J Physiol & Pathol Korean Med 29(4):322~329, 2015 엉겅퀴부위별열수추출물의항비만효과 윤홍화 조병옥 방숭주 심재석 1 장선일 * 전주대학교보건관리학과, 1 : 임실생약영농조합법인 Anti-Obesity Effects of Water Extracts from Different Organs of Cirsium japonicum var. ussuriense Hong Hua Yin, Byoung Ok Cho, Chong Zhou Fang, Jae-Suk Shim 1, Seon Il Jang* Department of Health & Science, Jeonju University, 1 : Imsil Herbal Medicine Association Cirsium japonicum var. ussuriense are often used in treatment of human diseases such as hemorrhage, blood congestion and inflammation in Korea. However, there was not report on the anti-obesity efficacy of water extracts from different organs of C. japonicum var. ussuriense. Here, we investigated the antioxidant effects of water extracts of flowers, leaves and roots from C. japonicum var. ussuriense. Total polyphenol amounts of the flower extract showed higher than those of leaf and root extract. Flower extract also showed the high antioxidant activities such as DPPH radical scavenging activity and reducing power. We also investigated the anti-obesity effects of water extracts of flowers, leaves and roots from C. japonicum var. ussuriense in 3T3-L1 cells and high fat diet-induced obesity mice. The mice were divided into four groups [high fat diet (HFD) control, HFD + leaf extract, HFD + flower extract and root extract] and administered with each extract (200 mg/kg) for 12 weeks. The flower and leaf extract significantly suppressed the levels of oil red O and triglyceride content. The flower and leaf extract also significantly reduced the triglyceride, total cholesterol and lower density lipoprotein levels of plasma as well as body and abdominal fat weight. Furthermore, oral glucose tolerance in the flower and leaf extract groups were significantly ameliorated in comparison to the high fat diet group. Therefore, these results indicate that the flower and leaf extract could ameliorate obesity and attenuate blood glucose level in high fat diet-induced obesity mice. We conclude that this study may provide positive insights into water extracts of flowers and leaves from C. japonicum var. ussuriense as a functional food ingredient for treatment of obesity. keywords : Cirsium japonicum var. ussuriense, Flowers, Leaves, Antioxidant, Anti-obesity 서론 비만은제 2형당뇨병을비롯한고혈압, 동맥경화, 암및심혈관계질환등대사성질환을유발할수있는주요요인으로현대인의건강을크게위협하고있다 1,2). 이러한비만을해결하기위해서는식욕억제, 영양물질의흡수저해, 에너지소비촉진및체내지방축적의억제등효과가있는물질의발굴이필요하다 3,4). 그러나일반적으로항비만약물을적용할경우두통과구토등을유발하는부작용이있기때문에다이어트시고려해야할사항으로남아있다 3). 