포스포릴콜린이다. 청구항 26 제 25 항에있어서, R 1 은 L 3 -A 1, LG 1 및 L 3 -LG 1 으로이루어진군으로부터선택되고 ; A 1 은약물, 항체, 항체단편, 단일영역항체, 아비머, 아드넥틴, 디아바디, 비타민, 보조인자, 다당류, 탄수화 물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티 드, 핵산, 방사성표지, 조영제, 형광단및염료로이루어진군으로부터선택되고 ;

11 L 3 는 -(CH 2 CH 2 O) 이고 ; LG 1 은말레이미드, 아세탈, 비닐, 알릴, 알데히드, -C(O)O-C 1-6 알킬, 히드록시, 디올, 케탈, 아지드, 알킨, 카 르복실산및숙신이미드로이루어진군으로부터선택된다. 청구항 27 제 26 항에있어서, 각각의 LG 1 이독립적으로히드록시, 카르복시, 비닐, 비닐옥시, 알릴, 알릴옥시, 알데히드, 아지드, 에틴, 프로핀, 프로파르길, -C(O)O-C 1-6 알킬,,, 되는중합체.,,,, 및로이루어진군으로부터선택 청구항 28 제 15 항에있어서, 하기로이루어진군으로부터선택되는화학식을갖는중합체 :,,

12 ,,, 및. 청구항 29 각각독립적으로아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈및비닐-에스테르로이루어진군으로부터선택되는다수의단량체를독립적으로포함하는중합체아암 ; 중합체아암의근위말단에연결된개시제단편 ; 및중합체아암의원위말단에연결된말단기를포함하고, 광산란으로측정하여약 50kD 내지약 1,500kD의피크평균분자량을갖는중합체로서, 각각의단량체는친수성기를포함하고, 개시제모이어티는라디칼중합에적합하고, 개시제단편및말단기중하나이상은기능성작용제또는연결기를포함하는중합체. 명세서 [0001] [0002] [0003] [0004] 기술분야관련출원에대한상호참조 : 본출원은 2010년 4월 15일에출원된미국가출원번호 61/324,413에대해우선권을주장하며, 이는모든목적을위해그전부가본원에포함된다. 컴팩트디스크로제출한 " 서열목록 ", 표, 또는컴퓨터프로그램목록부록에대한참조 : 해당없음. [0005] 배경기술 현재 ' 의학적으로차별화된제품 ' 을다루고자전념을다하고있는대형제약회사들간에일종의군비경쟁이일 어나고있다. 바이오의약품이핵심수단으로보인다. 그신념은차별화가반드시타겟신규성을통해서만 나오는것이아니고신규한약물포맷에서도나올것이라는점이다. 이포맷들은생성되는약물이포맷중심 적이라기보다는생물학중심적일수있도록유연성이있을것이다. 바이오의약품의이러한차세대조류는모 듈식, 다기능성, 및타겟화된것일것이다. 이들약물은타겟화될더넓은질병생물학의이해및다면적약 물에대한지식의적용을향한관점으로설계될것이다. 항체는매우훌륭한약물이지만, 상당한양의항체 단백질공학에도불구하고이들은융통성이없고 (rigid) 유연성이없는 (inflexible) 포맷이며계속그럴 것이다

13 [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] 제약단백질엔지니어들은더작은단백질포맷에기대를걸고있다. 2006년이라는기간에아드넥틴 (Adnexus 가개발하고 BMS가매수함 ), 아비머 (Avidia가개발하고 Amgen이매수함 ), 디아바디 (Domantis가개발하고 GSK가매수함 ), 합토젠 (Wyeth가매수함 ), BiTES(Micromet가개발함 ), 카멜리드 (Ablynx가개발함 ), 펩티드 (Gryphon Therapeutics 및 Compugen 및기타다수에서개발함 ) 와같은진보의조류가있었다. 그러나이러한제약파이프라인내의다중제품으로의플랫폼기술의전환은구체화되기까지는속도가더디었다. 지난 20년간, 이러한비-전 (non-whole) 항체포맷을끊임없이따라다니는문제점들은차선적 (suboptimal) 친화성, 불량한안정성, 낮은제조수율뿐만아니라도구개발과도관련되었다. 이문제들은많은부분해결되었거나해결되고있다. 하지만이들포맷의아킬레스건은이들의부적절한생체내 (in vivo) 체류시간에남아있고, 이는중요한제품기회의조류를저지하고있다. 전항체는 250 시간이상의생체내배설 (elimination) 반감기를갖고, 이는몸에서 1 개월초과의신체체류 (physical residency) 에해당한다. 이점이이들을투여의관점에서훌륭한제품포맷이되게한다. 이들은종종한달간격또는덜빈번한주입 (injection) 을달성할수있다. 궤적 (trajectory) 은또한더적은양 (1mL, 0.8mL, 0.4mL) 으로, 더안정한액체제형 ( 의사의재구성이요구되는동결건조된 (lyophilized) 제형과대비됨 ) 으로, 더높은농도 (50mg/mL, 100mg/mL, 200mg/mL) 에서저장및더높은온도 (-80 도, -20 도, 2-8 도, 실온 ) 에서피하투여하는것이선호된다. 항체는특히광범위한항체발견및개발생태계에서의모든작용으로타의추종을불허한다. 하지만, 항체는 아쉬운점을많이남긴다. 이들은어색하고 (ungainly), 유연하지않고, 크고, 단일-타겟한정이고, 포유류계에서제조되고, 전반적으로불량하게특성화되고 (poorly characterized), 타겟결합, 상피 FcRn수용체재순환, 항체-의존성세포-매개세포독성 (ADCC), 보체의존성세포독성 (CDC), 결합활성 (avidity), 고차구성 (higher order architectures) 등을몇몇예로들수있는많은상이한생체내생명작용의중심이된다. 더작은모듈식포맷은더안전하고, 타겟화된, 다기능성, 고효능의, 잘특성화되고 (well-characterized) 더값싼치료법에대하여주요한공헌을할수있다. 게다가, 재조합단백질및펩티드 ( 네이티브이거나뮤테인 ) 및올리고뉴클레오티드와같은다른유형의약물작용제의혈청체류시간및연관된신체성질을개선하기위한유사한요구가있다. 어려운점은이러한가용성바이오의약품에대한생체내체류시간을급격히증가시키고 ( 수행문제 ), 약물용해성, 안정성, 점도, 특성가능성 (characterizability) 과같은다른핵심파라미터에서타협을강제하지않고그렇게할수있고 ( 관련된신체특성문제 ), 초기동물연구부터스케일-업제조및후기 -단계인간임상시험에이르기까지타겟클래스 (class) 및약물개발경로를통틀어예측가능성을부여하는접근법을이용하는 ( 포트폴리오계획문제 ) 기술적해법을고안하는것이다. 해법중첫번째시도된클래스는생물학-기반이고단백질작용제를트랜스페린, 알부민, 면역글로불린감마 (IgG), IgG 불변영역 (IgG-Fc) 및 / 또는기타혈청단백질에융합함에의존하는것이다. 하지만생물학-기반혈청확장모이어티 (moiety) 를기능성생물학적모이어티에융합하는것은동시발생하는생물학적상호작용의수및복잡성을증가시킨다. 이비-타겟-매개상호작용은약물의바람직한치료작용을거의촉진하지않고, 오히려복잡하고거의이해되지않은방식으로약물의목적하는치료작용을더빈번하게손상시킨다. 순 (net) 영향은예측가능성, 수행, 및안전성을약화시키는것이다. 해법중두번째시도된클래스는약물에부착되는상이한유형의중합체를이용하는일련의접근법에폭넓게기반한다. 이중합체들은대체로물을결합시키고조직하는능력을기반으로작용한다. 결합된물은무수한생체내제거 (clearance) 메커니즘에의한제거를수동적및능동적으로감소시키는한편, 또한용해성, 안정성, 점도와같은중합체-약물컨쥬게이트의물리적성질을개선시킨다. 이해법의두번째클래스는다음과같은두가지방식으로더하위분류된다 : (1) 중합체내물결합실체 (entity) 에의해, 및 (2) 중합체가약 물작용제에부착되는방식에의해. (1) 과관련하여, 당 ( 탄수화물 ), 아미노산 ( 친수성단백질영역 ), 폴리에틸렌옥시드, 폴리옥사졸린, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈등과같은사용되고있는수많은상이한중합체성물결합모이어티가있다. (2) 와관련하여, 중합체가세포기구 (machinery) 에의해약물작용제에첨가되는지, 또는반-합성 (semi-synthetic) 콘쥬게이션단계에서첨가되는지여부에따라크게구별된다. 세포기구에의해 ( 즉, 반-합성단계를거치지않고 ) 약물작용제에첨가되는중합체와관련하여, 한예는코딩뉴클레오티드서열 ( 예를들어, Aranesp) 수준에서글리콜실화부위를첨가또는변경함에의해세포-매개글리코실화과정을통해친수성탄수화물중합체를번역된단백질의표면에첨가하는것이다. 또다른예는오픈리딩프레임코돈 ( 즉, Amunix의 XTEN 플랫폼 ) 수준에서단백질번역동안에일련의반복뉴클레오티드단위를첨가함에의해여러개의친수성아미노산을첨가하는것이다

14 [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 반-합성과관련하여 : 폴리에틸렌옥시드의중합체가기능화된다음약물작용제에컨쥬게이션되는페길화 (PEGylation) 에가장많은경험이존재한다. 또한, Fresenius는장쇄메이즈 (maize) 전분이기능화된다음약물작용제에컨쥬게이션되는헤실화 (HESylation) 접근법을이용한다. 또한, Serina Therapeutics는친수성폴리옥사졸린백본 (PEG의폴리에틸렌백본과상반됨 ) 을이용한다. Haddleton 등에의해기재된폴리PEG라일컫는또다른방법은라디칼중합이가능한중합체백본및여러개의짧은 PEG이거나당인물결합실체를이용한다. 이상이한기술접근법들을실제로어떻게잘작용시킬것인가? 일반적으로, 바이오의약및의약에의해소요되는상당한시간및돈에도불구하고, 일반적인결론은이기술들은요구되는수행이득 ( 특히생체내체류시간 ) 의수준을달성하지못하고있고, 게다가추가공정을통한그이상의진보를달성하기위한능력측면에서한계 (flat of the curve) 에있다는것이다. 요구되는개선의수준은약물및이의생물학적성질및요구되는 제품프로파일에의존하지만, 많은경우에서 3 내지 4 배나된다. 많은회사는이개선의수준을달성하기위해일하고있지만실제로이용되는기술은이에미치지못하고이들의이용가능성에서전반적으로틈새 (niche) 에서증대하는개선을달성하고있다. 예를들어 : 40 kda 분지형 PEG로 GM-CSF (Micromet 데이터 ) 의항체단편 scfv ( 대략 22 kd의크기 ) 억제제의페길화는쥣과 (murine) 에서부적절한 59 시간의정맥내주입후제거반감기를야기한다. 유용하려면쥣과의반감기는 150 시간 (3x 개선 ) 초과, 바람직하게는 250 시간 (4x 개선 ) 초과이어야한다. 40 kda 분지형 PEG (Pegasys 데이터 ) 로대략 19.5 kda의재조합인터페론알파의페길화는대략 50 시간의피하주입후쥣과제거반감기및 80 시간범위의인간반감기를야기한다. Pegasys는인간에일주일단위로투여된다. 증가된크기및구성의일련의 PEG 중합체로 IL-8 (Genentech 데이터, Leong 등, 2001) 에대한대략 50 kda의 Fab' 항체단편의페길화. 토끼에서정맥내주입후반감기는 PEG 20 kda 선형 44 시간에서 PEG 40 kda 분지형 105 시간의범위이다. 이는 40 kda 분지형중합체와컨쥬게이션된 TNFa에대한 Fab' 을갖는승인된제품 Cimzia의반감기에대해상호관련될수있다. 피하주입후인간반감기는 311 시간이고, 일개월단위피하 투여량에대해충분하다 ( 류마티스성관절염에대해 FDA 승인 ). 하지만 PEG 모이어티 ( 용해성, 안정성, 점도 ) 에의해유도되는성질은피하주입 ( 제한 1mL, 바람직하게는 0.8mL 이하 ) 를위해전체투여량 (400mg) 이단일바이알 (vial) 로제형화되는것을가능하게할만큼충분하지않다. 오히려 Cimzia는바람직하게는각각제품의 200mg을전달하는두개의분리된주입을위해두개의바이알에고체로제형화된다. 나아가, PEG 시약은매우비싸고약물의평균도매가의 20 퍼센트까지구성한다. 그러므로, Cimzia 제품은 Humira ( 항-TNFα 항체, 액체제형, 단일사용주사기, 단일피하주입에의해투여, 월 2회 ) 에대해시장에서그다지경쟁력이없고, Simponi ( 항-TNFa 항체, 액체제형, 단일사용주사기, 단일피하주입으로투여, 월 1회 ) 에대해서는더더욱경쟁력이없다. 40 kda 분지형 PEG 중합체로에리스로포이에틴수용체 (Hematide 데이터 ) 의펩티드미메틱 ( 대략 4kDa) 의페길화는피하주입후래트에서 23 내지 31 시간의반감기를보였다 ( 투여량의존 ). 원숭이에서반감기는 15 시간내지 60 시간의범위였다 (Fan 등 Experimental Hematology, 34, 2006). 분자의계획된투여빈도는일개월단위이다. 이경우, 이분자로일개월단위로투여하는능력은약물자체의신체반감기및체류시간을훨씬 초과하여지속하는약역학적효과에의해가능해진다. 이특성은어떠한효능이강한효현 (agonistic) 약물에서는유지되지만, 일반적으로최소억제농도를유지하는것이필요한억제제에서는유지되지않고, 효소에대해서도유지되지않고, 고투여량효현단백질에서도유지되지않는다. 인터페론베타 ( 대략 20 kda) 는 40 kda 선형 PEG 중합체로페길화되었다. 비페길화형태인 Avonex는원숭이에서정맥내주입후 5.5 시간의평균말단반감기및근육내주입후 10 시간의반감기를보여준다. 40 kda 선형 PEG 중합체의컨쥬게이션은정맥내주입후대략 15 시간및피하주입후 30 시간의반감기를보여줄수있다. 40 kda 분지형 PEG 중합체의컨쥬게이션은정맥내주입후 30 시간및피하주입후 60 시간의반감기를보여줄수있다. 계획된투여빈도는월 2회이므로, 이분자로월 2회투여하는능력은약물자체의신체반감기및체류시간을초과하여지속하는생물학적또는약역학적효과에의해가능해진다. 현존하는인터페론베타제품에대적하기위한매력적인타겟제품프로파일로서월 1회라는투여빈도가요구된다. 대안적으로, 월 2회투여되지만매우플랫 (flat) 하고, 잠재적으로영차카이네틱스 (zero order kinetics) 인중합체컨쥬게이 트가이상적일수있다. 이는대단히생체적합한컨쥬게이트로수득가능하고더낮은전체투여량으로투여된

15 다. 나아가, 인터페론베타는불안정하고전반적으로다루기 ' 어려운 ' 단백질이고, 용해성및안정성에서추 가개선이바람직하다. [0021] [0022] [0023] [0024] 60 kda 분지형 PEG 중합체로재조합인간인자 VIII(300 kda 이상 ) 의페길화가수행되었다. 비페길화된 FVIII 가인간에서 12 내지 14 시간순환반감기를보여준다. 이는출혈위기에대응하여급박하게사용된다. 이는또한주 3회정맥내주사 (infusion) 를통해예방을위해사용되고있다. 쥣과의평균말단반감기는비페길화형태에서 6 시간이고부위-지정페길화형태에서 11 시간이다. 토끼에서비페길화형태인전장 FVIII 단백질에서는 6.7 시간의평균말단반감기를보여주었다. 60kDa 분지형 PEG로페길화된형태에서, 반감기는 12 시간으로증가되었다. PEG-FVIII의반감기증가의규모는 PEG 질량 (mass) 의증가와상관관계가있다. 하지만, 핵심목적은주 1회정맥내주사로예방을가능하게하는것이다. 매우큰 ( 그리고비싼 ) 60kDa PEG 시약에의해전달되는이득조차도주 1회투여빈도를가능하게할것이라생각되지않고그럴것같지도않다. 이것이게임체인저 (game changer) 가되기위해서는 PEG에대해추가적인 >2x 바람직하게는 4x를필요로한다. 개선해야할또다른생체내수행지표 (performance metric) 는투여된 FVIII 약물에대해생성되는중화항체의발생률을실질적으로감소시키는것이될것이다. 이목적은부적절하게 FVIII-PEG 컨쥬게이트를통해만났다. 개선해야할또다른시험관내 (in vitro) 수행지표는정맥내투여보다피하투여를가능하게하기위해충분한안정하고고농도의제형을달성하는것이될것이다 - 이는또한피하부위에면역-자극항원제시 세포수준이높기때문에생체내면역원성특성의개선을요구할것이다. 최근, Biogen-개발 FVIII의면역글로불린 Fc 단편에의융합은시험되어페길화된 FVIII외생체내반감기의유사한수준을가지지만짐작컨대약물의 FcRn-매개내피세포제거때문에흥미롭게도매우불량한생체이용률을보였다. 이데이터는 FVIII 약물개발자들이현존하는기술이 " 난관에부딪쳤다 (hit a wall)" 는결론을내도록이끌었다. Amunix XTEN 기술은대략 850 개의친수성아미노산 ( 대략 80kDa의크기 ) 을 GLP-1 펩티드에융합시킨다. 이는 cynomolgus 원숭이에서반감기를 40kDa 분지형 PEG 중합체에컨쥬게이션된 GLP-1 등가물보다약간열등한 60 시간으로신장시킨다. 그래서 2x 증가된크기의중합체는본질적으로동등한수행이득을달성한다. 유사한이득의수준이인간성장호르몬에부착된 XTEN에서관찰되었다. 반감기이득의수준을더확장하고자하는면에서수많은도전이있다. 다른무엇보다도더, 물에결합하고물을구성함에사용되는친수성아미노산이그들의물결합특성의면에서최선은아니다. 둘째로, 중합체를첨가하기위한리보솜번역기구의필수사용은, 분자량을일정하게유지하고분지의수준을증가시킬때많은페길화예에서분지형구성에대해열등한 것으로나타났던단일아암 (arm), 선형구조로구성을제한한다. 셋째로, 중합체백본으로사용되는펩티드결합은충분히불안정하여이종성이실질적인측면에서제한이되어친수성중합체의길이가 40kDa 분지형 PEG 보다우수한반감기를달성할수있을만큼쉽게증가될수없는, 다분산성을보여줄것이다 ( 이는자체로제한이되는인코딩플라스미드벡터에서다중의긴반복단위의사용과관련된다른복잡성중상위에있다 ). 그리고이기술은이의적용에서틈새가되며, 예를들어화학합성을통해이전에합성적으로만들어진펩티드를지각된 ( 새로운불리한점뿐만아니라 ) 이점을갖지만전반적으로다른기술, 특히생체내제거반감기와가능한한유사한생체내수행을갖는세포-기반계에서만들수있게한다. rhepo는 165 개의아미노산과 3 개의 N-연결및 1 개의 O-연결글리코실화부위를갖는 30.4 kda 단백질이다. 질량의 40% 는탄수화물이다. 탄수화물은시험관내활성에는필요없지만, 생체내활성에는전적으로필요하다. Aranesp은 3 개의사슬을함유하는네이티브형태에반해 5 개의 N-연결올리고당사슬을함유하도록유전자수준에서개질된인간에리스로포이에틴의형태이다. 첨가되는탄수화물은당단백질의대략적인분자량을 30kDa에서 37kDa으로증가시킨다. 인간에서, 이변화는정맥내주입후평균말단반감기를 7 시간에서 21 시간으로, 피하주입후 16 시간에서 46 시간으로증가시키는데, 이는두경우에모두대략 3배개선이다. 재조합인간에리스로포이에틴의페길화된형태인 Mircera는만성신장질환환자에서대략 140 시간의피하주입후생체내반감기를보여주었지만, 약물의신장여과때문에환자는기계적제거를감소시키는수용체친화도의감소뿐만아니라반감기에서 2x 초과의증가를보이며, 실제신체반감기는 70 시간미만을의미하고이는 (40kDa 분지형 PEG로페길화된 ) Affymax의 Hematide 펩티도미메틱과비슷한정도이다. 헤실화기술은메이즈유래전분중합체의약물에의반-합성컨쥬게이션을이용한다. 데이터는 100kDa 헤실화중합체가마우스에서에리스로포이에틴상 30kDa 선형 PEG 중합체와등가 (Mircera 제품등가물 ) 임을보여준다. 더큰중합체를사용하는것이가능하지만, 그접근법은기본적으로전분물결합의성질에의해제한된다. 또한, (40kDa 분지형 PEG에대해그자체로열등한 ) 30kDa 선형 PEG에의 100kDa 중합체의등가성은이것이필수적인 4x 이득을제공하기전은물론이고 40kDa 분지형 PEG와동등해지기전에수행의면에서갈길이멀다는점을보여준다

16 [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] 이들예는시도된몇몇접근법및그들이달성한전반적인수행의예시이다. 요컨대, 이접근법들및기술은부족하다. 비-항체스캐폴드의경우, 그들은원숭이에서대략 60 내지 80 시간의제거반감기에서모여들어난관에부딪친다. 비록그계통은각기다르지만, 인간에서주 1회투여를가능하게하기위해서는원숭이에서 100 시간이상의평균말단반감기를달성하는것이일반적으로바람직하다. 그리고, 투여빈도가반감기보다더길때, 이는제형의용해성, 안정성및점도에부가적인요구를두게된다. 인자 VIII과같은다른유형의단백질에서는, 시작반감기의절대값및따라서필수적인타겟값은더낮지만, 매력적인타겟제품프로 파일에도달하기위해요구되는수행배수는유사하고대략 3x 내지 4x이다. 그렇다면문제는거기에어떻게도달하는가이다. 첫째로, 더많은배경이다. 전달을위한생물학적활성제를제형화하려는노력은투여경로, 활성제의생물학적안정성및생리학적으로양립되는매질에서의활성제의용해도를포함하는다양한변수와함께다루어져야한다. 생물학적활성제를제형화하는데선택이이루어지며, 선택된투여경로는활성제의생체이용률에영향을미칠수있다. 예를들어, 생물학적활성단백질및폴리펩티드에대해전신순환으로의비경구투여의선택은위장관에서발견되는단백질분해환경을회피한다. 하지만, 생물학적활성제의주입과같은직접투여가가능한경우에도, 제형은투여되는작용제에대한면역반응의발생및작열통및자통을포함하는임의의부형제에대한반응을포함하는다양한이유로인해불만족스러울수있다. 활성제가면역원성이아니고, 만족스러운부형제가이용될수있다하더라도, 생물학적활성제는고통스럽고 / 거나불편할수있는반복복용또는지속적주사를요구할수있는제한된용해성및짧은생물학적반감기를가질수있다. 일부생물학적활성제에대해, 작용제를수용성중합체에컨쥬게이션시킴으로써기능성작용제의적합한제형을 개발하는데있어서어느정도의성공이달성되었다. 수용성중합체에대한생물학적활성제의컨쥬게이션은일반적으로생물학적활성제, 특히단백질및펩티드의전달에대해다양한이득을제공하는것으로보인다. 이용되는수용성중합체중에서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이생물학적활성펩티드를포함하는다양한생물학적활성제에가장광범위하게컨쥬게이션된다. 면역원성또는항원성의감소, 증가된반감기, 증가된용해성, 신장에의한감소된제거및감소된효소적분해가 PEG 컨쥬게이트를포함하는다양한수용성중합체및기능성작용제의컨쥬게이트에기인되었다. 이러한속성의결과로서, 생물학적활성제의중합체컨쥬게이트는치료종점을달성하기위해덜빈번한투여를필요로하며, 더적은활성제의사용을허용케할수있다. 덜빈번한투여는고통스러울수있고, 건강관리전문가를방문하는불편함을필요로하는주입의전체횟수를감소시킨다. PEG 컨쥬게이션으로몇몇성공이달성되었을지라도, 생물학적활성제의 " 페길화 " 는난제로남아있다. 약물개발자들은에리스로포이에틴및다양한인터페론과같은효능이강한효현단백질을넘어서는진척을이루었으나, PEG 친수성중합체의이득은상업적으로성공적인제품에필요한 (i) 시험관내용해성, 안정성의증가및점도의감소, 및 (ii) 생체내생체이용률, 혈청및 / 또는조직반감기의증가및면역원성의감소를이끌어냄에불충분하다. 컨쥬게이트제조에사용하기위한 PEG의분지된형태는긴직쇄형 PEG 중합체사슬의사용에의해조우되는어려움및제한중일부를완화시키기위해도입되었다. 지금까지의경험은 PEG의분지된형태는동일한전체분자량의선형직쇄 PEG 중합체사슬에대해수행이득에서 " 곡선-이동 (curve-shift)" 을달성한다는점을보여 준다. 분지형중합체가긴선형의 PEG 중합체로형성된컨쥬게이트와연관된제한중일부를극복할수있는반면, 분지형및선형 PEG 중합체컨쥬게이트는모두컨쥬게이션된기능성작용제, 특히억제제의사용과연관된문제를적절히해결하지못한다. 그러나, 페길화는친수성중합체의타겟작용제에대한컨쥬게이션에서가장앞선기술을나타낸다. 페길화된화합물제품, 이중페그인터페론알파-2a (PEGASYS), 페그필그라스팀 (Neulasta), 페그아프타니브 (Macugen), 및세르톨리주마브페골 (Cimzia) 은 2009년에연간매출액으로 60억 $ 를초과했었다. ( 컨쥬게이션에적합한 ) 기능화된 PEG는이후다중으로기능화되고두개의컨쥬게이션반응으로리신잔기에부착되어 2-아암 PEG 시약이되는, 짧은선형중합체의중합을포함하는힘든공정을통해제조되었다. 합성단계의수및고품질의요구로인해, 다중크로마토그래피단계가요구된다. 낮은다분산성 (<1.2) 선형 PEG 중합체는 20kDa이경제적으로실현가능한한계가되어대략 20kDa, 30kDa 또는 40kDa의크기한계를갖는다. 그리고분지형시약으로형성될때, 최종시약크기는 40 kda (2 x 20 kda), 60 kda (2 x 30 kda), 80 kda (2 x 40 kda) 이다. 크기가클수록, 낮은다분산성으로제조하기에비용이많이든다. 또한, 크기가클수록, 중합체및연관된중합체-약물컨쥬게이트의용해성, 안정성, 및점도의최적성이작아진다. 요약하자면, PEG 중합체는에리스로포이에틴및인터페론과같은저-투여량, 고-효능효현분자와잘어울린다. 하지만, 이의상업적성공에도불구하고, 페길화된제품은부적절한안정성및용해성을가지고, PEG 시약은

17 제조하기비싸고, 가장중요한것은페길화된제품은생체내및시험관내수행을개선하는관점에서더여지 가제한된다. [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] 기능성작용제를수용성중합체에컨쥬게이션하는인정된이점및치료목적에적합한컨쥬게이트를형성함에 PEG와같은수용성중합체의제한을고려하여, 기능성작용제와컨쥬게이트를형성함에있어서부가적인수용성중합체가바람직하다. 수용성중합체, 특별히컨쥬게이트형성에사용되는 PEG의많은이점을갖고컨쥬게이트작용제로서 PEG에관찰되는불리한점에시달리지않는것이치료및진단작용제를형성함에사용하는것이바람직할것이다. 그럼에도불구하고페길화는전체생체적합성문제에대한해법으로의길을지시한다. PEG는체내에서무수한비-특이적생체내제거메커니즘으로부터컨쥬게이션된생물학적작용제를보호하는중합체의친수성특성때문에효과가있다. 물의중요성은일반적으로인지되어있지만, 이기술에서특별한통찰력은물이어떻게결합되는가와수행향상에중대한회합된물구조를인정하기위해더깊게파고드는것이다. PEG는그의친수성성질때문에효과가있지만, 물은상기중합체및따라서컨쥬게이션된작용제에단단히결합되지않는다. 물분자는페길화된화합물및이를둘러싼대량의물사이에자유교환상태에있어, 제거계 (clearance system) 가상기단백질을인지하는것을가능하게한다. 해답은복합체전체를비-특이적상호작용으로부터단단히가릴수있도록물을상기중합체및따라서컨쥬게이션된모이어티에매우단단히 " 풀로붙이는 (glue)" 방법을찾는것이다. 이를달성하기위해, 상기중합체가양성및음성전하모두를유지하여최종적으로 (net) 중성인본질적쌍성이온이되는것이필요하다. 어떤쌍성이온성중합체는그들의구조에결합된물분자를유지하고방출하지않으려한다. 그러면더진보를하기위해서는 (i) 물을더많이결합하고더선호되는물리적성질을갖고있어생체내및시험관내에서개선된기초생체적합성을갖는친수성모이어티의다른예및 (ii) 생체내및시험관내수행의관련된핵심동인 (driver) 인훨씬더크고, 확장된형태중합체 ( 크기및구성 ) 의예를자세히살펴볼필요성이있다. 이들중합체에서중요한것은이들이물분자를결합하는정도및물결합상호작용의물리적성질이다. 이러한성질의조합은중합체의기초적인생체적합성및그러한중합체가컨쥬게이션되는기능성작용제에생체적합성을부여할수있는정도를유도한다. 이상적인기술은비가역적이지않다면많은양의물을매우단단히결합하는물결합모이어티를사용하려하고, 이물결합모이어티를확장된형태 ( 즉, 멀티-아암 ) 구성을가질수있는, 목적하는다양한약물및포맷을가리기위해충분한길이및유연성의중합체백본으로갖추려고할것이고, 약물모이어티에의고효율컨쥬게이션을위해기능화될것이고, 최소의수의제조단계를가지고저렴하게제조될것이고, 분석적으로판단하여매우높은품질및작용면에서판단하여생체내 ( 말단반감기, 면역원성, 생활성 ) 및시험관내 ( 용해성, 안정성, 점도, 생활성 ) 에서매우높은수행을보일것이다. 이들요소의극대화를가능케하는기술은생체내및시험관내수행의새로운수준으로진출할것이다. 그러한기술의한가지는물결합모이어티로서다각도광산란으로측정할때총크기 50 kda 초과의피크분자량 (Mp) 의중합체상에, 상당히분지된구성또는슈도구성 (pseudo architecture) 의가능성을가지고, 관심있는바이오의약품 ( 들 ) 에부위-특이적컨쥬게이션을위해기능화되고, 고품질및낮은다분산성의잘특성화된치료법을가능하게하는기술로제조되고, 바이오의약품에컨쥬게이션될때또다른반감기확장기술 ( 예를들어, PEG 중합체로컨쥬게이션된 ) 로개질된동등한바이오의약품과대비해평균말단반감기에서급격한증가를부여하고, 컨쥬게이트에 PEG 또는기타기술에서보여지는것의배수인용해성, 안정성, 점도, 및특성화능력파라미터를부여하는, 포스포릴콜린유래 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 (HEMA-PC) 또는관련된쌍성이온을사용한다. 중합체의크기가매우중요하다. 가용성중합체-약물컨쥬게이트의맥락에서치료적목적으로사용될때, 선행기술은중합체의크기및이의품질사이에는잘정의되고기재된트레이드-오프 (trade-off) 가있다고교시 한다. 다분산성지수 ( 품질에대한핵심대용물 ) 는, 관심있는의약품에컨쥬게이션될때지속적인유효성이요구되는치료용단백질의믿을만한합성을상당히복잡하게하고, 제조, 규제, 임상, 및환자의관점에서바람직하지않은약물자체에그러한이종성을부여하는잠재적인통계적중합체의이종성을말해주므로특별히중요하다. 본발명은예를들어가용성약물에화학적컨쥬게이션을위해기능화된매우높은품질및매우낮은다분산성지수를갖는매우큰중합체를기재한다. 중요한것은, 중합체는불활성이아니고, 표면에부착을예정하고있지않고히드로겔과같이겔화되지않는다. 이는완전히새롭고, 놀라운것이고, 매우유용하고이전에기

18 재되지않은것이다. 이들의치료적의도를위해, 잘정의된약물물질이필수적이다. 이는그자체로중합체, 의약, 및컨쥬게이트의수준에서드러난다. 특히, 많은접근법및비기능화된중합체를갖는요소를사용하여만들어온중합체에대한연구결과물 (body of work) 가있다. 그연구결과물은요구되는단계가특정컨쥬게이션인본원에서는직접적인관련이없다. [0038] [0039] [0040] [0041] 기능화된중합체와관련된기술의현재상태는, 종래의슈도또는조절된라디칼중합에의해친수성단량체로부터제작되었고, 오직저분자량중합체 ( 전형적으로 <50 kda) 가기재되어왔다. 게다가, 이분자량에근접할수록, 다분산성지수 (PDI) 에의해입증된바와같이, 분자량의조절은길을잃었다. 예를들어, Ishihara 등 (2004, Biomaterials 25, 71-76) 은 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 (HEMA-PC) 의선형중합체를 37 kda의분자량까지제작하기위해조절된라디칼중합을활용하였다. PDI는 1.35였고, 이는약학적으로관련되기에는너무높은것이다. 게다가, 이들저자는 " 이방법에서, 분자량분산을조절하고분자량을증가시키는것은어렵다 " 라고분명히언급하였다. Lewis 등 (US 특허 2004/ ) 은또한조절된라디칼중합을이용하여이단량체의동종중합을기재하고, 1.45의 PDI를가진 11 kda까지분자량을보고하였다. 이후의간행물에서, Lewis 등 (2008, Bioconjugate Chem. 19, ) 은이번에는 HEMA-PC의기능화된동종중합체를분자량 37 kda까지다시합성하였다. PDI는 2.01이었다. 그들은오직급격히증가된다분산성을가진매우한정된 ( 불충분한 ) 분자량에서만양호한조절을달성했다고언급하였다. 그들은최고점의분자량범위 (37 kda) 에서조절의상실을보고하면서, 이러한다분산성의엄격한조절을가진종류의고분자량중합체의생성은가능하지않다는결론에이르게한것은더높은단량체농도에서빠른전환때문이라하였다. 예를들어, Haddleton 등 (2004, JACS 126, ) 은단백질과의컨쥬게이션에사용하기위하여 11,000 내지 34,000 달톤의크기범위인폴리 ( 메톡시PEG) 메타크릴레이트의작은선형중합체를제작하기위해조절된라디칼중합을활용하였다. 이들중합체의더큰것을만들어내기위한시도에서, 상기저자들은반응온도 를증가시켰고더빠른중합을유도할수있는촉매를찾아내려했다. 이후의간행물에서, Haddleton 등 (2005, JACS 127, ) 은 4.1 내지 35.4 kda의크기범위에서이작고불충분한분자량분포에서조차 1.25를초과하는 PDI 범위를갖는단백질컨쥬게이션을위해조절된라디칼중합을통해폴리 ( 메톡시PEG) 메타크릴레이트의기능화된동종중합체를다시합성하였다. 그다음의간행물에서, Haddleton 등 (2007, JACS 129, ) 은 의 PDI 범위를갖는 8 내지 30 kda의낮은크기범위에서단백질컨쥬게이션을위해조절된라디칼중합을통해기능화된중합체를다시합성하였다. Haddleton 등의사고방식및접근법은본발명과관련된고분자량, 낮은다분산성중합체를만들기위해사용될것이요구되는방법에대해부정적으로교시 (teach away) 하는것이다. 나아가, 단백질컨쥬게이션을위한저분자량중합체에대한집중은바이오의약품분야를다음수준으로데려가기에필요한크기, 구성, 및중합체의품질에관한이해의결여를반영한다. 본발명은부수적으로낮은 PDI를가진고분자량쌍성이온-함유중합체 ( 다각도광산란으로측정할때피크분자량 >50 kda) 를기재한다. 이는전술한기술의현재상태의요약에비추어볼때놀라운것이다. [0042] [0043] [0044] 발명의내용발명의개요일부구현예에서, 본발명은각각독립적으로아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈또는비닐-에스테르로부터선택되는다수의단량체를각각갖는 2 이상의중합체아암을갖는중합체로서, 각각의단량체는친수성기를포함하는중합체를제공한다. 상기중합체는또한중합체아암의근위말단에연결된개시제단편 ( 여기서개시제모이어티는라디칼중합에적합함 ) 을포함한다. 상기중합체는또한중합체아암의원위말단에연결된말단기를포함한다. 상기중합체의개시제단편및말단기중하나이상은기능성작용제또는연결기를포함한다. 다른구현예에서, 본발명은각각독립적으로아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈또는비닐-에스테르로이루어진군으로부터선택되는다수의단량체를각각갖는 2 이상의중합체아암 ( 각각의단량체는친수성기를포함함 ), 중합체아암의근위말단에연결된개시제단편 ( 여기서개시제모이어티는라디칼중합에적합함 ), 및중합체아암의원위말단에연결된말단기를갖는하나이상의중합체를포함하는컨쥬게이트를제공한다. 본발명의컨쥬게이트는또한개시제단편또는말단기에연결된, 생물활성작용제또는진단작용제를갖는하나이상의기능성작용제를포함한다

19 [0045] 일부다른구현예에서, 본발명은하기화학식의중합체를제공한다 : [0046] [0047] 상기식에서, R 1 은 H, L 3 -A 1, LG 1 또는 L 3 -LG 1 일수있다. 각각의 M 1 및 M 2 는독립적으로아크릴레이트, 메타크 릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐 - 피리딘, 비닐 - 피롤리돈또는비닐 - 에스테르로부터선택 될수있다. G 1 및 G 2 의각각은각각독립적으로친수성기이다. 각각의기 I는개시제단편이고 I' 는라디 칼스캐빈저로, I-I' 의조합은라디칼중합을통해중합체의중합을위해개시제 I 1 이다. 대안적으로, 각각 의 I' 은독립적으로 H, 할로겐또는 C 1-6 알킬로부터선택될수있다. 각각의 L 1, L 2 및 L 3 는링커일수있다. 각각의 A 1 은기능성작용제일수있다. 각각의 LG 1 은연결기일수있다. 하첨자 x 및 y 1 은각각독립적으로 1 내지 1000의정수일수있다. 각각의하첨자 z는독립적으로 1 내지 10의정수일수있다. 하첨자 s는 1 내지 100의정수일수있다. [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] 발명의상세한설명 I. 총론본발명은친수성기또는포스포릴콜린과같은쌍성이온, 및하나이상의기능성작용제 ( 본원에정의됨 ) 를갖는고 MW 중합체를제공한다. 고도로생체적합한분자로서의포스포릴콜린은기초적인생체적합성을유도한다. 그것은또한온도또는다른스트레스하에서단백질을보호하는면에서샤프론 (chaperone) 유형기능을갖는다. 그것은또한가역적세포흡수와같은다른기능을가능케할수있다. 기능성작용제는검출작용제, 영상화작용제, 표지작용제또는진단작용제뿐만아니라약물, 치료단백질또는타겟화작용제와같은생물활성작용제일수있다. 고 MW 중합체는하나이상의적절한기능성작용제를선택함으로써다양한상태및질병상태의치료에유용하다. 하나초과의생물활성작용제가고 MW 중합체에연결될수있고, 이에따라단지단일질병증상또는메커니즘이아니라전체질병의치료를가능하게한다. 게다가, 고 MW 중합체는적합한타겟화작용제및영상화작용제의부착에의해진단및영상화목적에유용하다. 고 MW 중합체는단일중합체중에치료및진단작용제양자모두를포함할수있어, 질병을치료할뿐만아니라검출하 고진단하는치료진단 (theranostic) 작용제를제공한다. 상기중합체는안정한또는불안정한연결을통해생물활성작용제 ( 들 ) 에연결될수있다. 상기중합체는포스포릴콜린과같은쌍성이온을함유하는단량체를이용하여, 원자이동라디칼중합 (ATRP) 과같은, 통상적인자유-라디칼중합또는조절 / 리빙 (living) 라디칼중합을통해제조될수있다. 고 MW 중합체의제조에사용되는개시제는다중개시부위를가질수있어, 스타 (star) 와같은멀티-아암중합체가제조될수있다. 개시제는또한생물활성작용제, 또는생물활성작용제에연결할수있는연결기중하나를함유할수있다. 본발명은또한생물활성표면상에분지형중합체구성을달성할수있는새로운방식을기재한다. 그개념은타겟분자상국소부위 ( 들 ) 에부착된 1 아암중합체를갖는효과적인 2 아암중합체를재형성하기위한타겟분자상 " 분지지점 (branching point)" 또는 " 근위부착지점 (proximal attachment point)" 중하나이다. 선행기술에서, 비부위-특이적시약 ( 예를들어 NHS 기능화 PEG 시약 ) 으로단백질의무분별한페길화는단백질전체에흩어져있는다중아민기에컨쥬게이션된다중 PEG 중합체를초래할것이다. 여기서, 기재된것은바람직하게는타겟작용제가개질되어두개의고유컨쥬게이션부위 ( 예를들어, 시스테인아미노산 ) 를찾아내는한단계접근법으로, 일단단백질또는펩티드또는작용제의 3차구조가형성되면상기두개의부위가서로근접해있을것이다. 그러면, 이개질된타겟작용제는대응하는컨쥬게이션화학적성질 ( 예를들어, 티올반 응성 ) 을함유하는중합체와함께컨쥬게이션반응에서사용된다. 결과는서로근접한두개의중합체와컨쥬게이션된단일타겟작용제이고, 그렇게함으로써분지지점또는 " 슈도 " 분지를형성한다. 또다른구현예에서, 타겟작용제는단일고유부위, 예를들어유리 (free) 시스테인을함유하게되고, 트리 ( 헤테로 ) 기능성연결

20 작용제는 2 선형중합체를이단일부위에부착하는데이용되게되어, 다시 " 슈도 " 분지를형성한다. [0053] [0054] [0055] [0056] 본발명은또한인테인을거쳐매우높은효율및부위특이적으로펩티드및단백질에의컨쥬게이션을달성하기위한새로운방식을기재한다. II. 정의 " 중합체 " 는함께연결된일련의단량체군을의미한다. 고 MW 중합체는아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈, 및비닐아세테이트와같은비닐에스테르를포함하나, 이에제한되지는않는단량체로부터제조된다. 추가단량체가본발명의고 MW 중합체에서유용하다. 두개의상이한단량체가사용될때, 두개의단량체는 " 공단량체 " 라부르며, 이는상이한단량체가공중합되어단일중합체를형성하는것을의미한다. 중합체는선형또는분지형일수있다. 중합체가분지형일때, 각각의중합체사슬은 " 중합체아암 " 으로언급된다. 개시제모이어티에연결된중합체아암의말단은근위말단 (proximal end) 이고, 중합체아암의성장하는-사슬말단은원위말단 (distal end) 이다. 중합체아암의성장하는사슬-말단에서, 중합체아암말단기는라디칼스캐빈저, 또는또다른기일수있다. " 친수성기 " 는물을끄는화합물또는중합체를의미하고, 통상적으로수용성이다. 친수성기의예는친수성중합체및쌍성이온모이어티를포함한다. 다른친수성기는히드록시, 아민, 카르복실산, 아미드, 술포네이트및포스포네이트를포함하나, 이에제한되지는않는다. 친수성중합체는폴리에틸렌옥시드, 폴리옥사졸린, 셀룰로오스, 전분및기타다당류를포함하나, 이에제한되지는않는다. 쌍성이온모이어티는양성및음성전하둘모두를갖는화합물을의미한다. 고 MW 중합체에서유용한쌍성이온모이어티는 4차질 소및포스포릴콜린 : RO-P(=O)(O - )O-CH 2 CH 2 -N + (Me) 3 와같은음성으로하전된포스페이트를포함할수있다. 다 른쌍성이온모이어티가본발명의고 MW 중합체에유용하고, 특허 WO 1994/ 호및 WO 1994/ 호는이 의전체내용이본원에포함된다. [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] " 개시제 " 는본발명의공단량체를이용한중합을개시시킬수있는화합물을의미한다. 중합은원자전달라디칼중합 (ATRP), 가역적첨가-단편화-종결 (RAFT) 중합또는니트록시드매개중합 (NMP) 과같은통상적인자유라디칼중합또는조절 / 리빙라디칼중합일수있다. 중합은변성전달 (degenerative transfer) 과같은 " 슈도 " 조절중합일수있다. 개시제가 ATRP에대해적합할때, 그것은균일하게분해되어라디칼중합을개시시킬수있는라디칼인개시제단편 I, 및성장하는중합체사슬의라디칼과반응하여중합을가역적으로종결시키는라디칼스캐빈저 I' 을형성시킬수있는불안정한결합을함유한다. 라디칼스캐빈저 I' 은통상적으로할로겐이지만, 또한니트릴과같은유기모이어티일수있다. " 링커 " 는두개의기를함께연결하는화학모이어티를의미한다. 링커는분해성또는비-분해성일수있다. 분해성링커는그중에서도가수분해성, 효소적분해성, ph 민감성, 광불안정성, 또는디설피드링커일수있다. 다른링커는동종이기능성및이종이기능성링커를포함한다. " 연결기 " 는생물활성작용제에의하나이상의결합으로이루어지는공유연결을형성할수있는작용기이다. 비제한적인예는표 1에예시된것을포함한다. " 가수분해성링커 " 는생리학적조건하에서가수분해를겪는공유결합과같은화학적연결또는결합을의미한다. 결합이가수분해되는경향은결합이엄격한곳사이의두개의중심원자를연결하는연결의일반적유형뿐만아니라, 이중심원자들에부착되는치환기에의존될수있다. 가수분해적으로민감한연결의비제한적인예는카르복실산의에스테르, 포스페이트에스테르, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬에테르, 이민, 오르토에스테르, 및일부아미드연결을포함한다. " 효소적분해성링커 " 는하나이상의효소에의한분해의대상이되는연결을의미한다. 일부효소적으로민 감한연결이또한효소적으로분해될수있다. 예를들어, 에스테라아제는카르복실산의에스테르또는포스페이트에스테르에서작용할수있고, 프로테아제는펩티드결합및일부아미드연결에서작용할수있다. "ph 민감성링커 " 는하나의 ph에서안정적이고, 또다른 ph에서분해되기쉬운연결을의미한다. 예를들어, ph 민감성링커는중성또는염기성조건에서는안정할수있으나, 약산성조건에서는불안정할수있다. " 광불안정성링커 " 는빛에대한노출후에분해되는공유결합과같은연결을의미한다. 광불안정성링커는유입되는빛을흡수한후, 광불안정성링커에의해연결된두개의기를분해시키기위해결합의재배열을유발하는방향족모이어티를포함한다. " 자가-희생또는이중프로드러그링커 " 는, 링커의주요기능이선택적트리거활성화 ( 예를들어, ph의강하또