이러한관점에서최근연구는안전성이확보된식물유래식용기능성물질들을활용한비만개선바이오활성소재물질발굴이활발히진행되고있다 5). 특히식물유래 polyphenol 중 flavonoid 계열의바이오활성물질은항산화뿐만아니라비만을개선하는데좋은효과가있는것으로알려져있다 5,6). Apigenin (4,5,7-trihydroxyflavone) 은식품을비롯한여러가지한방소재를비롯한엉겅퀴 (Cirsium japonicum var. ussuriense) 에함유된 yellow crystalline 바이오활성물질로최근비만에효과가있는것으로알려졌다. Apigenin은지방세포주인 3T3-L1 세포의분화를억제할뿐만아니라비만모델동물에서 nicotinamide adenine dinucleotide+ (NAD+) 를증가시켜 global protein acetylation을억제시켜비만을개선시키는효과가있다 7,8). 엉겅퀴 (Cirsium japonicum var. ussuriense) 는국화과 (Compositae) 에속하는다년생초본으로뿌리, 잎, 줄기및꽃부위를약용으로활용해왔다. 엉겅퀴의지상부인잎, 줄기및꽃등은 5-6월에채취하고뿌리는가을에채취하여건조시킨후열수또는주정 ( 알코올 ) 을활용하여추출한후토혈, 혈뇨, 대하, 간염및고혈압등치료에활용해왔다 9). 동의보감에의하면, 엉겅퀴의성질은평 ( 平 ) 하고맛은쓰며 [ 苦 ] 독이없고, 어혈이풀리게하고 * Corresponding author Seon IL Jang, Department of Health & Science, Jeonju University, 303 Cheonjam-ro, Wansan-gu, Jeonju-si, Jeollabuk-do, Korea E-mail : sonjjang@jj.ac.kr Tel : +82-63-220-3124 Received : 2015/06/12 Revised : 2015/07/15 Accepted : 2015/07/20 c The Korean Society of Oriental Pathology, The Physiological Society of Korean Medicine pissn 1738-7698 eissn 2288-2529 http://dx.doi.org/10.15188/kjopp.2015.08.29.4.322 Available online at http://society.kisti.re.kr/sv/sv_svjscj03l.do?method=list&poid=ksomp&kojic=drsrdh&svnc=v28n5&menuid=1&subid=13
H. H. Yin et al 323 피를토하고코피를흘리는것을멎게하며옹종과옴과버짐을낫게하고여자의적 백대하를낫게하고정 ( 精 ) 을보태주며혈을보하는효과가있다고하였다 10). 한방에서엉겅퀴뿌리는이뇨, 해독, 지혈및강장작용이있어서월경불순, 자궁근종, 빈혈, 요혈, 하혈등의치료에쓰이고있다. 또한엉겅퀴꽃을약용으로사용하는데, 꽃이누른것은황화지정 ( 黃花地丁 ) 이라하고꽃이자줏빛인것을자화지정 ( 紫花地丁 ) 이라하고이들은옹종을낫게한다고보고되어있다 11). 엉겅퀴의생리활성물질은 apigenin, luteolin, myricetin, kaempferol, pectolinarin, 5,7-dihydroxy-6,4'-dimethoxyflavone, hispidulin-7-neohesperidoside flavonoid 등 flavonoid 계열의화합물을함유하고있어항염증, 항암, 항돌연변이, 항진균, 신경보호및면역증진활성을가지고있다 11-15). 또한엉겅퀴추출물은지질과산화를억제하고 glutathione reductase의활성을증가시켜알코올성간질환을개선하고 11), 관절염을억제시키는효과가있는것으로알려졌다 16,17). 그러나엉겅퀴부위별추출물에대한항비만효과에대한연구보고는없는실정이다. 그러므로본연구는엉겅퀴부위별추출물의총폴리페놀함량을측정하고부위별추출물의항산화효과를검증한후에지방세포주인 3T3-L1 세포를대상으로지방생성억제를확인하고고지방사료투여에의한비만모델마우스를유도한후항비만효과를조사한결과흥미로운결과를얻었기에보고하고자한다. 재료및방법 1. 재료 1) 시약 Ascorbic acid, garlic acid, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), butylated hydroxyanisole (BHA), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox), dimethyl sulfoxide 및기타분석급시약은 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA) 로부터구입하였다. 지질분석과관련있는 AM 202-K, AM 203-KTC 및 AM 157S-K kit 등은아산제약 ( 서울, 대한민국 ) 에서구입하였다. 2) 엉겅퀴재료실험에사용한엉겅퀴부위소재는전라북도임실생약영농조합법인으로부터공급받았다. 건조된엉겅퀴뿌리, 잎, 꽃은각각 400 g으로정량하여증류수 4000 ml을주입하고 1시간끓인후얻어진추출물을 0.45 µm 필터를사용하여여과한다음동결건조기 (EYELA FDU-2100, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan) 에서건조하여분말형태로 35-38 g을회수하였다. 