21 는조직 - 특이적효소의존재 ) 후에기능성작용제를방출하는자발적화학분해후에만기능성작용제를방출하 는것인연결을의미한다. [0064] [0065] [0066] " 기능성작용제 " 는생물활성작용제또는진단작용제를포함하는것으로정의된다. " 생물활성작용제 " 는특정생물학적위치를타겟으로하고 / 하거나 ( 타겟화작용제 ), 생체내또는시험관내에서입증될수있는일부국소적또는전신적생리학적또는약리학적효과를제공하는임의의작용제, 약물, 화합물, 또는이의혼합물을포함하는것으로정의된다. 비제한적예는약물, 백신, 항체, 항체단편, scfvs, 디아바디, 아비머, 비타민및보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및핵산 ( 예를들어, mrna, trna, snrna, RNAi, DNA, cdna, 안티센스구조물, 리보자임등 ) 을포함한다. " 진단작용제 " 는조직또는질병의검출또는영상화를가능하게하는임의의작용제를포함하는것으로정의된다. 진단작용제의예는방사성표지, 형광단및염료를포함하나, 이에제한되지는않는다. " 치료단백질 " 은약물을전체적또는부분적으로구성하는아미노산서열을포함하는펩티드또는단백질을의미하고, 이는인간또는동물의약학적적용에사용될수있다. 본원에개시된것을포함하나, 이에제한되지는않는수많은치료단백질이당업계의실무가 (practitioner) 에게공지되어있다. "PC" 로도표시되는 " 포스포릴콜린 " 은하기를의미한다 : [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] 상기식에서, * 는부착지점을표시한다. 포스포릴콜린은쌍성이온기이고, 염 ( 예를들어, 내부염 ), 및이의양성자화된 (protonated) 형태및탈양성자화된 (deprotonated) 형태를포함한다. " 포스포릴콜린함유중합체 " 는포스포릴콜린을함유하는중합체이다. 각각의예에서, 포스포릴콜린함유중합체가특정용도에대해본출원에서상술되는경우, 그러한용도에서단일포스포릴콜린이또한이용될수있는것이분명히고려된다. " 쌍성이온함유중합체 " 는쌍성이온을함유하는중합체를의미한다. " 폴리 ( 아크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 ) 함유중합체 " 는 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 ( 즉, 2-메타크릴로일-2'-트리메틸암모늄에틸포스페이트 ) 과같은, 하나이상의아크릴로일옥시에틸포스포릴콜린단량체를함유하는아크릴산의중합체를의미한다. " 접촉시키는 " 은 2 이상의별개의종을접촉시켜이들이반응하도록이끄는과정을의미한다. 하지만, 생성되는반응생성물은첨가된시약사이의반응으로부터직접제조되거나, 반응혼합물에서제조될수있는첨가된시약중하나이상으로부터의중간체로부터제조될수있는것으로이해되어야한다. " 수용성중합체 " 는물에서가용성인중합체를의미한다. 수용성중합체의용액은여과후의동일용액에의해투과되는빛의약 75% 이상, 더욱바람직하게는약 95% 이상을투과시킬수있다. 중량을기준으로, 수용성중합체또는이의분획은물중에서약 35% 이상, 약 50% 이상, 약 70%, 약 85%, 약 95% 또는 100%( 건조중합체의중량을기준으로함 ) 존재할수있다. 중합체의맥락에서 " 분자량 " 은수평균분자량, 또는중량평균분자량또는피크분자량으로표현될수있다. 달리나타내지않는한, 본원의분자량에대한모든언급은피크분자량을의미한다. 이러한분자량결정, 수평균, 중량평균및피크는겔투과크로마토그래피또는다른액체크로마토그래피기술을이용하여측정될수있다. 수평균분자량을결정하기위한말단-기분석의이용또는총괄성특성 ( 예를들어, 빙점저하, 비등점상승, 또는삼투압 ) 의측정, 또는중량평균분자량을결정하기위한광산란기술, 초원심분리또는점도측정의이용과같은분자량값을측정하는다른방법이또한이용될수있다. 본발명의중합시약은통상적으로다분산성 ( 즉, 중합체의수평균분자량및중량평균분자량이동등하지않음 ) 이며, 겔투과크로마토그래피에의한판단시바람직하게는약 1.5 미만의낮은다분산성값을갖는다. 다른구체예에서, 다분산성은약 1.4 내지약 1.2, 더욱바람직하게는약 1.15 미만, 더욱더바람직하게는약 1.10 미만, 더욱더바람직하게는약 1.05 미만, 가장바람직하게는약 1.03 미만의범위일수있다. 본원에서사용되는단수형태구의개체는이러한개체하나이상을의미하며, 예를들어, 화합물은하나이상의화합물또는적어도하나의화합물을의미한다. 이와같이, 단수형태의용어, 및 " 하나이상 " 및 " 적어도

22 하나 " 는본원에서상호교환적으로사용될수있다. [0075] [0076] 본원에서사용되는 " 약 " 은상이한기구, 샘플, 및샘플제제에서취해진측정에서알수있는편차를의미한다. " 보호된 ", " 보호된형태 ", " 보호하는기 " 및 " 보호기 " 는특정반응조건하에서분자내의특별한화학적반응성작용기의반응을예방하거나차단하는기 ( 즉, 보호하는기 ) 의존재를의미한다. 보호기는이용되는반응조건및존재시분자내에추가반응성기또는보호기의존재뿐만아니라보호되는화학적반응기의종류에따 라다양할것이다. 당업자는 Greene 등의논문, "Protective Groups In Organic Synthesis," 3 rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999 에서발견되는것과같은기술분야에서공지된보호기를인지할 것이다. [0077] [0078] " 스페이서 " 및 " 스페이서기 " 는본원에서상호교환적으로사용되고, 이는수용성중합체의말단및기능성작용제의반응기및반응기와같은상호연결모이어티를연결하는데임의로사용되는원자또는원자의집합체를의미한다. 스페이서는가수분해적으로안정적일수있거나, 가수분해적으로민감하거나효소적으로분해성인연결을포함할수있다. " 알킬 " 은지정된탄소원자수를갖는선형또는분지형, 포화, 지방족라디칼을의미한다. 예를들어, C 1 -C 6 알킬은메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실등을포함하나, 이에제한되지는않는다. 다른알킬기는헵틸, 옥틸, 노닐, 데실등을포함하나, 이에제한되지는않는다. 알킬은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 및 5-6과같은임의의수의탄소를포함할수있다. 알킬기는통상적으로 1가이나, 알킬기가 2개의모이어티를함께연결시키는때와같이 2가일수있다. [0079] [0080] 유기라디칼또는화합물과관련하여상기및하기에서언급되는용어 " 저급 " 은각각 7개이하, 바람직하게는 4 개이하및 ( 분지되지않은경우 ) 1개또는 2개의탄소원자를갖는분지되거나분지되지않을수있는화합물또는라디칼을정의한다. " 알킬렌 " 은 2 이상의다른기를연결시키는상기정의된바와같은알킬기, 즉, 2가탄화수소라디칼을의미한다. 알킬렌에연결된두개의모이어티는알킬렌의동일한원자또는상이한원자에연결될수있다. 예를들어, 직쇄형사슬알킬렌은 -(CH 2 ) n 의 2가라디칼일수있고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 알킬렌 기는메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 이소프로필렌, 부틸렌, 이소부틸렌, sec- 부틸렌, 펜틸렌및헥실렌을 포함하나, 이에제한되지는않는다. [0081] 알킬및헤테로알킬라디칼 ( 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및헤테로시클로알케닐로종종언급되는기를포함함 ) 에대한치환기는 0 내지 (2m'+1)( 여기서, m' 은상기라디칼내의탄소원자의전체수이다 ) 범위의수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO 2 R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'- C(O)NR''R''', -NR''C(O) 2 R', -NH-C(NH 2 )=NH, -NR'C(NH 2 )=NH, -NH-C(NH 2 )=NR', -S(O)R', -S(O) 2 R', -S(O) 2 NR'R'', -CN 및 -NO 2 로부터선택된다양한기일수있다. R', R'' 및 R''' 는각각독립적으로수소, 비 치환된 (C 1 -C 8 ) 알킬및헤테로알킬, 비치환된아릴, 1-3 개의할로겐으로치환된아릴, 비치환된알킬, 알콕시 또는티오알콕시기, 또는아릴 -(C 1 -C 4 ) 알킬기를의미한다. R' 및 R'' 가동일질소원자에부착되는경우, 이들 은질소원자와조합되어 5-, 6-, 또는 7-원고리를형성할수있다. 예를들어, -NR'R'' 은 1-피롤리디닐및 4-모르폴리닐을포함하는것을의미한다. 상기치환기의논의로부터, 당업자는용어 " 알킬 " 이할로알킬 ( 예를들어, -CF 3 및 -CH 2 CF 3 ) 및아실 ( 예를들어, -C(O)CH 3, -C(O)CF 3, -C(O)CH 2 OCH 3 등 ) 과같은기를포함하는것을의미하는것을이해할것이다. 바람직하게는, 치환된알킬및헤테로알킬기는 1 내지 4 개의치환기, 더욱바람직하게는 1, 2 또는 3 개의치환기를갖는다. 본발명에의해고려되고또한바람직한것에서퍼할로알킬기 ( 예를들어, 펜타플루오로에틸등 ) 는예외이다. [0082] 알킬및헤테로알킬라디칼 ( 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및헤테로시클로알케닐로종종언급되는기를포함함 ) 에대한치환기는 0 내지 (2m'+1)( 여기서, m' 은상기라디칼내의탄소원자의전체수 ) 범위의수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO 2 R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''',

23 -NR''C(O) 2 R', -NR-C(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O) 2 R', -S(O) 2 NR'R'', -NRSO 2 R', -CN 및 -NO 2 로부터선택되나, 이에제한되지는않는다양한기중하나이상일수있다. R', R'', R''' 및 R'''' 는각각바람직하게는수소, 치환되거나비치환된헤테로알킬, 치환되거나비치환된아릴, 예를들어, 1-3 개의할로겐으로치환된아릴, 치환되거나비치환된알킬, 알콕시또는티오알콕시기, 또는아릴알킬기를의미한다. 본발명의화합물이하나초과의 R기를포함하는경우, 예를들어, R기의각각은, 상기기의하나초과가존재하는경우에각각 R', R'', R''' 및 R'''' 기인것과같이독립적으로선택된다. R' 및 R'' 가동일질소원자에부착될때, 이들은질소원자와조합되어 5-, 6-, 또는 7-원고리를형성할수있다. 예를들어, -NR'R'' 은 1-피롤리디닐및 4-모르폴리닐을포함하나, 이에제한되지는않는것을의미한다. 상기치환기논의로부터, 당업자는용어 " 알킬 " 이수소기이외의기에결합된탄소원자를포함하는기, 예를들어, 할로알킬 ( 예를들어, -CF 3 및 -CH 2 CF 3 ) 및아실 ( 예를들어, -C(O)CH 3, -C(O)CF 3, -C(O)CH 2 OCH 3 등 ) 을포함하는것을의미하는것을이해할것이다. [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] " 알콕시 " 는부착지점에알콕시기를연결시키거나알콕시기의 2 개의탄소에연결되는산소원자를갖는알킬기를의미한다. 알콕시기는, 예를들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소-프로폭시, 부톡시, 2-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 헥스옥시등을포함한다. 알콕시기는본원에기재된다양한치환기로추가치환될수있다. 예를들어, 알콕시기는할로겐으로치환되어 " 할로-알콕시 " 기를형성할수있다. " 카르복시알킬 " 은카르복시기로치환된알킬기 ( 본원에정의됨 ) 를의미한다. 용어 " 카르복시시클로알킬 " 은카르복시기로치환된시클로알킬기 ( 본원에정의됨 ) 를의미한다. 용어알콕시알킬은알콕시기로치환된알킬기 ( 본원에정의됨 ) 를의미한다. 본원에서이용되는용어 " 카르복시 " 는카르복실산및이의에스테르를의미한다. " 할로알킬 " 은수소원자의일부또는전부가할로겐원자로치환된상기정의된알킬을의미한다. 할로겐 ( 할로 ) 은바람직하게는클로로또는플루오로를나타내나, 또한브로모또는아이오도일수있다. 예를들어, 할로알킬은트리플루오로메틸, 플루오로메틸, 1,2,3,4,5-펜타플루오로-페닐등을포함한다. 용어 " 퍼플루오로 " 는불소로대체된모든이용가능한수소를갖는화합물또는라디칼을정의한다. 예를들어, 퍼플루오로페닐은 1,2,3,4,5-펜타플루오로페닐을의미하고, 퍼플루오로메틸은 1,1,1-트리플루오로메틸을의미하고, 퍼플루오로메톡시는 1,1,1-트리플루오로메톡시를의미한다. " 플루오로-치환된알킬 " 은하나, 일부또는전부의수소원자가불소로대체된알킬기를의미한다. 본발명의맥락에서 " 사이토카인 " 은면역및염증반응에서세포-세포통신에참여할수있는단백질신호전달분자군의일원이다. 사이토카인은통상적으로약 8-35 kda의질량을갖는작은수용성당단백질이다. " 시클로알킬 " 은약 3 내지 12, 3 내지 10, 또는 3 내지 7 개의엔도시클릭탄소원자를함유하는시클릭탄화수소기를의미한다. 시클로알킬기는융합된, 브릿지된및스피로고리구조를포함한다. " 엔도시클릭 " 은시클릭고리구조의일부를포함하는원자또는원자의기를의미한다. " 엑소시클릭 " 은시클릭고리구조에부착되나, 시클릭고리구조를정의하지않는원자또는원자의군을의미한다. " 시클릭알킬에테르 " 는 3 또는 4 개의엔도시클릭탄소원자및 1 개의엔도시클릭산소또는황원자를갖는 4 또는 5원시클릭알킬기 ( 예를들어, 옥세탄, 티에탄, 테트라히드로푸란, 테트라히드로티오펜 ); 또는 1 또는 2 개의엔도시클릭산소또는황원자를갖는 6 내지 7원시클릭알킬기 ( 예를들어, 테트라히드로피란, 1,3-디옥산, 1,4-디옥산, 테트라히드로티오피란, 1,3-디티안, 1,4-디티안, 1,4-옥사티안 ) 를의미한다. " 알케닐 " 은하나이상의이중결합을갖는 2 내지 6 개의탄소원자의직쇄형사슬또는분지형탄화수소를의미한다. 알케닐기의예는비닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부테닐, 부타디에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 이소펜테닐, 1,3-펜타디에닐, 1,4-펜타디에틸, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 1,3-헥사디에닐, 1,4-헥사디에닐, 1,5-헥사디에닐, 2,4-헥사디에닐, 또는 1,3,5-헥사트리에닐을포함하나, 이에 제한되지는않는다. 알케닐기는또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6 개의탄소를가질수있다. 알케닐기는통상적으로 1가이나, 알케닐기가 2 개의모이어티를함께연결시키는때와같이 2가일수있다. " 알케닐렌 " 은 2 이상의다른기를연결시키는상기정의된알케닐기, 즉, 2가탄화수소라디칼을의미한다

24 알케닐렌에연결된 2 개의모이어티는알케닐렌의동일한원자또는상이한원자에연결될수있다. 알케닐렌기는에테닐렌, 프로페닐렌, 이소프로페닐렌, 부테닐렌, 이소부테닐렌, sec-부테닐렌, 펜테닐렌및헥세닐렌을포함하나, 이에제한되지는않는다. [0094] [0095] [0096] " 알키닐 " 은하나이상의삼중결합을갖는 2 내지 6 개의탄소원자의직쇄형사슬또는분지형탄화수소를의미한다. 알키닐기의예는아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 이소부티닐, sec-부티닐, 부타디이닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 이소펜티닐, 1,3-펜타디이닐, 1,4-펜타디이닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 1,3-헥사디이닐, 1,4-헥사디이닐, 1,5-헥사디이닐, 2,4-헥사디이닐, 또는 1,3,5-헥사트리이닐을포함하나, 이에제한되지는않는다. 알키닐기는또한 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 4 내지 5, 4 내지 6 및 5 내지 6 개의탄소를가질수있다. 알키닐기는통상적으로 1가이나, 알키닐기가 2 개의모이어티를함께연결시키는때와같이 2가일수있다. " 알키닐렌 " 은 2 이상의다른기를연결시키는상기정의된알키닐기, 즉, 2가탄화수소라디칼을의미한다. 알키닐렌에연결된 2 개의모이어티는알키닐렌의동일한원자또는상이한원자에연결될수있다. 알키닐렌기는에티닐렌, 프로피닐렌, 부티닐렌, sec-부티닐렌, 펜티닐렌및헥시닐렌을포함하나, 이에제한되지는않는다. " 시클로알킬 " 은 3 내지 12 개의고리원자또는지정된원자수를함유하는포화되거나부분적으로불포화된, 모노시클릭, 융합된바이시클릭또는브릿지된폴리시클릭고리집합체를의미한다. 모노시클릭고리는, 예를들어, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 및시클로옥틸을포함한다. 바이시클릭및폴리시클릭고리는, 예를들어, 노르보르난, 데카히드로나프탈렌및아다만탄을포함한다. 예를들어, C 3-8 시클로알 킬은시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로옥틸, 및노르보르난을포함한다. [0097] [0098] " 시클로알킬렌 " 은 2 이상의다른기를연결시키는상기정의된시클로알킬기, 즉, 2가탄화수소라디칼을의미 한다. 시클로알킬렌에연결된 2 개의모이어티는시클로알킬렌의동일한원자또는상이한원자에연결될수 있다. 시클로알킬렌기는시클로프로필렌, 시클로부틸렌, 시클로펜틸렌, 시클로헥실렌, 및시클로옥틸렌을포 함하나, 이에제한되지는않는다. " 헤테로시클로알킬 " 은 3 내지약 20 개의고리원, 및 1 내지약 5 개의 N, O 및 S와같은헤테로원자를갖는 고리계를의미한다. B, Al, Si 및 P를포함하나, 이에제한되지는않는추가헤테로원자가또한유용할수있 다. 헤테로원자는또한, 비제한적인예로, -S(O)- 및 -S(O) 2 -와같이산화될수있다. 예를들어, 헤테로사 이클은테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오페닐, 모르폴리노, 피롤리디닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 이미 다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 인돌리닐, 퀴누클리디닐및 1,4- 디옥사 -8- 아자 - 스피로 [4.5] 데 -8- 실을포함하나, 이에제한되지는않는다. [0099] [0100] " 헤테로시클로알킬렌 " 은 2 이상의다른기를연결시키는상기정의된헤테로시클알킬기를의미한다. 헤테로시클로알킬렌에연결된 2 개의모이어티는헤테로시클로알킬렌의동일한원자또는상이한원자에연결될수있다. " 아릴 " 은 6 내지 16 개의고리탄소원자를함유하는모노시클릭또는융합된바이시클릭, 트리시클릭또는그이상의방향족고리어셈블리를의미한다. 예를들어, 아릴은페닐, 벤질또는나프틸, 바람직하게는페닐일수있다. " 아릴렌 " 은아릴기로부터유래된 2가라디칼을의미한다. 아릴기는알킬, 알콕시, 아릴, 히드록시, 할로겐, 시아노, 아미노, 아미노-알킬, 트리플루오로메틸, 알킬렌디옥시및옥시-C 2 -C 3 -알킬렌으로부 터선택된 1, 2 또는 3 개의라디칼에의해일치환, 이치환또는삼치환될수있거나 ; 이들모두는임의로, 예 를들어, 상기정의된바와같이추가로치환되거나 ; 1- 또는 2- 나프틸 ; 또는 1- 또는 2- 페난트레닐일수있다. [0101] 알킬렌디옥시는페닐의 2 개의인접한탄소원자에부착된 2 가치환기, 예를들어, 메틸렌디옥시또는에틸렌디 옥시이다. 옥시 -C 2 -C 3 - 알킬렌은또한페닐의 2 개의인접한탄소원자에부착된 2 가치환기, 예를들어, 옥시 에틸렌또는옥시프로필렌이다. 옥시 -C 2 -C 3 - 알킬렌 - 페닐에대한예는 2,3- 디히드로벤조푸란 -5- 일이다. [0102] [0103] 아릴로서바람직한것은나프틸, 페닐또는알콕시, 페닐, 할로겐, 알킬또는트리플루오로메틸에의해일치환되거나이치환된페닐, 특히페닐또는알콕시, 할로겐또는트리플루오로메틸에의해일치환되거나이치환된페닐, 특히페닐이다. R로서치환된페닐기의예는, 예를들어, 헤테로시클릭고리내에서임의로치환된 4-클로로펜-1-일, 3,4-디클

25 로로펜-1-일, 4-메톡시펜-1-일, 4-메틸펜-1-일, 4-아미노메틸펜-1-일, 4-메톡시에틸아미노메틸펜 -1-일, 4-히드 록시에틸아미노메틸펜-1- 일, 4-히드록시에틸-( 메틸 )-아미노메틸펜-1-일, 3-아미노메틸펜-1-일, 4-N-아세틸아미 노메틸펜-1-일, 4-아미노펜-1-일, 3-아미노펜-1-일, 2-아미노펜-1-일, 4-페닐-펜-1-일, 4-( 이미다졸-1-일 )-펜- 일, 4-( 이미다졸-1-일메틸 )-펜-1-일, 4-( 모르폴린-1-일 )-펜-1-일, 4-( 모르폴린-1-일메틸 )-펜-1-일, 4-(2-메톡 시에틸아미노메틸 )-펜-1-일 및 4-( 피롤리딘-1-일메틸 )-펜-1-일, 4-( 티오페닐 )-펜-1-일, 4-(3-티오페닐 )-펜-1-일, 4-(4-메틸피페라진-1-일 )-펜-1-일, 및 4-( 피페리디닐 )-페닐 및 4-( 피리디닐 )-페닐이다. [0104] [0105] [0106] " 아릴렌 " 은 2 이상의다른기를연결하는상기정의된아릴기를의미한다. 아릴렌에연결된 2 개의모이어티는아릴렌의상이한원자에연결된다. 아릴렌기는페닐렌을포함하나, 이에제한되지는않는다. " 아릴렌-옥시 " 는아릴렌에연결된모이어티중하나가산소원자를통해연결된상기정의된아릴렌기를의미한다. 아릴렌-옥시기는페닐렌-옥시를포함하나, 이에제한되지는않는다. 유사하게, 아릴및헤테로아릴기에대한치환기는다양하며, 이는방향족고리계에서 0 내지개방원자가의전체수범위의수의 -할로겐, -OR', -OC(O)R', -NR'R'', -SR', -R', -CN, -NO 2, -CO 2 R', -CONR'R'', -C(O)R', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR''C(O) 2 R',-NR'-C(O)NR''R''', -NH-C(NH 2 )=NH, -NR'C(NH 2 )=NH, -NH- C(NH 2 )=NR', -S(O)R', -S(O) 2 R', -S(O) 2 NR'R'', -N 3, -CH(Ph) 2, 퍼플루오로 (C 1 -C 4 ) 알콕시, 및퍼플루오로 (C 1 - C 4 ) 알킬로부터선택되고 ; 여기서 R', R'' 및 R''' 는독립적으로수소, (C 1 -C 8 ) 알킬및헤테로알킬, 비치환된아릴및헤테로아릴, ( 비치환된아릴 )-(C 1 -C 4 ) 알킬, 및 ( 비치환된아릴 ) 옥시-(C 1 -C 4 ) 알킬로부터선택된다. [0107] 아릴또는헤테로아릴고리의인접한원자상의치환기중두개는화학식 -T-C(O)-(CH 2 ) q -U- 의치환기로임의로 대체될수있고, 상기식에서, T 및 U 는독립적으로 -NH-, -O-, -CH 2 - 또는단일결합이고, q 는 0 내지 2 의정 수이다. 대안적으로, 아릴또는헤테로아릴고리의인접한원자상의치환기중두개는화학식 -A-(CH 2 ) r - B- 의치환기로임의로대체될수있고, 상기식에서, A 및 B 는독립적으로 -CH 2 -, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O) 2 -, -S(O) 2 NR'- 또는단일결합이고, r 은 1 내지 3 의정수이다. 이렇게하여형성된새로운고리의단일 결합중하나는임의로이중결합으로대체될수있다. 대안적으로, 아릴또는헤테로아릴고리의인접한원 자상의치환기중두개는화학식 -(CH 2 ) s -X-(CH 2 ) t - 의치환기로임의로대체될수있고, 상기식에서, s 및 t 는독립적으로 0 내지 3 의정수이고, X 는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O) 2 -, 또는 -S(O) 2 NR'- 이다. -NR'- 및 -S(O) 2 NR'- 에서치환기 R' 은수소또는비치환된 (C 1 -C 6 ) 알킬로부터선택된다. [0108] [0109] [0110] " 헤테로아릴 " 은 5 내지 16 개의고리원자를함유하는모노시클릭또는융합된바이시클릭또는트리시클릭방향족고리집합체를의미하고, 여기서고리원자의 1 내지 4 개는 N, O 또는 S와같은헤테로원자이다. 예를들어, 헤테로아릴은피리딜, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 푸라닐, 피롤릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 또는, 예를들어, 알킬, 니트로또는할로겐에의해치환된, 특히일치환되거나이치환된임의의다른라디칼을포함한다. 피리딜은 2-, 3- 또는 4-피리딜, 유리하게는 2- 또는 3-피리딜이다. 티에닐은 2- 또는 3-티에닐이다. 퀴놀리닐은바람직하게는 2-, 3- 또는 4-퀴놀리닐을나타낸다. 이소퀴놀리닐은바람직하게는 1-, 3- 또는 4-이소퀴놀리닐을나타낸다. 벤조피라닐, 벤조티오피라닐은바람직하게는각각 3-벤조피라닐또는 3-벤조티오피라닐을나타낸다. 티아졸릴은바람직하게는 2- 또는 4-티아졸릴, 가장바람직하게는 4-티아졸릴을나타낸다. 트리아졸릴은바람직하게는 1-, 2- 또는 5-(1,2,4-트리아졸릴 ) 이다. 테트라졸릴은바람직하게는 5-테트라졸릴이다. 바람직하게는, 헤테로아릴은피리딜, 인돌릴, 퀴놀리닐, 피롤릴, 티아졸릴, 이속사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티에닐, 푸라닐, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 이소퀴놀리닐, 벤조티에닐, 옥사졸릴, 인다졸릴, 또는치환된, 특히일치환되거나이치환된임의의라디칼이다. 본원에서사용되는용어 " 헤테로알킬 " 은 N, O 및 S와같은 1 내지 3 개의헤테로원자를갖는알킬기를의미한다. B, Al, Si 및 P를포함하나, 이에제한되지는않는추가헤테로원자가또한유용할수있다. 비제한적인예로, -S(O)- 및 -S(O) 2 -와같이헤테로원자는또한산화될수있다. 예를들어, 헤테로알킬은에테 르, 티오에테르, 알킬 - 아민및알킬 - 티올을포함할수있다

26 [0111] [0112] [0113] 본원에서사용되는용어 " 헤테로알킬렌 " 은 2 이상의다른기를연결하는상기정의된헤테로알킬기를의미한다. 헤테로알킬렌에연결된 2 개의모이어티는헤테로알킬렌의동일한원자또는상이한원자에연결될수있다. " 친전자체 " 는친핵체와반응할수있는친전자성중심, 즉, 전자를찾는중심을갖는이온성일수있는이온또는원자또는원자의집합을의미한다. 친전자체 ( 또는친전자성시약 ) 는반응파트너로부터둘모두의결합전자를수용함으로써반응파트너 ( 친핵체 ) 에대한결합을형성하는시약이다. " 친핵체 " 는친핵성중심, 즉, 친전자성중심을찾거나친전자체와반응할수있는중심을갖는, 이온성일수있는이온또는원자또는원자의집합을의미한다. 친핵체 ( 또는친핵성시약 ) 은둘모두의결합전자를제공함으로써반응파트너 ( 친전자체 ) 에대한결합을형성하는시약이다. " 친핵성기 " 는반응성기와반응한후의친핵체를의미한다. 비제한적인예로아미노, 히드록실, 알콕시, 할로알콕시등을포함한다. [0114] " 말레이미도 " 는술프히드릴 ( 예를들어, 티오알킬 ) 과반응시구조를갖는 -S- 말레이미도 기를형성하는, 구조를갖는피롤 -2,5- 디온 -1- 일기를의미하며, 상기식에서, " " 는말레 이미도기에대한부착지점을나타내고, " 부착지점을나타낸다. " 는본래의술프히드릴함유기의나머지에대한황원자티올의 [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] 본발명의개시의목적상, 단백질및폴리펩티드에서발견되는 " 자연발생아미노산 " 은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루타민, L-글루탐산, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, 및 / 또는 L-발린이다. 단백질에서발견되는 " 비자연발생아미노산 " 은자연발생아미노산으로언급된것이외의임의의아미노산이다. 비자연발생아미노산은, 비제한적인예로, 자연발생아미노산의 D 이성질체, 및자연발생아미노산의 D 및 L 이성질체의혼합물을포함한다. 4-히드록시프롤린, 데스모신, 이소데스모신, 5-히드록시리신, 엡실론-N-메틸리신, 3-메틸히스티딘과같은다른아미노산은비록자연발생단백질에서발견되나, 이들은일반적으로 mrna의리보솜번역이외의수단에의해도입됨에따라본개시의목적상단백질에서발견되는비자연발생아미노산인것으로간주된다. 중합체의기하학, 구성또는전체구조와관련하여 " 선형 " 은단일중합체아암을갖는중합체를의미한다. 중합체의기하학, 구성또는전체구조와관련하여 " 분지형 " 은원자전달라디칼중합반응에서이용되는개시제로부터유래될수있는 L 기와같은코어구조로부터연장된 2 이상의중합체 " 아암 (arm)" 을갖는중합체를의미한다. 분지형중합체는 2 개의중합체아암, 3 개의중합체아암, 4 개의중합체아암, 5 개의중합체아암, 6 개의중합체아암, 7 개의중합체아암, 8 개의중합체아암또는그이상을가질수있다. 본발명의개시의목적상, 단일선형기로부터연장된 3 개이상의중합체아암을갖는화합물은 " 코움 (comb)" 구조또는 " 코움 " 구성을갖는것으로표시된다. 분지형은또한더넓은덴드리머-유사구성을형성시키는 " 통계 (statistical)" 구조를통해달성될수있다. " 약학적으로허용되는 " 조성물또는 " 약학적조성물 " 은본발명의화합물및약학적으로허용되는부형제또는약학적으로허용되는부형제들을포함하는조성물을의미한다. " 약학적으로허용되는부형제 " 및 " 약학적으로허용되는담체 " 는본발명의조성물에포함될수있고, 환자에대해어떠한유의한해로운독물학적효과도야기시키지않는부형제를의미한다. 약학적으로허용되는부형제의비제한적인예는물, NaCl, 일반 (normal) 염수용액, 락테이트화된링거액 (lactated Ringer's), 일반수크로오스, 일반글루코오스등을포함한다. " 환자 " 또는 "~ 를필요로하는피검체 " 는본원에서제공된약학적조성물의투여에의해예방되거나치료될수 있는질환을앓고있거나이러한질환에걸리기쉬운살아있는생물체를의미한다. 비제한적인예로인간, 다른포유류및다른비-포유류동물을포함한다. " 치료적유효량 " 은확인된질병또는상태를치료하거나, 개선시키거나, 예방하거나, 검출가능한치료또는억

27 제효과를나타내는데유용한컨쥬게이션된기능성작용제또는약학적조성물의양을의미한다. 당해기술분야에서공지된임의의검정법에의해검출될수있다. 상기효과는 [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] 물질의 " 생물학적반감기 " 는생물체로의물질의도입후에물질의절반이생물체로부터제거되는데필요한시간을특정하는약동학적파라미터이다. III. 고분자중합체본발명은친수성기및작용기또는연결기를갖는고분자중합체를제공한다. 몇몇구체예에서, 본발명은아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐피리딘, 비닐피롤리딘또는비닐에스테르예컨대비닐아세테이트로부터각각독립적으로선택되는복수의단량체를각각갖는둘이상의중합체아암을갖는중합체를제공하며, 여기서각단량체는친수성기를포함한다. 중합체는또한중합체아암의근위말단에연결된개시제단편을포함하며, 여기서개시제모이어티는라디칼중합에적합하다. 중합체는또한중합체아암의원위말단에연결된말단기를포함한다. 중합체의하나이상의개시제단편및말단기는기능성작용제 (functional agent) 또는연결기를포함한다. 다른구체예에서, 본발명은아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐피리딘, 비닐피롤리딘또는비닐에스테르예컨대비닐아세테이트로부터각각독립적으로선택되는복수의단량체를갖는중합체아암을갖는중합체를제공하며, 여기서각단량체는친수성기를포함한다. 중합체는또한중합체아암의근위말단에연결된개시제단편을포함하며, 여기서개시제모이어티는라디칼중합에적합하다. 중합체는또한중합체아암의원위말단에연결된말단기를포함한다. 중합체의하나이상의개시제단편및말단기는기능성작용제또는연결기를포함한다. 게다가, 중합체는다각도광산란에의해측정된바와같이, 약 50 kda 내지약 1,500 kda의피크분자량 (Mp) 을갖는다. 본발명의중합체는임의의적합한분자량을가질수있다. 본발명의고 MW 중합체를위한예시적인분자량은약 50 내지약 1,500 킬로-달톤 (kda) 이될수있다. 몇몇구체예에서, 본발명의고 MW 중합체는약 50 kda, 약 100 kda, 약 200 kda, 약 250 kda, 약 300 kda, 약 350 kda, 약 400 kda, 약 450 kda, 약 500 kda, 약 750 kda, 약 1,000 kda 또는약 1,500 kda의분자량을가질수있다. 몇몇다른구체예에서, 본발명은아래화학식의중합체를제공한다 : [0128] [0129] 여기서 R 1 은 H, L 3 -A 1, LG 1 또는 L 3 -LG 1 이될수있다. 각각의 M 1 및 M 2 는아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐피리딘, 비닐피롤리딘또는비닐-에스테르로부터독립적으로선택될수있다. 각각의 G 1 및 G 2 는각각독립적으로친수성기이다. 라디칼중합을통한중합체의중합을위해 I-I' 의조합이개시제가되도록각각의군 I는개시제단편이고 I' 는라디칼스캐빈저이다. 택일적으로, 각각의 I' 은 H, 할로겐또는 C 1-6 알킬로부터독립적으로선택될수있다. 각각의 L 1, L 2 및 L 3 은링커가될수있다. 각각의 A 1 은기능성작용제가될수있다. 각각의 LG 1 은연결기가될수있다. 아랫첨자 x 및 y 1 은각각독립적으로 1 내지 1000의정수가될수있다. 각각의아랫첨자 z는독립적으로 1 내지 10의정수가될수있다. 아랫첨자 s는독립적으로 1 내지 100의정수가될수있다. [0130] 다른구체예에서, 본발명은화학식 I 의중합체를제공한다 :

28 [0131] [0132] (I) 여기서화학식 I 의 R 1 은 H, L 3 -A 1, LG 1 또는 L 3 -LG 1 이될수있다. 각각의화학식 I 의 M 1 및 M 2 는아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐피리딘, 비닐피롤리딘또는비닐 - 에스테르로부 터독립적으로선택될수있다. 각각의화학식 I 의 ZW 및 ZW 1 은독립적으로쯔비터이온성모이어티가될수있 다. 라디칼중합을통한화학식 I 의중합체의중합을위해 I-I' 의조합이개시제가되도록각각의 I 는개시제 단편이고 I' 는라디칼스캐빈저이다. 택일적으로, 각각의 I' 은 H, 할로겐또는 C 1-6 알킬로부터독립적으로선 택될수있다. 각각의 L 1, L 2 및 L 3 은링커가될수있다. 각각의화학식 I 의 A 1 은기능성작용제가될수있 다. 각각의화학식 I의 LG 1 은연결기가될수있다. 화학식 I의아랫첨자 x 및 y 1 은각각독립적으로 1 내지 1000의정수가될수있다. 각각의화학식 I의아랫첨자 z는독립적으로 1 내지 10의정수가될수있다. 화학식 I의아랫첨자 s는독립적으로 1 내지 100의정수가될수있다. s, x, y 1 및 z의합은, 다각도광산란에의해측정된바와같이, 화학식 I의중합체가약 50kDa 내지약 1,500kDa의피크분자량을가지도록될수있다. [0133] 다른구체예에서, 중합체는아래화학식을가질수있다 : [0134] [0135] 몇몇다른구체예에서, 중합체는아래화학식을가질수있다 : [0136] [0137] 여기서 R 2 는 H 또는 C 1-6 알킬로부터선택될수있으며, PC 는포스포릴콜린이될수있다. [0138] 본발명의고 MW 중합체는또한임의의적합한수의공단량체, M 2 를가질수있다. 예를들어, 공단량체의수, 아랫첨자 z는 1 내지 10, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이될수있다. 공단량체의수, 아랫첨자 z는, 또한 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2가될수있다. 몇몇구체예에서, 본발명의고 MW 중합체는, 예컨대화학식 (Ia) 에서아랫첨자 z가 1인두개의다른단량체를가질수있다 :

29 [0139] [0140] (Ia) 추가적인공단량체 M 2 가본발명의고 MW 중합체에존재할수있으며, 예컨대 M 2a, M 2b, M 2c, M 2d, M 2e, M 2f, M 2g, M 2h, 등은상기 M 2 에대해정의된바와같고, 각각의공단량체가동일하거나다른 y 1 값으로존재하며, 상응하는 ZW 1 기를가지는각각의공단량체가결합된다. [0141] 고 MW 중합체의다른단량체는또한임의의적합한비율로존재할수있다. 예를들어, M 2 단량체는, 총괄적이 거나개별적으로, M 1 단량체에대해 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 및 1:100의비율로존재할수있다. 게다가, 각각의 M 2 단량체는 M 1 또는임의의다른 M 2 단량체에대해임의의적합한비율, 예컨대 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 및 1:100으로존재할수있다. [0142] [0143] 본발명의고 MW 중합체는임의의적합한아키텍쳐를가질수있다. 예를들어, 고 MW 중합체는선형또는분지형이될수있다. 고 MW 중합체가분지형인경우, 이들은화학식 I의아랫첨자 s에정의된바와같이, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100 아암에이르는임의의적합한수의중합체아암을가질수있다. 몇몇구체예에서, 아랫첨자 s는 1 내지 32, 1 내지 16, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2가될수있다. 본발명의고 MW 중합체는임의의적합한아키텍쳐를채택할수있다. 예를들어, 고 MW 중합체는선형, 분자형, 스타형, 덴드리머, 코움 (combs) 형, 등이될수있다. 고 MW 중합체의기능성작용제는개시제단편 I, 또는라디칼스캐빈저 I', 또는둘모두에결합될수있다. 다중기능성작용제가존재하는경우, L 1 은둘이상의기능성작용제가개시제단편 I 에결합될수있도록분지 형링커가될수있다. 몇몇구체예에서, 고 MW 중합체는화학식 (Ib) 를갖는다 : [0144] [0145] (Ib) 화학식 (Ib) 에서, 기능성작용제 A 1 은약물, 치료적단백질또는목적작용제가될수있다. 링커 L 1 은, 예컨대 약물또는치료적단백질의원활한방출을위해약물또는치료적단백질에결합하는경우, 절단가능한링커가 될수있다. 택일적으로, 링커 L 1 은절단불가능한링커가될수있다. [0146] 다중공단량체 M 2 가존재하는경우, 각각의공단량체 M 2 는결합된다른쯔비터이온성기를가질수있다. 예를 들어, 고 MW 중합체는화학식 (Ic) 를가질수있다 : [0147] (Ic)

30 [0148] [0149] 여기서각각의 ZW 1a 및 ZW 1b 는 ZW에대해상기에서정의한바와같고, 각각의 y 1a 및 y 1b 는 y 1 에대해상기에서정 의한바와같다. 몇몇구체예에서, 고 MW 중합체는, 예컨대아래의구조식에서보여지는바와같은개시제단편 I에결합된연결 기 LG를갖는다 : [0150] [0151] 몇몇구체예에서, 본발명의고 MW 중합체는하나이상의부가적인단량체를갖는차후의중합을통해변경될수있다. 예를들어, 상기화학식 (Ic) 에서, 단량체 M 1 및 M 2a 는제1 중합에서공중합될수있으며, 단량체 M 2b 는제2 중합에서중합될수있다. 블록공중합체는, M 1 및 M 2a 의고 MW 중합체가되는제1 블록, 및 M 2b 의제2 블록호모중합체, 두블록들을가지도록형성된다. 택일적으로, 단량체 M 1 및 M 2a 의중합후, 단량체 M 2b 가단량체 M 2c 와공중합될수있으며, 따라서제 1 블록이 M 1 및 M 2a 의고 MW 중합체이고, 제 2 블록이 M 2b 및 M 2c 의고 MW 중합 체인블록공중합체가형성된다. 부가적인중합체구조는제 1 중합에서단량체 M 1, M 2a 및 M 2b 의공중합에의해 제조될수있으며, 이후제 2 공중합에서단량체 M 2c, M 2d, 및다른것들이공중합된다. 부가적인블록은부가적 인단량체를사용한제 3 중합에의해제조될수있다. 이러한중합체는다른특성, 약물및기능성작용제를 가질수있는공중합체의블록을제공한다. [0152] 몇몇구체예에서, 중합체는, [0153]

31 [0154], 또는 [0155] [0156] 이될수있으며, 여기서 PC 는포스포릴콜린이다

32 [0157] 몇몇다른구체예에서, 중합체는, [0158] [0159]

33 [0160] [0161] [0162] 이될수있다. 몇몇구체예에서, R 1 은 L 3 -A 1, LG 1 또는 L 3 -LG 1 이고 ; A 1 은약물, 항체, 항체단편, 단일도메인항체, 아비머, 아드넥틴, 디아보디, 비타민, 코펙터, 폴리사카라이드, 카보하이드레이트, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산. 라디오레벨, 대조작용제, 플루 오르포어또는염료이고 ; L 3 는 -(CH 2 CH 2 O) 이고; LG 1 은말레이미드, 아세탈, 비닐, 알릴, 알데히드, -C(O)O- C 1-6 알킬, 히드록시, 디올, 케탈, 아지드, 알킨, 카르복실산, 또는숙신이미드이다. 다른구체예에서, 각각의 LG 1 은히드록시, 카르복시, 비닐, 비닐옥시, 알릴, 알릴옥시, 알데히드, 아지드, 에틴, 프로핀, 프로파길, -C(O)O-C 1-6 알킬, [0163] 이다. [0164] [0165] A. 개시제 본발명의고 MW 중합체는임의의적합한개시제를사용하여중합된다. 본발명에서유용한개시제는화학식 I-(I') m 에의해기재될수있으며, 여기서아랫첨자 m 은 1 내지 100 의정수이다. 개시제단편 I 은중합을개시 하는임의의기가될수있다. 라디칼스캐빈저 I' 은중합체사슬성장을가역적으로종결시키는임의의기가될수있다. 라디칼스캐빈저 I' 는할로겐예컨대브롬이될수있으며, 중합체의말단이중합이후관능화되도록한다. 몇몇구체예에서, 라디칼스캐빈저 I' 은말단기로서언급된다. 또한, 개시제단편 I은고 MW 중합체의관능화정도 (functionality) 를조정하기위한다양한작용기를포함할수있는 R 1 기로임의로관능화될수있다. [0166] 본발명에서유용한개시제는, 각각중합체사슬의성장을가역적으로종결시킬수있는, 단일의라디칼스캐빈 저 I' 또는다중라디칼스캐빈저 I' 가있는임의의적합한수의가지들을가질수있다. 개시제단편 I 이분 지화되고다중중합체사슬을개시할수있는경우, 아랫첨자 m 은중합체사슬이성장함에따라많은라디칼스

34 캐빈저 I' 가있도록 1 초과이다. [0167] [0168] [0169] [0170] [0171] 본발명의중합체는복수의중합체아암을가질수있다. 예를들어, 중합체는 1 내지약 100개의중합체아암, 또는약 1 내지약 50개의중합체아암, 또는약 1 내지약 20개의중합체아암, 또는 1 내지약 10개의중합체아암, 또는 2 내지약 10개의중합체아암, 또는약 1 내지약 8개의중합체아암, 또는약 2 내지약 8 개의중합체아암, 또는 1 내지약 4개의중합체아암, 또는약 2 내지약 4개의중합체아암을가질수있다. 중합체는또한, 수평균분자량 (Mn) 으로나누어진중량평균분자량 (Mw) 으로측정되는임의의적합한다분산성지수 (PDI) 을가질수있으며, 1.0의 PDI가완전한단일분산중합체를나타낸다. 예를들어, PDI는약 2.0 미만, 또는약 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 또는 1.1 미만이될수있다. 몇몇구체예에서, 개시제단편은 1개의중합체아암과연결되고, 중합체는약 1.5 미만의다분산성지수를갖는다. 다른구체예에서, 개시제단편은 2 내지약 100개의중합체아암의근위말단에연결된다. 몇몇다른구체예에서, 중합체는약 2.0 미만의다분산성지수를갖는다. 여전히다른구체예에서, 개시제단편은 2개의중합체아암의근위말단에연결된다. 아직다른구체예에서, 개시제단편은 4개의중합체아암의근위말단에연결된다. 다른구체예에서, 개시제단편은 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 또는 12개의중합체아암의근위말단에연결된다. 유사-분지형 (Pseudo-branched) 중합체는또한중합체와인접되도록다중선형, 비분지형, 본발명의중합체에단일기능성작용제를결합함에의해얻어질수있다. 근접성은중합체를기능성작용제, 예를들어, 단백질상의시스테인상의인접포인트에결합함에의해얻어질수있다. 택일적으로, 근접성은, 단백질의이질적인영역에결합된중합체가단백질의폴딩및 2차및 3차구조에기인하여가까이근접되도록기능성작용제, 예를들어단백질의구조에의해얻어질수있다. 단일기능성작용제상의본발명의두중합체의근접성은, 어떻게근접성이달성되었는지에상관없이, 복수의중합체아암을가진본발명의중합체의그것과유사한특성이부여될수있다. 개시제단편 I 및라디칼스캐빈저 I' 사이의결합은불안정하며, 중합공정동안단량체 M 1 및공단량체 M 2 가개시제단편 I 및라디칼스캐빈저 I' 사이에삽입되도록한다. 예를들어, 자유라디칼, 예컨대 ATRP 중합동안, 도 1에도시된바와같이, 개시제단편 I 및라디칼스캐빈저 I' 는분리되어 I 및 I' 의라디칼을형성한다. 후에개시제단편 I의라디칼은용액중의단량체들과반응하여중합체를성장시키며전달중합체라디칼 ( 도 1 의종 A 및종 C) 을형성한다. 중합공정동안, 라디칼스캐빈저 I' 의라디칼은전달중합체라디칼과가역적으로반응하여중합체의성장을일시적으로정지시킬것이다. 단량체및라디칼스캐빈저 I' 사이의결합또한불안정하여, 결합이끊어질수있고전달중합체라디칼이부가적인단량체와반응하여중합체를성장시킬수있도록한다. 중합공정의결과, 개시제단편 I은중합체사슬의한쪽말단에있고라디칼스캐빈저 I' 은중합체사슬의반대쪽말단에있게된다. 개시제단편 I의라디칼은일반적으로 2차또는 3차탄소상이며, 인접한카르보닐탄소에의해안정화될수있다. 라디칼스캐빈저 I' 은일반적으로할로겐, 예컨대브롬, 클로인또는아이오딘이다. 이와함께, 개시제 단편 I 및라디칼스캐빈저 I' 은본발명의고 MW 중합체의제조에유용한개시제 I 1 을형성한다. [0172] [0173] [0174] US 6,852,816 ( 여기서참조로통합됨 ) 에기재된몇몇개시제를포함하는, 넓은다양성의개시제가본발명의고 MW 중합체의제조에사용될수있다. 몇몇구체예에서, 본발명의고 MW 중합체의제조를위해 ATRP 반응에사용되는개시제가알칸, 시클로알칸, 알킬카르복실산또는이들의에스테르, 시클로알킬카르복실산또는이들의에스테르, 에테르및시클릭알킬에테르, 알킬아릴기, 알킬아미드, 알킬아릴카르복실산및이들의에스테르로부터선택되며, 또한, 비분지형고 MW 중합체가제조되는경우하나의라디칼스캐빈저 I' 을포함하고, 분지형분자가제조되는경우, 하나이상의라디칼스캐빈저 I' 을포함한다. 본발명에유용한라디칼스캐빈저 I' 은, 제한되는것은아니지만, 할로겐, 예컨대 Br, Cl 및 I, 티오시아네이트 (-SCN) 및이소티오시아네이트 ( N=C=S) 이다. 다른기들은본발명의라디칼스캐빈저 I' 에유용하다. 몇몇구체예에서, 라디칼스캐빈저 I' 은브롬이다. ATRP 반응을위해사용되는개시제는하이드록실화될수있다. 몇몇구체예에서, 본발명의고 MW 중합체의제조를위한 ATRP 반응을위해사용된개시제가알칸, 시클로알칸, 알킬카르복실산또는이들의에스테르, 시클로알킬카르복실산또는이들의에스테르, 에테르및시클릭알킬에테르, 알킬아릴기, 알킬아미드, 알킬아릴카르복실산및이들의에스테르로부터선택되며, 하이드록실기를포함하며, 또한, 비분지형고 MW 중합체를제조하기위해서는하나의라디칼스캐빈저 I' 을포함하거나, 택일적으로분지형분자를제조하기위해서는, 하나

35 이상의라디칼스캐빈저 I' 을포함한다. [0175] [0176] [0177] ATRP 반응을위해사용되는개시제는하나이상의아민기를포함할수있다. 몇몇구체예에서, 본발명의고 MW 중합체의제조를위한 ATRP 반응을위해사용된개시제가알칸, 시클로알칸, 알킬카르복실산또는이들의에스테르, 시클로알킬카르복실산또는이들의에스테르, 에테르및시클릭알킬에테르, 알킬아릴기, 알킬아미드, 알킬아릴카르복실산및이들의에스테르로부터선택되며, 아민기를포함하며, 또한, 비분지형고 MW 중합체를제조하기위해서는하나의라디칼스캐빈저 I' 을포함하거나, 택일적으로분지형분자를제조하기위해서는, 하나이상의라디칼스캐빈저 I' 을포함한다. 알킬디카르복실산을포함하는, 하나이상의라디칼스캐빈저 I' 을갖는, 아미노또는히드록시기로치환된, 알킬카르복실산이또한개시제로서사용될수있다. ATRP 반응이본발명의고 MW 중합체의제조를위해사용되는본발명의몇몇구체예에서, 개시제는클로린및브롬으로부터선택된하나이상의할로겐을함유한알킬카르복실산이될수있다. COOH, OH 및 NH 2, 및하나이상의라디칼스캐빈저 I' 로부터선택된둘이상의기로치환된알칸은, 또한 ATRP 반응이본발명의고 MW 중합체의제조를위해사용되는경우고 MW 중합체의제조를위한개시제로서사용될 수있다. [0178] [0179] [0180] [0181] 개시제는또한, 제한되는것은아니지만, OH, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, -O-알킬, -COOH, -COO알킬, 또는포스페이트기 ( 또는이들의보호된형태 ) 를포함하는하나이상의기들을함유할수있다. 개시제의넓은다양성은상업적으로구입가능한, 예를들어시그마알드리치 (St. Louis, MO) 로부터구매가능한브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드에스테르이다. 이러한개시제의적합한보호형태는필요에따라당업계의표준방법을사용하여제조될수있다. 다른개시제는, 예를들어, 알킬퍼옥사이드, 치환된알킬퍼옥사이드, 아릴퍼옥사이드, 치환된아릴퍼옥사이드, 아실퍼옥사이드, 알킬하이드로퍼옥사이드, 치환된아릴하이드로퍼옥사이드, 아릴하이드로퍼옥사이드, 치환된아릴하이드로퍼옥사이드, 헤테로알킬퍼옥사이드, 치환된헤테로알킬퍼옥사이드, 헤테로알킬하이드로퍼옥사이드, 치환된헤테로알킬하이드로퍼옥사이드, 헤테로아릴퍼옥사이드, 치환된헤테로아릴퍼옥사이드, 헤테로아릴하이드로퍼옥사이드, 치환된헤테로아릴하이드로퍼옥사이드, 알킬퍼에스테르, 치환된알킬퍼에스테르, 아릴퍼에스테르, 치환된아릴퍼에스테르, 아조화합물및할라이드화합물을포함하는열, 산화환원또는광개시제를포함한다. 특정개시제는큐멘하이드로퍼옥사이드 (CHP), tert-부틸하이드로퍼옥사이드 (TBHP), tert-부틸퍼벤조에이트, (TBPB), 소듐카보네이트퍼옥사이드, 벤조일퍼옥사이드 (BPO), 라우로일퍼옥사이드 (LPO), 메틸에틸케톤 45%, 포타슘퍼술페이트, 암모늄퍼술페이트, 2,2-아조비스 (2,4-디메틸발레로니트릴 ), 1,1-아조비스 ( 시클로헥산카보니트릴 ), 2,2-아조비스 (N,N-디메틸렌이소부티라미딘 ) 디하이드로클로라이드, 및 2,2-아조비스 (2-아미도프로판 ) 디하이드로클로라이드를포함한다. 산화환원페어는예컨대퍼술페이트 / 설파이트및 Fe (2+) 퍼옥사이드또는암모늄퍼술페이트및 N,N,N'N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED) 이다. 본발명의고 MW 중합체의제조에유용한다른개시제는분지형이다. 단일분지포인트를갖는적합한개시제는아래의화합물을포함한다 : [0182]

36 [0183] 여기서라디칼 R 은임의의아래의것들이될수있다 : [0184] [0185] [0186] 몇몇구체예에서, 개시제는이될수있으며, 이는부가적인작용기를갖는반응을위한말레이미드를형성하기위한중합후탈보호화될수있는보호된말레이미드이다. 부가적인분지형개시제는, 제한되는것은아니지만, 아래의것들이고, 여기서, 라디칼 R은상기정의된바와같다 : [0187] [0188] 몇몇구체예에서, 분지형개시제는, 제한되는것은아니지만, 아래의것들을포함한다 : [0189] [0190] 본발명의고 MW 중합체의제조에유용한다른분지형개시제는아래의것들을포함한다 : [0191] [0192] 여기서라디칼 R 은상기에정의된바와같고, 라디칼 X 는 CHO, SO 2 Cl, SO 2 CH=CH 2, NHCOCH 2 I, N=C=O 및그중에서 도 N=C=S 가될수있다. 부가적인 X 기는아래의것들을포함할수있다 :

37 [0193] [0194] 여전히다른개시제는, 제한되는것은아니지만, 아래의것들을포함한다 : [0195] [0196] 다른구체예에서, 개시제는복수의중합체아암을얻기위한다양한분지형포인트를가질수있다, 예컨대 : [0197] [0198] 여기서라디칼 R 은상기에서정의된바와같다. 몇몇다른구체예에서, 개시제는아래의구조를가질수있다 : [0199]

38 [0200] 몇몇다른구체예에서, 개시제는아래의구조를가질수있다 : [0201]

39 [0202]

40 [0203]

41 [0204] [0205] [0206] [0207] 상술한바와같이, 개시제는별도로중합혼합물에첨가될수있거나, 다른분자, 예컨대단량체 ( 하이퍼브랜치구조 ) 또는중합체단편 ( 예컨대그라프트공중합체 ) 에포함될수있다. 중합의개시는열, UV 광, 또는당업자에게알려진다른방법에의해달성될수있다. 몇몇구체예에서, 본발명의개시제 I-I' 는아래화학식을갖는다 :

42 [0208] (F) r -Sp 1 -C-Sp 2 -I' [0209] 여기서개시제단편 I은 F-Sp 1 -C-Sp 2 에대응한다. 각각의라디칼 F는본발명의기능성작용제또는연결기와반응하기위한작용기이다. 라디칼 r은 1 내지 10이다. 라디칼 Sp 1 및 Sp 2 는스페이서이며공유결합, 예컨대 C 1-6 알킬, 아릴또는헤테로아릴을형성하기위한임의의적합한기가될수있다. 라디칼 C는하나이상의스 페이서, Sp 2 ( 동일하거나다를수있는 ), 및하나이상의라디칼스캐빈저, I' 에연결되기위한하나또는복수의포인트를제공하고, 하나이상의스페이서, Sp 1 ( 동일하거나다를수있는 ), 및하나이상의작용기, F ( 동일하거나다를수있는 ) 에연결되기위한하나또는복수의포인트를제공하는임의의코어가될수있다. 코어 C는임의의적합한구조, 예컨대분지형구조, 헤테로원자가포함된가교구조, 예컨대실세스퀴록산, 및다중펜던트작용기를갖는선형, 쇼트중합체가될수있다. 또한, 코어 C는, 제한되는것은아니지만, 에스테르, 아미드, 에테르, 및케톤을포함하는공유결합을형성하기위한임의의적합한기에의해하나이상의 Sp 1 및 Sp 2 스페이서에결합될수있다. 라디칼스캐빈저 I' 는라디칼성이동성원자또는기예컨대, 제한되는것은아니지만, 할로겐, Cl, Br, I, OR 10, SR 11, SeR 11, OC(=O)R 11, OP(=O)R 11, OP(=O)(OR 11 ) 2, O-(R 11 ) 2, S- C(=S)N(R 11 ) 2, CN, NC, SCN, CNS, OCN, CNO, N 3, OH, O, C1-C6-알콕시, (SO 4 ), PO 4, HPO 4, H 2 PO 4, 트리플레이트, 헥사플루오로포스페이트, 메탄술포네이트, 아릴술포네이트, 카르복실산할라이드이다. R 10 은 1 내지 20개의탄소원자의알킬또는각각의수소원자가할라이드에의해대체될수있는 1 내지 20개의탄소원자의알킬, 2 내지 20개의탄소원자의알켄일, 2 내지 10개의탄소원자의알킨일, 페닐, 1 내지 5개의할로겐원자또는 1 내지 4개의탄소원자를갖는알킬기, 아랄킬, 아릴, 아릴치환된알킬로치환된페닐, 여기서아릴기는페닐또는치환된페닐이고알킬기는 1 내지 6개의탄소원자이며, R 11 은아릴또는직쇄또는분지쇄 C 1 -C 20 알킬기이거나여기서 N(R 11 ) 2 기가존재하고, 두개의 R 11 기는 5, 6 또는 7원헤테로시클릭고리를형성하도록결합될수있다. 스페이서 Sp 1 는작용기 F 및코어 C에공유적으로결합하며동시에스페이서 Sp 2 는코어 C 및라디칼스캐빈저 I' 와공유적으로결합한다. [0210] 다른구체예에서, 본발명의개시제는아래화학식을갖는다 : [0211] [0212] 여기서각각의 I' 은독립적으로할로겐, -SCN, 또는 NCS로부터선택된다. L 4 및 L 5 는각각독립적으로결합또는링커이며, L 4 및 L 5 중하나는링커가되도록한다. C는결합또는코어기이다. LG 2 는연결기이다. 아랫첨자 p는 1 내지 100이며, 여기서아랫첨자 p가 1인경우, C는결합이고, 아랫첨자 p가 2 내지 100인경우, C는코어기이다. 몇몇다른구체예에서, 개시제는아래화학식을갖는다 : [0213] [0214] [0215] [0216] 여기서각각의 R 3 및 R 4 는독립적으로 H, CN 또는 C 1-6 알킬로부터선택된다. B. 단량체본발명의고분자량 (high MW) 중합체를준비하는데유용한단량체들은라디칼중합이가능한임의의단량체를포함한다. 전형적으로, 이러한단량체들은비닐기를갖는다. 적합한단량체들은아크릴레이트, 메타크릴레이

43 트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈및비닐아세테이트단량체들과같은비닐에스테르들을포함하지만, 이에한정되지않는다. 본발명에유용한단량체들은친수성기를포함한다. 본발명의친수성기는임의의적합한친수성기일수있다. 예를들면, 친수성기는쌍성이온기들및친수성중합체들을포함할수있다. 일부구현예들에서, 각각의친수성기는쌍성이온기를포함한다. 본발명의쌍성이온기들은음전하및양전하모두를띄는임의의화합물을포함한다. 음전하를띄고, 본발명의쌍성이온의사용에적합한기들은포스페이트, 술페이트, 기타옥소어니언 (oxoanions) 등을포함하지만, 이에한정되지않는다. 양전하를띄고, 본발명의쌍성이온의사용에적합한기들은암모늄이온들을포함하지만, 이에한정되지않는다. 일부구현예에서, 쌍성이온은포스포릴콜린일수있다. 본발명에유용한다른쌍성이온은 WO 및 WO ( 참조로여기에포함됨 ) 에기술된것들을포함한다. 본발명에유용한친수성중합체는폴리에틸렌옥사이드, 폴리옥사졸린, 셀룰로오즈, 덱스트란및기타다당류중합체들을포함한다. 본기술분야의당업자는다른친수성중합체도본발명에유용하다는것을인정할것이다. [0217] [0218] 다른친수성기는히드록시, 아민, 카르복실산, 아미드, 술포네이트및포스포네이트를포함하지만, 이에한정되지않는다. 이러한친수성기를포함하는본발명에유용한단량체들은아크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드 (NiPAAM) 및기타치환된아크릴아미드, 아크릴산등을포함하지만, 이에한정되지않는다. 쌍성이온성모이어티, ZW 를함유하는단량체들, M 1 은다음의것들을포함하지만, 이에한정되지않는다 : [0219] [0220] [0221] [0222] [0223] 다른단량체들은당업자에게잘알려져있고, 비닐아세테이트및그유도체들을포함한다. 일부구현예들에서, 친수성기는쌍성이온기가될수있다. 일부구현예에서, 단량체는 2-( 메타크릴로일옥시에틸 )-2 ( 트리메틸암모늄에틸 ) 포스페이트 (HEMA-PC) 일수있다. 일부구현예에서, 단량체는 2-( 아크릴로일옥시에틸 )-2'-( 트리메틸암모늄에틸 ) 포스페이트가될수있다. C. 링커본발명의고분자량중합체들은또한임의의적합한링커 L을포함할수있다. 링커 L 3 는개시제단편 I에기 능성작용제의부착을제공하고, 링커 L 1 및 L 2 은공중합체 M 1 및M 2 에쌍성이온기의부착을제공한다. 링커는절단성 (cleavable) 또는비절단성 ( non-cleavable), 동질적양기능성 (homobifunctional) 또는이질적양기능성 (heterobifunctional) 일수있다. 다른링커는이질적양기능성과절단성모두, 또는동질적양기능성및절단성모두일수있다. [0224] [0225] 절단성링커들은그중에서도가수분해성링커, 효소절단성링커, ph 민감성링커, 디설피드 (disulfide) 링커및광불안정성 (photolabile) 링커인것들을포함한다. 가수분해성링커는물과의반응으로링커를절단하도록링커내에에스테르, 카보네이트또는카르바메이트작용기를갖는것들을포함한다. 효소절단성링커는효소에의해절단되고, 링커내에에스테르, 아미도, 또는카르바메이트작용기를포함할수있는것들을포함한다. ph 민감성링커는하나의 ph에서안정하지만, 또다른 ph에서는불안정한것을포함한다. ph 민감성링커는, 산성에서염기성상태로, 염기성에서산성상태로, 약산성에서강산성상태로, 또는약염기성에서강염기성상태로 ph가변화될수있다. 적합한 ph 민감성링커가당업자에게잘알려져있으며, 케탈, 아세탈, 이민또는이미늄 ( imminiums), 실록산 (siloxane), 실라잔 (silazanes), 실란 (silanes), 말리메이트-아미드결합 (maleamates-amide bond), 오르쏘 (ortho) 에스테르, 히드라존 (hydrazones) 활성카르복실산유도체및비닐에테르를포함하지만, 이에한정되지않는다. 디설피드링커는링커내에디설피드결합을갖는것으로특징되고, 환원조건하에서절단된다. 광불안성링커는가시광선, 적외선, 자외선, 또는다른파장에서전자기방사선과같은빛에노출에의해절단되는것들을포함한다. 본발명에서유용한다른링커들은미국특허출원제 2008/ 호 ( 어센디스 / 컴플렉스바이오시스템에양도 ) 와제 2008/ 호 ( 미러스에양도 ) 및국제특허출원번호 WO2004/ 및 WO2009/ ( 시애틀제

44 네틱스에양도 ) 및 01/24763, 2009/ 및 2010/ ( 이뮤노젠에양도 ) ( 여기서전체로서포함됨 ) 에서 기술된것들을포함한다. 본발명에유용한미러스 (Mirus) 링커는다음의것들을포함하지만, 이에한정되지 않는다 : [0226] [0227] [0228] [0229] 다른링커는 Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2008년제 2판 ( 여기서전체로서포함됨 ) 에기술된것및 Angew. Chem. Int. 2009년판, 48, (Bertozzi, C.R. 및 Sletten, E.M) ( 여기에전체로서포함됨 ) 에기술된것을포함한다. 일부구현예에서, 링커 L 1, L 2 및 L 3 은각원자는독립적으로 C, N, O, S 및 P인, 최대 30 원자의길이를갖을수있다. 다른구현예에서, 링커 L1 및 L2는다음의것들중하나일수있다 : -C 1-12 알킬-, -C 3-12 시클로알킬-, -(C 1-8 알킬 )-(C 3-12 시클로알킬 )-(C 0-8 알킬 )-, -(CH 2 ) 1-12 O-, (-(CH 2 ) 1-6 -O- (CH 2 ) 1-6 -) , (-(CH 2 ) 1-4 -NH-(CH 2 ) 1-4 ) , (-(CH 2 ) 1-4 -O-(CH 2 ) 1-4 ) O-, (-(CH 2 ) 1-4 -O-(CH 2 ) 1-4- ) 1-12 O-(CH 2 ) , -(CH 2 ) (C=O)-O-, -(CH 2 ) O-(C=O)-, -( 페닐 )-(CH 2 ) 1-3 -(C=O)-O-, -( 페닐 )-(CH 2 ) 1-3 -(C=O)-NH-, -(C 1-6 알킬 )- (C=O)-O-(C 0-6 알킬 )-, -(CH 2 ) (C=O)-O-(CH 2 ) , -CH(OH)-CH(OH)-(C=O)-O- -CH(OH)-CH(OH)-(C=O)-NH-, -S- 말레이미도-(CH 2 ) 1-6 -, -S-말레이미도-(C 1-3 알킬 )-(C=O)-NH-, -S-말레이미도-(C 1-3 알킬 )-(C 5-6 시클로알킬 )-(C 0-3 알킬 )-, -(C 1-3 알킬 )-(C 5-6 시클로알킬 )-(C 0-3 알킬 )-(C=O)-O-, -(C 1-3 알킬 )-(C 5-6 시클로알킬 )-(C 0-3 알킬 )-(C=O)- NH-, -S-말레이미도-(C 0-3 알킬 )-페닐-(C 0-3 알킬 )-, -(C 0-3 알킬 )-페닐-(C=O)-NH-, -(CH 2 ) NH-(C=O)-, -(CH 2 ) (C=O)-NH-, -( 페닐 )-(CH 2 ) 1-3 -(C=O)-NH-, -S-(CH 2 )-(C=O)-NH-( 페닐 )-, -(CH 2 ) (C=O)-NH-(CH 2 ) , -(CH 2 ) 2 - (C=O)-O-(CH 2 ) 2 -O-(C=O)-(CH 2 ) 2 -(C=O)-NH-, -(C 1-6 알킬 )-(C=O)-N-(C 1-6 알킬 )-, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬에테르, -N=CH-, -(C 1-6 알킬 )-S-S-(C 0-6 알킬 )-, -(C 1-6 알킬 )-S-S-(C 1-6 알킬 )-(C=O)-O-, -(C 1-6 알킬 )-S-S-(C 1-6 알킬 )-(C=O)-NH-, -S-S-(CH 2 ) 1-3 -(C=O)-NH-(CH 2 ) 1-4 -NH-(C=O)-(CH 2 ) 1-3 -, -S-S-(C 0-3 알킬 )-( 페닐 )-, -S-S-(C 1-3 -알킬 )-( 페닐 )-(C=O)-NH-(CH 2 ) 1-5 -, -(C 1-3 알킬 )-( 페닐 )-(C=O)-NH-(CH 2 ) 1-5 -(C=O)-NH-, -S-S-(C 1-3 -알킬)-, -(C 1-3 -알킬 )-( 페닐 )-(C=O)-NH-, -O-(C 1 -C 6 알킬 )-S(O 2 )-(C 1-6 알킬 )-O-(C=O)-NH-, -S-S-(CH 2 ) 1-3 -(C=O)-, -(CH 2 ) 1-3 -(C=O)- NH-N=C-S-S-(CH 2 ) 1-3 -(C=O)-NH-(CH 2 ) 1-5 -, -(CH 2 ) 1-3 -(C=O)-NH-(CH 2 ) 1-5 -(C=O)-NH-, -(CH 2 ) 0-3 -(hetero아릴)-(ch 2 ) 0-3-, -(CH 2 ) 0-3 -페닐-(CH 2 ) 0-3 -, N=C(R)-, -(C 1-6 알킬 )-C(R)=N-(C 1-6 알킬 )-, -(C 1-6 알킬 )-( 아릴 )-C(R)=N-(C 1-6 알킬 )-, -(C 1-6 알킬 )-C(R)=N-( 아릴 )-(C 1-6 알킬 )-, 및 -(C 1-6 알킬 )-O-P(O)(OH)-O-(C 0-6 알킬 )- 상기 R은 H, C 1-6 알킬, C 3-6 시클로알킬, 또는 5 내지 8의내향고리 (endocyclic) 원자를갖는아릴기이다. [0230] 일부구현예에서, 링커 L1, L2 및 L3 은다음중하나일수있다 : -C 1 -C 12 알킬 -, -C 3 -C 12 시클로알킬 -, (-(CH 2 ) 1-6-O-(CH 2 ) 1-6 -) , (-(CH 2 ) 1-4 -NH-(CH 2 ) 1-4 ) , -(CH 2 ) 1-12 O-, (-(CH 2 ) 1-4 -O-(CH 2 ) 1-4 ) O-, -(CH 2 ) (CO)-O-, -(CH 2 ) (CO)-NH-, -(CH 2 ) O-(CO)-, -(CH 2 ) NH-(CO)-, (-(CH 2 ) 1-4 -O-(CH 2 ) 1-4 ) O-(CH 2 ) , -(CH 2 ) (CO)-O-(CH 2 ) , -(CH 2 ) (CO)-NH-(CH 2 ) , -(CH 2 ) O-(CO)-(CH 2 ) , -(CH 2 ) NH-(CO)-(CH 2 ) , -(C 3 -C 12 시클로알킬 )-, -(C 1 -C 8 알킬 )-(C 3 -C 12 시클로알킬 )-, -(C 3 -C 12 시클로알킬 )-(C 1-8 알킬 )-, -(C 1-8 알킬 )-(C 3 - C 12 시클로알킬 )-(C 1-8 알킬 )- 및 -(CH 2 ) 0-3 -아릴-(CH 2 ) [0231] [0232] 여전히다른구현예에서, 각각의링커 L 1, L 2 및 L 3 는가수분해성링커, 효소절단성링커, ph 민감성링커, 디 설피드 (disulfide) 링커및광불안정성 (photolabile) 링커로부터독립적으로선택된절단성링커이다. 본발명에유용한다른링커는자기 - 희생적 (self-immolative) 링커를포함한다. 유용한자기 - 희생적 (self

45 immolative) 링커는예를들어항체약물컨쥬게이트에유용한것들로당업자에게알려져있다. 모범적인자기 - 희색적 (self-immolative) 링커는미국특허제 7,754,681 호에기술되어있다. [0233] [0234] D. 연결기 LG 본발명의링커및기능성작용제는개시제단편 I 상의연결기와반응하여결합을형성할수있다. 본발명의연결기는다른작용기에결합을형성함으로써두개의기를서로연결할수있는임의의적합한작용기일수있다. 예를들면, 본발명에유용한연결기 (LG) 는그중에서도, 클릭화학 (click chemistry), 말레이미드화학및 NHS-에스테르에사용되는것들을포함한다. 클릭화학에관련된연결기는휘스겐 (Huisgen) 고리부가프로세스 ( 전체로서여기에포함된미국특허 7,375,234호참조 ) 를통하여트리아졸고리를형성하는아지드및알킨을포함하지만, 이에한정되지않는다. 말레이미드화학은 -OH,-SH, -NH 2 와같은친핵체 (nucleophile) 와안정한 결합을형성하는말레이미드올레핀의반응을수반한다. 다른연결기는 Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 제 2 판, 2008 ( 여기전체로서포함됨 ) 에기술된것들을포함한다. [0235] [0236] 연결기들과, 전형적으로발견되거나기능성작용제에도입되는일부기들과의반응의일부비 - 제한적예들이 표 I 에제시된다. 표 I [0237]

46 [0238]

47 [0239]

48 [0240]

49 [0241]

50 [0242] [0243] [0244] [0245] R' 은 C 1-6 알킬, C 3-6 시클로알킬, 또는 5-8 엔도시클릭 (endocyclic) 원자를갖는아릴기이고 ; R'' 은 H, C 1-6 알킬, C 3-6 시클로알킬, 또는 5-8 엔도시클릭 (endocyclic) 원자를갖는아릴기이며 ; R''' 은카르보닐유도체 *- (C=O)-, * - (C=O)-(CH 2 ) 1-8 -S-S-, *- (C=O)-(CH 2 ) 1-8 -(C=O)-O-, *- (C=O)-(CH 2 ) 1-8 -O- (C=O)-, * - (C=O)-(CH 2 ) 1-8 -(C=O)-NH-, 또는 *- (C=O)-(CH 2 ) 1-8 -NH-(C=O)-, 또는대안적으로, R''' 은 *- (C=O)-O-(CH 2 ) 1-8 -S-S-, *- (C=O)-O-(CH 2 ) 1-8 -(C=O)-O-,*- (C=O)-O-(CH 2 ) 1-8 -O-(C=O)-, *- (C=O)-O-(CH 2 ) (C=O)-NH-, 또는 *- (C=O)-O-(CH 2 ) 1-8 -NH-(C=O)- 형태의카르보닐유도체이며, 여기서 "*" 는숙신이미딜 (succinimidyl) 또는벤조트리아졸 (benzotriazolyl) 기들에부착지점을나타내고 ; [0246] [0247] X 및 Y 는각각의활성화제 (active agent), 링커, 단량체또는개시제단편 I 이다. -C(O)NR 1a R 1b, -NR 1a R 1b, C 1-6 알킬 -NR 1a R 1b, -N(R 1a )C(O)R 1b, -N(R 1a )C(O) 또는 1b, -N(R 1a )C(O)NR 1a R 1b, -OP(O)(OR 1a ) 2, -S(O) 2 OR 1a, -S(O) 2 NR 1a R 1b, -CN, -NO 2, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴및헤테로아릴. [0248] [0249] E. 기능성작용제 본발명의고분자량중합체에유용한기능성작용제는특정리간드, 수용체 (receptor), 복합체 (complex), 세포기

51 관 (organelle), 세포, 조직, 상피막 (epithelial sheet) 또는기관을타겟화 (targeting) 할수있거나특정조건또는질병상태를치료할수있는임의의생물학적작용제또는합성화합물을포함한다. 일부구현예에서, 생물활성작용제는약물, 치료적 ( 치료적 ) 단백질, 저분자, 펩티드, 펩토이드 (peptoid), 올리고뉴클레오티드 ( 앱타머, sirna, 마이크로RNA), 나노파티클, 탄수화물, 지질, 당지질, 인지질, 또는타겟화제 (targeting agent) 이다. 본발명의고분자량중합체에유용한다른기능성작용제는방사성표지, 조영제, 형광단및염료를포함하지만, 이에한정되지않는다. [0250] [0251] [0252] [0253] [0254] [0255] [0256] [0257] [0258] 기능성작용제는고분자량중합체의개시제단편 I 또는라디칼청소부 (scavenger) I' 또는둘모두에연결될수있다. 기능성작용제는상기에서기술된절단성또는비-절단성링커를통한중합 (polymerization) 전후에개시제단편 I 또는라디칼청소부 (scavenger) I' 양쪽에연결될수있다. 기능성작용제는또한, 공유적결합대신고분자량중합체에물리적흡착또는이온적으로흡수될수있다. 기능성작용제에연결되는본발명의고분자량중합체의제조는첫째, 기능성작용제를개시제단편에부착된연결기에연결하고, 연결된기능성작용제를본발명의고분자량중합체합성에적합한상태로만듦으로써, 유도할수있다. 그러한경우, 적합한연결기는 ATRP 반응에사용하기위한개시제 ( 예를들면, 요오드화, 브롬화또는염소화된화합물 / 기 ) 일수있다. 기능성작용제가중합체중합반응및임의의이어서요구되는시안과양립가능한경우, 이러한반응계획은가능하다. 그러나, 기능성작용제의미리형성된고분자량중합체로의결합은기능성작용제가중합에적합한조건과양립되지않는곳에도사용될수있다. 또한, 비용으로인해합성수득률을불완전하게하는작용제의부족을초래하는경우, 종종다단계합성반응에서특별히접하게되는, 미리만들어진본발명의고분자량중합체에기능성작용제의결합이채용될수있다. 기능성작용제가중합반응을위해채용된조건에맞지않는경우, 기능성작용제를중합반응뒤에도입하는것이바람직할수있다. 생물활성작용제는광범위하게선택될수있다. 일부구현예에서생물활성작용제는하나이상의약물, 백신, 앱타머 (aptamers), 인간 A 도메인스캐폴드 (scafolds) 에의한아비머스캐폴드 (avimer scaffolds), 디아바디, 카멜리드 (camelids), 샤크 IgNAR 항체, 완환된특이성을갖는피브로넥틴타입Ⅲ스캐폴드, 항체, 항체단편, 비타민및보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및핵산 ( 예를들면, mrna, trna, snrna, RNAi, 마이크로RNA, DNA, cdna, 안티센스구성체들, 리보짐 (ribozymes) 등, 및이들의조합들 ) 로부터선택될수있다. 일구현예에서, 생물활성작용제는단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 수용성또는세포-결합성, 세포밖또는세포안의, 키네신, 분자모터, 효소, 세포밖매트릭스물질및이들의조합들로부터선택될수있다. 또다른구현예에서, 생물활성작용제는뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 및핵산 ( 예를들면, mrna, trna, snrna, RNAi, DNA, cdna, 안티센스구성체들, 리보짐 (ribozymes) 등및이들의조합들 ) 으로부터선택될수있다. 또다른구현예에서, 생물활성작용제는스테로이드, 지질, 지방및이들의조합들로부터선택될수있다. 예를들면, 생물활성작용제는세포밖매트릭스에결합할수있는데, 예를들면, 세포밖매트릭스가히알루론산또는헤파린술페이트프로테오글리칸이고, 생물활성작용제는비-특이적, 정진기적, 벨크로 (Velcro) 형태결합인터랙션을위한콜린과같은양전하를갖는모이어티일때이다. 생물활성작용제는완전한활성 ( 고레벨의아고니즘또는안타고니즘과같은 ) 을갖도록설계및 / 또는선택될수있다. 대안적으로, 다기능성의생물활성작용제는완전히다른것과충돌하는동안하나의타겟단백질의활성을조절하기위하여선택될수있다. 모자이크단백질이세포밖결합도메인또는서브-도메인 ( 예를들면, VEGF 및헤파린결합상피성장인자 ) 를포함하는것처럼, 이러한결합지점들로부터서열은중합체부착을위한생물활성작용제로서복제될수있다. 보다광범위하게, 모자이크단백질은많은기능성 ( 타겟결합, 세포밖매트릭스결합, 스페이서, 어비디티 (avidity) 증가, 효소적 ) 도메인의스트링 (strings) 을나타낸다. 특정적용을위해선택된생물활성화제세트는요망되는기능성활성화제세트를복제하는것과유사한방법으로어셈블 (assembled) 될수있다. 다른기능성작용제, A는콜린, 리신, 아스파트산, 글루타민산및히알루론산과같은그들중에전하를띄는종을포함한다. 전하를띄는종은이온성부착, 예를들어유리 (vitreous) 로촉진하는데유용하다. 치료적단백질및항체하나의특별히유용한구체예에서, 기능성작용제는치료적단백질이다. 많은치료적단백질들은본출원을통하여에리스로포이에틴, 과립구집락자극인자 (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), GM-CSF, 인터

52 페론알파, 인터페론베타, 인간성장호르몬, 이미글루세라제 (imiglucerase) 및 RANK 리간드와같이, 제한됨 없이개시되었다. [0259] 일구체예에서, 기능성작용제는구체적으로밝혀진다당류, 단백질또는펩티드생물활성작용제로부터선택될수있는데, 다음을포함하지만, 이에제한되지는않는다 : Aβ, 어갈시다제 (agalsidase), 아레파셉트 (alefacept), 알카리포스파타제, 아스파라기나아제 (aspariginase), 암독소비어 (amdoxovir)(dapd), 안티드 (antide), 베캅러민 (becaplermin), A 타입및 B 타입을포함하는보툴리눔톡신과보툴리눔톡신활성을갖고더낮은분자량화합물, 칼시토닌, CD1d, 시아노비브린 (cyanovirin), 데니류킨디프티톡스 (denileukin diftitox), 에리스로포이에틴 (EPO), EPO 작용제, 도르나제 (dornase) 알파, 적혈구생성자극단백질 (NESP), V 인자, VII 인자, VIIa 인자, VIII 인자, VIII 인자가빠진도메인 B, IX 인자, X 인자, XII 인자, XIII 인자, 폰빌레브란트인자와같은응고인자 ; 세레다제 (ceredase), Fc 감마 r2b, 세레짐 (cerezyme), 알파-글루코시다제, N-아세틸갈락토자민-6-술페이트설파타제, 콜라겐, 시클로스포린, 알파디펜신, 베타디펜신, 디스모프레신, 익스펜딘-4, 사이토카인, 사이토카인수용체, 과립구집락자극인자 (G-CSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 알파-1 프로테이나제저해제, 과립구대식세포집락자극인자 (granulocyte macrophage colony stimulating factor,gm-csf), 피브리노겐, 필그래스팀 (filgrastim), 성장호르몬인간성장호르몬 (hgh), 소마트로핀, 성장호르르몬촉진호르몬 (GHRH), GRO-베타, GRO-베타항체, 뼈모르포겐성단백질-2, 뼈모르포겐성단백질-6, 부갑상선호르몬, 부갑상선관련펩티드, OP-1과같은뼈모르포겐성단백질 ; 산성섬유아세포성장인자 (fibroblast 성장 factor), 염기성섬유아세포성장인자, 섬유아세포성장인자 21, CD40 리간드, ICOS, CD28, B7-1, B7-2, TLR 및기타선천적면역수용체, 헤파린, 인간세럼알부민, 저분자량헤파린 (LMWH), 인터페론알파, 인터페론베타, 인터페론감마, 인터페론오메가, 인터페론타우, 공통인터페론 ; 인터류킨-1 리셉터, 인터류킨-2, 인터류킨-2 융합단백질, 인터류킨-1 수용체길항제, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-4 수용체, 인터류킨-6, 인터류킨-8, 인터류킨-12, 인터류킨-17, 인터류킨-21, 인터류킨-13 수용체, 인터류킨-17 수용체와같은인터류킨및인터류킨수용체 ; 락토페린및락토페린파편, 황체형성호르몬촉진호르몬 (LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린유사체, 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥트레오티드 (octreotide) 를포함하는소마토스타틴유사체, 바소프레신, 여포자극호르몬 (FSH), 이미글루세라제 (imiglucerase), 인플루엔자백신, 인슐린-유사성장인자 (IGF), 인슐린트로핀, 대식세포집락자극인자 (M-CSF), 알테플라제 (alteplase), 유로키나제 (urokinase), ㄹ리테플라제 (reteplase), 스트렙토키나제 (streptokinase), 파미테플라제 (pamiteplase), 라노테플라제 (lanoteplase) 및테네테플라제 (teneteplase) 와같은플라즈미노겐활성화제 ; 신경성장인자 (NGF), trk A, trk B, 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin), 혈소판-유래성장인자, 조직성장인자, 형질전환성장인자-1, 혈관내피 (vascular endothelial) 성장인자, 백혈병저해인자, 케라틴세포생장인자 (KGF), 신경교성장인자 (GGF), T 세포수용체, CD 분자 / 항원, 종양괴사인자 (TNF) ( 예를들면, TNF-α 및 TNF-β), TNF 수용체 ( 예를들면, TNF-α수용체및 TNF-β수용체 ), CTLA4, CTLA4 수용체, 모노사이트키모어트랙턴트 (monocyte chemoattractant) 단백질-1, 내피세포증식인자, 부갑상선호르몬 (PTH), PTHrP, 글루카곤-유사펩티드, 소마토트로핀, 티모신알파 1, 라스부리카제 (rasburicase), 티모신알파 1 IIb/IIIa 저해제, 티모신베타 10, 티모신베타 9, 티모신베타 4, 알파-1 안티트립신, 포스포디에스테라아제 (PDE) 화합물, VLA-4(very late antigen-4), VLA-4 저해제, 비스포스포네이트 (bisphosponates), 호흡기합포바이러스항체, 낭포성섬유종유발세포막단백질 (cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR) 유전자, 디옥시리보뉴클레아제 (Dnase), 살균성 / 투과성증가단백질 (BPI), 및안티-CMV 항체. 모범적인모노클로날항체들은이타네르셉트 (etanercept)(igg1의 Fc 부분에연결된인간 75 kd TNF 수용체의세포외리간드-결합부분으로구성된 2분자체융합단백질 ), 압시지맙 (abciximab), 아달리무맙 (adalimumab), 아펠리모맙 (afelimomab), 알레튜주맙 (alemtuzumab), B-림프구항체, 아트리주맙 (atlizumab), 바실리지맙 (basiliximab), 베박시주맙 (bevacizumab), 비시로맙 (biciromab), 벌티리무맙 (bertilimumab), CDP-484, CDP- 571, CDP-791, CDP-860, CDP-870, 세투지맙 (cetuximab), 클레노리지맙 (clenoliximab), 다클리주맙 (daclizumab), 에쿨리주맙 (eculizumab), 에드레콜로맙 (edrecolomab), 에팔리주맙 (efalizumab), 에파투주맙 (epratuzumab), 폰토리주맙 (fontolizumab), 가빌리모맙 (gavilimomab), 겜투주맙오조가미신 (gemtuzumab ozogamicin), 입리투모맙티우제탄 (ibritumomab tiuxetan), 인플리지맙 (infliximab), 이놀리모맙 (inolimomab), 켈리지맙 (keliximab), 라베투주맙 (labetuzumab), 레르델리무맙 (lerdelimumab), 올리주맙 (olizumab), 방사성표지된 lym-1, 메텔리무맙 (metelimumab), 메폴리주맙 (mepolizumab), 미투모맙 (mitumomab), 뮤로모나드 (muromonad)-cd3, 네바쿠맙 (nebacumab), 나타리주맙 (natalizumab), 오둘리모맙 (odulimomab), 오말리주맙 (omalizumab), 오레고보맙 (oregovomab), 팔리비주맙 (palivizumab), 펨투모맙 (pemtumomab), 펙셀리주맙 (pexelizumab), rhumab-vegf, 리투지맙 (rituximab), ㅅ사투모맙펜데티드 (satumomab pendetide), 세비루맙 (sevirumab), 시플리주맙 (siplizumab), 토지투모맙 (tositumomab),i 131 토지투모맙 (tositumomab), 트래스투주모맙

53 (trastuzumab), 투비루맙 (tuvirumab), 비실리주맙 (visilizumab) 및이들의단편들및유사제들을포함한다. [0260] [0261] [0262] 일구현예에서, 생물활성작용제는융합단백질이다. 예를들면, 생물활성구성요소는면역글로불린또는하나이상의어떤유용한펩티드시퀀스에융합된면역글로불린의부분일수있지만, 제한되지않는다. 예를들면, 생물활성작용제는항체 Fc 단편을포함할수있다. 일구현예에서, 생물활성작용제는 CTLA4 융합단백질일수있다. 예를들면, 생물활성작용제는 Fc-CTLA4 융합단백질일수있다. 또다른구현예에서, 생물활성작용제는 VIII인자융합단백질이다. 예를들면, 생물활성작용제는 Fc-VIII 인자융합단백질일수있다. 특정유용한일구현예에서, 생물활성작용제는인간단백질또는인간폴리펩티드, 예를들면, 이종의방법으로 (heterologously) 생산된인간단백질또는인간폴리펩티드이다. 인간형태 ( 예를들면, 단백질또는펩티드는인체내의인간세포내에서정상적으로생성된것임 ) 에대응하는수많은단백질및폴리펩티드가여기에개시되었다. 그러므로, 일실시예에서, 생물활성작용제는여기서인간형태로개시되어있는각각의단백질및폴리펩티드의인간형태이다. 이러한인간단백질의예로서, 과립구집락자극요인, 과립구대식세포집락자극요인, 인터페론 ( 예를들면, 알파인터페론및베타인터페론 ), 인간성장호르몬및에리스로포이에틴과같은인간항체, 인간효소, 인간호르몬및인간싸이토카인을포함하지만, 이에한정되지않는다. 생물활성작용제의역할을할수있는치료적단백질의다른예들은 ( 그들자체또는항체또는항체단편또는비-항체단백질의타겟으로서 ), VIII 인자, VIII 인자가빠진 b-도메인, VIIa 인자, IX 인자, X 인자, 항응고인자 ; 히루딘, 알테플라제 (alteplase), 조직플라스미노젠활성물질 (tpa), 레테플라제 (reteplase),tpa, 누락된 5 도메인들의 tpa-3, 인슐린, 인슐린리스프로 (lispro), 인슐린아스파트 (aspart), 인슐린글라진 (glargine), 장시간작용하는인슐린아날로그 (analogs), 보체 C5, hgh, 글루카곤, tsh, 폴리트로핀-베타, fsh, gm-csf, pdgh, ifn 알파2, ifn 알파2a, ifn 알파2b, inf-알파1, 공통 ifn, ifn-베타, ifn-베타 1b, ifn-베타 1a, ifn- 감마 ( 예를들면, 1 및 2), ifn-람다, ifn-델타, il-2, il-11, hbsag, ospa, t-림프구항원을겨냥하는뮤린항체 (murine mab), tag-72를겨냥하는뮤린항체 (murine mab), 종양관련당단백질, 혈소판표면수용체 gpii(b)/iii(a) 를겨냥하는키메릭항체로부터유래된 fab 단편, 종양관련항원 ca125을겨냥하는뮤린항체단편, 리실옥시다제 (lysyl oxidase), LOX2, 인간암배아성 (carcinoembryonic) 항원을겨냥하는뮤린항체단편, cea, 인간심장의미오신을겨냥하는뮤린항체단편, 종양표면항원 psma를겨냥하는뮤린항체단편, hmw-maa를겨냥하는뮤린항체단편들 (fab/fab2 혼합 ), 칼시노마-관련항원을겨냥하는뮤린항체단편 (fab), nca 90을겨냥하는단일클론의항체 (mab) 단편들 (fab), 표면과립구비특정교차반응항원, b 림프구의표면에서발견된 cd20 항체를겨냥하는키메릭항체, il2 수용체의알파체인을겨냥하는인간화항체 (humanized mab), il2 수용체의알파체인을겨냥하는키메릭항체, tnf-알파를겨냥하는키메릭항체, RS(respiratory synctial) 바이러스표면위의에피토프를겨냥하는인간화항체, her 2를겨냥하는인간화항체, 인간상피 (epidermal) 성장요인수용체 2, 싸이토케라틴ㅈ종양-관련항원항-ctla4를겨냥하는인간항체 (mab), b 림프구도르나제-알파디나제 (dornase-alpha dnase) 의 cd 20 표면항체를겨냥하는키메릭항체, 베타글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), tnf-알파, il-2-디프테리아톡신융합단백질, tnfr-lgg 단편융합단백질라로니다제 (laronidase), DNA아제 (dnaases), 알레파셉트 (alefacept), 다베포에틴 (darbepoetin) 알파 ( 집락자극요인 ), 토시투모맙 (tositumomab), 뮤린 mab, 알레투주맙 (alemtuzumab), 라스부리카제 (rasburicase), 아갈시다제 (agalsidase) 베타, 테리파라티드 (teriparatide), 부갑상선호르몬유도체, 아달리무맙 (adalimumab)(lgg1), 아나킨라 (anakinra), 생물학적모디파이어 (modifier), 네시리티드 (nesiritide), 인간 b-타입나트륨이뇨 (natriuretic) 펩티드 (hbnp), 집락자극요인들, 페그비소먼트 (pegvisomant), 인간성장호르몬수용체길항제, 재조합활성단백질 c, 오말리주맙 (omalizumab), 면역글로불린 e (lge) 차단제, 입리투모맙티우제탄 (lbritumomab tiuxetan), ACTH, 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상선호르몬, 피그멘터리호르몬, 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 황체형성호르몬, 융모성고나트로핀, 뇌하수체분비요인, 에타널셉트 (etanercept), 항이뇨호르몬, 프로락틴및갑상선자극호르몬을제한됨없이, 포함한다. 그리고이들중어느것도천연 ( 예를들면, 세린- 시스테인치환 ) ( 예를들면, 레드우드바이오사이언스의방법에대한포밀알데히드 ) 또는비-천연아미노산을사용하여, 위치-특정컨쥬게이션포인트 (N-말단, 또는 C-말단, 또는기타위치 ) 를갖도록변경될수있다. 비-천연아미노산잔기 ( 들 ) 은당다음으로이루어진군으로부터선택될수있다 : 아지도노르류신 (azidonorleucine), 3-(1-나프틸 ) 알라닌, 3-(2-나프틸 ) 알라닌, p-에티닐-페닐알라닌, p-프로파르글리-옥시-페닐알라닌, m-에티닐-페닐알라닌, 6-에티닐-트립토판, 5-에티닐-트립토판, (R)-2-아미노-3- (4-에티닐-1H-피롤-3-일) 프로파닉에시드 (propanic acid), p-브로모페닐알라닌, p-아이오도페닐알라닌, p-아지도페닐알라닌, p-아세틸페닐알라닌, 3-(6-클로로인도릴 ) 알라닌, 3-(6-브로모인도릴 ) 알라닌, 3-(5-브로모인도릴 ) 알라닌, 아지도호모알라닌, 호모프로파르길글리신, p-클로로페닐알라닌, α-아미노카프릴산, O-메틸-L-티로

54 신, N- 아세틸갈락토자민 -α- 트레오닌, 및 N- 아세틸갈락토자민 -α- 세린. [0263] ( 스스로또는이런항체의단편으로 ) 생물활성제로서의역할을할수있는치료적항체의예는전이성유방암을 가진환자의치료를위한인간화된항 HER2 단일클론항체인허셉틴 (HERCEPTIN TM ) (Trastuzumab) (Genentech, CA); 응혈형성의방지를위한혈소판상의항당단백질 IIb/IIIa 수용체인레오프로 (REOPRO TM ) (abciximab) (Centocor); 급성신장동종이식편거부반응의방지를위한면역억제성, 인간화된항-CD25 단일클론항체인제나팍스 (ZENAPAX TM ) (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Switzerland); 쥣과 (murine) 항-l7-IA 세포표면항원 IgG2a 항체 (Glaxo Wellcome/Centocor) 인파노렉스 (PANOREX ); 쥣과항-유전자형 (GD3 에피토프 ) IgG 항체 (ImClone System) 인 BEC2; 키메라항-EGFR IgG 항체 (ImClone System) 인 IMC-C225; 인간화된항-αVβ3 인테그린항체 (Applied Molecular Evolution/MedImmune) 인비탁신 (VITAXIN ); 캠패스 (Campath); 인간화된항 CD52 IgG1 항체 (Leukosite) 인캠패스 1H/LDP-03; 인간화된항 CD33 IgG 항체 (Protein Design Lab/Kanebo) 인스마트 (Smart) M195; 키메라항 CD2O IgG1 항체 (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku) 인리툭산 (RITUXAN ); 인간화된항-CD22 IgG 항체 (Immunomedics) 인림포사이드 (LYMPHOCIDE ); 인간화된항-ICAM3 항체 (ICOS Pharm) 인 ICM3; 영장류항-CD80 항체 (IDEC Pharm/Mitsubishi) 인 IDEC-114; 방사성표시된쥣과항-CD20 항체 (IDEC/Schering AG) 인제발린 (ZEVALIN ); 인간화된항-CD40L 항체 (IDEC/Eisai) 인 IDEC-13l; 영장류화된 (primatized) 항-CD4 항체 (IDEC) 인 IDEC-151; 영장류화된항-CD23 항체 (IDEC/Seikagaku) 인 IDEC-152; 인간화된항 CD3-IgG (Protein Design Lab) 인스마트항-CD3; 인간화된항-보완인자 5 (CS) 항체 (Alexion Pharm) 인 5G1.l; 인간화된항-TNF-α 항체 (CATIBASF) 인 D2E7; 인간화된항-TNF-α Fab 단편 (Celltech) 인 CDP870; 영장류화된항-CD4 IgG1 항체 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham) 인 IDEC-151; 인간항-CD4 IgG 항체 (Medarex/Eisai/Genmab) 인 MDX-CD4; 인간화된항-TNF-α IgG4 항체 (Celltech) 인 CDP571; 인간화된항-α4β7 항체 (LeukoSite/Genentech) 인 LDP-02; 인간화된항-CD4 IgG 항체 (Ortho Biotech) 인 OrthoClone OKT4A; 인간화된항-CD40L IgG 항체 (Biogen) 인안토바 (ANTOVA ); 인간화된항-VLA-4 IgG 항체 (Elan) 인안테그렌 (ANTEGREN ); 인간항-TGF-β 2 항체 (Cambridge Ab Tech) 인 CAT-152; 단일클론항-EGF 수용체 (EGFr) 항체인세툭시맙 (Cetuximab) (BMS); 항-VEGF 인간단일클론항체인베바시주마 (Bevacizuma) (Genentech); 자가면역장애를치료하는데사용되는키메라 ( 마우스및인간 ) 단일클론항체인인플릭시맙 (Infliximab) (Centocore, JJ); 화학요법에사용되는단일클론항체인젬투주맙오조가마이신 (Gemtuzumab ozogamicin) (Wyeth); 및황반변성을치료하는데사용되는키메라 ( 마우스및인간 ) 단일클론항체인라니비주맙 (Ranibizumab) (Genentech) 을포함하지만, 이에제한되지않는다. [0264] [0265] [0266] [0267] [0268] 단일영역항체와같은, 다른항체가본발명에서유용하다. 단일영역항체 (Ablynx에의해서나노바디 (Nanobody) 로불리는, sdab) 는단일단량체의가변적인항체영역으로이루어지는항체단편이다. 모든항체와같이, 단일영역항체는특정항원에선택적으로결합될수있다. 단지 kda의분자량을가진, 단일영역항체는보통항체 ( kda) 보다훨씬작다. 단일영역항체는중쇄항체의, 또는보통 IgG의하나의가변적인영역 (VH) 을포함하는, 약 110개의아미노산길이의펩티드사슬이다. 모든항체와달리, 단일영역항체들은보체계촉발된 (triggered) 세포독성을보이지않는데왜냐하면이들은 Fc 영역이부족하기때문이다. 낙타류 (camelid) 및어류유래단일영역항체들은모든항체에, 예를들어효소의활성위치에접근가능하지않은숨겨진항원에결합될수있다. 단일영역항체 (sdab) 은원하는항원과의단봉낙타 (dromedaries), 카멜 (camels), 라마, 알파카또는상어의면역법및그다음의중쇄항체를위한 mrna 코딩의분리에의해서얻어질수있다. 대안적으로이들은합성라이브러리를스크리닝함으로써만들어질수있다. 낙타류는아목타이로포다 (suborder Tylopoda) 중오직살아있는과인, 생물학적낙타과 (family Camelidae) 의구성원이다. 카멜 (Camels), 단봉낙타 (dromedaries), 쌍봉낙타 (Bactrian Camels), 라마 (llamas), 알파카 (alpacas), 비큐나 (vicunas), 및과나코 (guanacos) 가이군에속한다. 단백질, 펩티드및아미노산본원에개시된생물활성제로서사용하기위한단백질및펩티드는인비트로합성에의한그리고생물학적계의생산에의한생산을포함하는임의의유용한방법에의해서생산될수있다. 당해기술분야에서주지된인비트로합성방법의전형적인예는고체상합성 ("SPPS") 및고체상단편축합 ("SPFC") 을포함한다. 단백질의생산을위해서사용되는생물학적계도또한당해기술분야에서잘알려져있다. 박테리아 ( 예컨대, E coli 및 Bacillus sp.) 및이스트 ( 예컨대, Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia pastoris) 는이종단백질의생산을위