회수한추출물은 -20 C에서보관하면서실험에사용하였다. 3) 세포마우스배아에서유래한 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) 사로부터구입하여사용하였다. 전지방세포시기의 3T3-L1의배양은 10% FBS, 0.15% sodium bicarbonate와 1% penicillin-streptomycin이함 유된 DMEM 배지를사용하여 37 에서 5% CO 2 유지되는배양기에서배양하였으며, 지방세포분화를유도하기위해서전지방세포시기의배양액에 0.5 mm IBMX, 1 μm DEX 및 1 μm INS를첨가하여배양하면서실험에시용하였다. 4) 실험동물비만유도실험동물은무균환경에서사육된 4주령수컷 C57BL/6 마우스로중앙실험동물사 ( 서울, 대한민국 ) 로부터구입하였다. 일반고형사료 (Purina Lab. Rodent Chow(#38057), carbohydrates: 63.07%, fat: 12.41%, protein: 24.52%) 와물을자유롭게섭취하도록하였으며, 사육환경온도 23±3 C, 밤낮주기 (12시간) 가조절되는환경에서 1 주일간적응시킨후전주대학교실험동물위원회의실험규정에준하여실행하였다 (#JJU-IACUC-2014-04). 2. 방법 1) 총폴리페놀의측정총폴리페놀은 Mcdonal와 Prenzler의방법에따라서정량하여나타내었다 18). 엉겅퀴부위별추출물 0.5 ml 또는 garlic acid (standard polyphenolic compound) 를 0.2 M의 Folin-Ciocalteu reagent (5 ml) 와 1 M Na 2 CO 3 (4 ml) 을넣고잘혼합한뒤 15 분후흡광도 765 nm에서측정하였다. Standard curve는 garlic acid를사용하여 31.25-1000 µg/ml 농도로제조한후시료와동일한방법으로분석하여얻은표준검량선으로부터시료추출물의총폴리페놀함량을측정하였다. 2) DPPH 라디칼소거활성측정 DPPH 라디칼소거활성은 Blois 19) 의방법으로측정하였다. 엉겅퀴부위별추출물을 500 µg/ml으로정량하여증류수에녹여 96 well plate 에각시료를 100 µl를주입하고, 동시에 0.3 mm DPPH 100 µl를넣어실온에서 20분간반응시킨후 ELISA reader로 540 nm 파장에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거활성은시료용액의첨가군과무첨가군사이의흡광도의차이를백분율로나타내었다. DPPH 라디칼소거활성 (%)={1-( 첨가군흡광도 / 무첨가군흡광도 )}X100 3) ABTS 라디칼소거활성측정 ABTS 라디칼소거능은 Re 등 20) 의방법에의하여측정하였다. ABTS 7.4 mm과 potassium persulphate 2.6 mm을혼합한다음실온, 암소에서 24시간동안방치하여라디칼을형성한다음 ABTS 용액을실험직전에 732 nm에서흡광도가 0.70±0.03 ( 평균 ± 표준오차 ) 이되도록메탄올로희석하여사용하였다. 추출물의최종농도가 500 µg/ml 되도록정량하여 50 µl에준비된 ABTS 용액 950 µl를첨가하여암소에서 30분간반응시킨후 732 nm에서흡광도를측정하였다. ABTS의소거활성은시료용액의첨가군과무첨가군사이의흡광도의차이를백분율로나타내었다. ABTS 라디칼소거활성 (%)={1-( 첨가군흡광도 / 무첨가군흡광도 )}X100 4) 환원력측정환원력 (reducing power) 은 Oyaizu 21) 의방법을약간변형하여
324 H. H. Yin et al 측정하였다. 엉겅퀴부위별추출물을 500 µg/ml으로정량하여증류수에녹인후 0.2 M sodium phosphate buffer (ph 6.6) 500 µl를각각혼합하여 50 에서 20분간반응시킨후실온에서냉각하고 10% trichloroacetic acid 2.5 ml을가하였다. 위반응액을 1900 g 에서 10분간원심분리하여상층액 500 µl에증류수 500 µl, 1% ferric chloride 100 µl를가하여혼합한반응액의흡광도값을 700 nm에서측정하였다. 5) 3T3-L1 지방세포의 triglyceride 함량측정분화된 3T3-L1 지방세포는 well 당 1 10 4 개를 24 well plate 에접종하고 24시간후에엉겅퀴잎, 꽃과뿌리추출물을각각 200 μg/ml를처리하였으며, 참고약물대조군은 apigenin (10 μ g/ml) 을처리하고 72시간동안배양한후 PBS로세척하고 lysis buffer (1% Triton X-100/PBS) 를주입하였다. 세포에서총 triglyceride 함량은 triglyceride assay kit ( 아산제약, 서울, 대한민국 ). 단백질의농도는 Bio-Rad DC protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 를이용하여측정하였다. 6) Oil red O 염색 Oil red O 염색은 Ramírez-Zacarías 등 22) 의방법에따라수행하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포는 well 당 1 10 4 개를 24 well plate에접종하고 24시간후에엉겅퀴잎, 꽃과뿌리추출물을각각 200 μg/ml를처리하였으며, 참고약물대조군은 apigenin (10 μg/ml) 을처리하고 72시간동안배양한후 PBS로세척하고실온에서 20분간 10% 중성포르말린용액 (ph 7.2) 을주입하여고정하였다. 그후포르말린용액을제거하고 100% propylene glycol을 3 분동안각 well에넣고다시 60% propylene glycol을넣어세포의색소를탈색한다음 oil red O 용액을주입하여 1시간동안염색하였다. 그후세포외잔여 oil red O을제거하기위해서철저히세척한후세포내염색물을 well 당 1 ml의 isopropyl alcohol을넣어염색물을용출시켰다. 용출된염색액은 microplate readers (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland) 를이용하여 510 nm에서흡광도를측정하였다. 7) 고지방식이의한비만마우스모델제작고지방식이 (HFD) 와표준식이 (STD) 군의사료 (Table 1) 는 Research Diet Inc. (New brunswick, NJ, USA) 에서구입하여사용하였으며, 표준식이 (STD) 군을제외한실험군들은비만을유도하기위해고지방식이를 8주간급여하였다. 그후체중은 34-43 g과혈당은 120-140 mg/dl의마우스를선별하여실험군당 6마리를무작위로배정하였다. 실험수행과정은 Fig. 1과같다. 8) 실험군선정및추출물투여계획비만 C57BL/6 마우스를각실험군당 6마리씩나누고표준식이군 (normal control), 고지방식이군 (HF control, 45% fat calories), 고지방식이와엉겅퀴뿌리, 잎, 꽃추출물을투여하는군으로각각나누고고지방식이와 apigenin 투여군으로나누어 12 주간사육하였다. 엉겅퀴부위별추출물은각각 200 mg/kg/body weight로 2.5 ml/kg씩매일경구투여용존대를사용하여투여하였고 apigenin (10 mg/kg/body weight) 도같은방법으로경구투여하였다. 9) 체중, 공복혈당및내당능측정 체중은실험시작일에최초측정한다음 2 주간격으로실험 종료일까지 12 주까지측정하였고, 공복혈당 (fasting blood glucose) 측정은 2 주간격으로 12 주까지 12 시간이상마우스를금 식시킨후꼬리정맥혈액을채취하여혈당측정기 (Acuu-Check, Roche Diagnostics Korea Co., Ltd, Seoul, Korea) 를이용하여 측정하였다. 복강내당능 (intraperitoneal glucose tolerance test) 검사는실험종료 1 주전 12 시간금식시킨후포도당 (1 g/kg/body weight) 용액을복강에주사한후 0, 15, 30, 60, 120 분에마우스 꼬리혈액을채취하여측정하였다. Fig. 1. Schedule for treatment of mice in the experiment. Mice were administration with only high fat diet (HFD) and then divided to 4 groups such as HFD control, HFD + leaf extract, HFD + flower extract and root extract and administered with each extract (200 mg/kg) for 12 weeks. Intraperitoneal glucose tolerance test IPGTT) was performed at 11 weeks. The serum collection was performed at the last week before sacrificing mice. Table 1. Ingredient and chemical composition of diets Ingredient Experimental groups 1) STD (g) HFD (g) Casein 200 200 L-Cystine 3 3 Corn starch 315 0 Maltodextrin 10 35 125 Sucrose 350 68.8 Cellulose 50 50 Soybean oil 25 25 Lard 20 245 Mineral mix S10026 10 10 Dicalcium phosphate 13 13 Calcium carbonate 5.5 5.5 Potassium citrate 16.5 16.5 Vitamin mix V10001 10 10 Choline bitartrate 2 2 Gm% Gm% Protein 19.2 26.2 Carbohydrate 67.3 26.3 Fat 4.3 34.9 Kcal/gram 3.85 5.24 1) STD (standard diet with 10% fat calories); HFD (high fat diet with 45% fat calories). 10) 혈청채취 12 주간추출물투여후 12 시간금식시킨후, 에테르마취를 하고심장에서혈액을채취한후채취한혈액은 2500 rpm 에서 15 분간원심분리하여혈청을분리하였으며혈청의생화학적분석전 까지 -70 C 에보관하였다. 11) 혈중지질농도분석 혈청지질농도 (lipid profile) 분석을위해측정용 kit (AM