55 해서널리사용된다. 게다가, 본원에개시된것과같이사용하기위한생물활성제의생산을위한이종유전자발현은포유류세포계 ( 예컨대, CHO 세포 ) 와같은동물세포계를사용함으로써달성될수있다. 한특히유용한구현예에서, 생물활성제는유전자이식또는복제동물, 예컨대암소, 양, 염소및조류 ( 예컨대, 닭, 메추라기, 오리및칠면조 ) 에서생산되며, 각각은그대로당해기술분야에서이해된다. 예를들어, 2004년 8월 24 일에공표된, 미국특허제6,781,030호를보라. 이에개시된내용은참조에의해서이의전체로서본원에포함된다. [0269] [0270] [0271] [0272] [0273] [0274] [0275] 닭과같은길들인조류에서생성된단백질과같은생물활성제는 " 조류유래 " 생물활성제 ( 예컨대, 조류유래치료적단백질 ) 로언급될수있다. 조류유래치료적단백질의생산은당해기술분야에공지되어있으며, 예를들어, 2004년 5월 4일에공표된, 미국특허제6,730,822호에기재되어있으며, 이에개시된내용은참조에의해서이의전체로서본원에포함된다. 생물활성제가단백질또는폴리펩티드인경우의구현예에서, 단백질폴리펩티드시퀀스의아미노산에존재하는작용기는작용제를고분자량중합체에연결하는데사용될수있다. 단백질또는폴리펩티드생물활성제에대한연결은이들의시퀀스내에서자연적으로발생하는아미노산에또는그시퀀스에추가되거나또다른아미노산대신에삽입된 ( 예를들어세린의시스테인으로의교체 ) 자연적으로발생하는아미노산에만들어질수있다. 본발명에유용한펩티드는또한대환식펩티드, 시클로티드, 앱타머, LDL 수용체 A-영역, ( 미국특허제 60/514,391호에설명된것과같은 ) 단백질스캐폴드, 가용성수용체, 효소, 펩티드다합체, 영역다합체, 항체단편다합체, 및융합단백질을포함하지만, 이에제한되지않는다. 단백질또는폴리펩티드생물활성제는또한단백질및폴리펩티드에서발견되는보통의자연적으로발생하는아미노산에더하여비자연적으로발생하는아미노산을포함할수있다. 폴리펩티드또는단백질의특성을변경하는목적을위해존재하는것에더하여, 비자연적으로발생하는아미노산은단백질또는폴리펩티드를고분자량중합체에직접연결하는데사용될수있는작용기를제공하기위해도입될수있다. 더욱이, 자연적으로발생하는아미노산, 예컨대, 시스테인, 타이로신, 트립토판은이방법에서사용될수있다. 비자연적으로발생하는아미노산은여러가지수단에의해서단백질및펩티드내로도입될수있다. 비자연적인아미노산의도입에대한일부기술이미국특허제5,162,218호및미국특허제 호에설명되어있으며, 이에개시된내용은참조에의해서이의전체로서본원에포함된다. 첫째, 비자연적으로발생하는아미노산은아미노산측사슬위의또는아미노말단또는카르복실말단에서의폴리펩티드또는단백질의화학적변형에의해서도입될수있다. 단백질또는펩티드의화학적변형의비제한적인예는디아조메탄과같은작용제에의한메틸화, 또는리신측사슬에존재하는아미노기에서의또는펩티드또는단백질의아미노말단에서의아세틸화의도입일수있다. 비자연적인아미노산을제조하기위한단백질 / 폴리펩티드아미노기변형의또다른예는 1차아민을갖는단백질또는폴리펩티드내의위치에연결된작용성을갖는티올 ( 설프히드릴, -SH) 을도입하기위한메틸 3-메르캅토프로피온이미데이트에스테르또는 2-이미노티로란의사용이다. 도입될때, 이기는단백질또는폴리펩티드에대한공유결합을형성하는데이용될수있다. 둘째, 비자연적으로발생하는아미노산은화학적합성동안에단백질및폴리펩티드내로도입될수있다. 합성방법은약 200 개보다적은아미노산을갖는, 흔히약 150 개보다적은아미노산을갖는, 더흔히 100개이하의아미노산을갖는폴리펩티드를제조하는데일반적으로이용된다. 약 75 개미만또는약 50 개미만의아미노산을갖는더짧은단백질또는폴리펩티드는화학적합성에의해서제조될수있다. 비자연적인아미노산의원하는위치로의삽입을허용하기위해특히편리한합성제조방법은당해기술분야에서공지되어있다. 적합한합성폴리펩티드제조방법은메리필드고체상합성방법에기초를두고있으며여기서아미노산은성장하는사슬에순차적으로첨가된다 (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: ). 이런기술로폴리펩티드를합성하기위한자동화시스템은이제 Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif ; New Brunswick Scientific, Edison, N.J ; 및 Pharmacia, Inc., Biotechnology Group, Piscataway, N.J 와같은공급자로부터상업적으로구입가능하다. 폴리펩티드의화학적합성동안에도입될수있는비자연적으로발생하는아미노산의예는 20개의자연적으로발생하는아미노산의 D-아미노산및 D 및 L-형의혼합물, N-포르밀글리신, 오르니틴, 노르류신, 히드록시프롤린, 베타-알라닌, 히드록시발린, 노르발린, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 3차부틸글리신 (t-류신, 2-아미노- 3,3-디메틸부탄산 ), 히드록시-3차-부틸글리신, 아미노부티르산, 시클로류신, 4-히드록시프롤린, 피로글루탐산 (5-옥소프롤린), 아제티딘카르복실산, 피페콜린산, 인돌린-2-카르복실산, 테트라히드로-3-이소퀴놀린카르복실산, 2,4-디아미노부티르산, 2,6-디아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 2,6-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로

56 피온산, 5- 히드록시리신, 뉴라민산, 및 3,5- 디아이오도타이로신을포함하지만, 이에제한되지않는다. [0276] [0277] [0278] [0279] [0280] [0281] [0282] [0283] 셋째, 비자연적으로발생하는아미노산은비자연적인아미노산이삽입될위치에대응하는코돈에폴리펩티드를인코딩하는 DNA 시퀀스 ( 예컨대, 유전자 ) 내의무의미코돈 ( 예컨대, 앰버또는오커코돈 ) 의삽입에의해서인비보또는인비트로생물학적합성을통하여도입될수있다. 이런기술은예를들어미국특허제5,162,218호및제6,964,859호에설명되어있으며, 이에개시된내용은참조에의해서이의전체로서본원에포함된다. 여러가지방법이돌연변이생성유도된올리고뉴클레오티드를포함하는돌연변이코돈을삽입하는데사용될수있다. 변경된시퀀스는그뒤에원하는비자연적으로발생하는아미노산으로화학적으로도는효소로아실화된무의미코돈에대항하도록유도된, 억제자 trna를제공하는시스템내에서인비보또는인비트로로전사되고번역된다. 합성아미노산은무의미코돈에대응하는위치에삽입될것이다. 더큰그리고 / 또는글리코실화된폴리펩티드의제조를위해서, 이유형의재조합제조기술이보통선호된다. 아미노산중에서이방식으로도입될수있는것은포르밀글리신, 플루오로알라닌, 2-아미노-3-메르캅토-3-메틸부탄산, 호모시스테인, 호모아르기닌등이다. 단백질내에비자연적인아미노산을얻기위한다른유사한방법은메티오닌치환방법을포함한다. 비자연적으로발생하는아미노산이선택적인변형에민감한작용성을가지는경우에, 이들은단백질또는폴리펩티드에대한공유결합을형성하는데특히유용하다. 작용성이선택적인변형에민감한환경은작용성이유일한경우또는관심조건하에서반응할수있는다른작용성이입체화학적으로숨겨지거나또는그반대의경우를포함한다. 단일영역항체와같은, 다른항체는본발명에서유용하다. 단일영역항체 (Ablynx에의해서나노바디 (Nanobody) 로불리는, sdab) 는단일단량체의가변적인항체영역으로이루어지는항체단편이다. 모든항체와같이, 단일영역항체는특정항원에선택적으로결합될수있다. 단지 kda의분자량을가진, 단일영역항체는보통모든항체 ( kda) 보다훨씬작다. 단일영역항체는중쇄항체의, 또는보통 IgG의하나의가변적인영역 (VH) 을포함하는, 약 110개의아미노산길이의펩티드사슬이다. 모든항체와달리, 단일영역항체들은보체계촉발된 (triggered) 세포독성을보이지않는데왜냐하면이들은 Fc 영역이부족하기때문이다. 낙타류 (camelid) 및어류유래단일영역항체들은모든항체에, 예를들어효소의활성위치에접근가능하지않은숨겨진항원에결합될수있다. 단일영역항체 (sdab) 은원하는항원과의단봉낙타 (dromedaries), 카멜 (camels), 라마, 알파카또는상어의면역법및그다음의중쇄항체를위한 mrna 코딩의분리에의해서얻어질수있다. 대안적으로이들은합성라이브러리를스크리닝함으로써만들어질수있다. 낙타류는아목타이로포다 (suborder Tylopoda) 중오직살아있는과인, 생물학적낙타과 (family Camelidae) 의구성원이다. 카멜 (Camels), 단봉낙타 (dromedaries), 쌍봉낙타 (Bactrian Camels), 라마 (llamas), 알파카 (alpacas), 비큐나 (vicunas), 및과나코 (guanacos) 가이군에속한다. 본발명에유용한펩티드는또한대환식펩티드, 시클로티드, 앱타머, LDL 수용체 A-영역, ( 미국특허제 60/514,391호에설명된것과같은, 이의전체로서본원에포함되는 ) 단백질스캐폴드, 가용성수용체, 효소, 펩티드다합체, 영역다합체, 항체단편다합체, 및융합단백질을포함하지만, 이에제한되지않는다. 본발명은또한생물활성표면위에분지형중합체구조를달성하기위한새로운방식을설명한다. 이개념은예컨대목표분자위의국소화된위치 ( 들 ) 에부착된 1 아암중합체로효과적인 2 아암중합체를재생성하기위한목표분자위의 " 분지지점 " 또는 " 근위부착지점 " 중하나이다. 선행기술에서, 비위치-특이적시약 ( 예를들어 NHS 작용화된 PEG 시약 ) 으로의단백질의무분별한페길레이션 (PEGylation) 은단백질을통해서흩어진다수의아민기로컨쥬케이트된다수의 PEG 중합체를초래할것이다. 여기에, 설명된것은바람직하게, 단백질또는펩티드의 3차구조또는작용제가형성되었을때, 두개의위치가서로에대하여근접하게되도록, 타겟물질이두개의독특한컨쥬게이션위치 ( 예를들어, 시스테인아미노산들 ) 를두도록변형된한단계방법이다. 그다음에, 이변형된타겟물질은대응하는컨쥬게이션화합물 ( 예를들어, 티올반응성 ) 을포함하는중합체와의컨쥬케이션반응에서사용된다. 그결과는서로에대하여아주근접한두개의중합체로컨쥬케이트됨으로써, 분지지점또는 " 슈도 " 분지를생성하는단일타겟물질이다. 또다른구현예에서, 타겟물질은단일의독특한위치, 예를들어자유시스테인을포함할것이며, 트리 ( 헤테로 ) 작용성연결작용제는이단일위치에 2 선형중합체를부착하는데이용되어, " 슈도 " 분지를다시생성할것이다. 약물

57 [0284] [0285] 또다른구현예에서, 생물활성제는또한태크린, 메만틴, 리바스티그민, 갈란타민, 도네페질, 레베디라세탐, 레파글리니드, 아토르바스타틴, 알레파셉트, 타달라필, 바르데나필, 실데나필, 포삼프레나비르, 오셀타미비르, 발라시클로비르및발간시클로비르, 아바레릭스, 아데포비르, 알푸조신, 알로세트론, 아미포스틴, 아미오다론, 아미노카프로산, 아미노힙퓨레이트소듐, 아미노글루테티미드, 아미노레불린산, 아미노살리실산, 암로디핀, 암사크린, 아나그레리드, 아나스트로졸, 아프레피탄트, 아리피프라졸, 아스파라기나제, 아타자나비르, 아토목세틴, 안트라사이클린, 벡사로텐, 비칼루타미드, 블레오마이신, 보르테조밉, 부세레린, 부술판, 카베르골린, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부신, 실라스타틴소듐, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 시클로포스파미드, 사이프로테론, 사이타라빈, 캄프토테신, 13-시스레티노산, 모든트랜스레티노산 ; 다카르바진, 닥티노마이신, 답토마이신, 다우노루비신, 데페록사민, 덱사메타손, 디클로페낙, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 옥소루비신, 두타스테라이드, 엘레트립탄, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 에플레레논, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에티닐에스트라디올, 에토포시드, 엑세메스탄, 에제티미브, 펜타닐, 펙소페나딘, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루오로우라실, 플루옥심에스테론, 플루타르니드, 플루티카존, 폰다파리눅스, 풀베스트란트, 감마히드록시부티라트, 게피티닙, 겜시타빈, 에피네프린, L-도파, 히드록시우레아, 이코덱스트린, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 이리노테칸, 이트라코나졸, 고세레린, 라노니다제, 란소프라졸, 레트로졸, 루코보린, 레바미졸, 리시노프릴, 로보티록신소듐, 로무스틴, 메클로레타민, 메드록시프로그에스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 메만틴, 메르캅토퓨린, 메퀴놀, 메타라미놀비타르트레이트, 메토트렉세이트, 메토클로프라미드, 멕실레틴, 미글루스타트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 모다피닐, 날록손, 나프록센, 네비라핀, 니코틴, 닐루타미드, 니타족사니드, 니티시논, 노르에틴드론, 옥트레오티드, 옥살리플라틴, 팔로노세트론, 파미드로네이트, 페메트렉시드, 페르골리드, 펜토스타틴, 필카마이신, 포르피메르, 프레드니손, 프로카르바진, 프로클로르페라진, 온단세트론, 팔로노세트론, 옥살리플라틴, 랄티트렉시드, 로수바스타틴, 시로리무스, 스트렙토조신, 피메크롤리무스, 세르타코나졸, 타크롤리무스, 타목시펜, 테가세로드, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스토스테론, 테트라히드로카나비놀, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 티오트로피움, 토피라메이트, 토포테칸, 트레프로스티닐, 스테티노인, 발데콕십, 셀레콕십, 로페콕십, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노르엘빈, 보리코나졸, 돌라세트론, 그라니세트론, 포르모테롤, 플루티카손, 루프롤리드, 미다졸람, 알프라졸람, 암포테리신 B, 포도필로톡신, 항바이러스성뉴클레오시드, 아로일히드라존, 수마트립탄, 엘레트립탄 ; 매크로라이드예컨대에리트로마이신, 올레안도마이신, 트롤레안도마이신, 록시트로마이신, 클래리트로마이신, 다베르신, 아지트로마이신, 플루리트로마이신, 디리트로마이신, 조사마이신, 스피로마이신, 미데카마이신, 로라타딘, 데슬로라타딘, 루코마이신, 미오카마이신, 로키타마이신, 안다지트로마이신, 및스위놀리드 A; 플루오로퀴놀론예컨대시프로플록사신, 오플록사신, 레보플록사신, 트로바플록사신, 알라트로플록사신, 목시플록시신, 노르플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 게미플록사신, 그레파플록사신, 로메플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 페플록사신, 아미플록사신, 플레록삭신, 토수플록사신, 프룰리플록사신, 이르록사신, 파주플록사신, 클리나플록사신, 및시타플록사신 ; 아미노글리코시드예컨대겐타미신, 네틸미신, 파라메신, 토브라마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 및스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌, 람폴라닌, 미데플라닌, 콜리스틴, 답토마이신, 그라미시딘, 콜리스티메테이트 ; 폴리믹신예컨대폴리믹신 B, 카프레오마이신, 바시트라신, 페넴스 ; 페니실린 G, 페니실린 V와같은페니실리나제민감성작용제를포함하는페니실린 ; 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린과같은페니실리나제저항성작용제 ; 암피실린, 아목시실린, 및헤타실린, 실린, 및갈람피실린과같은그람음성미생물활성제 ; 카르베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및피페라실린과같은항슈도모날페니실린 ; 세프포독심, 세프프로질, 세프트부텐, 세프티족심, 세프트리악손, 세팔로틴, 세파피린, 세파렉신, 세프라드린, 세폭시틴, 세파만돌, 세파졸린, 세팔로리딘, 세파클로르, 세파드록실, 세팔로글리신, 세푸록심, 세포라니드, 세포탁심, 세파트리진, 세파세트릴, 세페핌, 세픽심, 세포니시드, 세포페라존, 세포테탄, 세프메타졸, 세프타지딤, 로라카르베프, 및목살락탐같은세팔로스포린, 아즈트레오남같은모노박탐 ; 및카르바페넴예컨대이미페넴, 메로페넴, 및에르타페넴, 펜타미딘이세티오네이트, 알부테롤술페이트, 리도카인, 메타프로테레놀술페이트, 베클로메타손디프레피오네이트, 트리암시놀론아세타미드, 부데소니드아세토니드, 살메테롤, 이프라트로피움브로마이드, 플루니솔리드, 크로모린소듐, 및에르고타민타르트레이트 ; 탁산예컨대파클리탁셀 ; SN 38, 및타이르포스틴을포함하지만이에제한되지않는구체적으로확인된약물또는치료제로부터선택될수있다. 생물활성제는또한또다른구현예에서아미노힙퓨레이트소듐, 암포테리신 B, 독소루비신, 아미노카프로산, 아미노레불린산, 아미노살리실산, 메타라미놀비타르트레이트, 파미드로네이트디소듐, 다우노루비신, 레보티록신소듐, 리시노프릴, 실라스타틴소듐, 멕실레틴, 세팔렉신, 데페록사민, 및아미포스틴으로이루어지는군으로부터선택될수있다. 본발명에서유용한다른생물활성제는세포외기질타겟물질, 작용성수송모이어티및표지작용제를포함한

58 다. 세포외기질타겟물질은헤파린결합모이어티, 매트릭스메탈로프로티나제결합모이어티, 리실옥시다제결합영역, 음전하모이어티또는양전하모이어티및히알루론산을포함하지만, 이에제한되지않는다. 작용성수송모이어티는혈액뇌관문수송모이어티, 세포내수송모이어티, 세포기관수송모이어티, 상피수송영역및종양목표모이어티 ( 폴레이트, 다른것 ) 를포함하지만, 이에제한되지않는다. 일부구현예에서, 본발명에서유용한타겟물질은다른것들중에서항-TrkA, 항 A-베타 ( 펩티드 1-40, 펩티드 1-42, 단량체형, 올리고머형 ), 항-IGF1-4, 아고니스트 RANK-L, 항-ApoE4 또는항-ApoA1을포함한다. [0286] [0287] [0288] [0289] 진단제본발명의고분자량중합체에서유용한진단제는방사성표지, 형광단, 염료및조영제와같은이미징제및탐지제를포함한다. 이미징제는대상의종양, 기관, 또는조직을이미징하기위해서본발명의고분자량중합체에부착되는라벨을가리킨다. 이미징모이어티는고분자량중합체에공유결합으로또는비공유결합으로부착될수있다. 본발명에사용하기에적합한이미징모이어티의예는방사성핵종, 형광단예컨대플루오레세인, 로다민, 텍사스레드, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 및형광단범위의알렉사플루오르 (AlexaFluor) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 항체, 가돌리늄, 금, 나노물질, 홀스래디쉬페록시다아제, 알칼라인포스파타아제, 이들의유도체, 및이들의혼합물을제한없이포함한다. 방사성표지는방사능을나타내는핵종을가리킨다. " 핵종 " 은이의원자번호, 원자량, 및에너지상태에의해 서특정된원자의유형, 예컨대탄소 14 ( 14 C) 를가리킨다. " 방사능 " 은방사성물질에의해서방출된, 알파입자, 베타입자, 핵자, 전자, 양전자, 중성미자, 및감마선을포함하는, 방사선을가리킨다. 본발명에사용하기에적합한방사성핵종은불소 18 ( 18 F), 인 32 ( 32 P), 스칸듐 47 ( 47 Sc), 코발트 55 ( 55 Co), 구리 60 ( 60 Cu), 구리 61 ( 61 Cu), 구리 62 ( 62 Cu), 구리 64 ( 64 Cu), 갈륨 66 ( 66 Ga), 구리 67 ( 67 Cu), 갈륨 67 ( 67 Ga), 갈륨 68 ( 68 Ga), 루비듐 82 ( 82 Rb), 이트륨 86 ( 86 Y), 이트륨 87 ( 87 Y), 스트론튬 89 ( 89 Sr), 이트륨 90 ( 90 Y), 로듐 105 ( 105 Rh), 은 111 ( 111 Ag), 인듐 111 ( 111 In), 요오드 124 ( 124 I), 요오드 125 ( 125 I), 요오드 131 ( 131 I), 주석 117m ( 117m Sn), 테크네튬 99m ( 99m Tc), 프로메튬 149 ( 149 Pm), 사마륨 153 ( 153 Sm), 홀뮴 166 ( 166 Ho), 루테튬 177 ( 177 Lu), 레늄 186 ( 186 Re), 레늄 188 ( 188 Re), 탈륨 201 ( 201 Tl), 아스타틴 211 ( 211 At), 및비스무트 212 ( 212 Bi) 를포함하지만, 이에제한되지않는다. 본원에사용된것처럼, 117m Sn 및 99m Tc에서 "m" 은메타상태를나타낸다. 게다가, 방사성동위원소의혼합물을일반적으로나타내는, 우라늄, 라듐, 및토륨과같은자연적으로발생하는방사성원소가방사성핵종의적합한예이다. 67 Cu, 131 I, 177 Lu, 및 186 Re는베타및감마방출방사성핵종이다. 212 Bi는알파및베다방출방사성핵종이다. 211 At는알파방출방사성핵종이다. 32 P, 47 Sc, m Sr, Y, Rh, Ag, Sn, Pm, Sm, Ho, 및 Re는베타방출방사성핵종의예이다. Ga, In, 99m Tc, 및 201 Tl 는감마방출방사성핵종의예이다. 55 Co, 60 Cu, 61 Cu, 62 Cu, 66 Ga, 68 Ga, 82 Rb, 및 86 Y 는양전자방 출방사성핵종의예이다. 64 Cu 는베타및양전자방출방사성핵종이다. 이미징제및탐지제는또한개시제, 링커, 연결기, 공단량체의합성동안에듀테륨, 13 C, 또는 15 N 과같은자연적으로발생하는동위원소의첨가를 통하여본발명의중합체내로디자인될수있다. [0290] [0291] [0292] [0293] 본발명에유용한조영제는다른것들중에서, 가돌리늄계조영제, 철계조영제, 요오드계조영제, 바륨술페이트를포함하지만, 이에제한되지않는다. 당해기술분야에서숙련된자는다른조영제가본발명에유용함을인식할것이다. 나노입자기능성작용제는나노입자를포함할수있다. 본발명에서유용한나노입자는범위가 1 내지 1000 nm인크기를갖는입자를포함한다. 나노입자는비드, 금속입자일수있거나일부경우에서미셀일수있고일부다른경우에서리포솜일수있다. 다른나노입자는탄소나노튜브, 양자점및콜로이드금을포함한다. 나노입자는진단제및 / 또는치료제와함께싸일수있다. 당해기술분야에서숙련된자들은또한본발명이동일하거나상이한유형의하나이상의작용제의동시적인탐

59 지를가능하게하는데사용될수있다는점을인지할것이다. 또한, 가요성링커화합물의사용도, 예를들어 분자가세포내로그리고낮은 ph 환경으로채워질때, 하나의형광라벨의손실을목격하는데사용될수있다. [0294] [0295] [0296] [0297] [0298] 컨쥬게이트본발명의중합체는위에설명된여러가지의기능성작용제에연결되어컨쥬게이트를형성할수있다. 일부구현예에서, 본발명은각각독립적으로아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 스티렌, 비닐-피리딘, 비닐-피롤리돈및비닐-에스테르예컨대비닐-아세테이트로이루어지는군으로부터선택되는다수의단량체를갖는중합체아암을갖는하나이상의중합체를포함하는컨쥬게이트를제공하며, 여기서각각의단량체는친수성기, 중합체아암의근위말단에연결된개시제단편, 및중합체아암의원위말단에연결된말단기를포함하며, 여기서개시제모이어티는라디칼중합체적합하다. 본발명의컨쥬게이트는또한개시제단편또는말단기에연결된, 생물활성제또는진단제를갖는하나이상의기능성작용제를포함한다. 본발명의컨쥬게이트의생물활성제는약물, 항체, 항체단편, 단일영역항체, 아비머, 아드넥틴, 디아바디, 비타민, 보조인자, 다당류, 탄수화물, 스테로이드, 지질, 지방, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는핵산을포함할수있다. 컨쥬게이트의진단제는방사성표지, 조영제, 형광단또는염료일수있다. 일부구현예에서, 2 이상의중합체는기능성작용제에연결된다. 일부구현예에서, 2 이상의중합체는기능성작용제위의근위반응기를통하여기능성작용제에연결되어슈도-분지형구조를생성한다. 다른구현예에서, 컨쥬게이트는중합체에부착된 2 이상의기능성작용제를포함한다. IV. 쌍성이온 / 포스포릴함유고분자량중합체의제조본발명의고분자량중합체는당해기술분야에서공지된임의의수단에의해서제조될수있다. 일부구현예에서, 본발명은본발명의고분자량중합체를제조하기위한공정을제공하며, 공정은자유라디칼중합을통하 여고분자량중합체를제조하기에충분한조건하에서, 제 1 단량체및제 2 단량체의혼합물과개시제, I 1 를접촉 시키는단계를포함하며, 여기서제 1 단량체는포스포릴콜린을포함하며, 각각의제 2 단량체및개시제는독립 적으로하나이상의기능성작용제또는기능성작용제에연결시키기위한연결기를포함한다. [0299] [0300] [0301] [0302] 본발명의고분자량중합체를제조하기위한혼합물은여러가지의다른성분을포함할수있다. 예를들어, 혼합물은또한촉매, 리간드, 용매, 및다른첨가제를포함할수있다. 일부구현예에서, 혼합물은또한촉매및리간드를포함한다. 적합한촉매및리간드가아래에서더상세히설명된다. 임의의적합한단량체가, 위에설명한것과같이, 본발명의공정에서사용될수있다. 본발명의고분자량중합체는임의의적합한중합방법에의해서, 예컨대살아있는라디칼중합체의해서제조될수있다. Odian, G. in Principles of Polymerization, 4 th, Wiley Interscience John Wiley & Sons: New York, 2004에의해서설명되고, 예를들어미국특허제6,852,816호의쌍성이온성중합체에적용되는살아있는라디칼중합. 안정한자유라디칼중합 (SFRP), 라디칼첨가단편화이동 (RAFT), 및니트록시드-매개중합 (NMP) 을포함하는, 몇몇의상이한살아있는라디칼중합방법론이이용될수있다. 게다가, 원자이동라디칼중합 (ATRP) 은본발명의고분자량중합체의제조를위한편리한방법을제공한다. 원자이동라디칼중합을통한중합체의제조는하나이상의할로겐을갖는개시제로시작되는단량체의라디칼중합을포함한다. 할로겐화된개시제는리간드 ( 예컨대, 비피리딘또는 PMDETA) 에의해서가용화될수있는전이금속염 (CuBr) 과같은촉매 ( 또는 CuBr 2 가이용될경우에촉매의혼합물 ) 에의해서활성화된다. 라디칼첨 가단편화이동중합은디티오에스테르, 디티오카르바메이트, 트리티오카보네이트, 및크산테이트와같은, 티오 카르보닐티오화합물을사용하여, 가역적인사슬이동공정을통하여중합공정을매개한다. 본발명의랜덤 공중합체의제조에유용한다른 " 살아있는 " 또는조절된라디칼공정은니트록시드 - 매개중합을포함한다. [0303] [0304] 개시제본발명의고분자량중합체의제조에유용한개시제는라디칼중합을통한중합에적합한임의의개시제를포함한다. 일부구현예에서, 개시제는위에설명한것과같은, 원자이동라디칼중합 (ATRP) 에적합하다. 다른유용한개시제는니트록시드매개라디칼중합 (NMP), 또는가역적인첨가단편화종결 (RAFT 또는 MADIX) 중합을위한것들을포함한다. 자유라디칼중합공정을조절하기위한여전히다른기술이사용될수있다. 예컨대이니퍼터 (iniferters), 퇴행성이동또는텔로머화공정의사용. 더욱이, 본발명에유용한개시제는위에

60 설명한것과같은, 하나이상의분지지점을갖는것들을포함한다. 다른구현예에서, 개시제는조절된라디칼 중합에유용하다. [0305] [0306] [0307] 본발명의고분자량중합체는빗및별구조를포함하지만, 이에제한되지않는다수의중합체아암을갖는분지형화합물을포함하는복잡한구조를가진다. 빗구조는 3 개이상의할로겐원자를가지는선형개시제를이용함으로써달성될수있고, 바람직하게할로겐은염소, 브롬, 또는요오드원자이고, 더바람직하게할로겐은염소또는브롬원자이다. 별구조는또한단일탄소원자위에다수의할로겐을가지는화합물또는다수의할로겐을가지는고리형분자를이용함으로써제조될수있다. 일부구현예에서별구조를갖는화합물은 3 개의중합체아암을가지며다른구현예에서이들은 4 개의중합체아암을가진다. 위에설명한개시제를보라. 촉매및리간드원자이동라디칼중합또는그룹라디칼이동중합에사용하기위한촉매는 Cu 1+, Cu 2+, Fe 2+, Fe 3+, Ru 2+, Ru. 3+, Cr 2+, Cr 3+, Mo 2+, Mo. 3+, W 2+, W 3+, Mn 2+, Mn 2+, Mn 4+, Rh 3+, Rh 4+, Re 2+, Re 3+, Co 1+, Co. 2+, Co 3+, V 2+, V 3+, Zn. 1+, Zn 2+, Ni 2+, Ni 3+, Au 1+, Au 2+, Ag 1+ 및 Ag 2+ 의적합한염을포함할수있다. 적합한염은할로겐, C 1 -C 6 -alkoxy, 술페이트, 포스페이트, 트리플레이트, 헥사플루오로포스페이트, 메탄셀포네이트, 아릴셀포네이트염을포함하지 만이에제한되지않는다. 일부구현예에서촉매는위에열거한금속이온의클로라이드, 브로마이드염이다. 다른구현예에서촉매는 CuBr, CuCl 또는 RuCl 2 이다. [0308] 일부구현예에서, 전이금속촉매를가용화하기위한하나이상의리간드의사용이바람직하다. 적합한리간드가, 구리클로라이드또는브로마이드, 또는루테늄클로라이드전이금속염이촉매의일부인경우를포함하여여러가지의전이금속촉매와조합하여유용하게사용된다. 리간드의선택은전이금속촉매를유기반응매체내에가용화하는데도와줄뿐만아니라, 이들의산화환원전위를조절하는리간드로서의촉매의기능에영향을미친다. 리간드의선택은또한생성혼합물로부터의촉매의용해도및분리성에기초를두고있다. 중합이액상에서수행될경우에비록고정화된촉매가이용될수있지만가용성리간드 / 촉매가일반적으로바람직하다. 적합한리간드는 ( 알킬피리딘예컨대, 4.4. 디알킬-2,2 비피리딘을포함하는 ) 피리딜기및존재하는경우에, 더긴알킬기가덜극성인단량체혼합물및용매매체에서의용해도를제공하는, 알킬치환된이미노기를가지는피리딜기를포함한다. 인다닐, 또는시클로펜타디에닐리간드에더하여, 트리페닐포스핀및다른인리간드는또한전이금속촉매와함께이용될수있다 ( 예컨대, 트리페닐포스핀, 인다닐또는시클로펜타디에 닐리간드와의 Ru +2 - 할라이드또는 Fe +2 - 할라이드착물 ). [0309] [0310] 금속이온이완전히착체를이룰때, 성분의몰비를기초로촉매내금속화합물및리간드의대략적인화학양론적양이일부구현예에서사용된다. 다른구현예에서, 금속화합물과리간드간비율은 1:(0.5 내지 2) 또는 1:(0.8 내지 1.25) 범위이다. 일반적으로, 촉매가구리인경우, 바이덴테이트 (bidentate) 또는멀티덴테이트 (multidentate) 질소리간드는더욱활성인촉매를생성한다. 또한, 가교또는시클릭리간드및분지형지방족폴리아민은단순한선형리간드보다더욱활성인촉매를제공한다. 브롬이반대이온인경우, 바이덴테이트또는 1/2개의 (one-half) 테트라덴 테이트리간드가 Cu +1 마다필요하다. 트리플레이트 (triflate) 또는헥사플루오로포스페이트와같은, 더욱복잡한반대이온을사용하는경우, 2개의바이덴테이트또는 1개의테트라덴테이트리간드가사용될수있다. 금속성구리및 Cu +2 는산화환원반응을하여 Cu +1 을형성할수있으므로, 금속성구리의첨가는특히더욱신속한중합을원하는일부구현예에서바람직할수있다. 일부 ATRP 반응의개시단계에서약간의 Cu +2 를부가하여, 정상적인종결의양을감소시킬수있다. [0311] [0312] 일부구현예에서, 중합반응에서사용되는촉매의양은존재하는개시제의몰당량 (molar equivalent) 이다. 그러나촉매는반응에서소비되지않기때문에, 개시제만큼고용량의촉매를포함하는것이필수적인것은아니다. 개시제에포함된각각의할로겐에대한촉매의비율은전이금속화합물을기준으로, 일부구현예에서약 1:(1 내지 50) 이고, 다른구현예에서약 1:(1 내지 10) 이며, 또다른구현예에서약 1:(1 내지 5) 이고, 다른예에서 1:1이다. 중합조건

61 [0313] [0314] [0315] 일부구현예에서, 본발명의실제라디칼중합공정은바람직하게는 3 내지약 2000 범위의중합도, 다른구현예에서약 5 내지약 500의중합도를달성하도록수행된다. 다른구현예에서중합도는 10 내지 100 범위이거나, 대안적으로약 10 내지약 50 범위이다. 그룹또는원자이동라디칼중합기술에서중합도는단량체에대한개시제의초기비율과직접적인관련이있다. 따라서일부구현예에서, 단량체에대한개시제의초기비율은 1:(3 내지약 2,000), 또는약 1:(5 내지 500), 또는약 1:(10 내지 100), 또는약 1:(10 내지 50) 이다. 중합반응은통상단일균질용액을사용하는액상에서수행된다. 그러나반응은고상및액상을포함하여 ( 예를들어, 현탁액또는수성유제 ) 비균질일수있다. 비중합성용매가사용되는경우에는, 사용되는용매는쌍성이온성단량체, 개시제, 촉매및그의리간드의특성 ; 그리고사용가능한임의의공단량체를고려하여선택된다. 용매는단일화합물또는화합물의혼합물을포함할수있다. 일부구현예에서용매는물이며, 다른구현예에서물은반응에존재하는단량체의중량을기준으로, 약 10 중량 % 내지약 100 중량 % 의양으로존재한다. 수불용성공단량체가쌍성이온성단량체와함께중합되는경우, 모든단량체들을가용화하는용매또는공용매 ( 물과함께 ) 를사용하는것이바람직할수있다. 적절한유기용매의비제한적인예로서는, 포름아미드 ( 예를들어, N,N'-디메틸포름아미드 ), 에테르 ( 예를들어, 테트라하이드로푸란 ), 에스테르 ( 에틸아세테이트 ), 그리고가장바람직하게는알콜을포함한다. 물과유기용매의혼합물이사용되는일부구현예에서, C 1 -C 4 수혼화성 (water miscible) 알킬알콜 ( 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올및테트라부탄올 ) 이유용한유기용매들이다. 다른구현예에서, 물과메탄올조합이중합반응을수행하는데적합하다. 반응은 또한 CO 2 와같은초임계용매내에서수행될수있다. [0316] [0317] [0318] [0319] [0320] [0321] [0322] [0323] 전술한바와같이, 일부구현예에서, 중합될단량체의중량을기준으로, 중합혼합물중약 10 중량 % 내지약 100 중량 % 의물을포함하는것이바람직하다. 다른구현예에서, 전체비중합성용매의양은, 반응혼합물에존재하는단량체의중량을기준으로, 약 1 중량 % 내지약 500 중량 % 이다. 다른구현예에서, 전체비중합성용매의양은반응혼합물에존재하는단량체의중량을기준으로, 약 10 중량 % 내지약 500 중량 %, 대안적으로 20 중량 % 내지 400 중량 % 이다. 어떤경우에는, 예를들어, 온도또는용매또는다른방법을변경하여, 반응조건을역동적인방식으로변화시킴으로써, 개시제또는단량체와같은투입시료의용해도를조정하는것이바람직하다. 일부구현예에서, 개시제와촉매가접촉하기전, 쌍성이온성단량체및물의접촉시간은, 쌍성이온성단량체이외의모든성분들을포함하는프리믹스를형성하여최소화되고, 상기프로믹스에부가될쌍성이온성단량체에대해서지속된다. 중합반응은임의의적절한온도에서수행될수있다. 일부구현예에서온도는대략주변온도 ( 실온 ) 내지약 120 이다. 다른구현예에서중합은약 60 내지 80 범위의주변온도로부터상승된온도에서행해질수있다. 다른구현예에서반응은주변온도 ( 실온 ) 에서행해진다. 일부구현예에서, 본발명의화합물은겔침투크로마토그래피에의해판단할때, 1.5 미만의 ( 분자량의 ) 다분산도를가진다. 다른구현예에서다분산도는 1.2 내지 1.4 범위이다. 또다른구현예에서, 다분산도는 1.2 미만일수있다. 중합체들의침전, 분별 (fractionation), 재침전, 막분리및동결건조와같은, 관심있는중합체를정제하는데다양한워크업과정이사용될수있다. 비할로겐화중합체말단 (Terminus) 일부구현예에서, 할로겐, 또는다른개시제단편 I' 을다른기능기로대체하는것이바람직할수있다. 지방족할로겐의전환을위해다양한반응이이용될수있다. 일부구현예에서, 지방족할로겐의전환은알킬, 알콕시, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는히드록시기를제공하는반응을포함할수있다. 또한할로겐의제거반응으로알켄 ( 이중결합 ) 을생성할수있다. 할로겐화말단을변경하는다른방법이 [Matyjaszewski et al. Prog. Polym. Sci. 2001, 26, 337] 에기재되어있으며, 상기문헌은원용에의해그전문에본명세서에포함된다. 작용제의부착

62 [0324] [0325] [0326] [0327] [0328] [0329] [0330] [0331] [0332] 작용제를본발명의고분자량중합체의커플링을화학적조건및수행되는반응에적용될수있는시약을사용하여수행하였다. 예시된방법은문헌 [Bioconjugated Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2d ed., 2008] ( 본원에통합됨 ) 에기술되어있다. 다른생체컨쥬게이션기술은문헌 [Bertozzi et al. Angewandte Chemie 2009, 48, 6974] 및 [Gauthier et al. Chem. Commun. 2008, 2591] 에서본원의참고문헌으로통합되어있다. 예를들어, 커플링이에스테르또는아미드의형성을요구하는경우에, 카르복실산및알콜또는아민사이의탈수산화는탈수산화제제 ( 예를들어, 디시클로헥실카르보디이미드, DCC, 또는물가용제 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 ) 카르보디이미드하이드로클로라이드, EDC와같은카르보디이미드 ) 를사용할수있다. 또한, N-히드록시숙신이미드에스테르 (NHS) 는아미드를제조하는데사용될수있다. NHS 에스테르를사용하는아미드를제조하는반응을전형적으로포스페이트, 바이카보네이트, 보레이트, HEPES, 또는다른비-아민함유완충액상에서 4도내지 25도의중성 ph 근처에서수행한다. 일부구체예에서, 의 ph에서탈수산화제로서 EDC를사용하는반응을사용될수있고, 다른구체예에서, 4.5 내지 5의 ph에서모르포리노에탄술폰산, MES가효과적인카르보디이미드반응완충액이다. 티올기는상이한생산물을제조하기위하여다양한조건하에서반응을시켰다. 말레이미드로티올을반응시켜서티오에테르결합을형성시킨경우에, 반응을 ph 에서전형적으로수행하였다. 과도한말레이미드기를머캅토에탄올과같은자유티올시약을첨가하여정지시켰다. 이황화결합이연결체로존재하는경우, 이결합은이황화피리딜과같은이황화 X 기능성기및생활성기로존재하는설프하이드릴사이의티올-이황화상호교차로제조할수있다. 이황화피리딜를수반하는반응을 ph 4 - ph 5에서수행할수있고, 반응을 343nm에서모니터링하여방출된피리딘-2-티온을검출할수있다. 티올기는또한수용액상에폭사이드와반응하여히드록시티오에테르를생성할수있다. 티올은또한아이오도아세테이트와같은할로아세테이트로다소약알칼리성 ph에서반응할수있다. 구아니도기 ( 예를들어, 관심있는단백질또는폴리펩타이드상알기닌의반응들 ) 와글리옥살과 ph 에서수행할수있다. 반응은전형적으로 25 에서진행하였다. 구아니도기당 2개의페닐글리옥살부분을함유하는유도체는중성또는알칼리성 ph 보다온화한산성조건 (ph 4 미만 ) 하에서보다안정적이고, 결합된재료를분리하도록하였다. 중성또는알칼리성 ph 값에서연결은천천히분해되었다. 단백질또는폴리펩타이드의알기닌잔기를페닐글리옥산시약과반응시킨경우, 연결의약 80% 가가수분해되어대략 48시간에서 37 에서약 ph 7에서천연알기닌잔기 ( 과도한시약이부재인경우 ) 를재생시켰다. 아민과이미도에스테르반응을전형적으로 ph 8-10에서수행하고, 바람직하게는약 ph 10에서수행하였다. 이미도에스테르와아민을반응시켜서형성된아미딘연결은가역반응이고특히높은 ph에서가역적이다. 할로아세탈은광역의 ph 범위를걸쳐설피드릴기와반응시킬수있다. 히스티딘잔기간에존재할수있는특히, 설프하이드릴기가단백질또는폴리펩타이드상에존재할수있는부반응을피하기위하여, 반응을약 ph 8.3에서수행할수있다. 알데히드는다양한조건하에아민과반응하여이민을형성할수있다. 알데히드또는아민중어느한개가즉시아릴기와근접한경우에, 그생성물은아릴기가존재하지않는경우보다안정적인경향을보이는시프 (Schif f) 이다. 이민결합을형성시키기위하여, 아민과알데히드를반응시키는조건은 ph 9 내지 11의알킬리성을사용하는것을포함하고, 1 내지 14시간동안약 0 내지상온의온도의온도, 1 내지 24시간동안을포함한다. 또한, 단백질의 N 단말으로우선적인커플링이요망되는경우에, 약 4-7의보다낮은 ph를이용할수있다. 보로하이드라이드및 3차아민함유완충액을포함하는완충액을이민의제조를위하여종종사용할수있다. 가수분해가허용되는요망되는이민컨쥬게이트를환원시켜서가수분해가허용되지않는아민결합을헝성시킬수있다. 환원과정을소듐보로하이드라이드또는소듐시아노보로하이드라이드를포함하는다양한적합한환원제로수행할수있다. 상기에서제공되는반응조건은수행자에게일반적인지침을제공하려는의도이다. 당업자는반응조건이필요에따라다양하여본발명의고분자량중합체에작용제를부착시키는것을촉지할수있고, 반응의변형을위한지침을유기화학의표준교과서로부터수득할수있다는것을인지할것이다. 추가적인지침을관련화학반응을논의하는문헌 [ Wong, S.S., Chemistry of protein Conjugation and Cross-Linking,"(CRC Press 1991)] 와같은교과서로부터수득할수있다. 상이한조합단백질을다양한크기의본원발명의광역의다양한중합체에성공적으로컨쥬게이션시키는것과