H. H. Yin et al 325 202-K, AM 203-KTC, AM 157S-K) 로 TC (total cholesterol), HDL (high density cholesterol), LDL (low density cholesterol) 및 TG (triglyceride) 을측정하였다. LDL 함량은 Friedewald 등 23) 의공식에의해 { 총콜레스테롤 HDL콜레스테롤-(TG/5)} 으로계산하였다. 임상진단에서순환계와관련한진단지수인동맥경화지수 (atherogenic index, AI) 는 (total cholesterol-hdl cholesterol)/hdl cholesterol 식 23) 으로계산하고, 심장위험지수 (cardiac risk factor, CRF) 는 total cholesterol/ HDL cholesterol 공식 23) 에의하여산출하였다. 12) 통계처리모든실험값은평균 ± 표준편차 (mean±sd) 로표시했으며, 통계분석은 ANOVA와 Student s t-test로처리하였으며, 유의성한계는 p<0.05로정하였다. 0.315 (O.D.) 로현저히억제되었으며 (p<0.001), 엉겅퀴잎추출물도각각 66.7% 와 0.53 (O.D.) 로유의하게억제되었다 (p<0.05). 그러나엉겅퀴뿌리추출물의경우 oil red O 염색상과함량및중성지방의변화에영양을미치지못하였다. 특히엉겅퀴꽃추출물의 oil red O 및중성지방의함량은참고약물인 apigenin ( 각각 49.3% 와 0.43 O.D.) 보다억제하는효과가우수하였다. 결 과 1. 엉겅퀴부위별추출물의총폴리페놀및항산화효과 엉겅퀴부위별추출물의총폴리페놀함량은꽃, 잎및뿌리 추출물이각각 6,758±15, 4,933±14, 708±14 로꽃추출물이가장 높았다 (Table 2). 또한 DPPH 와환원력은꽃추출물이각각 75.9±1.1% 와 0.51±0.01(O.D.) 로다른부위추출물보다그활성 이높았으며, 잎추출물은 ABTS 라디칼소거능이 61.7±0.6% 로 가장높은활성을보였다. 본연구에서사용된엉겅퀴부위별추출 물은참고약물로사용된모든물질에비해서그활성이낮았지만, 꽃추출물의 DPPH 라디칼소거활성은다른부위에비해서매우 높은활성을보였으며, ABTS 라디칼소거활성은잎추출물이가 장높았다. Table 2. Total polyphenol contents and antioxidant effects of water extracts from different organs of C. japonicum var. ussuriense Extract 1) or Total polyphenol Radical scavenging activity (%) Reducing compound 2) (mg/100 g GAE) DPPH ABTS power (O.D.) Flowers 6758±15 75.9±1.1 48.2±0.1 0.51±0.01 Leaves 4933±14 52.5±1.5 61.7±0.6 0.04±0.01 Roots 708±14 17.5±1.1 11.1±0.2 0.1±0.01 BHT - 89.2±0.5 - - Trolox - - 94.6±0.2 - Ascorbic acid - - - 1.35±0.01 1) The extracts of the flowers, leaves and roots from C. japonicum var. ussuriense was prepared by extracting with water. 2) Reference compound: BHT (butylated hydroxyanisole), Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman- 2-carboxylic acid), Ascorbic acid. 2. 엉겅퀴부위별추출물의 3T3-L1 세포지방함량억제효과 엉겅퀴부위별추출물이지방세포의지방함량을억제하는지 알아보기위하여마우스유래지방세포주인 3T3-L1 세포를활용하 여조사하였다. 먼저 3T3-L1 지방세포에엉겅퀴부위별추출물을 각각 200 μg/ml 을처리하고 72 시간후에 oil red O 로염색한결 과 Fig. 2A 와같이엉겅퀴꽃추출물은대조군은물론다른부위 추출물에비해서현저히 oil red O 염색상이현저히줄어는효과 가있었다. 