63 상이한컨쥬게이션화학을통한구조기술을보여주었다. 많은교훈을공정개발노력 ( 컨쥬게이션, 하류공정, 분석개발 ) 및일부독특한특징을가지는기술을하기에서기술하였다. 컨쥬게이트는본원발명의중합체에 공유결합되어컨쥬게이션된단백질또는다른치료제를배타적으로지칭하는것이다. [0333] [0334] [0335] [0336] 컨쥬게이션반응분야에서, 1-2 배의저분자량몰과량비율은우수한컨쥬게이션효율을수득하기위하여유용하다. 낮은몰중합체과량을달성하고우수한컨쥬게이션효율 (>20%) 을유지하기위하여, 단백질농도를통상수용되는 1-2mg/ml의농도보다매우높게하여야만한다. 사용되는어느한특정의단백질에대하여달성될수있는농도는단백질의안정성및생물리학적성질에의존할것이다. 예시적범위는 5-10 mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml, >100 mg/ml을포함한다. 반응의다른측면에서, 주요한도전은중합체의농도이고, 이농도는최적의효율 100mg/ml의상위하는정상농도에대한매우높은수준을또한요구한다. 재미있게도이러한발명의중합체는과량의 500mg/ml의농도에서조차낮은점도를가지는극단의가용성을증명한다. 이러한특징은매우쉽게혼합되는것과같은컨쥬게이션반을을다루는것이가능하도록하는반면, 그와같은농도에서 PEG와같은다른중합체로는용액이너무점도가있어서다룰수가없다. 추가로혼합을개선시키는다양한기구의사용은공정을개선한다. 예를들어, 온도제어기가있는초음파용기를중합체가용화를촉진하기위하여초기혼합에서사용할수있고, 차례로컨쥬게이션효율을향상시킬수있다. 히엘셔울트라소닉 GmbH로부터의바이얼트윗터와같은대안적인초음파기구는초음파용기와비교하여초음파에너지를전달하는효율을개선한다. 이론적인관점에서는초음파파형은중합체및단백질간에상호작용을촉진시키는진동파형을생성한다. 이는보다높고보다개선된컨쥬게이션효율로해석된다. 냉각시스템과같은온도조절기작을추가하는것은이러한시스템에서열감수성단백질을보호한다. 이러한공정을큰산업규모로스케일업 ( 예를들어, 킬로그램또는이보다큰단위 ) 하기위하여, 레소딘사에의해개발된공명음향혼합기술과같은다른장치가유용하다. 사실, 이러한유형의혼합기는성공적으로사용되어고점도중합체및 1,000cp 초과의점도를가지는유체를가용화시킨다. 최고실질적인농도에서본원발명의중합체는그와같은점도수준의분획물로존재하여공명음향혼합기술이특히매력적이게한다. 이와같은기술의추가적인장점은비침습성이고완전히숨겨지는특징뿐만아니라고속의혼합시간을포함한다. 이러한성질은일반적으로단백질의약품과특이하게본원발명의기술과조합하는데에매우바람직하다. 요망되지않는폴리-PEG화된컨쥬게이션부산물은제조과정중에제품의비용을증가시키는것으로본산업에서이슈가된반면, 조절된복잡성및생산품승인장애를또한증가시켰다. 재미있게도본원발명의모든중합체로부터유래된많은상이한정제된컨쥬게이트로사용되어온것들은항상단백질과중합체간에동일한몰비율이된다. 이는다른중합체및컨쥬게이션기술과비교해볼때, 독특하고매우요망되는특징이다. 이전에서기술된하류공정영역에서, 본발명의선호되는중합체는쌍성이온성이온성질로인한중화된총전하를갖는다. 그러므로, 이중합체는광역의 ph 및이온강도를포함하는크로마토그래피조건하에서양이온또는음이온교환수지와상호작용하지않는다. 즉, 자유중합체는 ph 및이온강도와상관없이어떠한이온수지를통해서흘러갈것이다. 그러나, 상이한단백질에컨쥬게이션되면, 켄쥬게이트의크로마토그래피적거동이단백질에의해보여진다. 중합체방어효과의존재및컨쥬게이션화학반응과정중에단백질의변경된전하로인하여컨쥬게이트의이온교환수지와상호작용은천연의단백질과비교하여약화된다. 이러한성질은양이온및음이온교환수지각각과상호작용하는염기성및산성단백질에서관찰된다. 이는또한다음을포함하는제품관련오염으로부터컨쥬게이트를분리하기위한고휴율, 단순, 비용-효과적및직교하는정제방법을고려함으로써, 제조관점의고도로요망되는성질이다 : 미반응자유중합체, 미반응자유단백질및응집체와독소, 컨쥬게이션반응물과첨가물과같은공정오염물. 단일이온교환크로마토그래피단계가충분하다. 예를들어, 컨쥬게이션반응이단백질의 pi보다높은 ph의완충액을가지는낮은이온강도 ( 예를들어 0-20mM NaCl) 로수행되는산성단백질컨쥬게이트에대하여컨쥬게이션반응이완료된경우에컨쥬게이션반응용기의내용물을음이온교환수지 ( 예를들어 Q 유형 IEX 수지 ) 에대하여직접적용할수있고, 여기서미반응자유중합체가수지를통하여흘러가게되고컬럼은이때추적되고동일한 ph에서컨쥬게이션반응과유사한낮은이온강도완충액으로세정된다. 결합분획물은이때증가된염농도로단계적으로용출된다. 제 1 단백질분획물은정제된컨쥬게이트이고, 천연단백질및응집체와독소와같은다른오염물과비교하여이온교환수지에보다약하게결합하기때문이다. 농도구배단계는고도로요망되는데이는천연단백질이컬럼으로부터여과되는잠재적인위험을최소화시킬것이기때문이다. 예를들어, 강한양이온교환수지를사용하면, 사이토카인중합체컨쥬게이트는 ph 7에서 30-60mM NaCl 주변에서용출되는반면, 천연의사이토카인은 100mM 또는그이상까지용출되지않을것이고, 이러한조건하에서사이토카인은이합체및응집체는전형적으로 200mM NaCl 또는그이상

64 에서용출되며, 마지막으로독소가보다높은염농도에서용출된다. [0337] [0338] 염기성단백질컨쥬게이트에대하여, 분리단계는단백질의 pi보다낮은 ph의완충액으로낮은이온강도 ( 예를들어 0-20mM NaCl) 에서양이온수지 ( 예를들어 SP 유형 IEX 수지 ) 를사용하여수행할수있다. 이러한공정은미반응자유중합체가여전히독소및다른음성전한오염물과함께분획물을통해서흐름상에존재하는반면컨쥬게이트및자유미반응단백질이컬럼에결합하여남아있다. 용출완충액의이온강도를증가시켜서천연단백질과비교하여 IEX 수지와약한상호작용때문에분획된제 1 단백질은컨쥬게이트이다. 전형적인 Fab' 컨쥬게이트는 30-60mM NaCl에서용출되는반면천연 Fab' 는 mM NaCl에서용출된다. 산성단백질컨쥬게이트 ( 예를들면, 사이토카인및스캐폴드-기재다중-도메인기재단백질 ) 뿐만아니라염기성단백질컨쥬게이트 ( 예를들면, Fab') 를포함하는다수의다른단백질컨쥬게이트를정제하기위한실험은컨쥬게이트용출에요구되는이온강도가 ( 심지어백만달톤이상의경우에도 ) 중합체크기및구조물 ( 멀티-아암구조물 ) 에상당히의존함을나타낸다. 이것은대부분의공정발전노력들이요구됨이없이중합체에서의변화로일부치료제까지의일반적인제조공정의설계를가능하게하는플랫폼기술에서매우갈망하는특징이다. [0339] [0340] [0341] [0342] [0343] [0344] [0345] [0346] [0347] 제조관점에서말하면, 상기기술된다운스트림정제공정은하기와같은이점을갖는다 : 1. 고도의계량화 ; 2. 수지가상업적으로이용가능하고필요한기구가이미산업적표준을따를때현재상업제작공정의적용가능성 ; 3. 샘플기술은공정분석 (In Process Analytics, IPA) 에서뿐만아니라대량생산에서도사용될수있음 ; 4. 일반적공정의발전이실현가능함 ; 5. 단일단계성질및직교설계로인한비용효율성 ; 6. 우수한회수율 ( 현재공정수율은 80% 정도임 ). 분석개발분야에서, 본발명에따른중합체의쌍성이온성성질은컨쥬게이트의 SDS-PAGE 분석법의개발에 2가지영향을미친다. 첫째, SDS-PAGE 분석법은오랫동안반-정량적인단백질특징화를위한신속, 고해상도, 고속및저비용방법을제공한다는점에서, 단백질분석에편재하고편리한방법으로여겨졌다. 그러나, 순전하중성특성뿐만아니라큰수력학적반경을갖는중합체는중합체가심지어 4% 겔만큼낮게폴리아크릴아미드매트릭스로 ( 매우큰크기의중합체의경우 ) 열악하게이동하거나거의이동하지않음을의미한다. 둘째, 본발명에따른중합체는잠재적으로쿠마시블루염료가중합체와상호작용하는것을방지하는그들의순전하중성특성으로인해, 쿠마시블루염료에의해염색되지않는다. 그러나, 일단단백질이상기중합체에컨쥬게이트되는경우, 상기컨쥬게이트는염색된다. 이들은처음에는대부분의단백질생화학자들에게 2가지의원하지않는특성이지만 ; 그러나, 이러한두가지특성의조합은추가의정제없이반응혼합물로부터컨쥬게이션의빠르고용이한분석을직접적으로효율적이게하는매우원하고유일한기술의설계를가능하게한다. 본기술에서, 컨쥬게이션반응혼합물은 SDS-PAGE 겔로로딩되고표준프로토콜에따라분리된다. 그다음, 상기겔은쿠마시블루로염색된후표준프로토콜에따라탈색된다. 작은단백질은그것의분자량으로이동하는반면, 상기컨쥬게이트의존재는로딩에가까운쿠마시블루염색된밴드를나타내고, 중합체가없는대조군반응과비교하여, 밴드강도에서부수적인감소를나타낼것이다. 따라서, 중합체단독으로는겔의고분자량영역에서어떤염색도나타내지않기때문에비효율적컨쥬게이션을갖는반응들을구별하기가매우용이하다. 컨쥬게이션반응분석기술은쿠마시블루에의한 PEG 중합체뿐만아니라 PEG화단백질염색과같은 PEG화반응에서는불가능하고, 겔내의매우유사한위치로, 특히매우큰 PEG 중합체를이동시킨다 ; 게다가, PEG 중합체는 SDS-PAGE 겔의이동패턴을왜곡시키는매우원하지않는특성을나타낸다. 상기후자의문제는, 비반응유리중합체의순전차중성특성이겔매트릭스로그들을들어가지않게하므로 ( 반면, 컨쥬게이트와비컨쥬게이트된유리단백질만그렇게할것이다 ), 본발명의중합체에서는관찰되지않는다. 본발명에따른중합체의다른흥미로운특성은그들은방향족기의부재로인해 UV 280nm 흡광도를갖지않는다는점이다. 그러나, 그들은 220nm에서흡광도를갖는다. 이것은단백질용액의동일한중량농도와비교할때, 중합체는적어도 10x 낮은흡광도를갖는다. 이것은크기배제또는 IEX 분석과같은다른크로마토그래피방법을사용하여컨쥬게이션반응혼합물내의컨쥬게이트의존재를확인하기위하여시도할때매우유용하다. UV280/UV220 비율을비교함으로써, 비율이급속도로증가하기때문에컨쥬게이트의존재를확인하는것

65 은매우용이하다. 동일한기술이생성물용출을관찰하는분석스케일뿐만아니라생산스케일에도사용될수 있다. [0348] [0349] [0350] [0351] [0352] [0353] [0354] [0355] [0356] V. 조성물본발명은일또는그이상의본발명의화합물및일또는그이상의약제학적으로허용가능한부형제를포함하는약제학적조성물을포함하고제공한다. 본발명의화합물은본발명의약제학적조성물내에서, 약제학적으로허용가능한염, 전구약물, 대사산물, 그들의유사체또는유도체로서존재할수도있다. 본명세서에서사용된, 용어 " 약제학적으로허용가능한부형제 " 또는 " 약제학적으로허용가능한담체 " 는약제학적조성물투여와양립가능한, 임의의모든용매, 분산매, 코팅, 항균및항곰팡이제, 등가제및등장성및흡수지연제등을포함한다. 본발명에따른고 MW 중합체의제형화에사용하기위한약제학적으로허용가능한담체는락토오스, 백토, 수크로오스, 활석, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘스테아레이트, 스테아르산등과같은고형담체 ; 및시럽, 식염수, 포스페이트완충된식염수, 물등과같은약체담체를포함하나, 이에제한되는것은아니다. 담체는단독으로또는왁스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸메타크릴레이트등과함께글리세릴모노스테아레이트또는글리세릴디스테아레이트와같은, 당업계에알려진임의의시간-지연물질을포함할수도있다. 당업계에공지된바와같은다른필러, 부형제, 풍미제, 및그밖의첨가제가또한본발명에따른약제학적조성물내에포함될수도있다. 약제학적활성물질에상기매질및작용제의사용은당업계에잘알려져있다. 임의의통상적인매질또는작용제가활성화합물과양립불가능한경우를제외하고는, 본발명의조성물내에상기의사용이고려된다. 보충적활성화합물이또한본발명의조성물내에첨가될수있다. 상기약제학적조성물제제는모든종류의제형을포함한다. 일구현예에서, 상기는주입또는융합에적합한 ( 피하, 근육, 정맥, 내피, 복막, 척추, 심실, 두개, 척수, 낭내, 및골질내를포함하는 ) 비경구제형 ( 예를들면, 분말또는재구성되거나희석될수있는농축액뿐만아니라분산액및용액 ) 이다. 상기조성물이액체매질과의희석될필요가있는재구성또는농축이요구되는고체인경우, 임의의적합한액체매질이사용될수도있다. 액체매질의바람직한예는물, 식염수, 포스페이트완충식염수, 링거용액, 한크용액, 덱스트로스용액, 및 5% 인간혈청알부민을포함하나, 이에제한되는것은아니다. 본발명에따른고 MW 중합체를포함하는화합물또는약제학적조성물이아암을포함하지만, 이에제한되지않는세포증식장애의치료에적합한경우, 화합물또는약제학적조성물은종양, 혈관또는체강내로의직접적인주입을포함하는다양한경로를통해피검체에투여될수있다. 약제학적조성물이약체용액, 부형제또는투여바로직전에재구성될수있는분말일수도있는반면, 그들은또한다른형태를가질수도있다. 일부구현예에서, 상기약제학적조성물은시럽, 물약, 알약, 과립, 페이스트, 부형제, 크림, 연고, 정제, 캡슐 ( 경질또는연질 ) 스프레이, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 패치, 좌약, 분말등으로제조될수도있다. 상기조성물은또한 ( 입또는설하를포함하는 ) 국소, 폐, 직장, 경피, 경점막, 구강, 눈등을포함하지만, 이에제한되지않는비경구투여이외의투여경로를위해제조될수도있다. 무바늘주입장치가피부하, 피하및 / 또는근육투여를달성하기위하여사용될수있다. 그러한장치는저 (<20 cp), 중 (20-50 cp), 및고 (>100 cp) 점성제형이투여될수있도록본발명의중합체및컨쥬게이트와조합될수있다. 일부구현예에서, 본발명에따른상기약제학적조성물은본발명의일또는그이상의고 MW 중합체를포함한다. 본발명에따른다른약제학적조성물은항원또는타겟분자에특이적인생물학적리간드로기능을하는본발명의일또는그이상의고 MW 중합체를포함할수도있다. 그러한조성물은생물학적작용제가항체, 또는 FAb 2 또는 FAb' 단편또는항체가변영역과같은항체단편의아미노산염기서열을포함하는폴리펩티느인경 우, 본발명의고 MW 중합체를포함할수도있다. 대안적으로, 상기화합물은고 MW 중합체일수도있고, 상기폴리펩티드는단쇄항체의항원결합염기서열을포함할수도있다. 본발명에따른고 MW 중합체내에존재하는생활성작용제가항원또는타겟분자에특이적인리간드로서작용하는경우, 이러한화합물들은또한진단및 / 또는조영시약및 / 또는진단분석법으로사용될수도있다. [0357] 약제학적조성물내의화합물의양은다양한인자에따라다양할것이다. 일구현예에서, 그것은단일투여용

66 기 ( 예를들면, 바이알 ) 에적합한치료적유효량일수도있다. 일구현예에서, 상기화합물의양은단일용도실린저에적합한양이다. 다른구현예에서는, 상기양은다중-용도디스펜서 ( 예를들면, 국소제형을전달하기위해사용되는경우제형의방울의전달하기에적합한용기 ) 에적합하다. 숙련자들은임상적으로원하는결과를달성하기위하여약제학적조성물의양을증가시키는반복적투여에의해실험적으로치료적유효량을측정함으로써화합물의양을결정하는것이가능할것이다. [0358] 일반적으로, 약제학적으로허용가능한부형제는조성물내에서약 0.01 중량 % 내지약 중량 %, 또는약 1 중량 % 내지약 99 중량 % 로존재할것이다. 약제학적조성물은약 5 중량 % 내지약 10 중량 %, 또는약 10 중량 % 내지약 20 중량 %, 또는약 20 중량 % 내지약 30 중량 %, 또는약 30 중량 % 내지약 40 중량 %, 또는약 40 중량 % 내지약 50 중량 %, 또는약 50 중량 % 내지약 60 중량 %, 또는약 60 중량 % 내지약 70 중량 %, 또는약 70 중량 % 내지약 80 중량 %, 또는약 80 중량 % 내지약 90 중량 % 의부형제를함유할수도있다. 상기부형제의다른적합한범위는약 5% 내지약 98 중량 %, 약 15 내지약 95 중량 %, 또는약 20 중량 % 내지약 80 중량 % 를포함한다. [0359] [0360] [0361] [0362] [0363] [0364] [0365] [0366] 약제학적으로허용가능한부형제는문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy" 19 th ed., Williams & Williams, (1995) and Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3 rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000] 를포함하나, 이에제한되지않는다양한공지문헌에기술되어있다. VI. 방법본발명에따른고 MW 중합체는임의의질병상황또는상태를치료하기에유용하다. 상기질병상황또는상태는급성이거나만성일수있다. 본발명에따른고 MW 중합체를사용하여치료될수있는질병상황및상태는암, 자가면역질환, 유전적질환, 감염, 염증, 신경장애, 및대사장애를포함하지만, 이에제한되는것은아니다. 본발명에따른고 MW 중합체를사용하여치료될수있는암은난소암, 자궁암, 폐암, 방광암, 갑상선암, 간암, 흉부암, 췌장암, 자궁경부암, 고환암, 대장암, 항문암, 쓸개관암, 위장관유암종, 식도암, 담낭암, 직장암, 맹장암, 소장암, 위 ( 위의 ) 암, 신장암, 중추신경계암, 피부암, 융모암 ; 두경부암, 골육종, 섬유육종, 신경모세포종, 신경아교종, 흑색종, 백혈병및림프종을포함하지만, 이에제한되는것은아니다. 본발명에따른고 MW 중합체를사용하여치료될수있는자가면역질병은다발성경화증, 근무력증, 크론병, 괴양성대장염, 원발성담즙성간경변증, 타입 1 당뇨병 ( 인슐린의존성당뇨병또는 IDDM), 그레이브병, 자가면역용혈성빈혈, 악성빈혈, 자가면역저혈소판증, 혈관염, 예를들면, 베게너육아종증, 베체트병, 류마티스관절염, 전신성홍반성낭창 ( 낭창 ), 피부경화증, 전신경화증, 갈리안바레증후군, 히시모토갑상선척추관절증, 예를들면, 강직성척추염, 건선, 포진성피부염, 염증성장질환, 심상성천포창및백반증을포함하지만, 이에제한되는것은아니다. 본발명에따른고 MW 중합체에의해치료가능한신진대사장애는리소좀축적장애, 예를들면, 뮤코다낭증 IV 또는모르큐증후군, 활성인자결핍 /GM2 강글리오사이드종, 알파-마노사이드종, 아스파르틸글루코사이뇨증, 콜레스테릴에스테르축적질환, 만성헥소사미니데이즈 A 결핍증, 시스틴축적증, 다논병, 파브리병, 파버병, 푸코사이드축적증, 갈락토사이알도시스, 고셔병, GM1 강글리오사이드증, 저인산염혈증, I-세포병 / 뮤코리피드증 II, 영아시알산축적병 /ISSD, 유아헥소스아미니데이즈 A 결핍증, 크랩병, 이염성백질이영양증, 점액다당류증, 예를들면슈도-헬러다발이상증 / 뮤코리피드증 IIIA, 헬러증후군, 샤이에증후군, 헬러-샤이에증후군, 헌터증후군, 산필리포증후군, 모르퀴오, 히알루로니다아제결핍증, 마로테옥소-라미, 슬라이증후군, 뮤코리피드증 I/ 시알산증, 뮤코리피드증, 및뮤코리피드증, 다중설리피다제결핍증, 니에만-피크질병, 신경성지방갈색소증, 폼페병 / 글리코겐축적증 II, 농축이골증, 샌드호프병, 쉰들러병, 살라병 / 시알산축적증, 테이-삭스 /GM2 강글리오사이드증및월만병을포함한다. 본발명의컨쥬게이트및본발명에따른컨쥬게이트를함유하는조성물 ( 예를들면, 약제학적조성물 ) 은다양한상태를치료하기위하여사용될수있다. 예를들면, 많은상태를위한치료요법이본명세서에개시된, 기능성작용제가사용되는당업계의숙련자에게알려져있다. 본발명은본발명의컨쥬게이트 ( 예를들면, 다양한기능성작용제에컨쥬게이트된중합체를함유하는포스포릴콜린 ) 및본발명의컨쥬게이트를함유하는조성물이상기상태를치료하기위하여사용될수있고, 그러한컨쥬게이트가중합체를함유하는포스포릴콜린에결

67 합하지않는동일한기능성작용제비해강화된치료요법을제공한다고이해된다. [0367] [0368] [0369] [0370] [0371] 따라서, 본발명은중합체를함유하는포스포릴콜린에컨쥬게이트된동일한특정생물활성작용제를사용하여상태를치료함으로써상기활성제의해치료가능한것으로알려진상태의치료를고려한다. 본발명의다른측면은본발명의화합물또는상기기술된본발명의약제학적으로허용가능한조성물의치료적유효량을그것이요구되는피검체에투여하는것을포함하는생물학적작용제에반응성인상태를치료하는방법에관한것이다. 용량및투여는원하는효과를유지하기위한생활성작용제 ( 들 ) 의충분한수준이제공될수있도록조절된다. 임의의주어진피검체에적절한용량및 / 또는투여는질병상태의중증도, 피검체의일반적건강상태, 연령, 체중, 및피검체의성별, 식이요법, 투여의시간및빈도, 약물조합 ( 들 ), 반응민감성, 및치료내성 / 반응성을포함하는다양한인자들에따라변경될수도있다. 주어진상황에서의치료적유효량은임상의의기술및판단내에서일반적실험에의해측정될수있다. 본명세서에기술된약제학적조성물은단독으로투여될수도있다. 대안적으로, 2 또는그이상의약제학적조성물이연속적으로, 또는본발명의 2개의고 MW 중합체또는본발명의 1개의고 MW 중합체및다른생활성작용제를함유하는혼합물이나조합물로투여될수도있다. 본명세서에서설명된다른생활성작용제의용도가문헌 [Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ and Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (1990)] 와같은표준참고서에서발견될수도있다. 본발명은혈액관련단백질, 예를들면인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X 및프로테아제의변경, 예를들면천연염기서열또는뮤테인염기서열과천연기능또는변경된 ( 예를들면, 문헌 [Catalyst Biosciences of South San Francisco with technology] 를참고하여존재하는효소의결합특이성을변경하기위하여파지디스플레이를통해 ) 기능을갖는세린프로테아제를기술한다. US 특허 7,632,921는전체내용이본명세서에포함되어있다. 작용화된중합체의부위-특이적컨쥬게이션을가능하게하는효소의변경이개시되어있다. 그러한단백질이적절히설정된인체내에서방출될수있도록, 예를들면 0차방출프로파일이가능하도록, 중합체와효소사이의유연한화학물질의사용이개시되어있다. 다음재생인자 VIII에대한타겟생산프로파일은 50 kda 분자량이상의확장된형태인, 멀티-아암쌍성이온-함유중합체가시스테인과같은부위-특이성아미노산에부착되어있는, 재조합 FVIII 또는재조합 B-도메인결실된 FVIII의공유컨쥬게이트를포함한다. 상기컨쥬게이트의임상적약리학자들은제거및면역시스템으로부터컨쥬게이트를보호하기위해구조화되는특수한물을입증할것이다. 상기컨쥬게이트는인간에서 50 시간제거반감기이상 ( 바람직하기는 80 시간이상 ) 을입증할것이다. 상기컨쥬게이트는동일한생활성을갖는 60 kda PEG-BDD FVIII에비해 2x ( 바람직하기는 4x) 증가된반감기를입증할것이다. 환자에서사용된상기컨쥬게이트는임상적으로무의미한항체형성을나타낼것이다. 상기생약리학적컨쥬게이트는예방학적으로 (1주에 1회미만의빈도로 ) 뿐만아니라혈우병을갖는환자의즉각적인치료에사용될것이다. 또한, 존재하는 FVIII 중성화항체, 예를들면종래 FVIII 생약리학적치료로부터의환자의구조치료에사용될것이다. 상기약물은 IV 및 / 또는피하투여를위해액체제형이높은안정성, 높은농도, 및저점도를가질수있도록할것이다. 활성성분들은 0.4ml의이상적인명목부피내에서 30 내지 250 마이크로그램의중합체약물컨쥬게이트로구성된 250 내지 2,000 IU 범위내일수있다. 상기중합체의비용은낮을것이고, FVIII 또는 BDD FVIII 단백질에중합체의컨쥬게이션효능은매우, 예를들면 75% 정도까지높을것이다. 그러한생산물및생산프로파일은중합체의우수한생체친화성를사용하고단백질로전환되도록한다. 구체적으로, 극한생체친화성은그자체로매우단단한수분결합, 극한용해성, 매우높은농도, 매우낮은점도, 및극한안정성을나타낸다. 기술적으로, 이것은 PEG화또는이와동등한기술에비해 >2x ( 또는이상적으로 >4x) 증가된제거반감기, 극한적으로낮거나없는면역원성, 높은농도, 및실온안정성액체제형으로해석된다. 생산물프로파일이점은낮은투여횟수, 동일한곡선하면적에서의낮은투여, 네이브환자에유효한안전한치료, 중성화항체를갖는환자의구조치료, 가정에서의피하투여, 실온저장된미리-충전된실린저 / 자동주입기, 높은가우지 ( 낮은직경 ) 시린저바늘, 낮은주입량, 및긴저장수명을포함한다. 제조시, 우선, 단일포트합성, 매우높은중합체분자량, 복합구조물, 및제조시낮은비용이달성가능하다. 또한, 약물로의중합체의높은효율의컨쥬게이션이가능하다. 이러한제조이점은저렴하고, 더이용가능한약물및높은매출이익으로해석될수있다. 본발명은 Avidia에양도된 US 특허출원 60/514,391에기술된바와같이재조합변경된 LDL 수용체클래스 A 도메인의멀티머또는관계공통서열에고 MW 쌍성이온-함유중합체를부착하는것을기술한다. 당업계의숙련자들은상기아비머가리신결핍된후작용화된중합체의부위-특이적부착을위한 N- 및 / 또는 C- 말단에첨가된리신및 / 또는다른아미노산일것으로이해할것이다. N-말단리신은바람직하기는 ( 메티오닌이후의 ) 제2-67 -

68 아미노산이고알데히드또는아세탈기를함유하는작용화된중합체와같은아민-유도개시제의상대적부위특이적컨쥬게이션을야기할수있다. 당업계의숙련자는단백질내에존재하는 N-말단아미노기또는다른아민기에도컨쥬게이트하는멀티-포인트부착보다는리신의아민에우선적으로컨쥬게이트되도록 ph가컨쥬게이션반응을매우낮게유도하기위하여, 상대적으로친수성아미노산및낮은 pi 및높은안정성을갖는아비머조성물의이점을알것이다. 상기치료제는 N-말단에컨쥬게이트된중합체및 C-말단리신 ( 유효한분지형구조 ) 를통해 C-말단에컨쥬게이트된다른중합체를가질수있다. 그러한아비머는또한티올-반응성작용화된중합체와부위특이적컨쥬게이션을위해첨가된여분의 N- 또는 C-말단시스테인을갖는포유동물계내에서만들어질수있다. 상기중합체작용기는또한조직타겟인자를함유할수있다. 아미버에중합체를부착하는화학물질은그것이생체내에서예를들면, 혈청또는 ph 반응방법등을통해분해될수있도록유연할수있다. 단량체및유사하게사용되는목적의다른도메인으로구성된다량체는 EGF 도메인, Notch/LNR 도메인, DSL 도메인, Anato 도메인, 인테그린베타도메인또는참조된특허패밀리에기술된다른도메인을포함한다. [0372] [0373] [0374] [0375] 본발명은또한펩티드및합성펩티드, 구체적으로다수의도메인을갖는더합성된펩티드에고 MW 쌍성이온- 함유중합체의부착을기술한다. 다수의도메인펩티드에의한큰문제는그들이안정하지않고또한매우빠른속도로분해된다는것이다. 본발명에기술된높은생체이용성쌍성이온-함유중합체의부착이이문제를해결한다. 상기중합체는안정성을증가시키고또한생체거주시간을증가시킨다. 이것은약물로서단순선형 ( 비구조화됨 ), 예를들면갈망하는이점또는다기능적이점을달성하기위해목표로하는 2, 3, 4 또는그이상의모듈의시리즈에서기능적모듈마다약 20개의아미노산의모듈을가능하게한다. 각각의모듈은또한약간의구조 (" 제한적 " 펩티드형 ) 을가지거나각각의모듈은시스테인노트또는실제로마크로시클릭인자와같은노트된펩티드도메인일수있다. 중요한점은이들이합성되거나 N-말단또는 C-말단 ( 또는둘다 ) 에중합체컨쥬게이션을위한부위특이적모이어티또는중앙에중합체컨쥬게이션위치로서로연결될수있다는것이고, 상기부착지점은천연아미노산또는비-천연아미노산인부위특이적아미노산일수있다는것이다. 어떠한의미에서, 이것은우선적인특성을갖는합성아비머이다. 모든아미노산은합성될수도있다. 본발명에따른펩티드플러스중합체는미래의신규하고강력한약물형태를기술한다. 당업계의숙련자들은본발명에따른고분자량중합체의적용깊이가매우넓음을이해할것이다. 그러한중합체의컨쥬게이션으로부터이득이될수있는치료적양상에대한일부리스트는 : 아비머 (LDL 수용체 A-도메인스캐폴드 ), 아드넥틴 ( 피브리노넥틴형 III 스케폴드 ), 애블링스 ( 카멜리드, IIama-ids), NAR ( 상어 ), 모든종 ( 래트, 토기, 상어, IIama, 낙타등 ) 으로부터의하나의-아암및 / 또는단일도메인항체, 디아바디, 기타다중- 도메인기재단백질, 예를들면변형된피브로넥틴도메인의멀티머, 항체단편 ( 효능제또는길항제로서 scfv 단량체, scfv 다이머 ), Fab', Fab'-2', 용해성세포외도메인 (stnfr1, 예를들면, 또는용해성 cmet 수용체단편 ), 오픈리딩프라임의일부로만들어진 1,500 개의친수성아미노산스트링을포함하는 Amunix XTEN와의조합, 올리고뉴클레오티드, 예를들면앱타머, microrna, sirna, (Fc-영역에컨쥬게이션된 ; 비-Fc 영역에컨쥬게이션된 ) 전체항체, (Fc-영역에컨쥬게이션된 ; 융합단백질에컨쥬게이션된 ) Fc-융합, ( 고분자량중합체가펩티드자체에직접컨쥬게이트된경우 ) CovX 항체백본의치환체로서상기중합체의사용, 더광범위하게는 (CovX 바디, 펩티바디, 인간화된항체또는다른항체, 펩티드가상기항체의다른위치에서컨쥬게이트됨으로서항체백본의상단의분자에모듈식다기능약물을형성하는경우 Carlos Barbas로부터의신규한 Zyngenia 플랫폼 ) 전장천연또는뮤테인항체에본발명의중합체의부착으로이루어진다. 또한, 미국특허출원 60/514,391에기술된많은도메인구조가본명세서에그것의전체내용이포함되어있다. 특히세포-표면타겟에결합하거나상기를억제하기위한컨쥬게이트가관심대상이고, 구조물로부터확장되는큰크기의설정및본발명에기술된중합체컨쥬게이트의느린속도가유리한생물학적이점을가질수있다. 본발명은안과의우선적으로활성컨쥬게이트의물리적존재로인해측정된 10일이상의유리체내평균말단반감기를갖는유리체내또는결막하부투여를위한컨쥬게이트를기술한다. 상기활성컨쥬게이트는또한상기중합체의일말단에가깝게공유결합된, 2개의작용제를함유할수있다. 이경우, 2개의작용제는습식및건식연령-관련황반변성의치료를위한 VEGF 및 PDGF의앱타머일수있다. 본발명은췌장의베타세포에결합하는바와같이면역또는제거과정으로부터세포의보호인자로서, GLP-1, 수용성 TACI 수용체, BAFF 뿐만아니라 BAFF 억제제, 인슐린및그의변이체, IL-12 뮤테인 ( 기능적항-IL-23 등가물 ), 항-IL-17 등가물, FGF21 및뮤테인, RANK 리간드및그의길항체, 대체보체의억제를위한인자 H 및융합체단백질 (Taligen), 면역시냅스의억제제, 면역시냅스의활성인자, T-세포및 / 또는 B/ 세포공동자극경로의억제인자, 뉴런세포및 / 또는그들의지지기질세포의활성인자또는억제인자, 세포외기질효소, 예를들면라이실옥시다제또는메탈로프로테인아제 / 메탈로프로테아제, 조절 T 세포또는항체생성세포의활성인

69 자또는억제인자를포함함으로써, 비만세포와같은세포를억제하기위한세포-표면활성화모듈 (ITAM) 에세포-표면억제모듈 ((ITAM)) 을함께제공하는 2개의수용성또는세포-표면체의공동-국지화를조절하기위한, 존재하지만미스-폴딩된단백질을새프로닝하기위한, 유전질환을치료하기위한체내에서그들의수명을연장하기위한세포의보호기능을발휘 ( 즉, 능동또는수동의국지적또는일반화면역과정에서의제거및 / 또는그들의관여를감소시키기위한생체적합성증가로부터의이점을가질수있는체내의세포또는조직또는단백질을위해그들에결합함으로써생체적합성의복구 ) 한다. [0376] [0377] [0378] [0379] [0380] [0381] 본발명은세포-도입을매개하기위한본발명의중합체의사용을의도한다. 예를들면, 본발명의중합체의그들의개시제구조또는 2차및 1차의일이상의단백질-유도펩티드및양친매성펩티드의말단을통한컨쥬게이션 (Current Opinion in Biotechnology, 2006, 17, ). 당해기술분야의숙련자들은또한세포도입을용이하게하기위하여펩티드에탄화수소모이어티를결합하는분류펩티드기술과의조합가능성을인식할것이다. 본발명은 PLGA와같은다른약물전달기술과본발명의조합을의도한다. PEG의천연친수성이다수의 PLGA 특성을개선시키므로, 현재발명의고 MW 중합체기술도이를더욱개선시킬것이다. 예를들면, 전체중량의퍼센트로서증가된약물로딩 ( 본기술분야의현재생약제학적상태는 <20% 이나일반적으로는 10% 미만이다 ) 은또한일반적인증가 % 로서 >5% 이다. 현재발명의중합체의강화된물결합은수용성을유도하고생약제학적-중합체컨쥬게이트로로딩된 PLGA의더높은로딩및생체내효율을증가시킨다. 본발명은특정약물-중합체컨쥬게이트 ( 중화항체의더낮은새로운발생 ) 에대한더낮은면역원성을나타내는컨쥬게이트를의도한다. 또한, 차단, 마스킹, 탈-면역화를의도한다. 존재하는중화항체가제거될뿐만아니라약물-중합체컨쥬게이트가가지고있거나천연이거나환자가면역원성생약제학적및발전된항체로이전에치료되어가지게된환자에게제공될수있다. 나중의환자의경우, 본발명은그러한환자를 " 구조 " 하는능력이의도된것으로, 치료요법을그들에게제공가능하다. 예를들면, 이것은환자가인자 VIII 치료요법 ( 예를들면, 그것에실패한후인자 VII 치료요법으로바꾸는것보다는 ) 을유지할수있기때문에인자 VIII로유용하다. 본기술의측면을가지고있는면역시스템이또한약물이국소덴드리틱및다른고유의및적응성면역세포집단이면역원성이발생이증가하는경우피하또는무-바늘주입을위한제형화를가능하게한다. 본발명의약물-중합체컨쥬게이트가다시면원원성이감소되거나존재하는중성화항체를숨긴후에, 본기술은피하투여를가능하게하고항체상호작용을막으므로적합한환자베이스를확장시켜과민증과같은주입관련부작용의발생을감소시킬것이다. 본발명은단일제형으로조합되는동일하거나다른치료모이어티에다른중합체컨쥬게이트집단을포함시킬가능성을가능하게한다. 결과는원하는생체내및시험관내특성을조심스럽게맞추는것이다. 예를들면, 단일의치료모이어티및컨쥬게이트를단일포트로만들거나다른크기, 구조체의 2개의종합체로포트를분리시킨다. 2개의집단은생체내에서다르게행동할것이다. 한집단은매우작거나적은분지형중합체를함유할수있다. 두번째집단은크거나, 더분지형인구조체일수있다. 작은중합체로의컨쥬게이트는더빨리제거될것이다. 이것은예를들면, 로딩용량으로서또는혈청으로부터존재하는사이토카인 ( 약물모이어티로서항- TNF 또는항-IL-6 scfv의컨쥬게이션 ) 의제거에특이적인볼루스만큼크다. 더큰중합체와의컨쥬게이트는더느리고예를들면, 신규하게생성된 TNFa 또는 IL-6를제거할것이다. 이것은집단의다른비율, 예를들면 1:1 또는 2:1 또는 10:1 또는 100:1 등으로수행될수있다. 컨쥬게이트된치료모이어티는동일하지만다른컨쥬게이트된중합체의결과로서다른말단특성이있고다른생물학적효과를가질수있다. 다른예는목표가볼루스측면 ( 빨리활성화 ) 뿐만아니라기본 ( 연장된 ) 측면을가지는단일주입을가지는경우인슐린또는다른길항적단백질이있다. 인자 VIII의경우, 컨쥬게이트된인자 VIII의일집단은중합체와효소사이의가수분해성링커를가지므로효소가빨리빠져나온다. 두번째집단은안정한링커를가질수있으므로긴기간 ( 만성, 예방 ) 측면을위해제공한다. 본발명은컨쥬게이션을생성함으로써 IV 및 / 또는 SC 주입이후에, 0차방출동역학이달성될수있다. 방출기간 (1달, 2달, 3달, 4달, 6달, 12달 ) 은중합체의크기및구조및링커화학에의존할것이다. 이는지리적으로국지화된저장소로부터일정한양의약물을방출하는의료장치또는펌프와기능적으로동일할것이다. 본발명의경우, 상기약물은물리적으로함유될것이다. 일정한주기를갖거나특정조직내에풍부하게타겟화하는것보다는, 발생이선형방출및최소한의발사및 100% 로딩과유사한를갖는 0차동력학및과유사하거나동일하도록설계된다. 당해기술분야의숙련자들은본발명이중합체및개시제내에절단부위또는약한부위의도입을가능하게함

70 으로써더큰중합체구조및 / 또는컨쥬게이션이용이하고빨리체내에서제거되는작은조작으로시간에따라 분해될수있음을인지할것이다. 우선예를들면개시제및약물, ( 개시제, 중합체백본, 단량체 ) 내의에스테 르결합사이의민감한링커를포함한다. [0382] 그러한약한부위는수동적으로 ( 예, 가수분해에의해 ) 또는능동적으로 ( 효소에의해 ) 파괴될수있다. 파괴또는제거를유도하는그밖의접근법은노출된화학물질에서의변화가노출된화학물질이신장또는간, 또는파괴또는제거를위한다른부위에대하여시간에걸쳐파괴를유도하거나, 방출된중합체의컨쥬게이트를타겟으로하여이루어지도록보호기또는전구약물화학물질의사용을포함할수있다. [0383] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의랜덤공중합체의제조를위한도식을보여준다. 개시제 I-I' 은개시제단편 I 및라디칼스 캐빈저 I' 으로분해된다. 이후, 개시제단편 I는공단량체 M 1 및 M 2 와반응하여중합과정을개시시키고, 종 A 를생성한다. 이후, 라디칼스캐빈저 I' 은종 A와가역적으로반응하여종 B를형성시킬수있다. 대안적으로, 종 A는추가단량체와반응하여중합체의전파를계속할수있다 ( 종 C). 부수적으로, 종 C의성장하는중합체사슬은라디칼스캐빈저 I' 와가역적으로반응하여랜덤공중합체, 종 D를형성할수있다. 도 2는본발명의컨쥬게이트를보여준다. 도 3은본발명의컨쥬게이트를보여준다. [0384] [0385] 발명을실시하기위한구체적인내용 VII. 실시예실시예 1. N-(2-히드록시에틸 )-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로파탈이미드의제조 [0386] [0387] 교반바가구비된 100-ml 둥근바닥플라스크에 50 ml의에탄올및 2.0 g의엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로프탈산무수물을충전시켰다. 교반된혼합물을얼음수조로냉각시키고, 20 ml의에탄올중의 0.73 g의에탄올아민의용액을 10분에걸쳐적가하였다. 반응을 4시간동안환류가열시킨후, 밤새냉각시켰다. 여과하고, 에탄올로세정하여 0.73 g의요망되는생성물을백색결정질고형물로서수득하였다. 여과액을농축시키 고다시냉각시켜이차결정물을수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 2.90 (s, 2H, CH), 3.71 (m, 2H, OCH 2 ), 3.77 (t, J=5.0 Hz, NCH 2 ), 5.29 (t, J=1.0 Hz, 2H, OCH), 6.53 (t, J=1.0 Hz, 2H, CH=CH). [0388] 실시예 2. 이소프로필이덴 -2,2- 비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피온산의제조 [0389] [0390] 교반바가구비된 100-ml 둥근바닥플라스크에 50 ml의아세톤, 13.8 ml의 2,2-디메톡시프로판, 10 g의 2,2-비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피온산, 및 0.71 그램의 p-톨루엔술폰산일수화물을충전시켰다. 혼합물을주위온도에서 2시간동안교반시킨후, 메탄올중의 1 ml의 2M 암모니아로중화시켰다. 용매를증발시키고, 혼합물을디클로로메탄중에용해시킨후, 20 ml의물로 2회추출하였다. 유기상을마그네슘술페이트상에서건조시키고, 증 발시켜백색결정질고형물로서 10.8 g 의생성물을제공하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 1.20 (s, 3H, CH 3 CC=O), 1.43 (s, 3H, CH 3 ), 1.46 (s, 3H, CH 3 ), 3.70 (d, J=12.4 Hz, 2H, OCH 2 ), 4.17 (d, J=12.4 Hz, 2H, OCH 2 )

71 [0391] 실시예 3. N,N- 디메틸피리디늄 p- 톨루엔술포네이트 (DPTS) 의제조 [0392] [0393] [0394] 10 ml의벤젠중의 1.9 g의 p-톨루엔술폰산일수화물의용액을 Dean-Stark 트랩을사용하여공비증류에의해건조시킨후, 3.42 g의 4-디메틸아미노피리딘을첨가하였다. 다량의고형물이형성되었고, 반응을일으키는데추가 25 ml의벤젠이필요했고, 실온으로냉각시키면서서서히교반하였다. 생성된고형물을여과로분리하고, 10 ml의벤젠으로세척하고, 건조시켜백색고형물로서 7.88 g의생성물을수득하였다. 실시예 4. 보호된말레이미드브로모프로피오네이트개시제의제조 [0395] [0396] 교반바가구비된 100-ml 둥근바닥플라스크에 50 ml 테트라하이드로퓨란, 2 g의 N-(2-히드록시에틸 )-엑소-3,6- 에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로파탈이미드, 및 2.0 ml 트리에틸아민을충전시켰다. 교반된혼합물을 0도로냉각시키고, 5 ml의테트라하이드로퓨란중의 1.18 ml의 2-브로모이소부티릴브로마이드의용액을 30분에걸쳐적가하였다. 반응물을 3시간동안얼음상에서, 이어서실온에서밤새교반하였다. 반응혼합물을농축시켜오일성잔류물을제공하고, 이를헥산중의 30 내지 50% 에틸아세테이트로실리카겔플래시크로마토그래피에 의해정제하여백색분말로서 1.96 g 의요망되는생성물을제공하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 1.89 (s, 6H, CH 3 ), 2.87 (s, 2H, CH), 3.82 (t, J=5.4 Hz, 2H, NCH 2 ), 4.33 (t, J=5.4 Hz, 2H, OCH 2 ), 5.27 (t, J=1.0 Hz, 2H, OCH), 6.51 (t, J=1.0 Hz, 2H, CH 비닐 ). [0397] [0398] 실시예 5. 보호된말레이미드비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제의제조 보호된말레이미드이소프로필이덴산. [0399] [0400] 30 ml의건성디클로로메탄중의 2.00 g의 N-(2-히드록시에틸 )-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로파탈이미드및 1.67 g의이소프로필이덴-2,2-비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피온산의용액을 563 mg의 DPTS와함께 10 ml의건성디클로로메탄중의 2.37 g의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드의용액으로적가처리하였다. 반응혼합물을주위온도에서밤새교반시킴에따라다량의고형물이형성되기시작하였다. 반응물을여과시키고, 침전물을소량의디클로로메탄으로세척하였다. 합한유기층을농축시켜소량의고형물을함유하는투명한오일을제공하였다. 이오일을헥산중의처음 20 내지 100% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피처리하였다. 요망되는생성물을함유하는분획을합하고농축시켜백색고형물로서 3.17 g의 최종생성물을제공하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 1.19 (s, 3H, CH 3 CC=OO), 1.37 (s, 3H, CH 3 ), 1.41 (s, 3H, CH 3 ), 1.55 (s, 6H, (CH 3 ) 2 C), 2.86 (s, 2H, C=OCHCHC=O), 3.58 (d, J=12Hz, CH 2 O), 3.78 (t, J=5.4Hz, CH 2 CH 2 O), 4.14 (d, J=12H, CH 2 O), 4.30 (t, J=5.4Hz, CH 2 CH 2 O), 5.27 (t, 2H, CHOCH), 6.51 (s, 2H, CH=CH). [0401] 보호된말레이미드디올. [0402]

72 [0403] 50 ml 의메탄올중의상기로부터의이소프로필이덴화합물의용액을 1.0 g 의 Dowex 50Wx8-100 이온교환수지 (H + 형태 ) 로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였는데, 이때반응은 tlc ( 실리카겔, 에틸아세테이트 ) 에의해완료된것으로나타났다. 혼합물을여과시키고, 고체수지를소량의메탄올로세척하였다. 합한유기물을농축시키고, 고진공하에두어추가의정제없이다음반응에서사용되는 1.55 g의약간탁한오일을제공하였다. [0404] 보호된말레이미드비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제. [0405] [0406] 40 ml의무수테트라하이드로퓨란 (THF) 중의상기로부터의미정제생성물의용액을 1.45 ml의트리에틸아민과함께얼음수조중에서냉각시키고, 20 ml의무수 THF 중의 1.23 ml의 2-브로모이소부티릴브로마이드의용액을수분에걸쳐적가하였다. 반응물을 30분동안차가운조건에서교반한후, 실온으로 6시간에걸쳐가온시켰다. 추가 600 μl의트리에틸아민, 이어서추가 0.5 ml의 2-브로모이소부티릴브로마이드를첨가하였다. 반응물은 ph 시험지에의해측정하는경우산성이었고, 추가 200 μl의트리에틸아민을첨가하여용액의 ph를 9로조절하였다. 반응물을밤새교반하고, 농축시키고, 잔여물을 50 ml의디클로로메탄과 50 ml의물로분배하였다. 유기층을황산나트륨상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜오일을제공하였다. 이를헥산중의처음 20%, 이어서 30%, 마지막으로 40% 에틸아세테이트로실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피처리하였다. 생성물 을함유하는분획을합하고, 농축시켜백색고형물로고형화된 1.63g 의오일을제공하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 1.32 (s, 3H, CH 3 CC=O), 1.91 [s, 12H, (CH 3 ) 2 CBr], 2.90 (s, 2H, CHC=O), 3.78 (t, 2H, NCH 2 CH 2 O), 4.28 (t, 2H, NCH 2 CH 2 O), 4.31 (app q, 4H, CH 2 OC=O), 5.30 (s, 2H, CHOCH), 6.52 (s, 2H, CH=CH). [0407] 실시예 6. N-[2-(2- 히드록시에톡시 ) 에틸 ]- 엑소 -3,6- 에폭시 -1,2,3,6- 테트라하이드로파탈이미드의제조 [0408] [0409] 교반바가구비된 250 ml 둥근바닥플라스크에 100 ml의메탄올및 20 g의엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로프탈산무수물을충전시켰다. 교반된혼합물을 0도로냉각시키고, 40 ml의메탄올중의 0.73 그램의 2-(2- 아미노에톡시 ) 에탄올의용액을 45분에걸쳐적가하였다. 반응물을실온에서 2시간동안교반한후, 밤새약하게환류가열시켰다. 용액을농축시키고, 생성물을 100 ml의디클로로메탄중에용해시킨후, 100 ml의브라인으로세척하였다. 유기층을황산나트륨상에서건조시키고, 농축시키고, 100 ml의디클로로메탄및 100 ml의 에틸아세테이트로실리카겔플러그에통과시켜정제하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 2.90 (s, 2H, CH), 3.49 (m, 2H, OCH 2 ), 3.59 (m, 4H, OCH 2 ), 3.65 (m, 2H, NCH2), 5.15 (t, J=0.8 Hz, 2H, OCH), 6.55 (t, J=0.8 Hz, 2H, CH=CH). [0410] 실시예 7. 비스 2,2-[(2- 브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온산의제조 [0411]

73 [0412] 교반바가구비된 500 ml 둥근바닥플라스크를 200 ml의디클로로메탄, 8.0 g의 2,2-비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피온산, 및 33.5 ml의트리에틸아민으로충전시켰다. 교반된혼합물을 0도로냉각시키고, 30 ml의디클로로메탄중의 14.7 ml의 2-브로모이소부티릴브로마이드의용액을 30분에걸쳐적가하였다. 반응물을 1.5시간동안얼음상에서교반시킨후, 실온으로밤새가온시켰다. 침전물을추가디클로로메탄을지닌용액으로취하고, 혼합물을 400 ml의 0.5 N 염산으로세척하고, 무수황산나트륨상에서건조시켰다. 반응혼합물을농축시켜오일성잔류물을제공하고, 이를 1% 아세트산을함유하는헥산중의 30 내지 40% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시크로마토그래피에의해정제하여백색왁스형고형물로서 27.4 g의요망되는생성물을제공 하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD): δ= 1.33 (s, 3H, CCH 3 ), 1.90 (s, 12H, (CH 3 ) 2 CBr), 4.30 (d, J=5.4 Hz, 2H, NCH 2 ), 4.39 (d, J=5.4 Hz, 2H, OCH 2 ). [0413] 실시예 8. 보호된말레이미드연장형비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제의제조 [0414] [0415] 교반바가구비된 250 ml 둥근바닥플라스크에 100 ml의디클로로메탄, 1.0 g의 N-[2-(2-히드록시에톡시 ) 에틸 ]- 엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라하이드로파탈이미드, 실시예 7로부터의 2.5 g의디브롬산, 0.5 g의디메틸아미노피리딘, 및 0.35 그램의 DPTS을충전시켰다. 질소를용액을통해잠시동안거품발생시키고, 1.6 그램의 DCC를서서히첨가하였다. 반응을실온으로밤새교반시켰다. 여과시키고, 증발시켜실리카겔플래시크로마 토그래피에의해정제된분홍색오일성잔류물을제공하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD): δ= 1.34 (s, 3H, CH 3 ), 1.90 (s, 6H, CH 3 ), 2.94 (s, 2H, CH), 3.64 (m, 6H, OCH 2 ), 4.22 (t, J=5.4 Hz, 2H, NCH 2 ), 4.35 (app q, 4H, OCH 2 ), 5.15 (t, J=1.0 Hz, 2H, OCH), 6.54 (t, J=1.0 Hz, 2H, CH=CH). [0416] 실시예 9. 아세탈비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제의제조 [0417] [0418] 50 ml의디클로로메탄중의 1.03 g의 3,3-디에톡시-1-프로판올및 3.0 g의 2,2-비스 (2-브로모이소부티릴옥시메틸 ) 프로피온산의용액을 817 mg의 N,N-디메틸피리디늄 p-톨루엔술포네이트와함께 1.58 g의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드로처리하고, 반응물을주위온도에서밤새교반하였다. 반응물을여과시키고, 침전물을소량의디클로로메탄으로세척하였다. 합한유기물을농축시키고, 잔류물을헥산중의 10 내지 20% 에틸아세테이트로실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피처리하였다. 요망되는생성물을함유하는분획을합하고, 농축시 켜 2.87 g의투명한무색오일을제공하였다. 1 H NMR에의해측정하는경우물질이여전히순수하지않아서다시디클로로메탄을사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜점성의투명오일로서 2.00 g의요망되는생성물을제공하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 1.20 (t, 6H, CH 3 CH 2 O), 1.34 (s, 3H, CH 3 CC=O), 1.92 [s, 12H, (CH 3 ) 2 CBr], 1.98 (app q, 2H, CHCH 2 CH 2 ), 3.50 (m, 2H, OCH 2 CH 3 ), 3.66 (m, 2H, OCH 2 CH 3 ), 4.24 (t, 2H, CH 2 CH 2 OC=O), 4.37 (app q, 4H, CH 2 OC=OCBr), 4.60 (t, 1H, O-CH-O)

74 [0419] 실시예 10. 비닐비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제 1 의제조 [0420] [0421] 교반바가구비된 100 ml 둥근바닥플라스크에 30 ml의디클로로메탄, 86 밀리그램의 4-펜텐-1-올, 실시예 7로부터의 432 밀리그램의디브롬산, 및 88 밀리그램의 DPTS을충전시켰다. 질소를용액을통해잠시동안기포발생시키고, 169 μl의 N,N'-디이소프로필카르보디이미드를서서히첨가하였다. 반응물을실온에서밤새교반한후, 추가 0.1 그램의 DPTS를첨가하고, 반응물을밤새다시교반하였다. 여과하고, 증발시키고, 헥산중의 20 내지 40% 를사용하여실리카겔상의플래시크로마토그래피에의해정제하였다. 용매를첫번째생성물로부터 제거하여컬럼을수행하여무색오일로서 0.13 g 의요망되는생성물을수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD): δ= 1.34 (s, 3H, CH 3 ), 1.77 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 ), 1.90 (s, 12H, CH 3 ), 2.15 (q, J=7.2 Hz, 2H, CHCH 2 CH 2 ), 4.16 (t, J=6.4 Hz, 2H, OCH 2 ), 4.36 (app. q, 4H, CCH 2 O), 5.02 (m, 2H, CH 2 =CH), 5.82 (m, 1H, CH 2 =CH). [0422] 실시예 11. 비닐비스 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제 2 의제조 [0423] [0424] 교반바가구비된 100 ml 둥근바닥플라스크에 25 ml의디클로로메탄, 370 밀리그램의에틸렌글리콜모노비닐에테르, 실시예 7로부터의 432 밀리그램의디브롬산, 및 590 g의 DPTS을충전시켰다. 플라스크를질소로채우고, 681 μl의 N,N'-디이소프로필카르보디이미드를서서히첨가하였다. 반응물을실온에서밤새교반시켰다. 혼합물을여과한후, 건조시키고, 헥산중의 5 내지 10% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시크 로마토그래피로정제하여무색오일로서생성물을수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 1.36 (s, 3H, CH 3 ), 1.92 (s, 12H, CH 3 ), 3.90 (app q, J=5.4 Hz, 2H, NCH 2 CH 2 O), 4.05 (dd, 1H, J=2.4, 6.8 Hz, =CH), 4.19 (dd, J=2.4, 14.4 Hz, 1H, =CH), 4.39 (m, 2H, NCH 2 CH 2 O), 4.40 (app q, 4H, OCH 2 ), 6.45 (dd, 1H, J=6.8, 14.4 Hz, =CHO). [0425] 실시예 12. Boc- 아미노비스 ( 말레이미드 ) 개시제의제조 [0426] [0427] 50 ml 의디클로로메탄중의 2.19 g 의 N-Boc-3- 아미노 -1- 프로판올및 5.20 g 의 2,2- 비스 (2- 브로모이소부티릴옥시 메틸 ) 프로피온산의용액을 350 mg 의 DPTS 와함께 3.0 g 의 N,N'- 디시클로헥실카르보디이미드로처리하고, 반응물 을주위온도에서밤새교반하였다. 반응혼합물을여과하고, 침전물을소량의디클로로메탄으로세척하였다

75 농축시키고, 헥산중의 5 내지 20% 에틸아세테이트로실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜소량의고형잔여물을함유하는오일을제공하였다. 이러한물질을에틸아세테이트중에취하고, 여과하였다. 다시농축시켰는데소량의고형물을여전히함유하는오일이제공되어물질을다시에틸아세테이트중에취하고, 여과하고, 농축시켜요망되는생성물을등명한오일로서 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ= 4.8 (br s, 1H, NH), 4.37 (app q, 4H, CH 2 OC=OCBr), 4.22 (t, 2H, CH 2 CH 2 OC=O), 3.20 (app q, 2H, NHCH 2 ), 1.92 [s, 12H, (CH 3 ) 2 CBr ], 1.85 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 ), 1.43 (s, 9H, (CH 3 ) 3 O), 1.35 (s, CH 3 CC=O). [0428] 실시예 13. 보호된말레이미드 4- 올의제조 [0429] [0430] 교반바가구비된 100 ml 둥근-바닥플라스크에 30 ml의디클로로메탄, 실시예 7로부터의 1.6 g의디올, 1.71 g 의이소프로필이덴-2,2-비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피온산, 및 0.5 g의 DPTS을충전시켰다. 용액을통해질소를잠시동안기포발생시키고, 1.70 ml의 N,N'-디이소프로필카르보디이미드를서서히첨가하고, 반응물을실온에서밤새교반시켰다. 여과하고, 증발시키고, 헥산중의 10 내지 40% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시크로마토그래피에의해정제하였다. 디클로로메탄중의 2% 메탄을을사용하여실리카겔상의플래시크로마토그래피에의해이차정제하여약 2 g의무색오일을수득하였다. 이오일을 25 ml의메탄올중에용해시키고, Dowex 50WX8-100 수지 (H + 형태 ) 로실온에서 60시간동안교반하였다. 반응물을여과하고, 농축시킨후, 디클로로메탄중의 150 ml의 15% 메탄올로실리카겔플러그에통과시켰다. 증발시켜 1.3 g의거의무색의 경성포움을수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 1.13 (s, 6H, CH 3 ), 1.25 (s, 3H, CH 3 ), 2.96 (s, 2H, CHC=ON), (m, 8H, CH 2 OH), 3.64 (t, J=2.8 Hz, 2H, CH 2 CH 2 OC=O),4.22 (app q, 4H, C(CH 3 )CH 2 OC=O l ), 4.22 (t, J=2.8 Hz, CH 2 CH 2 OC=O), 5.21 (t, J=0.8 Hz, CHOCH), 6.55 (t, J=0.8 Hz, CH=CH). [0431] 실시예 14. 보호된말레이미드테트라 ( 브로모프로피오네이트 ) 개시제의제조 [0432] [0433] 교반바가구비된 100 ml 둥근바닥플라스크에 20 ml의디클로로메탄, 실시예 13으로부터의 0.55 g의테트라올, 및 1.69 ml의트리에틸아민을충전시켰다. 교반된혼합물을 0도로냉각시키고, 10 ml 디클로로메탄중의 0.99 ml의 2-브로모이소부티릴브로마이드의용액을적가하였다. 반응물을실온에서밤새교반시킨후, 50 ml의반포화된소듐바이카보네이트로세척하였다. 반응혼합물을농축시키고, 헥산중의 40% 에틸아세테이트로실리카겔상의플래시크로마토그래피에의해정제하여오일성갈색생성물을제공하였다. 갈색생성물을메탄올중에서용해시키고, 차콜로처리하여색을제거하여 0.68 g의요망되는생성물을연한갈색오일로서수득하였

76 다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 1.26 (s, 3H, CH 3 CC=O), 1.34 (s, 6H, CH 3 CC=O), 1.90 (s, 24H, (CH 3 ) 2 CBr), 2.95 (s, 2H, CH), 3.78 (t, J=5 Hz, 2H, NCH 2 ), 4.25 (m, 6H, OCH 2 C (4H) and OCH 2 CH 2 N (2H)), 4.35 (app q, 8H, OCH 2 ), 5.23 (t, J=1 Hz, 2H, CHOCH), 6.55 (t, J=1 Hz, 2H, CH=CH). [0434] [0435] [0436] [0437] 실시예 15. 고분자량쌍성이온성중합체의제조 " 생 " 조절된자유라디칼공정인원자이동라디칼중합 (ATRP) 을이용하여고분자량의쌍성이온성단량체, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 (HEMA-PC) 의조절되어제조된친수성중합체를생성시키는대표적인프로토콜은하기와같다. 하기개시제가사용되었다 : PMC2M1( 실시예 4로부터 ) [0438] [0439] PMC2Ms( 실시예 5 로부터 ) [0440] [0441] PMC2M4( 실시예 14 로부터 ) [0442] [0443] 개시제및리간드 (2,2'-바이피리딜) 를 Schlenk 튜브에넣었다. 디메틸포름아미드또는디메틸설폭사이드를개시제와리간드의중량 % 가약 20중량 % 가되도록적가하였다. 생성된용액을건조얼음 / 아세톤혼합물을사용하여 -78 로냉각시키고, 10분동안진공하에탈기시켰다. 튜브를질소하에다시채우고, 촉매 ( 달리지시되지않는한 CuBr) 를질소하에유지시키면서 Schlenck 튜브에채웠다 ( 브롬 / 촉매 / 리간드의몰비는 1/1/2로유지됨 ). 용액은즉시암갈색이되었다. Schlenck 튜브를밀봉하고 -78 로유지하였다. 용액을진공 / 질소사이클을 3 회적용시킴으로써퍼징시켰다. 질소하에서유지시키면서소정량의단량체를 200프루프의탈기된에탄올과혼합함으로써 HEMA-PC의용액을제조하였다. 단량체용액을약한교반에의해 Schlenk 튜브에적가하였다. 온도를 -78 로유지하였다. 관통진공을적어도 10 내지 15분동안용액으로부터거품발생이중지될때까지혼합물에가하였다. 이후, 튜브를질소로재충전시키고, 실온으로가온시켰다. 용액을교반하고, 중합이진행됨에따라용액은점성이되었다. 3 내지 8시간후, 반응물을공기에직접적인노출에의해켄칭시켜 Cu (I) 내지 Cu (II) 로산화시키자, 혼합물은색깔이청녹색이되었고, 이를실리카컬럼에통과시켜구리촉매를제거하였다. 수집된용액을회전증발기에의해농축시키고, 생성된혼합물을테트라하이드로푸란으로침전시키거나물에대

77 해분석한후건조동결시켜자유유동하는백색분말을수득하였다. [0444] 여러중합반응으로부터의데이터가하기표에기재되어있다. [0445] [0446] [0447] [0448] [0449] 최고분자량 (g/mol) 및다분산성 (PDI) 을폴리 ( 에틸렌옥사이드 ) 표준으로보정된 Shodex OHpak SB-806M HQ 컬럼에의해측정하였다. 실시예 16. 레트로 Diel-Alder 반응을사용하여퓨란-보호된말레이미드기능화된중합체의비보호실시예 15로부터의중합체를둥근바닥플라스크에서에탄올 (20 내지 50중량 %) 중에용해시켰다. 에탄올을회전증발기에의해서서히제거하여플라스크벽에박막을형성시켰다. 반응용기를진공하에서 110 이상의온도의오일배쓰에 90분동안넣은후, 실온으로냉각시켰다. 1 HNMR (400MHz, d-메탄올 ) 에의해모니터링된말레이미드작용기의비보호 : [0450] [0451] [0452] [0453] [0454] [0455] [0456] 비보호전 : δ(ppm):5.2 (2H, -CH-O-CH-) 및 6.6 (2H, -CH=CH-). 비보호후 : δ(ppm): 6.95 (2H, -CO-CH=CH-CO-). 실시예 17. 인간 IgG의펩신분해및 F(ab')2 단편의정제실시예 15의기능화된중합체로의컨쥬게이션을위한 F(ab')2 항체단편의생성에서사용하기위해전체인간 IgG를 Innovative Research, Jackson Immunochem, and/or Rockland Laboratories로부터구입하였다. IgG를고정된펩신 (Thermo Scientific) 을이용하여분해한후, 투석에의하거나 PD-10 탈염컬럼 (GE Healthcare) 을이용함으로써소듐아세테이트완충액을이용하여 4.5로 ph 조정하였다. ph 조정후, 0.5 ml 양의고정된펩신을소듐아세테이트완충액, ph 4을이용하여 3회세척하고, 0.5 ml의최종부피로재현탁시켰다. 1 ml의 IgG를고정된펩신에 10 mg/ml의농도로첨가하고, 37 에서로커 (rocker)/ 진탕기상에두었다. 4시간동안분해시켰다. 4시간후, 40 μl의샘플을분리시키고, PBS 이동상을갖는 Shodex Protein KW 컬럼을이용한 HPLC 에의해분석하였다. IgG 피크를 F(ab')2 피크로부터분리시키고, 분해된퍼센트를기초로하여분해의진행을결정하였다. 고정된펩신은힌지영역을넘어서는 Fc 도메인만을분리시킴으로써 F(ab')2 항체단편을발생시키는데사용되는단백질분해성효소이다. 이는힌지영역내의공유이황화결합에의해연결된 2개의항체-결합 Fab' 단편으로구성되는 F(ab')2 단편을발생시킨다. IgG의 F(ab')2로의분해후, 샘플을원심분리시켜분해된항체단편으로부터고정된펩신의겔을분리시키고, 수지를 3회세척하였다. 세척물을본래의상층액과조합시켰다. F(ab')2 항체단편을 Superdex 200 HR 10/30 컬럼 (GE Healthcare) 및 PBS를이용하여 Fc 단편으로부터정제하였다. 정제된 F(ab')2가먼저용리된후, Fc 단편이용리되었다. 정제된 F(ab')2를 2-8 에서저장하였다. 실시예 18. Fab' 단편으로의말레이미드기능화된중합체의컨쥬게이션

78 [0457] [0458] [0459] [0460] [0461] [0462] [0463] [0464] 용액중의 15 mm의최종농도의소듐보로히드라이드를이용한이황화결합의환원에의해실시예 17의 F(ab')2 제조물로부터 Fab' 단편을생성시켰다. F(ab')2 제조물을 4 mm EDTA를함유하는 PBS를이용하여희석시키고, 동일완충액중의동일부피의소듐보로히드라이드를첨가하고, 혼합물을실온에서교반플레이트상에두었다. 반응을실온에서 1-1.5시간동안진행시키고, 환원의진행을 Shodex Protein KW 컬럼및이동상으로서 PBS를이용하는 HPLC에의해모니터하였다. F(ab')2의 90% 이상이소모된경우에환원이완료된것으로간주하였다. 이황화물환원직후, 0.1N HCl을이용하여샘플 ph를약 4-5로조정하였다. 용액의 ph 조정후, 샘플을추가 10분동안혼합한후, 0.1N NaOH를이용하여 ph를 로조정하였다. 교반하면서, 10-몰과량의실시예 16으로부터의말레이미드기능화된중합체를혼합물에첨가하고, 실온에서인큐베이션하였다. HPLC 에의한분석을위해 0 시간에서샘플을분리시키고, 반응의진행을모니터하기위해 1 및 2시간에서다시분리시켰다. Waters Alliance 2695 HPLC system 2695에는 Waters 2996 Photodiode Detector 및 PBS 이동상을갖는 Shodex Protein KW-803 컬럼이장비되었다. 컨쥬게이션효율을 220 nm 및 280 nm에서모니터하였다. 2시간후, 샘플을 AKTA Prime Plus (GE Healthcare) 및 Superdex 200 HR 10/30 분취용크기배제컬럼을이용하여정제하였다. 사용된용리완충액은 PBS였다. 중합체컨쥬게이션된 Fab' 가먼저용리된후, 유리중합체및반응되지않은 Fab' 이용리되었다. 수거된분획을 PBS 이동상을갖는 Shodex Protein KW-803 컬럼을이용하여분석하였다. 정제된 Fab' 컨쥬게이트를함유하는분획을조합시키고, Sartorius로부터의 Vivaspin 2 (3000 MWCO) 필터를이용하여농축시켰다. 실시예 kda 말레이미드기능화된중합체로의항-VEGF 앱타머의컨쥬게이션말단아민을함유하는항-VEGF 앱타머 (Agilent, Boulder, CO) 를실시예 15의말레이미드기능화된중합체 ( 샘플 5) 에컨쥬게이션시킨후, 실시예 16에따라탈보호시켰다. 하기와같이말단아민을티올로전환시키는데트라우트시약 (Traut's Reagent) 을사용하였다. 앱타머 (5.4 mg) 를 500 μl의 0.1M 소듐바이카보네이트완충액, ph=8.0에용해시켰다. 독립된바이얼에서, 7.2 mg의 2-이미노티올란 HCl( 트라우트시약, Sigma) 을 3.6 ml의정제수에용해시켜 2 mg/ml 용액을생성시켰다. 100 μl양의 2-이미노티올란 HCl을앱타머혼합물에첨가하고, 1 시간동안실온에서교반하였다. 트라우트시약을함유하는앱타머샘플을 PD-10 탈염컬럼상을통과시켜임의의반응되지않은 2-이미노티올란을제거하고, 최종완충액을 4 mm EDTA를함유하는 PBS로교환하였다. 말단티올기를함유하는앱타머샘플의적은일부를실온에서교반막대와혼합하고, 지속적으로교반하면서 14.0 mg 의말레이미드기능화된중합체를반응물에첨가하였다. KW-803 컬럼, PBS 이동상및 1 ml/ 분의유속을이용하는 HPLC에의한분석을위해 0시간에서 60 μl샘플을분리시켰다. 샘플을 220 and 280 nm의파장에서뿐만아니라굴절지수검출에의해모니터하였다. 분취량을분리시키고, 2시간후에시험하고, 밤새 4 에서교반한후에다시시험하였다. 앱타머컨쥬게이트를용리액으로서포스페이트완충액을이용하는 Superdex 200 HR 10/30(GE Healthcare) 상에서의동용매 (isocratic) 구배를이용하여정제하였다. 정제된컨쥬게이트가먼저용리된후, 반응되지않은중합체및잔여앱타머가용리되었다. 실시예 20. 중합체-아프타머컨쥬게이트를사용한 PLGA 미소구체제조실시예 19로부터의중합체-아프타머컨쥬게이트를폴리 ( 락틱-코-글리콜 ) 산 (PLGA) 미소구체를지닌유중유용매혼합물로제형화하였다. 중합체-아프타머컨쥬게이트 (20 mg) 를실온에서디클로로메탄중 0.1% 클로로포름중의 100 mg/ml PLGA의용액에현탁시켰다. 현탁된컨쥬게이트를폴리 ( 디메틸 ) 실록산과혼합하여미소구체의균일한분산액을제조하였다. 상기혼합물을헵탄을함유한플라스크로옮기고, 실온에서 3 시간동안교반하였다. 얻어진미소구체를분리하고, 0.2 마이크론필터를이용하여수집하고진공하에서밤새건조시켰다. 실시예 21. 무테인인자 VIII를 50, 100, 및 200 kda 말레이미드작용화된중합체 (2개의아암을지닌중합체 ) 에및 100 및 200 kda 작용화된중합체 (4개의아암을지닌중합체 ) 에컨쥬게이션 BDD 인자 VIII와시스테인무테인의사이트특이적컨쥬게이션 ( 미국특허제7,632,921호 ) 을고정화된트리스 (2- 카르복시에틸 ) 포스핀 (TCEP) 또는디티오트리에톨 (DTT) 중어느하나를사용하여환원시켜 " 캡 (cap)" 을방출시켰다. 환원후에, 환원제인고정화된 TCEP를원심분리를통해제거하거나, DTT를사용할때, PD-10 탈염화컬럼 (GE Healthcare) 을이용하여제거를수행하였다. BDD 인자 VIII 상의환원된시스테인을실온에서 2 시간이하동안, 또는 4 에서밤새, 1배내지 10배몰과량의, 50 내지 200 kda (2-아암) 또는 100 내지 200 kda (4-아암 ) 의분자량을갖는실시예 16으로부터의말레이미드작용화된중합체로처리하였다. 최종컨쥬게이션된 BDD 인자 VIII 샘플을소듐클로라이드구배를이용한음이온교환크로마토그래피를이용하여정제하였다. 컨쥬게이션된무테인을미반응된인자 VIII 및자유말레이미드작용화된중합체로부터분리하였다. 분별된샘플들을

79 확인을위해 SEC HPLC 및 SDS-PAGE로분석하였다. 인자 VIII의컨쥬게이션된무테인을함유한모든분획들을합하고 PD-10 탈염화컬럼을이용하여소듐포스페이트완충제중에서최종제형으로완충제교환하였다. 특정경우에서, 컨쥬게이션반응에서사용되는말레이미드작용화된중합체의분자량에따라, 미반응된종들로부터컨쥬게이션된인자 VIII를분리시키기위해 SEC를이용한추가정제가요구된다. [0465] [0466] [0467] 실시예 내지 200 kda 말레이미드작용화된중합체에 scfv의컨쥬게이션 c-말단보호된시스테인으로개질된 scfv 분절을 4 mm EDTA를함유한 PBS로희석시키고, 동일한완충제중의동일한부피의소듐보로하이드라이드를첨가하였다. 상기혼합물을실온에서교반플레이트상에배치시켰다. 대안적으로, 환원을고정화된 TCEP를이용하여 6 내지 7의 ph 범위에서수행하였다. 반응물을실온에서 0.5 내지 2 시간동안진행시키고, 환원의진행을 Shodex 단백질 KW 컬럼및이동상으로서 PBS를이용한 HPLC로모니터링하였다. 디설파이드환원직후에, 샘플을교반하면서실온에서 10 몰과량의실시예 16으로부터의말레이미드작용화된중합체와반응시켰다. 샘플을 HPLC에의한분석을위하여시간 0(zero) 에서제거하였고, 반응의진행을모니터링하기위하여다시 1 시간및 2 시간에제거하였다. Waters Alliance 2695 HPLC 시스템 2695에 Waters 2996 광다이오드검출기, 및 PBS 이동상을구비한 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을장착하였다. 컨쥬게이션효능을 220 nm 및 280 nm에서모니터링하였다. 2 시간후에, 샘플을 KTA Prime Plus (GE Healthcare) 및 Superdex 200 HR 10/30 제조용크기배제컬럼을이용하여정제하였다. 사용된용출완충제는 PBS이었다. 중합체컨쥬게이션된 scfv가먼저용출된후에자유중합체및미반응된 Fab' 가용출되었다. 수집된분획들을 PBS 이동상과함께 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을이용하여분석하였다. 정제된 scfv 컨쥬게이트를함유한분획들을합하고 Sartorius로부터의 Vivaspin 2 (3000 MWCO) 필터를이용하여농축시켰다. 실시예 23. 2,2-[(2-브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 3-히드록시프로필에스테르의합성 [0468] [0469] 500 mg의 DPTS와함께, 50 ml의건조아세토니트릴중 4.40 그램의 1,3-프로판디올및 5.00 그램의비스 2,2- [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산 ( 실시예 7로부터 ) 의용액을 2.86 그램의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 이후에, 반응물을여과하고, 여액을농축시켜일부고형물을함유한오일을수득하였다. 이를헥산중 30% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피로정제하고, 생성물함유분획들을합하고, 농축시켜 1.75 그램의생성물을등명한무색오일로서수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ = 1.35 (s, 3H, CCH3), 1.92 (s 및중첩하는 m, 14H, (CH 3 ) 2 CBr 및 CH 2 CH 2 CH 2 ), 3.71 (app q, J=6 Hz, 2H, HOCH 2 ), 4.31 (t, J=6 Hz, 2H, CH 2 OC=O), 4.37 (app q, 4H, CH 2 OC=OCBr). [0470] 실시예 24. 비스 2,2-[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 3- 옥소프로판올에스테르의합성 [0471] [0472] 25 ml의디클로로메탄중 1.01 그램의비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 3-히드록시프로필에스테르 ( 실시예 23로부터 ) 의용액을 1.75 그램의데스-마틴페리오디난 [Org. Synth. Coll. Vol. X, 696 (2004)] 로처리하고, 반응물을실온에서 30분동안교반하였으며, 이때에반응은 tlc ( 실리카겔, 헥산중 30% 에틸아세테이트 ) 에의해완료된것으로나타났다. 반응물을여과하고농축시키고, 잔류물을헥산중 30% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피로처리하여 730 mg의요망되는알데히드생성물을등명한무색오일로서수득하였으며, 이를빛으로부터보호하였고질소-충전된글로브박스의냉장고 에저장하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.33 (s, 3H, CCH 3 ), 1.92 (s, 12H, (CH 3 ) 2 CBr), 2.83 (t,

80 J=6.4 Hz, 2H, HC=OCH 2 ), 4.34 (app q, 4H, OCH 2 ), 4.48 (t, J=6.4 Hz, HC=OCH 2 CH 2 ), 9.79 (br s, 1H, CHO). [0473] 실시예 25. 비스 2,2-[(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, N- 히드록시숙신이미드에스테르 [0474] [0475] 5 ml의디클로로메탄중 500 mg의비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산 ( 실시예 7로부터 ) 및 133 mg의 N-히드록시숙신이미드의용액을 286 mg의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서 1.5 시간동안교반하였으며, 이때에, 반응은 tlc ( 실리카겔, 헥산중 30% 에틸아세테이트 ) 에의해완료된것으로나타났다. 반응물을여과하고, 농축시키고, 잔류물을헥산중 30% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 생성물함유분획들을합하고농축시켜 518 mg의요망되는 NHS 에스테르를등명한 무색오일로서수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.55 (s, 3H, CCH 3 ), 1.95 (s, 12H, (CH 3 ) 2 CBr), 2.84 ( 브로드 s, 4H, O=CCH 2 CH 2 C=O), 4.49 (s, 4H, CH 2 OC=OCBr). [0476] [0477] [0478] [0479] 실시예 26. 고분자량알데히드및 NHS 에스테르작용화된쌍성이온성중합체의제조 " 리빙 (living)" 제어된자유라디칼공정, 원자이동라디칼중합 (ATRP) 을이용하여쌍성이온성단량체, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 (HEMA-PC) 의고분자량, 주문-제조된친수성중합체를생성시키기위한대표적인프로토콜은하기와같다. 하기개시제들을사용하였다 : NHSM2 ( 실시예 25로부터 ) [0480] [0481] AlC2M2 ( 실시예 24 로부터 ) [0482] [0483] 개시제및리간드 (2,2'-비피리딜) 를슈랭크튜브에도입하였다. 디메틸포름아미드또는디메틸설폭사이드를, 개시제및리간드의중량백분율이대략 20% 이도록점적으로도입하였다. 얻어진용액을드라이아이스 / 아세톤혼합물을사용하여 -78 로냉각시키고, 진공하에서 10분동안탈기시켰다. 상기튜브를질소및촉매 ( 달리명시되지않는한 CuBr) 하에서재충전하고, 질소하에서유지시키고, 슈랭크튜브에도입하였다 ( 브롬 / 촉매 / 리간드의몰비는 1/1/2에서유지됨 ). 용액은바로진한갈색이되었다. 슈랭크튜브를시일링하고 -78 로유지시켰다. 진공 / 질소사이클을 3회적용하여용액을퍼징하였다. 질소하에서유지된규정된양의단량체를 200프로프 (proof) 탈기된에탄올과혼합하여 HEMA-PC의용액을제조하였다. 단량체용액을슈랭크튜브에적가하고, 약하게교반하여균질화하였다. 온도를 -78 로유지시켰다. 용액으로부터의버블링이멈출때까지, 완전한진공을반응혼합물에적어도 10 내지 15분동안적용하였다. 이후에, 튜브를질소로재충전하고실온으로가온시켰다. 용액을교반시켰으며, 중합이진행됨에따라, 용액은점성을갖게된다. 3 내지 8 시간후에, Cu(I) 를 Cu(II) 로산화시키기위하여공기에직접노출시켜반응을켄칭시켰으며, 혼합물은청록색이되었으며, 이를구리촉매를제거하기위하여실리카컬럼으로통과시켰다. 수집된용액을회전증발로농축시키고, 얻어

81 진혼합물을테트라히드로푸란으로침전시키거나물로투석한후에냉동건조시켜자유 - 유동백색분말을수득 하였다. [0484] 중합반응으로부터의데이타는하기표에나타낸다. [0485] [0486] [0487] [0488] [0489] [0490] [0491] [0492] [0493] [0494] 실시예 kda 알데히드기능화된중합체에인간성장호르몬의컨쥬게이션포스페이트완충액중 10 mg/ml 농도의인간성장호르몬 (hgh) 의샘플을제조하였다. 별도의플라스크에, 소듐시아노보로하이드라이드를 100 mm 농도에서계량하고, 10 ml의소듐포스페이트완충제, ph 6에서희석시켰다. PBS로희석시킨직후에이를사용하였다. 동일부피의용액중의소듐시아노보로하이드라이드를실시예 26으로부터의알데히드기능화된중합체및 hgh를함유한반응혼합물에첨가하였다. 반응을실온또는 4 에서밤새혼합하였다. 반응의컨쥬게이션백분율을이동상으로서 PBS 및 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을이용한 HPLC로모니터링하였다. 샘플을 AKTA Prime Plus (GE Healthcare) 및 Superdex 200 HR 10/30 제조용크기배제컬럼을이용하여정제하였다. 사용된용출완충제는 PBS이다. 컨쥬게이션된 hghrk 먼저용출된후에자유알데히드기능화된중합체및미반응된 hgh가용출되었다. 합쳐진분획들을 PBS 이동상과함께 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을이용하여 HPLC로분석하였다. 정제된 hgh 컨쥬게이트를함유한분획들을합하고 Sartorius로부터의 Vivaspin 2 (3000 MWCO) 필터를이용하여농축시켰다. 실시예 kda NHS 에스테르기능화된중합체에헤마티드의컨쥬게이션 1 내지 10 mg/ml 농도의헤마티드의용액을 PD-10 탈염화컬럼 (GE Healthcare) 을이용하여 0.1 M 소듐보레이트완충제, ph 9로완충제교환하였다. 실시예 26으로부터의 NHS 에스테르기능화된중합체를실온에서일정하게교반하는헤마티드의샘플에 10 몰과량으로첨가하였다. 반응물을실온에서 2 시간동안또는 4 에서밤새진행시켰다. 컨쥬게이션의정도를결정하기위한샘플을 Shodex KW-803 컬럼및 PBS 이동상을이용하여 HPLC로분석하였다. 샘플의분취액을시간 0에뽑아내고컨쥬게이션후 1 및 2시간에뽑아내었다. 2시간이지난후또는하룻밤후에, 1 M 글리세린을첨가하여반응을켄칭시켰다. 샘플을 AKTA Prime Plus (GE Healthcare) 및 Superdex 200 HR 10/30 제조용크기배제컬럼을이용하여정제하였다. 사용된용출완충제는 PBS이다. 헤마티드에컨쥬게이션된 NHS 에스테르기능화된중합체가먼저용출되고자유중합체, 미반응된헤마티드, 및다른소분자가용출되었다. 수집된분획들을 PBS 이동상과함께 Shodex 단백질 KW-803 컬럼을이용하여 HPLC로분석하였다. 정제된헤마티드컨쥬게이트를함유한분획들을합하고, Sartorius로부터의 Vivaspin 2 (3000 MWCO) 필터를이용하여농축시켰다. 실시예 29. HEMA-PC의고압중합고압하에서 HEMA-PC 단량체의중합을유리-라이닝된스테인레스스틸압력용기에서수행하였다. 비율 HEMA- PC/2-아암보호된말레이미드개시제 ( 실시예 8로부터 /CuBr/ 바이피리딜은 /1/2/4의범위임 ; 에탄올중 T=22 ; DMF ( 에탄올중 1-1.5%w/w) 를함유한에탄올중 [HEMA-PC]0=0.86M). 압력은 1 bar 내지 6 kbar의범위이다. 실시예 30. N-[2-(2-히드록시에톡시 ) 에틸 ]-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라히드로프탈이미드, 이소프로필리덴- 2,2-비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피오네이트의제조 [0495]

82 [0496] [0497] 1.3 g의 DPTS 및 5.24 g의 DMAP와함께, 250 ml의디클로로메탄중 11.0 g의 N-[2-(2-히드록시에톡시 ) 에틸 ]-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라히드로프탈이미드및 8.22 g의이소프로필리덴-2,2-비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피온산의용액을 12.9 g의 DCC로처리하고, 반응물을밤새교반하였다. 반응물을여과하고, 농축시켜잔류물을수득하고, 이를헥산중 40-50% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서두부분으로플래시컬럼크로마토그래피하여요망되는생성물을등명한오일로서수득하였다. 실시예 31. N-[2-(2-히드록시에톡시 ) 에틸 ]-엑소-3,6-에폭시-1,2,3,6-테트라히드로프탈이미드, 2,2-비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피오네이트의제조 [0498] [0499] 상기로부터의생성물을 100 ml의메탄올에용해시키고, 2.0 g의 Dowex 50Wx8-100 이온교환수지 (H + 형태 ) 로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을여과하고, 농축시켜요망되는생성물을오일로서수득하였으며, 이를추가정제없이사용하였다. NMR (CD 3 OD): δ (t, 2H, CH=CH, J=0.8 Hz), (t, 2H, CH-O, J=0.8 Hz), (m, 2H, CH 2 -CH 2 -O-C=O, J= 4.9 Hz), 3.63 (m, 10H, N-CH 2 및 N-CH 2 -CH 2 및 CH 2 - CH 2 -O-C=O 및 CH2-OH), (s, 2H, CH-CH), (s, 3H, CH 3 ). [0500] 실시예 32. N-[2-(2- 히드록시에톡시 ) 에틸 ]- 엑소 -3,6- 에폭시 -1,2,3,6- 테트라히드로프탈이미드, 2,2- 비스 -[2,2- 비 스 (2- 브로모이소부티릴옥시메틸 ) 프로피오닐옥시메틸 ] 프로피오네이트개시제의제조 [0501] [0502] 500 mg의 DPTS 및 810 mg의 DMAP와함께, 50 ml의디클로로메탄중상기단계로부터의 1.5 g의디올및 3.72 g 의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산의용액을 1.40 g의디이소프로필카르보디이미드로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을농축시키고, 잔류물을헥산중 40% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서여러차례크로마토그래피하였다. 각경우에서의적절한분획들을합하고, 농축시켜요망되는생성물을오일로서수득하였다. NMR (CD 3 OD): δ 6.55 (t, 2H, CH=CH, J=0.8 Hz), 5.17 (t, 2H, CH- O, J=0.8 Hz), 3.34 (m, 12H, CCH 2 ), 4.23 (m, 2H, CH 2 -CH 2 -O-C=O, J= 4.7 Hz), 3.68 (m, 2H, N-CH 2, J=4.7 Hz), 3.64 (app q, 4H, N-CH 2 -CH 2 및 CH 2 -CH 2 -O-C=O), 2.95 (s, 2H, CH-CH), (s, 24H, Br-C-CH 3 ), 1.34 (s, 6H, CH 3 ), (s, 3H, CH 3 ). [0503] 실시예 33. N-(3- 프로피온산 )- 엑소 -3,6- 에폭시 -3,6- 디메틸 -1,2,3,6- 테트라히드로프탈이미드, 2,2- 비스 [(2- 브로 모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산을지닌에스테르, 3- 히드록시프로필에스테르개시제의제조 [0504]

83 [0505] 50 mg의 DPTS 및 100 mg의 DMAP와함께, 20 ml의건조아세토니트릴중 738 mg의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 3-히드록시프로필에스테르및 399 mg의 N-(3-프로피온산 )-엑소-3,6-에폭시-3,6-디메틸-1,2,3,6-테트라히드로프탈이미드의용액을 375 mg의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을여과하여잔류물을수득하고, 이를헥산중 30-40% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 1.02 g의요망되는생성물을등명한오일 로서수득하였다. 1 H NMR에의해, 생성물의약 10% 가레트로딜스-알더반응을이미수행한것으로나타났다. NMR (CDCl 3 ): δ 6.19 (s, 2H, CH=CH), 4.37 (app q, 4H, CCH 2 O, J=10.9, 29.7 Hz), 4.23 (t, 2H, CH 2 CH 2 O, J=6.3 Hz), 4.15 (t, 2H, CH 2 CH 2 O, J=6.3 Hz), 3.62 (t, 2H, NCH 2, J=7.4 Hz), 3.22 (s, 2H, CHC=O), 2.48 (t, 2H, CH 2 C=O, J=7.4 Hz), 2.00 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2, J=6.3 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C (CH 3 ) 2 ), 1.78 (s, 6H, CH 3 ), 1.35(s, 3H,CH 3 ). [0506] 실시예 34. N-(3- 프로피온산, t- 부틸에스테르 )-2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온아미드의제 조 [0507] [0508] 50 ml의디클로로메탄중 1.00 g의 b-알라닌 t-부틸에스테르히드로클로라이드의용액을 25 ml의중탄산나트륨포화수용액으로처리하고, 혼합물을 15분동안교반하였다. 층을분리하고, 유기물을황산나트륨으로건조시켰다. 이러한용액에 2.38 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시] 메틸 ) 프로피온산을첨가한후에, 1.92 ml의디이소프로필에틸아민및 2.1 g의 HBTU를첨가하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 이후에, 반응혼합물을다른 50 ml의디클로로메탄으로희석시키고, 2 x 50 ml의물로세척하고, 황산나트륨으로건조시켰다. 여과하고농축시켜오일을수득하고, 이를헥산중 20-25% 에틸아세테이트로플래시컬럼크로마토그래피하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 730 mg의백색고형물을수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 6.70 (t, 1H, NH, J=5.4 Hz), 4.33 (app q, 4H, CH 2 O, J=16.3, 11.4 Hz), 3.51 (q, 2H, NCH 2, J=6.0 Hz), 2.46 (t, 2H, CH 2 CO, J=6.0 Hz), 1.93 (s, 12H, Br-C(CH 3 ) 2 ), 1.45 (s, 9H, C(CH 3 ) 3 ), 1.33 (s, 3H, CH 3 ). [0509] 실시예 35. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 2- 히드록시에틸에스테르개시제의제조 [0510] [0511] 883 mg의 DPTS와함께, 50 ml의디클로로메탄중 4.32 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시] 메틸 ) 프로피온산및 g의에틸렌글리콜의용액을 1.39 g의디이소프로필카르보디이미드로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응혼합물을농축시킨후에, 50 ml의에틸아세테이트및 70 ml의물로분별하였다. 유기층을농축시키고, 잔류물을헥산중 20% - 40% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 2.7 g의요망되는생성물을등명한오일로서수득하였다. NMR (CD 3 OD): δ 4.38 (app q, 4H, CCH 2, J=11.2, 30.2 Hz), 4.20 (t, 2H, CH 2 OH, J=5.0 Hz), 3.75 (t, 2H, CH 2 CH 2 OH, J=5.0 Hz), 1.90 (s, 12H, Br-CCH 3 ), 1.36 (s, 3H, CH 3 )

84 [0512] 실시예 36. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 3- 히드록시프로필에스테르개시제의제조 [0513] [0514] 80 ml의디클로로메탄및 20 ml의아세토니트릴중 5.31 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산및 4.68 g의 1,3-프로판디올의용액을 1.0 g의 DPTS로처리한후에 3.0 g의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서 2 시간동안교반하였다. 이어서, 반응물을여과하고, 농축시키고, 잔류물을헥산중 30% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜등명한오일을수득하였는데, 이는아주순수하지는않았다. 헥산중 10-15% 아세톤을이용하여실리카겔상에서리크로마토그래피 (Rechromatography) 하여요망되는생성물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 4.38 (app q, 4H, CCH 2 O, J=11.2 Hz), 4.31 (t, 2H, CH 2 CH 2 O, J=6.3 Hz), 3.71 (q, 2H, CH 2 OH, J=5.9 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH 3 ) 2 ), 1.9 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 ), 1.35 (s, 3H, CH 3 ). [0515] 실시예 37. 개시제 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 11- 히드록시 -3,6,9- 트리옥사운데카노에이트 [0516] [0517] 250 mg의 DPTS와함께, 50 ml의디클로로메탄중 1.86 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산및 4.18 g의테트라에틸렌글리콜의용액을 1.15 g의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을여과하고, 여액을 50 ml의디클로로메탄으로희석시키고, 20 ml의물로세척하였다. 유기물을황산나트륨으로건조시키고, 여과하고, 농축시켜잔류물을수득하고, 이를먼저헥산중 50-70% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피하였다. 적절한분획을합하고, 여과하고, 농축시켜 1.19 g의요망되는생성물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 4.38 (app q, 4H, CCH 2 O, J=31.8, 11.2 Hz), 4.31 (t, 2H, CH 2 CH 2 OC=O, J=5.0 Hz), (m, 14H,CH 2 O), 2.46 (t, 1H, OH, J=6.3 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH 3 ) 2 ), 1.35 (s, 3H, CH 3 ). [0518] 실시예 38. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 11- 히드록시 -3,6,9- 트리옥사운데카노에이트, NHS 카보네이트개시제의제조 [0519] [0520] 3 ml의건조아세토니트릴중 630 g의상기히드록실화합물및 1.28 g의디숙신이미딜카보네이트의용액을 610 mg의 DMAP로처리하고, 반응물을실온에서교반하였다. 반응물은여전히불균일하였으며, 이에따라 4 ml 의건조 THF를첨가하고, 2 시간후에, 반응물은황색으로변하였고균질하게되었지만, tlc( 실리카겔, 헥산중 50% 에틸아세테이트 ) 상에서여러스폿을함유하였다. 반응물을농축시켜잔류물을수득하고, 이를헥산중 50-60% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피하였다. 두개의분획을분리하고, 보다낮은 rf를갖는분획을농축시켜 260 mg의요망되는생성물을등명한오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 4.47 (m, 2H, CH 2 O(C=O)O), 4.37 (app q, 4H, CCH 2 O, J=11.2, 31.6 Hz), 4.30 (m, 2H,

85 CH 2 CH 2 O(C=O)C), 3.79 (m, 2H, CH 2 CH 2 O(C=O)C), 3.71 (t, 2H, CH 2 CH 2 O(C=O)O, J=5.0 Hz), 3.67 (s, 4H,CH 2 O), 3.65 (s, 4H, CH 2 O), 2.84 (s, 4H, CH 2 C=O), 1.92(s, 12H, Br-C (CH 3 ) 2 ), 1.35(s, 3H, CH 3 ). [0521] 실시예 39. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 졸케탈에스테르개시제의제조 [0522] [0523] 200 mg의 DPTS와함께, 918 mg의졸케탈및 3.0 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산의용액을 2.15 g의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을여과하여잔류물을수득하고, 이를헥산중 10% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 1.85 g의요망되는생성물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 4.38 (app q, 4H, CCH 2 O), 4.32 (m, 1H, OCH), 4.19 (m, 2H, CHCH 2 OC=O), 4.07 (d 의 d, 1H, OCH 2 CH, J=6.7, 8.6 Hz), 3.76 (d 의 d, 1H, OCH 2 CH, J=5.7, 8.6 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH 3 ) 2 ), 1.43 (s, 3H, (CH 3 ) 2 CO), 1.36 (s, 3H, CH 3 ), 1.35 (s, 3H, (CH 3 ) 2 CO). [0524] 실시예 40. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 2,3- 디히드록시프로필에스테르개시제의제조 [0525] [0526] 50 ml의메탄올중 1.0 g의상기케탈의용액을 750 mg의 Dowex 50Wx8-100으로처리하고, 반응물을밤새교반하였다. 이후에, 반응물을여과하고, 농축시키고, 잔류물을헥산중 20-40% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 630 mg의요망되는생성물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 +D 2 O): δ 4.40 (d의 app q, 4H, CCH 2 O, J=2.8, 11.5, 30.2 Hz), 4.24 (d 의 app q, 2H, CHCH 2 OC=O, J=4.5, 6.6, 11.5 Hz), 3.96 (m, 1H, CH), 3.66 (d 의 app q, 2H, HOCH 2 CH, J=3.8, 5.6, 11.5, 37.9 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH 3 ) 2 ), 1.37 (s, 3H, CH 3 ). [0527] 실시예 41. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 2-(2,3- 디히드록시프로폭시 ) 에틸에스테르개 시제의제조 [0528] [0529] 15 ml의물및 15 ml의 t-부탄올중 1.5 g의 2-[(2-브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]-2-히드록시메틸프로피온산, 2- ( 알릴옥시 ) 에틸에스테르의용액에 2.86 그램 (3 eq) 의페리시안화칼륨, 1.20 그램 (3 eq) 의탄산칼륨, 7.5 mg 의칼륨오스메이트탈수화물, 11 mg의퀴누클리딘, 및 276 mg (1 eq) 의메탄술폰아미드를첨가하고, 반응혼합물을실온에서밤새교반하였다. 반응은 TLC( 실리카겔, 헥산중 50% 에틸아세테이트 ) 로완료된것으로나타났으며, 이에따라반응물을 100 ml의물에부은후에, 100 ml의디클로로메탄으로추출하였다. 합한유기물들을황산나트륨으로건조시키고, 여과하고, 농축시켜오일성잔류물을수득하고, 이를헥산중 30-40% 에틸아세테이트를이용하여실리카겔상에서플래시컬럼크로마토그래피하였다. 적절한분획을합하고, 탈색화탄