다음은 oil red O 함량과중성지방함량을조사한결과 (Fig. 2B 와 C) 대조군에비해서엉겅퀴꽃추출물은각각 29.8% 와 Fig. 2. Effect of water extracts from different organs of C. japonicum var. ussuriense on the inhibition of oil red O content and intracellular triglyceride production in 3T3-L1 adipocytes. Cells were treated with 200 μg/ml flower, leaf or root extract for 72 h. (A) oil red O staining, (B) oil red O contents and (C) Triglyceride contents. Data are presented as the means±s.d. of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 vs. control. Fig. 3. Effect of water extracts from different organs of C. japonicum var. ussuriense on the inhibition of body weight in C57BL/6 obesity mice. Mice were administrated with standard (normal) diet (10% fat calories) or HF diet (45% fat calories) for 8 weeks and then divided to 6 groups such as Normal, HF, HF+Extract (flowers, leaves or roots) or HF+Apigenin. (A) Body weight for 12 weeks and (B) increasing body weight for 12 weeks. Data are presented as the means±s.d. of n=6 mice. #p<0.001 vs. normal group. *p<0.05 and **p<0.01 vs. control. 3. 엉겅퀴부위별추출물의체중감소에미치는효과 다음은엉겅퀴부위별추출물이비만유도 C57BL/6 마우스의 체중감소에미치는효과를알아보기위하여엉겅퀴부위별추출물
326 H. H. Yin et al 을투여하기전 8주간은모두고지방사료를투여하여비만을유도한후 12주간체중의변화를조사하였다. 대조군은비만유도후 12주간고지방사료를투여하였고, 실험군은고지방사료와엉겅퀴부위별추출물 ( 각각 200 mg/kg) 또는참고약물인 apigenin (10 mg/kg) 을 1일당 1회경구투여하고 2주간격으로체중을측정하였다. 그결과 Fig. 3와같이일반사료투여정상군에비해서고지방투여대조군은현저히체중의증가를보였다 (p<0.001). 그러나고지방사료투여대조군에비해서엉겅퀴뿌리추출물은체중감소에효과는없었지만, 꽃과잎추출물은체중감량이유의한효과가있었다 (p<0.01과 p<0.05). 특히엉겅퀴꽃추출물은잎과 apigenin 투여군보다더체중감량의효과가있었다. 물은잎과 apigenin 투여군보다더체중감량의효과가있었다. 더불어복부지방의감소도엉겅퀴꽃추출물은잎과 apigenin 투여군보다더체중감량의효과가있었다 (Fig. 4B). 5. 엉겅퀴부위별추출물의혈중지방감소에미치는효과엉겅퀴부위별추출물이비만유도 C57BL/6 마우스의혈중지방감소에미치는효과를알아보기위하여 8주간은모두고지방사료를투여하여비만을유도한다음엉겅퀴부위별추출물을 12 주간투여한후혈액을심장으로부터채취하여혈청에서중성지방, 콜레스테롤과고밀도지방 (high density lipoprotein, HDL) 과저밀도지방 (low density lipoprotein, LDL) 을측정하였다. 그결과 Fig. 5와같이일반사료투여정상군에비해서고지방투여대조군은중성지방을비롯한모든지방관련지표가현저히상승하였다. 그러나고지방사료투여대조군에비해서엉겅퀴뿌리추출물은복부지방감소에효과는없었지만, 꽃과잎추출물은중성지방과총콜레스테롤및 LDL이유의하게감소되었다 (Fig. 5A, B와 D). HDL 의경우엉겅퀴부위별추출물과 apigenin 투여군은모두대조군에비해서상승하는효과가있었다 (Fig. 5C). 이러한이유는고지방식이로인한결과로사료된다. Fig. 4. Effect of water extracts from different organs of C. japonicum var. ussuriense on the inhibition of abdominal fat in C57BL/6 obesity mice administrated with high fat (HF) diet. Mice were administrated with standard (normal) diet (10% fat calories) or HF diet (45% fat calories) for 8 weeks and then divided to 6 groups such as Normal, HF, HF+Extract (flowers, leaves or roots) or HF+Apigenin. (A) Morphology of abdominal fat at 12 weeks and (B) weight of abdominal fat at 12 weeks. Data are presented as the means±s.d. of n=6 mice. #p<0.001 vs. normal group. *p<0.05 and **p<0.01 vs. control. 4. 엉겅퀴부위별추출물의복부지방감소에미치는효과엉겅퀴부위별추출물이비만유도 C57BL/6 마우스의복부지방감소에미치는효과를알아보기위하여 8주간은모두고지방사료를투여하여비만을유도한다음엉겅퀴부위별추출물을 12주간투여한후복부지방을측정하였다. 대조군은비만유도후 12주간고지방사료를투여하였고, 실험군은고지방사료와엉겅퀴부위별추출물 ( 각각 200 mg/kg) 또는참고약물인 apigenin (10 mg/kg) 을 1일당 1회경구투여하고최종 12주에복부지방을측정하였다. 그결과 Fig. 4와같이일반사료투여정상군에비해서고지방투여대조군은현저히복부지방의증가를보였다 (p<0.001). 그러나고지방사료투여대조군에비해서엉겅퀴뿌리추출물은복부지방감소에효과는없었지만, 꽃과잎추출물은복부지방감량이유의한효과가있었다 (p<0.01과 p<0.05). 특히엉겅퀴꽃추출 Fig. 5. Effects of water extracts from different organs of C. japonicum var. ussuriense on the serum lipid profile in C57BL/6 obesity mice. Mice were administrated with standard (normal) diet (10% fat calories) or HF diet (45% fat calories) for 8 weeks and then divided to 6 groups such as Normal, HF, HF+Extract (flowers, leaves or roots) or HF+Apigenin. (A) Triglyceride, (B) Total cholesterol, (C) HDL cholesterol and (D) LDL cholesterol. LDL cholesterol=[total cholesterol-hdl cholesterol- (triglyceride/5)] Data are presented as the means±s.d. of n=6 mice. #p<0.001 vs. normal group. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 vs. control. 6. 엉겅퀴부위별추출물의동맥경화및심장위험지수에미치는 영향 본연구는엉겅퀴부위별추출물이혈청의동맥경화지수및
H. H. Yin et al 327 심혈관위험지수에미치는영향을알아보았다. 그결과 Table 3 과 같이동맥경화지수와심혈관위험지수는정상군이 0.31±0.02 와 0.73±0.03 인데비해서대조군은 1.62±0.23 과 2.55±0.21 으로현저 히증가하였다 (p<0.001). 그러나엉겅퀴꽃추출물과잎추출물은 대조군에비해서유의하게감소되는효과가있었다. 이러한결과는 비만에의한심혈관계질환의위험도판정에이용되는동맥경화지 수와심혈관위험지수가엉겅퀴꽃추출물과잎추출물의투여에따 라체내의지질대사를개선하여심혈관계질환의위험을감소시키 는데효과가있는것으로사료된다. Table 3. Effects of water extracts from different organs of C. japonicum var. ussuriense on atherogenic index (AI) and cardiac risk factor (CRF) in C57BL/6 obesity mice Groups Atherogenic index Cardiac risk factor Normal 0.31±0.02 0.73±0.03 Control 1.62±0.23# 2.55±0.21 # Flower extract 0.49±0.19** 1.50±0.18** Leaf extract 0.42±0.18** 1.43±0.17** Root extract 0.77±0.21* 1.84±0.19 Apigenin 0.41±0.15** 1.22±0.14** Fig. 6. Effects of water extracts from different organs of C. japonicum var. ussuriense on the inhibition of fasting blood glucose and oral glucose tolerance test in C57BL/6 obesity mice. Mice were administrated with standard (normal) diet (10% fat calories) or HF diet (45% fat calories) for 8 weeks and then divided to 6 groups such as Normal, HF, HF+Extract (flowers, leaves or roots) or HF+Apigenin. (A) Fasting blood glucose contents for 12 weeks per 2 weeks and (B) Fasting blood glucose contents at 12 weeks on oral glucose tolerance test. Data are presented as the means±s.d. of n=6 mice. #p<0.001 vs. normal group. *p<0.05, **p<0.01 and **p<0.01 vs. control. 7. 