86 소로처리하고, 여과하고, 농축시켜 850 mg의요망되는생성물을거의무색의오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 4.39 (d의 app q, 4H, CCH 2 O, J=4.1, 11.1, 3.0, 37.6 Hz), 4.31(t, 2H, OCH 2 CH 2 OC=O, J=4.7 Hz), 3.87 (m, 1H, CH-OH), (m, 2H,CH 2 -OH), 3.72(m, 2H, OCH 2 CH), 3.58(app t, 2H, OCH 2 CH 2 OC=O), 2.68 (d, 1H, CH-OH, J=5.1 Hz), 2.15 (app t, 1H, CH 2 -OH, J=6.1 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH 3 ) 2 ), 1.36 (s, 3H, CH 3 ). [0530] 실시예 42. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 12-( 알릴옥시 )-3,6,9,12- 테트라옥사도데카노 에이트개시제 [0531] [0532] 30 ml의무수아세토니트릴중의 1.60 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산및 870 mg의 12- ( 알릴옥시 )-3,6,9,12-테트라옥사도데칸의용액에 218 mg의 DPTS 및 362 mg의 DMAP과함께, 917 mg의 DCC를첨가하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 이후, 혼합물을여과하고, 농축시키고, 잔류물을먼저헥산중 50-60% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하고, 생성물함유분획을합하고, 농축시켜 1.35 g의요망되는생성물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ (m, 1H, CH 2 CH=CH 2 ), 5.28 (dq, 1H, H-CH=CH), 5.18 (dq, 1H, H-CH=CH), 4.37 (app q, CH 2 OC=O), 4.30 (dd, 2H, CH 2 CH 2 OC=O), 4.02 (d, 2H, CH 2 =CHCH 2 ), (m, 14H, CH 2 CH 2 OCH 2 ), 1.92 (s, 12H, Br-C (CH 3 ) 2 ), 1.35 (s, 3H, CH 3 ). [0533] 실시예 43. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 12-(2,3- 디히드록시프로폭시 )-3,6,9,12- 테트 라옥사도데실에스테르개시제의제조 [0534] [0535] 15 ml의물및 15 ml의 t-부탄올중의 1.29 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산, 12-( 알릴옥시 )-3,6,9,12-테트라옥사도데실에스테르의혼합물에, 1.98 g (3 eq) 의페리시안화칼륨, 829 mg (3 eq) 의탄산칼륨, 8 mg의포타슘오스메이트디히드레이트, 11 mg의퀴누클리딘, 및 190 mg (1 eq) 의메탄술폰아미드를첨가하고, 반응혼합물을실온에서밤새교반하였다. 반응이 TLC ( 실리카겔, 헥산중 50% 에틸아세테이트 ) 에의해완료된것으로나타남에따라, 반응물을 50 ml의물에부은후, 100 ml의디클로로메탄로추출하였다. 합한유기물질을황산나트륨상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜오일성잔류물을얻었으며, 이를디클로로메탄중 5% 메탄올을사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 생성물함유분획을합하고, 작은주걱두개의활성탄소로 2회처리하였다. 여과하고농축시켜소량의고형물을함유하는연회색오일을얻었으며, 이에따라이를에틸아세테이트중에흡수시키고, 여과한후, 농축시켜 1.06 g의요망되는생성물을여전히소량의고형물을함유하는연회색오일로서얻었다. NMR (CDCl 3 ): δ 4.38 (app q, 4H, CCH 2 OC=O), 4.30 (t, 2H, CH 2 CH 2 OC=O, J=5.0 Hz), 3.85(p, 1H, CHOH, J=5 Hz), 3.71 (t, 2H, OCH 2 CHOH, J= 4.8 Hz), 3.72 δ 3.55 (m, 16H, OCH 2 CH 2 O 및 CH 2 OH), 3.12 (s, 1H, CHOH), 2.37 (s, 1H, CH 2 OH), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH 3 ) 2 ), 1.35 (s, 3H, CH 3 )

87 [0536] 실시예 44. 2,2,5- 트리메틸 -1,3- 디옥산 -5- 카르복실산, 2-( 알릴옥시 ) 에틸에스테르의제조 [0537] [0538] 25 ml의무수 THF 중의 1.4 g의에틸렌글리콜모노알릴에테르및 2.35 g의 2,2,5-트리메틸-1,3-디옥산-5-카르복실산의용액을 500 mg의 4-디메틸아미노피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (DPTS) 및 1.44 g의디메틸아미노피리딘 (DMAP) 로처리한후, 3.38 g의디시클로헥실카르보디이미드를첨가하고, 반응물을실온에서 3일동안교반하였다. 반응혼합물을여과하고, 농축시켜반고형잔류물을얻었으며, 이를헥산중 20% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 생성물함유분획을합하고, 농축시키고, 여과 하여 2.83 g (81%) 의소량의고형물을함유하는등명한오일을얻었다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.23 (s, 3H, C=OCCH 3 ), 1.39 (s, 3H, CH 3 ), 1.43 (s, 3H, CH 3 ), 3.66 (m, 4H), 4.02 (dd, 2H, CH 2 =CHCH 2 ), 4.20 (d, 2H), 4.31 (t, 2H, C=OOCH 2 ), 5.18 (dd, 1H, =CH), 5.28 (dd, 1H, =CH), 5.89 (m, =CHCH 2 ). [0539] 실시예 45. 2,2- 비스 ( 히드록시메틸 ) 프로피온산, 2-( 알릴옥시 ) 에틸에스테르 [0540] [0541] 50 ml의메탄올중의 2.72 g의 2,2,5-트리메틸-1,3-디옥산-5-카르복실산, 2-( 알릴옥시 ) 에틸에스테르의용액을 1.0 g의 Dowex 50W-X8 수지 (H+ 형 ) 으로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을여과하고, 여액을농축시켜오일을얻었으며, 이를디클로로메탄중 5% 메탄올을사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 생성물함유분획을합하고, 농축시켜 2.23 g의생성물을등명한연황색오일로서 얻었다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = (ddt, 1H, H 2 C=CHCH 2 ), 5.28 (dq, 1H, HHC=CHCH 2 ), 5.22 (dq, 1H, HHC=CHCH 2 ), 4.36 (app t, 2H, OCH 2 CH 2 ), 4.02 (dt, 2H, H2C=CHCH 2 ), 3.86 (dd, 2H, CH 2 OH), 3.74 (dd, 2H, CH 2 OH), 3.68 (app t, 2H, OCH 2 CH 2 ), 2.90 (br d, 2H, OH), 1.11 (s, CH 3 ). [0542] 실시예 46. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, 2-( 알릴옥시 ) 에틸에스테르개시제의제조 [0543] [0544] 2.86 g의 DCC가소량의디클로로메탄중의용액으로첨가됨에따라 100 ml의디클로로메탄중의 1.2 g의알릴옥시에탄올, 5.0 g의 2,2-비스 (2-브로모이소부티릴옥시메틸 ) 프로피온산및 690 mg의 DPTS의용액을실온에서교반하였다. 반응물을실온에서밤새교반한후, 여과하고, 농축시켜오일을얻었다. 이를헥산중 10% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜등명한오일을수득하고, 이는충분히순수하지않았다. 이오일을헥산중 3-4% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시크로마토그래피로다시처리하였다. 생성물함유분획을합하고, 농축시켜 2.78 g의요망되는생성물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 5.89 (m, 1H, CH 2 CH=CH 2 ), 5.28 (dq, 1H, H-CH=CH, J=17.2, 1.7 Hz), 5.20 (dq, 1H, H-CH=CH, J=10.5, 1.5 Hz), 4.38 (app q, 4H, CH 2 OC=O), 4.31 (t, 2H, OCH 2, J=4.7 Hz), 4.01 (dt, 2H, OCH 2, J=5.6, 1.5 Hz), 3.65 (t, 2H, OCH 2, J=4.7 Hz), 1.91 (s, 12H, Br-C (CH 3 ) 2 ), 1.35 (s, 3H, CH 3 )

88 [0545] 실시예 47. 2,2- 비스 -[2,2- 비스 (2- 브로모이소부티릴옥시메틸 ) 프로피오닐옥시메틸 ] 프로피온산, 2-( 알릴옥시 ) 에 틸에스테르개시제 [0546] [0547] 25 ml의무수아세토니트릴중의 2.42 g의 2-[(2-브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ]-2-히드록시메틸프로피온산, 2-( 알릴옥시 ) 에틸에스테르및 1.73 g의 2,2-[ 비스-(2-브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산의용액을 200 mg의 DPTS 및 580 mg의 DMAP과함께 1.03 g의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. TLC ( 실리카겔, 헥산중의 30% 에틸아세테이트 ) 에의해반응이완료되지않음을확인함으로써추가의 812 mg의 2,2-[ 비스- (2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산및 400 mg의 DCC를첨가하고, 반응물을다시실온에서밤새교반하였다. 반응혼합물을여과하고, 농축시키고, 잔류물을먼저헥산중의 20% 에틸아세테이트를사용하고, 다음에헥산중의 30% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 생성물함유분획을합하고, 농축시켜 1.27 g의요망하는화합물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 5.88 (m, 1H, CH 2 CH=CH 2 ), 5.28 (dq, 1H, H-CH=CH, J=17.4, 1.6 Hz), 5.20 (dq, 1H, H-CH=CH, J=10.3, 1.3 Hz), 4.24 δ 4.44 (m, 14H, CH 2 OC=O), 4.01 (d, 2H, CH 2 =CHCH 2, J=5.6), 3.65 (t, 2H, CH 2 CH 2 OCH 2, J=4.7 Hz), 1.91 (s, 24H, Br-C (CH 3 ) 2 ), 1.33 (s, 6H, CH 3 ), 1.30 (s, 3H, CH 3 ). [0548] 실시예 48. 2,2- 비스 -[2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 프로피오닐옥시메틸 ] 프로피온산 ], 2-[(2,3- 디히드록 시 ) 프로폭시 ] 에틸에스테르개시제의제조 [0549] [0550] 15 ml의물및 15 ml의 t-부탄올중의 1.21 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산, 2-( 알릴옥시 ) 에틸에스테르의혼합물에 1.14 g (3 eq) 의페리시안화칼륨, 480 mg (3 eq) 의탄산칼륨, 7.5 mg의포타슘오스메이트디히드레이트, 11 mg의퀴누클리딘, 및 110 mg (1 eq) 의메탄술폰아미드를첨가하고, 반응혼합물을실온에서밤새교반하였다. 반응이 tlc( 실리카겔, 헥산중 50% 에틸아세테이트 ) 에의해완료된것으로나타남으로써, 반응물을 50 ml의물에부은후, 100 ml의디클로로메탄으로추출한후, 추가의 50 ml의디클로로메탄으로추출하였다. 합한유기물질을황산나트륨상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜오일성잔류물을얻었으며, 이를헥산중 50% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하고,

89 생성물함유분획을합하고, 농축시켜 620 mg의요망되는생성물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ (m, 14H, CCH 2 OC=O), 3.86 (m, 1H, CH 2 CHOHCH 2 ), (m, 3H), (m, 3H), 2.78 (dd, 1H, OH), 2.23 (app t, 1H, OH), 1.92 (s, 24H, CH 3 CBr), 1.34 (s, 6H, CH 3 ), 1.31 (s, 3H, CH 3 ). [0551] 실시예 49. 2,2- 비스 [(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 메틸 ] 프로피온산, (2- 아지도에톡시 ) 에틸에스테르개시제의제 조 [0552] [0553] 20 ml의무수아세토니트릴중의 3.30 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시) 메틸 ] 프로피온산및 1.0 g의 2- (2-아지도에톡시) 에탄올의용액에, 225 mg의 DPTS과함께, 1.89 g의 DCC를첨가하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을여과하고, 농축시켜잔류물을수득하고, 이를헥산중 10-15% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 2.06 g의요망되는생성물을등명한무색오일로서수득하였다. NMR (CDCl 3 ): δ 4.39 (app q, 4H, CCH 2 O, J=11.1, 33.8 Hz), 4.31 (t, 2H, OCH 2 CH 2 OC=O, J=5 Hz), 3.72 (t, 2H, CH 2 N 3, J=5 Hz), 3.67 (t, 2H, CH 2 CH 2 N 3, J=5 Hz), 3.38 (t, 2H, OCH 2 CH 2 OC=O, J=5 Hz), 1.92 (s, 12H, Br-C(CH 3 ) 2 ), 1.36 (s, 3H, CH 3 ). [0554] 실시예 50. 3,5- 비스 -(2- 브로모이소부티릴옥시 ) 벤즈알데히드의제조 [0555] [0556] 20 ml의디클로로메탄중의 1.0 g의 3,5-디히드록시벤즈알데히드및 4.0 ml (4 eq) 의트리에틸아민의용액을빙수조에서냉각시키고, 5 ml의디클로로메탄중의 3.35 g의 2-브로모이소부티릴브로마이드를고형물이형성되는만큼의수분에걸쳐적가하였다. 반응물을 1.5시간동안실온에서교반하였으며, 이시기에, 반응은 TLC ( 실리카겔, 헥산중의 30% 에틸아세테이트 ) 에의해완료된것으로나타났다. 반응물을 25 ml의물로세척한후, 농축시켜잔류물을수득하고, 이를헥산중 10% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 소량의탈색용탄소로처리하고, 여과하고, 농축시켜 2.2 g의오 일을얻었으며, 이를냉각기에서결정화시켜백색고형물을얻었다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 2.08 (s, 12H, CH 3 ), 7.29 (t, 1H, J=2.4 Hz, ArH), 7.61 (d, J=2.4 Hz, 2H, ArH), 10.0 (s, 1H, CHO). [0557] 실시예 (13- 알릴옥시 -2,5,8,11- 테트라옥사트리데실 )-2,4,9- 트리페닐 -1,3,5- 트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸의제조 [0558]

90 [0559] 10 ml의무수 THF 중의 870 mg의 11-알릴옥시-3,6,9-트리옥사운데칸 -1-올메탄술포네이트및 1.01 g의 2,4,9- 트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸-7-메탄올 (WO2000/037658) 의용액을 410 mg의소듐히드라이드 ( 오일중 60%) 로처리하고, 반응물을 2시간동안 80 로가열하였다. 반응물을수 ml의물을첨가함으로써조심스럽게켄칭시키고, 20 ml의 sat NaCl에부은후, 3 x 10 ml의디클로로메탄으로추출하였다. 유기물질을황산나트륨상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜잔류물을수득하고, 이를헥산중 25-35% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 920 mg 의요망되는생성물을무색오일로서수득하였다. NMR (DMSO-d 6 ): δ (m, 6H, PhH), (m, 9H, PhH), (m, 3H), (m, 3H), 2.78 (dd, 1H, OH), 2.23 (app t, 1H, OH), 1.92 (s, 24H, CH 3 CBr), 1.34 (s, 6H, CH 3 ), 1.31 (s, 3H, CH 3 ). [0560] 실시예 아미노 -15- 알릴옥시 -2,2- 비스 ( 아미노메틸 )-4,7,10,13- 테트라옥사펜타데칸트리히드로클로라이드 의제조 [0561] [0562] 이전반응들로부터의트리아자아다만탄화합물을 20 ml의에탄올및 4 ml의에테르에흡수시킨후, 2 ml의진한염산으로처리하였다. 반응물을혼합한후, 4 에서 1.5 시간동안방치하였다. 이후, 30 ml의에테르를첨가하고, 혼합물을다시추가의 30분동안냉각시켰다. 이후, 100 ml의에테르를첨가하고, 여과에의해고형생성물을회수하고, 에테르로세척하고, 진공하에건조시켜 564 mg의생성물을백색고형물로서얻었다. NMR (DMSO-d 6 ): δ 7.75 (m, 6H, CCH), 7.44 (m, 6H, CCHCH), 7.30 (m, 3H, CCHCHCH), 5.86 (m, 1H, CH 2 =CH), 5.70 (s, 1H, NCH ( 적도방향 )), (s, 2H, NCH( 축방향 )), 5.23 (dq, 1H, CH 2 =CH), 5.11 (dq, 1H, CH 2 =CH), 3.93 (dt, 2H, CH-CH 2 -O), (m, 16H, OCH 2 CH 2 O), 3.26 (m, 2H, NCH 2 ), 3.19 (d, 2H, NCH 2 ), 2.88 (s, 2H, NCH 2 ), (s, 2H, CCH 2 O). [0563] 실시예 53. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-1- 아미노 -15- 알릴옥시 -2,2- 비스 [N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아 미노메틸 ]-4,7,10,13- 테트라옥사펜타데칸개시제의제조 [0564] [0565] 이전절차로부터의트리아민히드로클로라이드를 25 ml의디클로로메탄중에흡수시키고, 용액을빙수조로냉각시키고, 1.35 ml의트리에틸아민으로처리한후, 0.46 ml의 2-브로모이소부티릴브로마이드를첨가하였다. 이후, 반응물을 2시간에걸쳐실온으로가온되게하면서교반하였다. 이후, 반응혼합물을 3 x 10 ml의 1N HCl, 2 x 10 ml의포화된 NaHCO 3, 10 ml의포화된 NaCl로세척하고, 마그네슘술페이트상에서건조시켰다. 용액을 여과하고, 농축시켜잔류물을수득하고, 이를에틸아세테이트를사용하여실리카겔의플러그를통해플러싱 (flushing) 시켰다. 농축시켜 989 mg의요망되는생성물을점성오일로서얻었다. NMR (DMSO-d 6 ): δ (t, 3H, NH), 5.87 (m, 1H, CH), 5.23 (dq, 1H, CH 2 =CH), 5.12 (dq, 1H, CH 2 =CH), 3.93 (dt, 2H, CH 2 -CH), 3.6 δ 3.45 (m, 16H, OCH 2 CH 2 O), (s, 2H, CCH 2 O), 3.12 (d, 6H, CCH 2 N), (s, 18H, CH 3 ). [0566] 실시예 54. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-1- 아미노 -15-(2,3- 디히드록시프로필 )-2,2- 비스 [N-(2- 브로모 -2- 메틸

91 프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4,7,10,13- 테트라옥사펜타데칸개시제의제조 [0567] [0568] 5 ml의 t-부탄올및 5 ml의물중의이전절차로부터의 350 mg의알칸의혼합물에, 433 mg (3 eq) 의페리시안화칼륨, 182 mg (3 eq) 의탄산칼륨, 42 mg (1 eq) 의메탄술폰아미드, 7.5 mg의퀴누클리딘, 및 4 mg의포타슘오스메이트디히드레이트를첨가하고, 용액을실온에서밤새교반하였다. 반응이 TLC ( 실리카겔, 디클로로메탄중 5% 메탄올 ) 에의해완료된것으로나타났으며, 이에따라 50 ml의물을첨가하고, 용액을 50 ml의디클로로메탄으로추출하고, 추가의 2 x 25 ml의디클로로메탄으로추출하였다. 합한추출물을황산나트륨상에서건조시키고, 농축시키고, 진한회색잔류물을디클로로메탄중의 2-5% 메탄올을사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 310 mg의요망하는디히드록시화합물을연한회색오일로서얻었다. NMR (CDCl 3 ): δ 7.91 (t, 3H, NH), 3.88 (m, 1H, HOCH 2 CHOHCH 2 ), ( 복합 m, 21H), 3.35 (s, 1H, OCH 2 C(CH 2 )3), 3.19 (d, 6H, J=6.4 Hz, CH 2 NH), 1.99 (s, 18H, CH 3 ). [0569] 실시예 (7- 아지도 -2,5- 디옥사헵틸 )-2,4,9- 트리페닐 -1,3,5- 트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸의제조 [0570] [0571] [0572] 15 ml의무수 THF 중의 1.1 g의 2,4,9-트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸-7-메탄올 (WO2000/037658) 및 585 mg의 2-(2-아지도에톡시 ) 에틸메탄술포네이트의용액에 224 mg의 NaH ( 오일중 60%) 를첨가하고, 용액을밤새 70 로가열하였다. 추가의 245 mg의 NaH 및 600 mg의 2-(2-아지도에톡시 ) 에틸메탄술포네이트를첨가하고, 다시밤새가열을지속하였다. 반응혼합물을냉각시키고, 25 ml의물로희석하고, 50 ml의디클로로메탄으로추출하였다. 유기층을포화된 NaCl로세척하고, 황산나트륨상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜잔류물을얻었다. 이물질을헥산중 10 내지 25% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 1.15 g의요망되는생성물을오일로서얻었으며, 이는완전하게순수하지는않았지만, 다음반응에추가의정제없이사용하였다. NMR(DMSO) 매우복잡함. 실시예 아미노-9-아지도-2,2-비스 ( 아미노메틸 )-4,7-디옥사노난트리히드로클로라이드의제조 [0573] [0574] [0575] 20 ml의에탄올및 4 ml의에테르중의이전절차로부터의 1.15 g의트리아자다만탄화합물의용액을빙수욕으로냉각시키고, 3 ml의진한 HCl를첨가하였다. 고형생성물이즉시형성되기시작하였으며, 반응물을 10분동안냉각상태로방치되게하였다. 추가의 30 ml의에테르를첨가하고, 반응물을밤새냉각시켰다. 반응혼합물을추가의 100 ml의에테르로희석하고, 고형생성물을여과에의해분리하고, 보다많은에테르로세척하고, 진공하에건조시켜 800 mg의생성물을백색고형물로서얻었다. 실시예 57. N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 )-1-아미노-9-아지도-2,2-비스[N-(2-브로모 -2-메틸프로피오닐) 아미노메틸 ]-4,7-디옥사노난개시제의제조

92 [0576] [0577] 25 ml의디클로로메탄중의이전절차로부터의 800 mg의트리히드로클로라이드염의용액을빙수욕으로냉각시킨후, 3.5 ml의트리에틸아민으로처리하였다. 이혼합물에 1.07 ml의 2-브로모이소부티릴브로마이드를적가하고, 반응물을 2시간에걸쳐실온으로가온시키면서교반하였다. 이후, 혼합물을 3 x 10 ml의 1N HCl, 2 x 10 ml의포화된 NaHCO 3, 및 10 ml의포화된 NaCl로세척한후, 마그네슘술페이트상에서건조시다. 여과하고농 축시켜잔류물을얻었으며, 이를헥산중의 20 내지 30% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 630 mg의요망되는생성물을오일로서얻었다. NMR(CDCl 3 ): δ 7.76 (t, 3H, NH, J=6.3 Hz), 3.68 (m, 4H, OCH 2 CH 2 O), 3.63 (m, 2H, N 3 CH 2 CH 2 O), 3.40 (t, 2H, N 3 CH 2, J=5.0 Hz), 3.37 (s, 2H, CCH 2 O), 3.19 (d, 6H, CCH 2 N, J=6.8 Hz), 1.99 (s, 18H, CH 3 ). [0578] 실시예 알릴옥시 -2,5,8,11- 테트라옥사트리데실 6- 아암개시제 [0579] [0580] 25 ml의디클로로메탄중의 0.9 g의 1-아미노-15-알릴옥시-2,2-비스 ( 아미노메틸 )-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸트리히드로클로라이드및 3.89 g의 2,2-비스 [(2-브로모이소부티릴옥시] 메틸 ) 프로피온산의용액에 530 mg의 DPTS 및 890 mg의 DMAP과함께, 2.7 g의 DCC를첨가하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을여과하고, 농축시키고, 잔류물을헥산중 50-70% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 1.9 g의요망되는생성물을점성오일로서얻었다. NMR (CDCl 3 ): δ 7.78 (t, 3H, NH, J=6.5 Hz), 5.91 (m, 1H, CH), 5.27 (dq, 1H, CH 2 =CH, J=17.4, 1.6 Hz), 5.18 (dq, 1H, CH 2 =CH, J=10.4, 1.4 Hz), 4.38 (app q, 12H, CH 2 OC=O), 4.01 (dt, 2H, CH-CH 2, J=5.7, 1.4 Hz), 3.61 ( 두개의 m, 16H, OCH 2 CH 2 O), 3.30 (s, 2H, CCH 2 O), 3.14 (d, 6H, CH 2 N, J=6.1 Hz), 1.92 (d, 36H, BrC(CH 3 ) 2, J=1.2 Hz), 1.38 (s, 9H, CH 3 )

93 [0581] 실시예 (2,3- 디히드록시프로필 )-2,5,8,11- 테트라옥사트리데실 6- 아암개시제 [0582] [0583] 10 ml의물및 10 ml의 t-부탄올중의이전절차로부터의 1.0 g의알칸의혼합물에 638 mg (3 eq) 의페리시안화칼륨, 268 mg (3 eq) 의탄산칼륨, 10 mg의포타슘오스메이트디히드레이트, 12 mg의퀴누클리딘, 및 61 mg (1 eq) 의메탄술폰아미드를첨가하고, 반응혼합물을실온에서밤새교반하였다. 반응물을 50 ml의물에부은후, 50 ml의디클로로메탄으로추출하고, 추가의 25 ml의디클로로메탄으로추출하였다. 합한유기물질을황산나트륨상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜오일성잔류물을얻었으며, 이를디클로로메탄중 2-4% 메탄올을사용하여실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피로처리하고, 생성물함유분획을합하고, 농축시켜 417 mg 의요망되는생성물을점성오일로서얻었다. NMR (CDCl 3 ): δ 7.78 (t, 3H, NH, J=6.0 Hz), 4.39 (app q, 12H, CH 2 OC=O), 3.86 ( 브로드 s, 1H, OH-CH), 3.62 (m, 20H, OCH 2 CH 2 O 및 OHCHCH 2 O 및 OH-CH 2 ), 3.27 (s, 2H, CCH 2 O), 3.13 (s, 6H, NCH 2 ), 2.40 (s, 2H, OH), 1.92 (s, 36H, BrC(CH 3 ) 2 ), 1.38 (s, 9H, CH 3 ). [0584] [0585] 실시예 ( 아크릴로일옥시에틸 -2'-( 트리메틸암모늄 ) 에틸포스페이트, 내염의제조 제 1 중간체 [0586] [0587] [0588] 질소대기하에서, 100 ml의무수아세토니트릴중의 11.6 g의 2-히드록시에틸아크릴레이트및 14.0 ml의트리에틸아민의용액을 -20 로냉각시키고, 10 ml의무수아세토니트릴중의 14.2 g의 2-클로로-2-옥소-1,3,2-디옥사포스폴란의용액을약 30분에걸쳐적가하였다. 반응물을냉각상태로 30분동안교반한후, 질소대기하에서여과하였다. 침전물을 10 ml의냉각된아세토니트릴로세척하고, 여액을다음반응에직접사용하였다. 2-( 아크릴로일옥시에틸-2'-( 트리메틸암모늄 ) 에틸포스페이트, 내염 [0589] [0590] 상기절차로부터의용액에 14.0 ml의트리메틸아민 ( 질소하에서드라이아이스-아세톤응축기를이용하여응축됨 ) 을첨가하고, 반응혼합물을가압용기로밀봉시키고, 4시간동안 65 에서교반하였다. 반응혼합물을교반하면서실온으로냉각시키고, 이러한반응혼합물이약 30 에도달함에따라고체가형성되기시작하였다. 이후, 용기를밤새 4 냉장고에두었다. 엄격히질소대기하에서, 고체를여과에의해수거하고, 20 ml의저온건조아세토니트릴로세척한후, 15분동안질소스트림하에서건조시켰다. 이후, 고체를밤새고진공하에서건조시켜, 백색고체로서 12.4 그램의생성물을생성시켰다. NMR (CDCl 3 ): δ 6.41 (dd, 1H, J=1.6, 17.2 Hz, 비닐 CH), 6.18 (dd, 1H, J=10.6, 17.2 Hz, 비닐 CH), 5.90 (dd, 1H, J=1.6, 10.4 Hz, 비닐 CH), 4.35 (m, 2H), 4.27 (m, 2H), 4.11 (m, 2H), 3.63 (m, 2H), 3.22 (s, 9H, N(CH 3 ) 3 )

94 [0591] 실시예 펜틴 -1- 올, NHS 에스테르의제조 [0592] [0593] 20 ml의건조아세토니트릴중 1.02 그램의 4-펜틴산및 1.20 그램의 N-히드록시숙신이미드의용액에 300 mg의 DPTS를처리한후, 2.8 그램의 DCC를첨가하고, 반응물을밤새실온에서교반하였다. 반응물을여과시키고, 농축시켜, 잔여물을생성시키고, 이를헥산중 30% 에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피에적용시켰다. 생성물을함유하는분획을조합시키고, 농축시켜, 백색고체로 1.62 그램의요망되는생성물을생성시켰다. NMR(CDCl 3 ): δ 2.89 (d의 d, 2H, CH 2 C=O, J=7.9, 6.4 Hz), 2.85 (s, 4H, O=CCH 2 CH 2 C=O), 2.62 (app d 의 d 의 d, 2H, CHCCH 2, J=8.6, 6.9, 2.7 Hz), 2.06 (t, 1H, CH, J=2.7 Hz). [0594] 실시예 62. N- 프로파르길말레이미드의제조 [0595] [0596] 50 ml의포화소듐바이카보네이트중의 1.08 그램의프로파르길아민히드로클로라이드의용액을얼음수조를이용하여냉각시키고, 2.0 그램의 N-카보에톡시말레이미드를수분에걸쳐나누어첨가하였다. 반응물을 30분동안저온에서교반시킨후, 25분에걸쳐실온으로가온시켰다. 이후, 반응물을 3 x 25 ml의디클로로메탄으로추출하고, 이를소듐술페이트상에서건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을 10 ml의에틸아세테이트에용해시키고, 2시간동안 50 에서가열시켜고리화를완료시켰다. 반응물을농축시키고, 잔여물을헥산중 30% 에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피에적용시켰다. 상기와같은두번째크로마토그래피로매우담황색인오일로 1.24 g의생성물을생성시켰다. NMR(CDCl 3 ): δ 6.77 (s, 2H, CHC=O), 4.30 (d, 2H, NCH 2, J=2.4 Hz), 2.22 (t, 1H, CCH, J=2.5 Hz). [0597] 실시예 헥신 -1- 알의제조 [0598] [0599] 20 ml의디클로로메탄중 694 mg의 5-헥신-1-올의용액에 3.0 그램의데스-마틴페리오디난 (Dess-Martin periodinane) 을실온에서처리하고, 용액을 2시간동안실온에서교반하였다. 반응물을여과시키고, 여과액을농축시켜, 잔여물을생성시키고, 이를헥산중에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피에적용시켰다. 적절한분획을농축시켜, 매우담황색인오일로생성물을생성시켰다. NMR(CDCl 3 ): δ 9.81 (t, 1H, CH=O, J=2.6 Hz), 2.61 (d 의 t, 2H, CH 2 CH=O, J=7.1, 1.2 Hz), 2.28 (d 의 t, 2H, CCH 2, J=7.1, 2.6 Hz), 1.99 (t, 1H, CCH, J=2.6 Hz), 1.86 (p, 2H, CCH 2 CH 2, J=7.0 Hz). [0600] 실시예 64. 비스 [2,2-(2- 브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온산, 3,6,9,12- 테트라옥사펜타데크 -14- 인 - 1- 올에스테르의제조

95 [0601] [0602] 교반막대가장비된 100-ml 둥근-바닥플라스크에 30 ml의건조아세토니트릴, 3.0 그램의비스 [2,2-(2-브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온산및 1.63 그램의 3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14- 인-1-올을충전시켰다. 용액에 300 mg의 DPTS를첨가한후, 1.86 그램 (1.3 eq) 의 DCC를첨가하고, 반응혼합물을밤새실온에서교반시켰다. 반응혼합물을여과및농축시켜잔여물을생성시키고, 이를헥산중 20-50% 에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시크로마토그래피로정제하였다. 적절한분획을조합시키고, 농축시켜, 소량의고체를함유 하는투명한오일로 1.82 그램의요망되는생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.35 (s, 3H, CH 3 CC=O), 1.92 (s, 12H, (CH 3 ) 2 CBr), 2.43 (t, J=2.4, 1H, CCH), (m, 14H, OCH 2 CH 2 O), 4.21 (d, 2H, J=2.4, HCCCH 2 ), 4.30 (app q, 2H, OCH 2 CH 2 OC=O), 4.34 (dd, 2H, CH 2 OC=OCBr). [0603] 실시예 65. 3,6,9,12- 테트라옥사펜타데크 -14- 인 -1- 아민의제조 [0604] [0605] 50 ml의농축수성암모니아중 3.5 그램의 3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14- 인-1-올, 1-메탄술포네이트의용액을교반하고, 2시간동안압력용기에서 100 에서가열하였다. 이후, 용기를냉각시키고, 반응물을농축시켜, 황색오일을생성시켰다. 여기에 20 ml의무수에탄올을첨가하고, 용액을농축시켜, 황색오일을생성시키고, 이를디클로로메탄중 7% 메탄올과함께실리카겔상의크로마토그래피에적용시켰다. 적절한분획을조합시 키고, 농축시켜, 황색오일로 2.24 그램의요망되는생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 2.54 (t, 1H, J=2.4, CCH), 3.23 (app t, 2H, CH 2 NH 2 ), 3.66 (m, 8H, OCH 2 CH 2 O), 3.74 (m, 4H, OCH 2 CH 2 O), 3.86 (app t, 2H, CH 2 CH 2 NH 2 ), 4.26 (d, J=2.4, 2H, CH 2 CCH). [0606] 실시예 알릴옥시메틸 -2,4,9- 트리페닐 -1,3,5- 트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸의제조 [0607] [0608] 50 ml의 DMSO 및 2.8 그램의분말화된 KOH의혼합물을 10분동안실온에서교반한후, 4.0 그램의 2,4,9-트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸-7-메탄올을첨가하고, 바로직후에 1.46 그램 (1.2 eq) 의알릴브로마이드를첨가하였다. 반응혼합물을 3시간동안실온에서교반한후, 100 ml의에테르와 100 ml의물사이에분배시켰다. 수성층을또다른 3 x 50 ml의에테르로추출하고, 조합된유기물을소듐술페이트상에서건조시켰다. 여과및농축시켜고체포말을생성시키고, 이를헥산중 5% 에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시크로마토그래피에적용시켰다. 적절한분획을조합시키고, 농축시켜, 분쇄가능한황색포말로 3.51 그램 (80%) 의요망되는생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ= 2.68 (s, 2H, NCH 2 적도페닐에인접 ), 2.92 (s, 2H, CCH 2 ), 3.28 (d, J=13.4 Hz, 2H, NCH 2 축페닐과적도페닐사이 ), 3.51 (d, J=13.4 Hz, 2H, NCH 2 가장가까운축페닐 ), 3.73 (t의 d, J=1.5, 5.4 Hz, 2H, CHCH 2 O), 5.04 (q의 d, J=1.5, 10.4 Hz, 1H, CH 2 =CH), 5.07 (q의 d, J=1.7, 17.2 Hz, 1H, CH 2 =CH), 5.42 (s, 2H, NCH 축 ), 5.65 (s, 1H, NCH 적도 ), 5.71 (m, J=5.4, 10.4, 17.2 Hz, 1H, CH 2 =CH), (m, 15H, 페닐 )

96 [0609] 실시예 67. 2,2- 비스 ( 아미노메틸 )-4- 옥사헵트 -6- 에닐아민트리히드로클로라이드의제조 [0610] [0611] 30 ml의테트라히드로푸란중 3.51 그램의 7-알릴옥시메틸-2,4,9-트리페닐-1,3,5- 트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸의용액에 30 ml의 1N HCl을처리하고, 반응물을 30분동안실온에서교반하였다. THF를 rotovap 상에서제거하고, 수성잔여물을 3 x 25 ml의에테르로추출하였다. 수성층을건조농축시키고, 20 ml 의메탄올을첨가하고, 용액을다시건조농축시켰다. 생성된백색고체를밤새고진공하에두어, 백색고체 로 2.10 그램 (93%) 의요망되는생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, D -2 O): δ = 3.34 (s, 6H, CH 2 NH 3 ), 3.76 (s, 2H, OCH 2 C(CH 2 ) 3 ), 4.11 (m, 2H, CH 2 =CHCH 2 ), (m, 2H, CH 2 =CHCH 2 ), (m, CH 2 =CHCH 2 ). [0612] 실시예 68. N-(2- 브로모 -2- 메틸이소부티릴 )-2,2- 비스 [N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4- 옥사헵트 -6- 에닐아민의제조 [0613] [0614] 250 ml의디클로로메탄중 2.10 그램의 2,2-비스 ( 아미노메틸 )-4-옥사-헵트-6-일아민트리히드로클로라이드의혼합물에 10 ml의트리에틸아민을처리한후, 얼음수조를이용하여냉각시켰다. 이러한용액에수분에걸쳐 5.77 그램의 2-브로모이소부티릴브로마이드를적가하였다. 얼음배쓰를제거하고, 용액을 2시간동안교반하였다. 반응혼합물을 100 ml의물로추출하고, 유기층을소듐술페이트상에서건조시켰다. 여과및농축시켜잔여물을생성시키고, 이를디클로로메탄중 2-6% 에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시크로마토그래피에적용시켰다. 적절한분획을조합시키고, 농축시켜, 백색고체로 3.66 그램 (79%) 의요망되는생성물을생 성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.99 (s, 18H, CH 3 ), 3.20 (d, 6H, J=6.8, CH 2 NH 2 ), 3.34 (s, 2H, OCH 2 C(CH 2 ) 3 ), 3.99 (m, 2H, CH 2 =CHCH 2 ), (m, 2H, CH 2 =CHCH 2 ), (m, 1H, CH 2 =CHCH 2 ), 7.72 (app t, J=6.8, 3H, NH). [0615] 실시예 69. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-2,2- 비스 [N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4- 옥사 - 6,7- 디히드록시헵틸아민의제조 [0616] [0617] 60 ml 의 t- 부탄올및 60 ml 의물중의 5.39 그램의 N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-2,2- 비스 [N-(2- 브로모 -2- 메 틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4- 옥사헵트 -6- 에닐아민의용액에 8.8 그램 (3 eq) 의포타슘페리시아니드, 3.68 그램

97 (3 eq) 의포타슘카보네이트, 850 mg(1 eq) 의메탄술폰아미드, 160 mg의퀴누클리딘, 및 130 mg의포타슘오스메이트데히드레이트를처리하고, 반응물을 4시간동안실온에서교반하였다. 혼합물을 150 ml의에틸아세테이트와 150 ml의물사이에분배시키고, 수성층을또다른 2 x 30 ml의에틸아세테이트로추출하였다. 조합된유기물을소듐술페이트상에서건조시키고, 여과시키고, 농축시켜, 반고체잔여물을생성시켰다. 이를디클로로메탄중 2-4% 메탄올과함께실리카겔상의플래시크로마토그래피에적용시키고, 적절한분획을조합시키고, 농축시켜, 회색포말로 5.33 그램의요망되는생성물을생성시켰다. [0618] 실시예 70. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-6- 아미노 -5,5- 비스 [N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-3- 옥사헥사날 [0619] [0620] 200 ml의 THF 및 50 ml의물중 5.33 g의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 )-2,2-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4-옥사-6,7-디히드록시헵틸아민의용액에 3.5 그램의소듐메타페리오데이트를첨가하고, 반응물을 3시간동안실온에서교반한후, 농축시켜, 대부분의 THF를제거하였다. 잔여물을 100 ml의에틸아세테이트와 50 ml의물사이에분배시키고, 수성층을 25 ml의에틸아세테이트로세척하였다. 조합된유기물을 50 ml의포화 NaCl로세척하고, 소듐술페이트상에서건조시켰다. 여과및농축시켜회색잔여물을생성시키고, 이를헥산중 50% 에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시크로마토그래피에적용시키고, 적절한분 획을조합시키고, 농축시켜, 거의백색의고체로 3.87 그램의요망되는생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 2.00 (s, 18H, CH 3 ), 3.19 (d, 6H, J=6.8, CH 2 NH), 3.31 (s, 2H, OCH 2 C(CH 2 ) 3 ), 4.32 (s, 2H, CHOCH 2 ), 8.01 (app t, J=6.8, 3H, NH), 9.70 (s, 1H, CHO). [0621] 실시예 71. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-5,5- 비스 [N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-3- 옥사 -6- 아미 노헥산산의제조 [0622] [0623] 2.2 ml의농축황산중 2.55 그램의크롬트리옥시드를용해시켜크롬산 ( 존스시약 (Jones reagent)) 의용액을제조하고, 얼음배쓰를이용하여냉각시키고, 혼합물을물을이용하여 10 ml로조심스럽게희석시켰다. 이러한시약의 7 ml 분취량을얼음수조를이용하여냉각시키고, 20 ml의아세톤중 3.67 그램의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 )-2,2-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4-옥사-6-옥소헥실아민의용액을 5분에걸쳐적가하였다. 반응물을 20분동안얼음중에서교반시킨후, 200 ml의에틸아세테이트와 200 ml의물사이에분배시켰다. 수성층을또다른 25 ml의에틸아세테이트로추출하고, 조합된유기물을 25 ml의포화 NaCl로세척하고, 소듐술페이트상에서건조시켰다. 용액을여과시키고, 농축시켜, 진한어두운색의오일을생성시켰다. 이를 0.1% 아세트산을함유하는디클로로메탄중 2% 메탄올과함께실리카겔상의플래시컬럼크로마토그래피에적용시켰다. 적절한분획을조합시키고, 농축시켜, 포말로서 3.58 그램의요망되는생성물을생성시 켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 2.01 (s, 18H, CH 3 ), 3.21 (d, 6H, J=2.8, CH 2 NH), 3.36 (s, 2H,

98 OCH 2 C(CH 2 ) 3 ), 4.13=2 (s, 2H, CH 2 CO 2 H), 8.15 (app t, J=2.8, 3H, NH). [0624] 실시예 72. N-Boc-β- 알라닌, N- 히드록시숙신이미드에스테르의제조 [0625] [0626] 80 ml의무수아세토니트릴중 8.0 그램의 N-Boc-β-알라닌및 5.0 그램의 N-히드록시숙신이미드와함께 100 mg 의 DPTS의용액에 10.5 그램의 DCC를처리하고, 반응물을밤새실온에서교반하였다. 혼합물을여과시키고, 침전물을아세토니트릴로세척하였다. 여과액을농축시켜오일을생성시키고, 이를헥산중 30-40% 에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시크로마토그래피에적용시켜, 백색고체로요망되는생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ = 1.45 (s, 9H, C(CH 3 ) 3 ), 5.93 (m, 6H, NHS, CH 2 COON), 3.53 (app q, 2H, NHCH 2 ), 5.2 (br s, 1H, NH). [0627] 실시예 73. 3,6,9,12- 테트라옥사 -14- 인펜타데카날의제조 [0628] [0629] 5 ml 의디클로로메탄중의 1.0 그램의 3,6,9,12- 테트라옥사펜타데크 -14- 인 -1- 올및 67 mg 의 TEMPO 의용액에 1.52 그램의아이오도벤젠디아세테이트를첨가하고, 반응물을밤새실온에서교반하였다. 반응물을농축시켜 황색오일을생성시키고, 이를헥산중 % 에틸아세테이트와함께실리카겔상의플래시크로마토그래피 에적용시켰다. 적절한분획을조합시키고, 농축시켜, 투명한무색오일로 300 mg의생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 2.44 (t, 1H, J=2.4, CCH), (m, 12H, OCH 2 CH 2 O), 4.17 (d, J=0.8, 2H, CH 2 CHO), 4.21 (d, 2H, J=2.4, CH 2 CCH), 9.74= (s, 1H, CHO). [0630] 실시예 아지도옥시 -2,5- 디옥사헵틸 6- 아암개시제의제조 [0631] [0632] 디클로로메탄중 800 mg의 1-아미노-9-아지도-2,2-비스 ( 아미노메틸 )-4,7-디옥사노난트리히드로클로라이드, 3.89 g의비스 [2,2-(2-브로모이소부티릴) 히드록시메틸 ] 프로피온산, 530 mg의 DPTS, 및 890 mg의디메틸아미노피리딘의용액에 2.7 g의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를처리하고, 실온에서밤새교반하였다. 반응혼합물을여과시키고, 농축시키고, 헥산중 50% 에틸아세테이트와함께실리카겔플래시크로마토그래피로 정제하여, 2.1 g 의요망되는생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.38 (s, 9H, CH 3 ), 1.92 (s, 36H, CH 3 ), 3.15 (d, J=6.6 Hz, 6H, CH 2 NH), 3.32 (s, 2H, OCH 2 C), 3.42 (t, J=5.2 Hz, 2H, N 3 CH 2 ),

99 (m, 2H, OCH 2 CH 2 O), 3.66 (m, 2H, OCH 2 CH 2 O), 3.69 (t, J=5.2 Hz, 2H, N 3 CH 2 ), 4.38 (dd, J=11.1, 17.0 Hz, 12H, CCH 2 O), 7.57 ( 브로드 t, J=6.6 Hz, NH 2 ). [0633] 실시예 75. N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 )-5,5- 비스 [N-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-3- 옥사 -6- 아미 노헥산산, N- 히드록시숙신이미딜에스테르의제조 [0634] [0635] 64.5 mg의 N-히드록시숙신이미드, 358 mg의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 )-5,5-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-3-옥사-6-아미노헥산산, 및 26 mg의 DPTS의용액에 300 mg의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를처리하고, 실온에서밤새교반하였다. 반응혼합물을여과시키고, 농축시키고, 헥산중 50% 에틸아세테이트와함께실리카겔플래시크로마토그래피로정제하여, 백색분말로 270 mg의요망되는생성물을생성시켰 다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.99 (s, 18H, CH 3 ), 2.87 (s, 4H, CH 2 CO), 3.17 (d, J=6.6 Hz, 6H, CH 2 NH), 3.39 (s, 2H, CCH 2 O), 4.51 (s, 2H, OCH 2 CO), 7.86 (t, J=6.6 Hz, 3H, NH). [0636] 실시예 76. N-(3,7,10,13- 테트라옥사펜타데크 -14- 이닐 )-3- 메틸말레이미드의제조 [0637] [0638] 3,6,9,12- 테트라옥사펜타데크 -14- 인 -1- 아민의 346 mg 분취량을질소하에서의교반과함께 224 mg 의시트라콘산 무수물분말에천천히첨가하였다. 발열반응이발생하여황갈색고체가생성되었다. 생성된혼합물을 6 시간 동안 120 로가열한후, 실온으로냉각시켰다. 생성물을헥산중 50% 에틸아세테이트와함께실리카겔플래 시크로마토그래피로분리시켜, 투명한무색오일로 160 mg의순수한생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 2.08 (d, 3H, CH 3 ), 2.43 (t, 1H, J=2.4 Hz, CHCCH 2 ), (m, 18H, CH 2 CH 2 O), 4.20 (d, J=2.4 Hz, 2H, CCH 2 O), 6.32 (q, J=1.8 Hz, 1H, CHCO). [0639] 실시예 77. N-(3,7,10,13- 테트라옥사펜타데크 -14- 이닐 ) 말레이미드의제조 [0640] [0641] 3,6,9,12- 테트라옥사펜타데크 -14- 인 -1- 아민의 1.15 g 분취량을질소하에서의교반과함께 660 mg 의분말화된 말레산무수물에천천히첨가하였다. 이후, 혼합물을 6 시간동안 120 로가열한후, 실온으로냉각시켰다. 생성물을헥산중 50% 에틸아세테이트와함께실리카겔플래시크로마토그래피로분리시켰다

100 [0642] 실시예 프로파르길옥시메틸 -2,4,9- 트리페닐 -1,3,5- 트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸의제조 [0643] [0644] [0645] 20 ml의디메틸술폭시드중의 3.0 g의 2,4,9-트리페닐-1,3,5-트리아자트리시클로 [ ,7] 데칸-7-메탄올 (WO2000/037658) 및 850 mg의포타슘히드록시드의용액에 1.46 g의 80% 프로파르길브로마이드용액을처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 혼합물을각각 100 ml의물과디에틸에테르사이에분배시키고, 수성층을 50 ml 에테르로 2회추출하였다. 조합된유기물을 20 ml의물로세척한후, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔여물을헥산중 5% 에틸아세테이트중실리카겔플래시크로마토그래피에적용시켜 0.9 g의요망되는생성물을생성시켰다. 실시예 79. 2,2-비스 ( 아미노메틸 )-4-옥사헵트-6-이닐아민트리히드로클로라이드의제조 [0646] [0647] [0648] 10 ml의테트라히드로푸란중 [ 상기절차로부터의프로파르길아다만탄생성물 ] 의 900 mg 샘플에 10 ml의 1N 수성염산을처리하고, 30분동안실온에서교반하였다. 이후, 테트라히드로푸란을실온에서회전증발에의해제거하고, 생성된수용액을 3 x 25 ml의에테르로추출하였다. 수성층을조심스럽게농축시키고, 20 ml 메탄올에용해시키고, 다시농축시켜, 어두운갈색분말로 568 mg의요망되는생성물을생성시켰다. 실시예 80. N-(2-브로모-2-메틸이소부티릴 )-2,2-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-4-옥사헵트-6- 이닐아민의제조 [0649] [0650] [ 상기절차로부터의프로파르길트리아민 ] 의 580 mg 샘플을 2.5 ml의트리에틸아민과함께 25 ml의디클로로메탄에현탁시키고, 얼음상에서교반하였다. 이후, 1.43 g의브로모이소부티릴브로마이드를적가하고, 반응물을 2시간동안교반하였고, 반응물은실온으로점차가온되었다. 혼합물을 3 x 10 ml의 1N 염산, 2 x 10 ml의포화소듐바이카보네이트, 및 10 ml의포화소듐클로라이드로세척하였다. 유기상을무수마그네슘술페이트상에서건조시키고, 여과시키고, 농축시키고, 잔여물을디클로로메탄중 5% 에틸아세테이트와함께실리카겔 플래시크로마토그래피에적용시켜, 700 mg 의요망되는생성물을생성시켰다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.99 (s, 18H, CH 3 ), 2.46 (t, 1H, J=2.4 Hz, CCH), 3.18 (d, J=6.7 Hz, 6H, CH 2 NH), 3.39 (s, 2H, CH 2 O), 4.18 (d, J=2.4 Hz, CHCCH 2 O), 7.73 (t, J=6.7 Hz, 3H, NH). [0651] 실시예 아지도 -2,2- 비스 ( 아지도메틸 )-4,7,10,13,16- 펜타옥사노나데크 -18- 엔의제조 [0652]

101 [0653] 10 ml의테트라히드로푸란중 530 mg의펜타에리트리톨트리아지드의용액에 380 mg의소듐히드라이드 (60% 분산액 ) 를처리하였다. 버블링 (bubbling) 이가라앉는경우, 1.24 g의 3,6,9,12-테트라옥사펜타데크-14- 엔 -1-올, 1-메탄술포네이트를첨가하고, 반응물을 에서밤새교반하였다. 혼합물을냉각시키고, 물몇방울을임의의잔여소듐히드라이드를켄칭시키기위해첨가하였고, 이후대부분의 THF를농축에의해제거하였다. 잔여물을각각 50 ml의물과디클로로메탄사이에분배시켰다. 수성상을 25 ml의디클로로메탄으로 2회추출하고, 조합된유기물 (100 ml) 을 25 ml의포화소듐클로라이드로 2회세척하였다. 유기상을무수마그네슘술페이트상에서건조시키고, 여과시키고, 농축시키고, 잔여물을헥산중 10-50% 에틸아세테이트와함께실리카겔플래시크로마토그래피에적용시켜, 2개의밀접하게이격된스폿을분리시켰다. 최종수득량은 260 mg의 투명한무색오일이었다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 3.34 (s, 2H, CCH 2 O), 3.35 (s, 6H, CH 2 N 3 ), (m, 16H, OCH 2 CH 2 O), 4.03 (t 의 d, J=1.4, 5.6 Hz, 2H, CHCH 2 O), 5.18 (q 의 d, J=1.4, 10.4 Hz, 1H, CH 2 =CH), 5.28 (q 의 d, J=1.6, 17.3 Hz, 1H, CH2=CH), 5.92 (m, J=5.6, 10.4, 17.2 Hz, 1H, CH). [0654] 실시예 82. 2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타데크 -16- 에닐 9- 아암클릭 - 계열개시제의제조 [0655] [0656] [0657] 3 ml의무수에탄올중알릴테트라에틸렌글리콜트리아지드 (120mg, 0.28mmol) 의탈기된용액에 253 μl의 DMF 중 PMDETA의용액 (100mg/ml)(25.3mg, 0.146mmol) 을첨가한후, 3 ml의에탄올에용해된 700 mg의 3-아암알킨유도체 (1.1 mmol, 개시제의 mol에비해 4 당량 ) 를첨가하였다. 혼합물을 3회의신속한진공-질소주기에의해탈기시켰다. 이후, 21mg의 CuBr(0.146 mmol, 0.5 당량, 또는아지드당 0.17 Cu) 을반응혼합물에첨가하였다. 반응물을신속히탈기시키고, 실온에서의교반과함께질소하에서밤새진행시켰다. 실리카겔플래시크로마토그래피로요망되는생성물을생성시켰다. 실시예 ,17-디히드록시-2,5,8,11,14-펜타옥사헵타데실 9-아암클릭-기반개시제의제조 [0658] [0659] 교반바가구비된둥근바닥플라스크에 15 ml의물, 15 ml의 t-부탄올, 이전절차로부터의 456 mg의알릴테트라에틸렌글리콜트리아졸, 198 mg의페리시안화칼륨, 83 mg의탄산칼륨, 19 mg의메탄술폰아미드, 1 mg의퀴누클리딘, 및 1 mg의오스뮴산칼륨이수화물을충전시키고, 실온에서밤새교반하였다. 반응혼합물을각각 100 ml의물과디클로로메탄사이에서분배시켰다. 수성층을 25 ml의디클로로메탄으로두번더추출하고, 유기층을합하고, 무수황산마그네슘상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을디클로로메탄중 5% 메탄

102 올을이용하는실리카겔플래시크로마토그래피로처리하여요망되는생성물을수득하였다. [0660] 실시예 84. 2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타덱 -16- 에닐 9- 아암아미드 - 기반개시제의제조 [0661] [0662] [0663] 아세토니트릴중 1-아미노-15-알릴옥시-2,2-비스 ( 아미노메틸 )-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸트리히드로클로라이드의용액이 6 당량의트리에틸아민과함께, 아세토니트릴중 3 당량의 N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 )- 5,5-비스 [N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐) 아미노메틸 ]-3-옥사-6-아미노헥산산, N-히드록시숙신이미딜에스테르의용액과반응하게하고, 혼합물을밤새교반하였다. 반응혼합물을농축시켜잔류물을수득하고, 이를디클로로메탄에취하고, 1N HCl에이어염화나트륨포화용액으로세척한다음, 황산나트륨상에서건조시켰다. 여과하고농축시켜잔류물을수득하였고, 이것을헥산중의에틸아세테이트의혼합물에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피에의해정제시켜요망되는생성물을수득하였다. 실시예 85. 프로파르길테트라에틸렌글리콜아이오도아세타미드의제조 [0664] [0665] [0666] 아이오도아세트산무수물 (8.8 mmol, 3.11 g) 을드라이아세토니트릴 (20 ml) 중프로파르길테트라에틸렌글리콜아민 (8 mmol, 1.85 g) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (8 mmol, 1.39 g) 의교반된용액에첨가하였다. 90분후에, 혼합물을농축시켰다. 잔류물을 100 ml의에틸아세테이트에용해시키고, 100 ml의물로 3회에이어 50 ml의염화나트륨포화용액으로세척하였다. 유기물을무수황산나트륨상에서건조시키고, 농축시키고, 잔류물을헥산중의 30-40% 에틸아세테이트에의한실리카겔플래시크로마토그래피로처리하였다. 실시예 86. 프로파르길테트라에틸렌글리콜브로모아세타미드의제조 [0667] [0668] [0669] 교반바가구비된둥근바닥플라스크에프로파르길테트라에틸렌글리콜아민 (8 mmol, 1.85 g), 브로모아세트산 (12 mmol, 1.67 g), 디메틸아미노피리딘 (9.6 mmol, 1.17 g), 4-디메틸아미노피리디늄 4-톨루엔술포네이트 (2.4 mmol, 0.71 g), 및디클로로메탄 (20 ml) 을충전시켰다. 교반혼합물을통해질소를 10분간버블링시킨다음, N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (15.6 mmol, 3.22 g) 를첨가하였다. 실온에서밤새교반시킨후에, 혼합물을여과하고, 농축시키고, 헥산중의 40% 에틸아세테이트에의한실리카겔플래시크로마토그래피로처리하였다. 실시예 87. N-(2-브로모-2-메틸이소부티릴 )-2,2-비스[N-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 ) 아미노메틸 ]-3-아미노-1-프로판올의제조

103 [0670] [0671] 200 ml의디클로로메탄중 2.00 g의 2,2-아미노메틸-3-아미노-1-프로판올트리히드로클로라이드 (WO2000/037658) 및 9.33 ml의트리에틸아민의용액을빙수조로냉각시키고, 9.33 ml의 2-브로모이소부티릴브로마이드를적가하였다. 반응혼합물이교반되게하면서 3시간에걸쳐실온으로가온시켰다. 그후용액을 3 x 50 ml의 1N HCl, 3 x 50 ml의포화소듐비카르보네이트, 및 50 ml의염화나트륨포화용액으로세척하였다. 이어서용액을무수황산마그네슘상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜 4.67 g의요망되는생성물을백색고형물로서수득하였다. 이러한물질은헥산중의 30-50% 에틸아세테이트에의한실리카겔크로마토그래피에의 해추가로정제될수있었다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ = 1.91 (s, 18H, CH 3 ), 3.05 (d, 6H, J=6.4 Hz, CH 2 N), 3.21 (d, 2H, J=4.4 Hz, CH 2 OH), 8.17 (t, J=6.4 Hz, 3H, NH). [0672] 실시예 88. N-t- 부틸옥시카르보닐 -2,2-[ 비스 (2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오 닐 )- 에탄올아민의제조 [0673] [0674] 100 ml의디클로로메탄중 3.50 g의 N-Boc 트리스 ( 히드록시메틸 ) 아미노메탄 (J. Fluorine Chem. 2007, 128, 179) 의용액을 11 ml (5 eq) 의트리에틸아민과함께빙수조로냉각시키고, 6.2 ml (3.2 eq) 의 2-브로모이소부티릴브로마이드를적각하였다. 반응물을찬상태에서 3시간동안교반한다음, tlc ( 실리카겔, 헥산중의 30% 에틸아세테이트 ) 에의해조사하였다. 반응이아직완료되지않았으므로, 추가의 3 g의 2-브로모이소부티릴브로마이드를적가하였다. 추가 1시간동안교반시킨후에, 반응물을여과시키고, 침전물을소량의디클로로메탄으로세척하였다. 합친유기물을 50 ml의포화소듐비카르보네이트로세척한다음, 황산나트륨상에서건조시켰다. 여과하고농축시켜잔류물을수득하였고, 이것을헥산중의 10-30% 에틸아세테이트를이용하여플래시크로마토그래피로처리하였다. 생성물함유분획을약 50 ml의부피로농축시키고, 이어서또다른 200 ml의헥산을냉각및교반하면서첨가하였다. 약 2시간에걸쳐, 혼합물로부터많은고형생성물이결정화되었다. 이것을여과에의해회수하고공기-건조시켜 7.1 g (67%) 의요망되는생성물을백색결정질고형물로서수득하 였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.43 (s, 9H, Boc), 1.95 (s, 18H, (CH 3 ) 2 CBr), 4.54 (s, 6H, CH 2 O), 4.8 (br s, 1H, NH). [0675] 실시예 89. 2,2-[ 비스 (2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2- 브로모 -2- 메틸프로피오닐 ) 에탄올아민트리플 루오로아세테이트의제조 [0676]

104 [0677] [0678] 40 ml의디클로로메탄중 6.0 g의 N-t-부틸옥시카르보닐-2,2-[ 비스 (2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2- 브로모-2-메틸프로피오닐 )-에탄올아민의용액을 10 ml의트리플루오로아세트산으로처리하고, 반응물을실온에서 1시간동안교반시켰다. 그후반응물을농축시키고 20 ml의헥산을첨가하였다. 혼합물을다시농축시킨다음, 고진공하에두어 6.14 g의요망되는생성물을백색고형물로서수득하였다. 실시예 90. 디글리콜산무수물을갖는 2,2-[ 비스 (2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 ) 에탄올아민하프아미드의제조 [0679] [0680] [0681] 50 ml의아세토니트릴중 5.03 g의 2,2-[ 비스 (2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 ) 에탄올아민트리플루오로아세테이트의혼합물을 2.0 ml (2 eq) 의트리에틸아민으로처리하였고, 그직후에반응물이균질해졌다. DMAP의 50 mg 부분을첨가하고, 이어서 860 mg (1 eq) 의디글리콜산무수물을첨가하고, 반응물을실온에서 3시간동안교반시켰다. 그후반응물을농축시키고잔류물을 100 ml의디클로로메탄에용해시키고, 2 x 50 ml의 1N HCl에이어서 50 ml의염화나트륨포화용액으로세척하였다. 유기물을황산나트륨상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜잔류물을수득하고, 이를헥산중의 50% 에틸아세테이트에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜요망되는생성물을수득하였다. 실시예 91. 디글리콜산무수물을갖는 2,2-[ 비스 (2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐 ) 에탄올아민하프아미드, NHS 에스테르의제조 [0682] [0683] 30 ml의무수아세토니트릴중디글리콜산무수물을갖는 2.5 g의 2,2-[ 비스 (2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐) 에탄올아민, 하프아미드의용액을 500 mg의 N-히드록시숙신이미드및 85 mg 의 DPTS와함께, 900 mg의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 그후혼합물을여과하고, 여액을농축시켜잔류물을수득하고, 이를헥산중의 50% 에틸아세테이트에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜요망되는생성물을수득하였다

105 [0684] 실시예 92. 2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타덱 -16- 에닐 9- 아암디글리콜산 - 기반개시제의제조 [0685] [0686] [0687] 아세토니트릴중 1-아미노-15-알릴옥시-2,2-비스 ( 아미노메틸 )-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸트리히드로클로라이드의용액을 6 당량의트리에틸아민과함께, 디글리콜산무수물을갖는 2,2-[ 비스 (2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐) 에탄올아민하프아미드, NHS 에스테르의용액과반응시키고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 그후반응혼합물을농축시키고, 잔류물을 100 ml의디클로로메탄에용해시키고, 2 x 50 ml의 1N HCl에이어 50 ml의염화나트륨포화용액으로세척하였다. 유기물을황산나트륨상에서건조시키고, 여과하고, 농축시켜잔류물을수득하고, 이를헥산중의에틸아세테이트에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피로처리하였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜요망되는생성물을수득하였다. 실시예 메틸-2-히드록시메틸-4,7,10,13,16-펜타옥사 -18-에닐노나데칸올의제조 [0688] [0689] [0690] 100 ml의무수 THF 중 3.6 g의 5-히드록시메틸-2,2,5-트리메틸-1,3- 디옥산의용액을빙수조로냉각시키고, 2.7 g의 NaH ( 오일중 60%) 로처리하였다. 버블링침강후에, 7.0 g의 3,6,9,12-테트라옥사펜타덱-14-엔-1- 올메탄술포네이트를첨가하고, 반응물을 70 에서 2시간동안교반시켰다. 반응물을냉각시키고, 3 ml의물을신중하게첨가시키고, 반응혼합물을 100 ml의물과 100 ml의에테르사이에서분배시켰다. 수성층을추가의 2 x 50 ml의에테르로추출하고, 합한유기물을황산나트륨상에서건조시켰다. 여과하고농축시켜황색오일을수득하였고, 이것을헥산중의 10-15% 아세톤에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피로처리하여 5.62 g의요망되는아세토나이드생성물을등명한오일로서수득하였다. 이러한오일의 4.84 g 부분을 50 ml의메탄올에취하고, 1.0 g의 Dowex 50Wx8 수지 (H+ 형태 ) 로처리하고, 반응물을실온에서밤새교반하였다. 그후혼합물을여과시키고, 여액을농축시켜 4.30 g의요망되는생성물을투명하고거의무색인오일로서수득하였다. 실시예 94. 비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온산을갖는 2-메틸-2-히드록시메틸- 4,7,10,13,16-펜타옥사-18-에닐노나데칸올, 모노에스테르의제조 [0691] [0692] 무수아세토니트릴중 2-메틸-2-히드록시메틸-4,7,10,13,16-펜타옥사 -18-에닐노나데칸올의샘플을 1 당량의비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온산, 촉매량의 DPTS 및 1.2 당량의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서교반하였다. 여과하고농축시켜오일을수득하고, 이를헥산중의에틸아세테이트에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피에의해서정제하여요망되는화합물을수득하였다

106 [0693] 실시예 95. 2,5,8,11,14- 펜타옥사헵타덱 -16- 에닐 5- 아암하이브리드개시제의제조 [0694] [0695] [0696] 무수아세토니트릴중비스 2,2-[(2-브로모이소부티릴 ) 히드록시메틸 ] 프로피온산을갖는 2-메틸-2-히드록시메틸- 4,7,10,13,16-펜타옥사-18-에닐노나데칸올, 모노에스테르의용액을디글리콜산무수물을갖는 1 당량의 2,2- [ 비스 (2-브로모-2-메틸프로피오닐옥시 ) 메틸 ]-O-(2-브로모-2-메틸프로피오닐) 에탄올아민하프아미드, 촉매량의 DPTS 및 1.2 당량의 DCC로처리하고, 반응물을실온에서교반하였다. 여과하고농축시켜오일을수득하고, 이를헥산중의에틸아세테이트에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피에의해서정제하여요망되는 5-아암개시제를수득하였다. 실시예 96. 보호된말레이미드 8-아암개시제의제조 [0697] [0698] 교반바가구비된둥근바닥플라스크에보호된말레이미드테트라올 (1 mmol, 543 mg), 비스 ( 브로모 ) 산 (4.5 mmol, 1.94 g), 디메틸아미노피리딘 (3.6 mmol, 440 mg), 4-디메틸아미노피리디늄 4-톨루엔술포네이트 (0.9 mmol, 265 mg), 및디클로로메탄 (20 ml) 을충전시켰다. 교반혼합물을통해 10분간질소를버블링시킨다음, N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (5.85 mmol, 1.21 g) 를첨가하였다. 실온에서밤새교반시킨후에, 혼합물을여과하고, 농축시키고, 헥산중의 40% 에틸아세테이트에의한실리카겔플래시크로마토그래피로처리하였다

107 [0699] 실시예 97. 보호된말레이미드 12- 아암개시제의제조 [0700] [0701] [0702] [0703] 교반바가구비된둥근바닥플라스크에보호된말레이미드테트라올 (1 mmol, 543 mg), 3-아암하프아미드산 (4.5 mmol, 3.14 g), 디메틸아미노피리딘 (3.6 mmol, 440 mg), 4-디메틸아미노피리디늄 4-톨루엔술포네이트 (0.9 mmol, 265 mg), 및디클로로메탄 (20 ml) 을충전시켰다. 교반혼합물을통해 10분간질소를버블링시킨다음, N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (5.85 mmol, 1.21 g) 를첨가하였다. 실온에서밤새교반시킨후에, 혼합물을여과하고, 농축시키고, 헥산중의 40% 에틸아세테이트에의한실리카겔플래시크로마토그래피로처리하였다. 실시예 98. 고분자량쌍성이온성중합체의제조 NHSM2 개시제를이용하여합성된실시예 2-아암중합체 [0704] [0705] [0706] [0707] " 리빙 " 제어성자유라디칼공정인원자이동라디칼중합반응 (ATRP) 을이용하여쌍성이온성단량체의고분자량테일러-메이드친수성중합체인 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 (HEMA-PC) 을생산하기위한대표적인프로토콜은하기와같다. 하기개시제를이용하였다 : PMC2M1 ( 실시예 4로부터 ) [0708]

108 [0709] PMC2M2 ( 실시예 5 로부터 )' [0710] [0711] PMC2EOM2 ( 실시예 8 로부터 ) [0712] [0713] PMC2M4 ( 실시예 14 로부터 ) [0714] [0715] PMC2EOM4 ( 실시예 32 로부터 ) [0716] [0717] NHSM2 ( 실시예 25 로부터 ) [0718]

109 [0719] NHSEO4M2 ( 실시예 38 로부터 ) [0720] [0721] N3C2EOM2 ( 실시예 49 로부터 ) [0722] [0723] N3EOM6 ( 실시예 74 로부터 ) [0724] [0725] AlC2M2 ( 실시예 24 로부터 ) [0726] [0727] BAlM2 ( 실시예 50 으로부터 ) [0728]

110 [0729] AcC2M2 ( 실시예 9 로부터 ) [0730] [0731] DC1M2 ( 실시예 40 으로부터 ) [0732] [0733] DC1EOM2 ( 실시예 41 로부터 ) [0734] [0735] DC1EO4M2 ( 실시예 43 으로부터 ) [0736] [0737] DC1EOM4 ( 실시예 48 로부터 ) [0738]

111 [0739] DC1EO4M6 ( 실시예 59 로부터 ) [0740] [0741] AKC1EO4M2 ( 실시예 64 로부터 ) [0742] [0743] AEC1EO4M9 ( 실시예 92 로부터 ) [0744] [0745] 개시제및리간드 ( 달리지시하지않는한, 2,2'-바이피리딜 ) 을슈랭크튜브에도입시켰다. 개시제와리간드둘모두의총중량퍼센트가 20% 를초과하지않도록디메틸포름아미드또는디메틸설폭사이드를적가식으로도입시켰다. 개시제또는리간드가오일이거나, 포함된양이저울의정확도한계미만인경우, 시약들을디메틸포름아미드 (100 mg/ml) 중의용액으로서도입시켰다. 생성된용액을드라이아이스 / 아세톤혼합물을이용하여 -78 로냉각시키고, 추가의버블링이나타나지않을때까지진공하에탈기시켰다. 혼합물이이러한온도에서여전히균질한채로남아있었다. 질소하에튜브를재충전하고, 질소하에유지된촉매 ( 달리지시하지않는한, CuBr) 를슈랭크튜브에도입시켰다. 용액은즉시암갈색이되었다. 슈랭크튜브를밀봉시켜 -78 에서유지시키고, 진공을적용시킨즉시용액을퍼징시켰다. 사용준비가될때까지단량체인 HEMA-PC가항상비활성조건하에건조고형물로서유지될것을보장하도록주의하였다. 소정량의단량체를질소하에 200proof의탈기된에탄올과혼합시킴에의해 HEMA-PC의용액을새로제조하였다. 단량체용액을슈랭크튜브에적가시키고광산란에의해균질화시켰다. 달리지시하지않는한, 단량체 (g)/ 에탄올 (ml) 의비율은 0.255였다. 온도를 -78 로유지시켰다. 용액으로부터버블링이멈출때까지철저한진공을반응혼합물에적어도 10 내지 15분간적용시켰다. 혼합물은이러한온도에서균질한채로있었고, 즉어떠한반응성분들 ( 예컨대, 개시제또는리간

112 드 ) 도침전되지않아서조기중합또는원치않는중합을피할수있었다. 튜브를질소로재충전시키고, 진공- 질소사이클을 2회반복하였다. 그후튜브를질소로재충전하고실온 (25 ) 으로가온시켰다. 중합이진행됨에따라, 용액은점성이되었다. 약간의시간이흐른후에 ( 하기표에정의됨 ), 반응물을공기에직접노출시켜켄칭시킴으로써혼합물의색이청녹색이되게하였고, 실리카컬럼을통해통과시켜구리촉매를제거하였다. 수집된용액을회전증발에의해농축시키고, 생성된혼합물을테트라히드로푸란으로신중하게침전시킴에의해정제시킨후에디에틸에테르로충분히세척하거나, 물에대해투석시켰다. 중합체를백색플러피 (fluffy) 분말로서수집하고 ( 물에대해투석시킨경우동결건조후에 ) 실온에서진공하에두었다. [0746] 수회의중합반응으로부터의데이터를하기표에도시한다. [0747] [0748]

113 [0749]

114 [0750] [0751] [0752] [0753] 피크분자량 (Mp), 수분자량 (Mn) 및다분산성 (PDI) 을멀티 - 앵글광산란에의해측정 / 획득하였다. 실시예 99. 고분자량쌍성이온성중합체의추가제조 DC1EO4NM3 개시제를이용하여합성된실시예 3- 아암중합체 [0754] [0755] [0756] " 리빙 " 제어성자유라디칼공정인원자이동라디칼중합반응 (ATRP) 을이용하여쌍성이온성단량체의고분자량테일러-메이드친수성중합체인 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 (HEMA-PC) 을생산하기위한대안적인대표적인프로토콜은하기와같다. 하기개시제를이용하였다 :

115 [0757] HOC1NM3 ( 실시예 87 로부터 ) [0758] [0759] DC1EO4NM3 ( 실시예 54 로부터 ) [0760] [0761] N3EO2NM3 ( 실시예 57 로부터 ) [0762] [0763] 개시제및리간드 ( 달리지시하지않는한, 2,2'-바이피리딜 ) 을슈랭크튜브에도입시켰다. 개시제와리간드둘모두의총중량퍼센트가 20% 를초과하지않도록디메틸포름아미드또는디메틸설폭사이드를적가식으로도입시켰다. 개시제또는리간드가오일이거나, 포함된양이저울의정확도한계미만인경우, 시약들을디메틸포름아미드 (100 mg/ml) 중의용액으로서도입시켰다. 생성된용액을드라이아이스 / 아세톤혼합물을이용하여 -78 로냉각시키고, 추가의버블링이나타나지않을때까지진공하에탈기시켰다. 혼합물이이러한온도에서여전히균질한채로남아있었다. 질소하에튜브를재충전하고, 질소하에유지된촉매 ( 달리지시하지않는한, CuBr) 를슈랭크튜브에도입시켰다. 용액은즉시암갈색이되었다. 슈랭크튜브를밀봉시켜 -78 에서유지시키고, 진공을적용시킨즉시용액을퍼징시켰다. 사용준비가될때까지단량체인 HEMA-PC가항상비활성조건하에건조고형물로서유지될것을보장하도록주의하였다. 소정량의단량체를질소하에 200proof의탈기된에탄올과혼합시킴에의해 HEMA-PC의용액을새로제조하였다. 디메틸포름아미드 (100 mg/ml) 중 CuBr 2 의 탈기된용액을, 할라이드 /CuBr/CuBr 2 의비가 24시간까지의반응시간에대해 1/0.9/0.1이고 24시간보다긴반응시간에대해 1/0.75/0.25이도록하여질소하에 HEMA-PC의용액에첨가하였다. 생성된용액을슈랭크튜브에적가시키고광산란에의해균질화시켰다. 달리지시하지않는한, 단량체 (g)/ 에탄올 (ml) 의비율은 0.50이었다. 온도를 -78 로유지시켰다. 용액으로부터버블링이멈출때까지철저한진공을반응혼합물에적어도 10 내지 15분간적용시켰다. 혼합물은이러한온도에서균질한채로있었고, 즉어떠한반응성분들 ( 예컨대, 개시제또는리간드 ) 도침전되지않아서조기중합또는원치않는중합을피할수있었다. 튜브를질소로재충전시키고, 진공-질소사이클을 2회반복하였다. 그후튜브를질소로재충전하고실온 (25 ) 으로가온시켰다. 중합이진행됨에따라, 용액은점성이되었다. 약간의시간이흐른후에 ( 하기표에정의됨 ), 반응물을공기에직접노출시켜켄칭시킴으로써혼합물의색이청녹색이되게하였고, 실리카컬럼을통해통과시켜구리촉매를제거하였다. 수집된용액을회전증발에의해농축시키고, 생성된혼합물을테트라히드로푸란으로신중하게침전시킴에의해정제시킨후에디에틸에테르로충분히세척하거나, 물에대해투석시켰다. 중합체

116 를백색플러피분말로서수집하고 ( 물에대해투석시킨경우동결건조후에 ) 실온에서진공하에두었다. [0764] 수회의중합반응으로부터의데이터를하기표에도시한다. [0765] [0766] [0767] [0768] [0769] 피크분자량 (Mp), 수분자량 (Mn) 및다분산성 (PDI) 을멀티-앵글광산란에의해측정 / 획득하였다. 실시예 100. 고분자량 PEG 중합체의제조 " 현재사용되는 (living)" 제어된자유라디칼공정, 원자이동라디칼중합 (ATRP) 을사용한, 친수성단량체, 폴리 ( 에틸렌글리콜 ) 메틸에테르메타크릴레이트, MW 475 (HEMA-PEG475) 의고분자량의주문-제조되는친수성중합체를생성시키는대표적인원안은다음차이를제외하고는실시예 98에개괄된원안과기본적으로는동일하다. 단량체 (HEMA-PEG 475 ) 를 200 푸르프 (200 proof) 로용해시키고, 용액을동결-펌프-해동기술 (freezepump-thaw technique)(3회 ) 을이용하여탈기시켰다. 생성되는탈기된혼합물을개시제, 리간드및 CuBr의탈기된용액에 -78 에서질소하에도입하였다. 생성되는혼합물을 -78 에서탈기시키고, 해동시키고, 실온에서질소하에넣었다

117 [0770] [0771] 1 단량체 (g)/ 용매 (ml) 0.50 [0772] 2-78 에서의혼합물의동결로인한불균일중합에기인한더높은 PDI [0773] [0774] [0775] 3 에틸렌글리콜공용매 (-78 에서의동결을방지 ) 의첨가에기인한더낮은 PDI 실시예 101. 고분자량아크릴아미드중합체의제조 " 현재사용되는 " 제어된자유라디칼공정, 원자이동라디칼중합 (ATRP) 을이용한, 친수성단량체, N,N-디메틸아크릴아미드 (DMA), 아크릴아미드 (AM) 또는 N-이소프로필아크릴아미드 (NIPAM) 의고분자량주문-제조되는친수성중합체를생성시키는대표적인원안은다음차이를제외하고는실시예 99에개괄된원안과기본적으로는 동일하다. 사용된리간드는트리스 [2-디메틸아미노) 에틸 ] 아민 (Me6TREN) 이고, 3.3 mol x 10-5 이샘플 1 및샘플 2에첨가되고, 1.5 mol x 10-5 이모든다른샘플에첨가되며, 용매는물이었다. 할라이드 /CuBr/CuBr 2 /Me6TREN의비는각각의경우에 1/0.75/0.25/1이었다. 촉매의첨가후에, 용기를밀봉하고, 0 에서두었다. 아크릴아미드유도체, DMA, AM 또는 NIPAM의수용액을동결-펌프-해동기술을이용하여탈기시키고 (3회), 질소하에캐눌라를통해서개시제, 리간드및촉매를함유하는슈렝크튜브 (Schlenk tube) 에도입하였다. 용기를밀봉하고, 4 에서반응이진행되게하였다. 잠시후에, 반응물을공기에직접노출시켜서켄칭시켰다. 블루-그린반응혼합물을짧은실리카겔플러그를통해서통과시켜서구리촉매를제거하였다. 수집된용액을동결건조에의해서농축시켰다. [0776] [0777] 1 AM 단량체 [0778] 2 DMA 단량체 [0779] [0780] [0781] [0782] 3 NIPAM 단량체할라이드 /CuBr/CuBr 2 /Me6TREN의비율은각각의경우에 1/0.75/0.25/1이었다. 실시예 102. 디올기능화된개시제의중합후의디올전구체로부터의알데히드작용기의생성증류수에용해된아주과량의소듐퍼아이오데이트를증류수중의디올기능화된중합체의용액 (10중량%) 에첨가하였다. 반응을암실에서 90분동안실온에서진행시켰다

118 [0783] [0784] 반응을글리세롤 (NaIO 4 에대해 1.5 배 ) 의수용액으로켄칭시켜서어떠한미반응소듐퍼아이오데이트를제거하였 다. 혼합물을실온에서 15 분동안교반하고, 투석백 (MWCO 14 내지 25 kda) 에넣고, 실온에서 1 일동안투석 에의해서정제하였다. 이어서, 물을동결건조에의해서제거하고, 중합체를무수분말로서수거하였다. [0785] [0786] [0787] [0788] Cy5.5 하이드라지드형광염료 (GE Healthcare) 의결합에의해서알데히드정량화를수행하였다.. 실시예 103. 아지도기능화된중합체에대한 N-프로파르길말레이미드및 5-헥신-1-알의결합하기시약을아지도기능화된중합체에결합시켰다. N-프로파르길말레이미드 ( 실시예 62로부터 ) [0789] [0790] 5- 헥신 -1- 알 ( 실시예 63 으로부터 ) [0791] [0792] [0793] 200 프루프에탄올중의아지도기능화된중합체의탈기된용액에과량의알킬유도체 ( 아지도기당 1.2 당량 ) 를첨가한다음, DMF (100mg/ml) 중의원액으로서리간드 N,N,N',N",N"-펜타메틸디에틸렌트리아민 (PMDETA) 를첨가하였다. 혼합물을 3회진공 / 질소사이클에의해서탈기시켰다. 구리브로마이드 (I) 를전형적으로는아지도기에대해서 0.2 내지 1의비율로반응혼합물에첨가하였다. CuBr/PMDETA의비율은 1/1이었다. 반응물을다시탈기시키고, 실온에서밤새교반하였다. 하기중합체를사용하였다 ( 실시예 98로부터의샘플 1, 2, 8, 9 및 10; 실시예 100으로부터의샘플 4; 및실시예 99로부터의샘플 3, 5, 6 및 7): [0794] [0795] 실시예 104. 말레이미드기능화된중합체에대한재조합인간모노클로날 Fab' 의컨쥬게이션

119 [0796] 말레이미드기능화된중합체 ( 실시예 16 에따른탈보호후에실시예 98 로부터 ) 를제조하였다 : [0797] [0798] [0799] [0800] [0801] 재조합인간 Fab'( 분자량 50 kda) 의컨쥬게이션을 2mM EDTA를함유하는 ph 5의 10 mm 소듐아세테이트중에서 10x 몰과량의 TCEP 및 5 내지 10 배몰과량의말레이미드기능화된중합체로수행하였다. 반응혼합물중의최종 Fab' 농도는 1 내지 2mg/ml이었으며, 반응은암실에서 5시간동안실온에서수행한다음, 록킹테이블 (rocking table) 을사용하여약하게혼합하면서 4 에서밤새수행하였다. 생성되는 Fab -중합체컨쥬게이트를결합완충액으로서 20mM Tris ph 7.4를사용하는 GE Healthcare로부터의 MacroCap SP (MSP) 컬럼상에서이온교환크로마토그래피를사용하여정제하였다. 일반적으로, 컨쥬게이션반응물 ( 약 5 mg 단백질을함유 ) 을결합완충액으로 4 배희석시키고, 중력흐름에의해서 2 ml MSP 컬럼에로딩하였다. 컬럼을 10 이상의컬럼용적 (CV) 의결합완충액으로세척하였다. 컨쥬게이트의용리는컬럼을 10 이상의 CV 동안 40 내지 50mM NaCl을함유하는결합완충액으로용리시킴으로써달성되었다. 수거된분획을 10 kda MW 컷오프막을지니는 Amicon Ultrafree 농축기로농축시키고, 0.5M NaCl을함유하는결합완충액내로완충액을교환하고, 주가로약 1mg/ml 의최종단백질농도로농축시켰다. 최종컨쥬게이트를 0.22 마이크론필터로무균여과하고, 사용전에 4 에서저장하였다. 최종단백질농도는 1.46의 Fab' 흡광계수 (10mm 통과길이큐벳중의 1mg/ml 용액 ) 를지닌 OD280nm를사용하여측정하였다. 이어서, 컨쥬게이트농도를 Fab' 외에중합체의 MW를포함시킴으로써계산하였다. 컨쥬게이트의 MW를 2996 광다이오드어레이검출기및 Wyatt minidawn Treos 다중각도광산란검출기가장착된 Waters 2695 HPLC 시스템과함께 Shodex 806MHQ 컬럼을사용하여분석하였다. PDI및 Mp를 Wyatt MALS 검출기와연결된 ASTRA 소프트웨어를사용하여계산하고, 데이터를상기표에나타낸다. 또한, 모든경우에, 컨쥬게이트의화학양론은 Fab 와중합체사이에 1 대 1인것으로밝혀졌다. 실시예 105. 알데히드기능화된중합체에대한재조합인간시토카인의컨쥬게이션하기알데히드기능화된중합체 ( 달리명시된것외에는실시예 102에따른산화후에실시예 98 및실시예 99 로부터 ) 를사용하였다 :

120 [0802] [0803] 1 실시예 103 으로부터의중합체 ( 클릭화학을통해서결합된알데히드 ) [0804] 2 DC1M2 개시제 ( 즉, 스페이서없음 ) [0805] [0806] [0807] [0808] [0809] 3 DC1EOM2 개시제 ( 즉, 에틸렌옥사이드스페이서 ) 5.02의 pi와의 22 kda 재조합인간시토카인의컨쥬게이션을 40mM 소듐시아노보로하이드라이드를함유하는 ph 7의 10mM 헤페스완충액에서수행하였다. 최종단백질농도는컨쥬게이션완충액중에용해된 6 내지 7 배몰과량의중합체의존재하에 1 내지 1.5mg/ml이었다. 반응물을실온으로옮기거나, 록킹테이블을사용하여약하게혼합하면서암실에서밤새 4 에보관하였다. 컨쥬게이션효율을두가지방법을이용하여모니터링하였다 : (i) SDS-PAGE 분석을사용한세미-정량적인방법및 (ii) Dionex Corporation으로부터의 ProPac SEC-10 컬럼, 4x300mm 에의한분석용크기배제크로마토그래피 (SEC) 를사용한정량적인방법. 생성되는시토카인-중합체컨쥬게이의정제를 GE Healthcare로부터의음이온교환 Q Sepharose HP (QHP) 컬럼을사용하여수행하였다. 일반적으로, 컨쥬게이션반응물 ( 약 1 mg 단백질을함유함 ) 을 20 mm Tris ph 7.5을함유하는 QHP 세척완충액으로약 4배희석시키고, 중력흐름으로 2ml QHP 컬럼상에로딩시켰다. 컬럼을 10 컬럼용적 (CV) 이상의세척완충액으로세척하였다. 컨쥬게이트의용리가 5CV 이상을위한 40 내지 50mM NaCl을함유하는세척완충액으로컬럼을용리시킴으써달성되었다. 수집된분획을 10 kda MW 컷오프막을지닌 Amicon Ultrafree 농축기로농축시키고, 1xPBS ph 7.4 로완충액교환하고, 1mg/ml 이상의최종단백질농도로추가로농축시켰다. 최종컨쥬게이트를 0.22 마이크론필터로무균여과하고, 사용전에 4 에서저장하였다. 최종단백질농도는 0.81의시토카인흡광계수를지니는 OD277nm(10mm 통과길이큐벳 (cuvette) 내의 1mg/ml 용액 ) 을사용하여측정하였다. 이어서, 컨쥬게이트농도는단백질에추가로중합체의 MW를포함시킴으로써계산된다. 시토카인-중합체컨쥬게이트의특성화는하기검정으로수행하였다 : (i) 컨쥬게이트의 MW는 2996 광다이오드어레이검출기 (2996 Photodiode Array Detector) 및 Wyatt minidawn Treos 다중각도광산란검출기가장착된 Waters 2695 HPLC 시스템에의한 Shodex 806MHQ 컬럼을사용하여분석하였다. PDI 및 Mp는 Wyatt MALS 검출기과연결된 ASTRA 소프트웨어를사용하여계산하고, 데이터를상기표에나타낸다. 또한, 모든경우에, 컨쥬게이트의화학양론은단백질과중합체사이에 1 대 1인것으로나타났으며 ; (ii) 쿠마씨블루염료 (Coomassie Blue stain) 를사용한 SDS-PAGE 분석. 비-환원및환원조건둘모두하의고 MW 컨쥬게이트의존재및유리단백질의결핍은단백질이중합체에공유결합으로컨쥬게이트되는양호한지표를제공했다. 또한, 단백질과중합체사이의비-공유회합의징후가없었을뿐만아니라정제된단백질-중합체컨쥬게이트제조물내의분자간디설파이드결합매개된단백질응집의존재도없었다

121 [0810] [0811] [0812] 아주중요한차이는샘플 3과샘플 4 사이에서관찰되었다. 샘플 3은말단작용기와개시제코어사이에스페이서가없는 DC1M2 개시제를사용하여제조된중합체로부터의구성되었다. 샘플 4는말단작용기와개시제코어사이에단일의에틸렌옥사이드스페이서를지니는 DC1EOM2 개시제를사용하여제조된중합체로부터구성되었다. 샘플 4에대한컨쥬게이션효율은샘플 3보다 5배더높아서, 작용기반응성에영향을주는데있어서의스페이서화학의중요성을나타냈다. 실시예 106. 알데히드기능화된중합체에대한재조합인간다중-도메인단백질의컨쥬게이션하기알데히드기능화된중합체 ( 실시예 102에따른산화후의실시예 98 및실시예 99로부터 ) 를사용하였다 : [0813] [0814] [0815] [0816] [0817] [0818] [0819] 4.77의 pi와의 21 kda 재조합인간다중-도메인단백질의컨쥬게이션을 40mM 소듐시아노보로하이드라이드를함유하는 ph 7의 10mM 헤페스완충액중에서수행하였다. 최종단백질농도는컨쥬게이션완충액에용해된 6 내지 7배몰과량의중합체의존재하에 1 내지 1.5mg/ml이었다. 반응을록킹테이블을사용하여약하게혼합하면서실온에서수행하거나암실에서밤새 4 에서수행하였다. 컨쥬게이션효율을두가지방법을이용하여모니터링하였다 : (i) SDS-PAGE 분석을사용한세미-정량적인방법및 (ii) Dionex Corporation으로부터의 ProPac SEC-10 컬럼, 4x300mm 에의한분석용크기배제크로마토그래피 (SEC) 를사용한정량적인방법. 생성되는단백질-중합체컨쥬게이의정제를 GE Healthcare로부터의음이온교환 Q Sepharose HP (QHP) 컬럼을사용하여수행하였다. 일반적으로, 컨쥬게이션반응물 ( 약 1 mg 단백질을함유함 ) 을 20 mm Tris ph 7.5을함유하는 QHP 세척완충액으로약 4배희석시키고, 중력흐름으로 2ml QHP 컬럼상에로딩시켰다. 컬럼을 10 컬럼용적 (CV) 이상의세척완충액으로세척하였다. 컨쥬게이트의용리가 5CV 이상을위한 40-50mM NaCl을함유하는세척완충액으로컬럼을용리시킴으써달성되었다. 수집된분획을 10 kda MW 컷오프막을지닌 Amicon Ultrafree 농축기로농축시키고, 1xPBS ph 7.4 로완충액교환하고, 1mg/ml 이상의최종단백질농도로추가로농축시켰다. 최종컨쥬게이트를 0.22 마이크론필터로무균여과하고, 사용전에 4 에서저장하였다. 최종단백질농도는 1.08의도메인단백질흡광계수를지니는 OD280nm(10mm 통과길이큐벳 (cuvette) 내의 1mg/ml 용액 ) 을사용하여측정하였다. 이어서, 컨쥬게이트농도는단백질에추가로중합체의 MW를포함시킴으로써계산되었다. 단백질-중합체컨쥬게이트의특성화는하기검정으로수행하였다 : (i) 컨쥬게이트의 MW는 2996 광다이오드어레이검출기 (2996 Photodiode Array Detector) 및 Wyatt minidawn Treos 다중각도광산란검출기가장착된 Waters 2695 HPLC 시스템에의한 Shodex 806MHQ 컬럼을사용하여분석하였다. PDI 및 Mp는 Wyatt MALS 검출기과연결된 ASTRA 소프트웨어를사용하여계산하고, 데이터를상기표에나타낸다. 또한, 모든경우에, 컨쥬게이트의화학양론은단백질과중합체사이에 1 대 1인것으로나타났으며 ; (ii) 쿠마씨블루염료 (Coomassie Blue stain) 를사용한 SDS-PAGE 분석. 비-환원및환원조건둘모두하의고 MW 컨쥬게이트의존재및유리단백질의결핍은단백질이중합체에공유결합으로컨쥬게이트되는양호한지표를제공했다. 또한, 단백질과중합체사이의비-공유회합의징후가없었을뿐만아니라정제된단백질-중합체컨쥬게이트제조물내의분자간디설파이드결합매개된단백질응집의존재도없었다. 실시예 107. 알데히드기능화된 HEMA-PEG 중합체에대한재조합인간시토카인및재조합인간다중-도메인단백질의컨쥬게이션 kda의분자량을지닌 6-아암아지도기능화된 HEMA-PEG475 중합체를실시예 100에기재된과정에따라서제조하였다. 알데히드작용기를실시예 103에기재된과정에따라서 5-헥신-1-알을아지도작용기에결합시킴으로써도입되었다. 이러한중합체는하기차이가있으면서일반적으로각각실시예 105 및실시예 106에기재된과정에따라서 22 kda 재조합시토카인및 21 kda 재조합인간다중-도메인단백질에컨쥬게이트되었다. 암실

122 에서불황성조건하에실온에서밤새인큐베이션한후에, 반응물을 20 mm Tris ph 7.5의첨가에의해서켄칭시키고, 샘플을구배형성이가능한용매전달분자가구비된 Waters HPLC 시스템및크로마토그램흔적검출을위한 UV 검출기를사용하는약한음이온교환크로마토그래피를사용하여크로마토그래피하였다. 15μl의각각의샘플을 1ml/min의유량으로컬럼에가한다음, 5분완충액중등용매세척 (20 mm Tris ph 7.4) 을수행한후에, 9분에걸친 80% 완충액의선형구배 (0.5M NaCl를함유하는완충액 A) 에적용시켰다. 염구배는컬럼재생을위한 100% 완충액 A로다시감소시키기전에 2분동안 80% 에서유지시켰다. 크로마토그래피분리과정중에, OD220nm에의해서검출된단백질피크분획을 SDS-PAGE에의한추가의분석을위해서수작업으로수집하였다. 세개의주요피크가수집되었다. 첫번째피크는초기등용매세척액동안 1.8 내지 3분에서용리되었고, 이러한분획은중합체가컬럼을통해서전하중성으로흐른다는사실로인해서비컨쥬게이션된유리중합체와동등하고 ; 두번째피크는염구배에서의초기에용리되는약하게-결합된컨쥬게이트분획이였고 ; 구배에서나중에용리되는마지막피크는비컨쥬게이션된유리단백질에상응하였다. 3개의분획들을수집하여 10K MWCO 농축기가장착된 Amicon Ultrafree 4로농축시켰다. 농축된분획은상기참조된예에서기재된바와같이 SDS-PAGE 에이어진쿠마씨블루염료및 SEC-MALS에의해서추가로분석되었으며, 데이터가다음표에기재된다 : [0820] [0821] 실시예 108. N-2- 브로모이소부티릴 -β- 알라닌 t- 부틸에스테르의제조 [0822] [0823] 25 ml의디클로로메탄중의 1.92 g의 t-부틸-β-알아미네이트하이드로클로라이드의혼합물을빙수욕으로냉각시키고, 25 ml의 1N NaOH를첨가한다음, 2.53 g의 2-브로모이소부티릴브로마이드를첨가하였다. 반응물을 15분동안냉각상태에서교반하고, 이어서, 층을분리하고, 유기층을황산나트륨으로건조시켰다. 여과하고농축시켜오일을수득하고, 이를헥산중의 40% 에틸아세테이트에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피에가하 1 였다. 적절한분획을합하고, 농축시켜 2.78 g의요망되는생성물을등명한오일로서수득하였다. H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.47 (s, 9H, Boc), 1.94 (s, 6H, (CH 3 ) 2 CBr), 2.48 (t, 6H, J=6, CH 2 C=O), 3.50 (app q, 2H, J=6, CH 2 NH). [0824] 실시예 109. N-2- 브로모이소부티릴 -β- 알라닌 2-( 디페닐포스피노 ) 페닐에스테르의제조 [0825] [0826] 5 ml의포름산중의 2.78 g의 N-2-브로모이소부티릴-β- 알라닌 t-부틸에스테르의용액을실온에서밤새교반하였다. 이어서, 반응물을농축시켜오일을수득하였고, 이를 50 ml의에테르와 50 ml의물사이에분배시켰다. 유기층을황산나트륨으로건조시키고, 여과하고, 농축시켜 1.66 g의백색고형물을수득하였다. 이러한고형물을 20 ml의 a무수아세토니트릴에취하고, 1.94 g의 (2-히드록시페닐) 디페닐포스핀을첨가한다음, 200 mg의 DPTS 및 1.88 g의 DCC를첨가하였다반응물을실온에서 2 시간동안교반하였는데, 이때, tlc( 실시카겔, 헥산중의 50% 디클로로메탄 ) 에의해서반응이완료된것으로나타났다. 반응물을여과하고농축시켜오일을수득하고, 이를헥산중의 10 내지 20% 아세톤에의한실리카겔상의플래시크로마토그래피에가하여요망되는생성물 을점성오일로서수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ = 1.95 (s, 6H, (CH 3 ) 2 CBr), 2.55 (t, 2H, J=6,