엉겅퀴부위별추출물의혈당감소에미치는효과 엉겅퀴부위별추출물이비만유도 C57BL/6 마우스의혈당감 소에미치는효과를알아보기위하여 8 주간은모두고지방사료를 투여하여비만을유도한후꼬리정맥으로부터혈당을측정하여 120~140 mg/dl 범위의마우스를선별하여실험군당 6 마리씩배 정하여엉겅퀴부위별추출물을 12 주간투여하면서 2 주간격으로 꼬리정맥으로부터혈당을측정하였다. 그결과 Fig. 6A 와같이대 조군을비롯한엉겅퀴추출물과 apigenin 은최초혈당수치보다 시간이지날수록높았으나, 그룹간큰차이를볼수없었다. 그러 므로본연구는엉겅퀴부위별내당능에미치는영향을알아보기 위하여실험최종일에내당능검사를하였다. 그결과 Fig. 6B 와 같이 glucose 를투여한후 15 분후에대조군에비해서엉겅퀴부 위별추출물투여군은유의하게혈당강하효과가있었다. 엉겅퀴꽃추출물은 15분에서부터 30분까지 apigenin과유사하였으나, 시간이경과할수록 apigenin 보다혈당강하효과가우수하였다. 또한엉겅퀴잎추출은 15분에는 apigenin 보다혈당강하효과가낮았지만, 시간이지날수록 apigenin과유사한혈당강하효과가있었다. 그러나엉겅퀴뿌리추출물은 15분에엉겅퀴잎과같은혈당강하가있었을지라도시간이경과할수록엉겅퀴꽃추출물은물론엉겅퀴잎추출물보다혈당강하효과가낮았다. 고찰 현재대표적으로항비만용으로활용되고있는치료제는췌장지방분해효소 (pancreatic lipase) 을억제함으로써내장지방을감소시키는 orlistat (Xenical) 24) 와식욕을억제시키는 sibutramine (Reductil) 25) 가알려졌다. 그러나이들약물은혈압의상승, 갈증, 두통, 변비및불면증등심한부작용이동반될수있어문제점을안고있다 26). 그러므로부작용이없고안전성이확보된비만개선에대한천연물소재를대상으로연구가활발히진행되고있다 3,5). 본연구는이러한관점에서전통적으로한방에서사용하고있는엉겅퀴부위별추출물을대상으로비만개선효과가있는것으로알려진식물유래 apigenin과항비만효과를조사하였다. 먼저본연구는엉겅퀴부위별추출물을대상으로총폴리페놀함량을조사한결과엉겅퀴꽃추출물 (6758±15 mg/100 g) 은잎과뿌리추출물에비해서각각 1.36배와 9.54배로가장높았다 (Table 1). 또한엉겅퀴추출물은 DPPH 라디칼소거활성과환원력도다른부위보다항산화활성이높았다. 그러나 ABTS 라디칼소거활성은잎추출물이 61.7±0.6% 로꽃추출물 (48.2±0.1%) 보다높았다. 일반적으로식품을비롯한한방에서사용하고있는약용식물은폴리페놀계화합물을포함하고있는데, 이계열의물질은항산화활성작용이있다. 인체에서비만으로야기되는당뇨병을비롯한심혈관계질환은염증을동반하는데, 염증반응이진행되면필연적으로 ROS (reactive oxygen species) 와 RNS (reactive nitrogen species) 를대량생성됨으로써정상조직을손상시키는것으로알려져있다 27). 그러므로본연구결과엉겅퀴꽃과잎의항산화활성은비만으로야기될수있는조직손상을개선시키는데효과적으로활용될수있을것이라사료된다. 다음은본연구결과에서는보여주지않았지만, 엉겅퀴부위별추출물의농도를 50-500 μg/ml까지 24시간처리한결과세포독성이없음을확인한후 3T3세포의지방함량농도를정하여실험하였다. 엉겅퀴부위별추출물이마우스비만세포주인 3T3-L1 세포에서 oil red O와 triglyceride 함량에미치는영향을조사한결과꽃추출물은대조군에비해서각각 68% 와 57% 를감소시키는효과로잎과뿌리추출물보다우수한지방생성억제효과를보였다. 특히엉겅퀴꽃추출물은참고약물로사용한 apigenin 보다 oil red O와 triglyceride 함량이각각 18% 와 10% 높은감소효과를보여주었다. Apigenin은식품을비롯한한방에서활용하고있는약용식물에함유되어있는 flavonoid계천연물질로항산화를비롯한항암, 항염증및항비만작용이있는것으로잘알려졌다 3,5).
328 H. H. Yin et al 최근에팔꽃나무 (Daphne genkwa) 를비롯한엉겅퀴꽃으로부터분리한 apigenin을활용하여바이오활성에대한연구가진행되고있다 8,28). Apigenin은 p53과 RelA-p65의 acetylation 뿐만아니라 global protein acetylation를감소시키는생화학적신호전달을억제시킴으로써비만을개선시키는효과가있고, 주요조절표적분자가 CD38로알려져있다 8). 이와같이엉겅퀴꽃추출물은 apigenin을비롯한바이오활성물질이함유되어지방생성을억제하는것으로추정된다. 그다음은엉겅퀴부위별추출물이고지방사료투여에의한비만모델마우스에서체중및복부지방감량에효과가있는지알아보았다. 본연구는고지방사료를 8주간투여한후비만을유도한후엉겅퀴부위별추출물을 12주간투여한후비만개선에대한효과를확인하였다. 그결과엉겅퀴꽃추출물과잎추출물은체중및복부지방감소에유의한효과가있음을알수있었다. 12 주간의체중변화에서 0주에군별체중차이를보였는데이는 8주간의고지방식이투여로인하여생긴개체차이로사료된다. 또한엉겅퀴꽃추출물과잎추출물은고지방사료에의해증가된중성지방과총콜레스테롤및 LDL의함량을유의하게억제시키는효과가있었다. 동맥경화지수는임상에서 3.0 이상의값을나타냈을때동맥경화의위험신호로사용되고있다 23). 본연구에서고지방사료 (45% fat 함유 ) 를투여한결과대조군의동맥경화지수가 3.0에는미치지못하였지만 1.62로정상군 (0.32) 에비해서 5배이상의수치를보였다. 그러나엉겅퀴꽃추출물과잎추출물을투여한실험군은대조군에비해서유의하게감소되는효과를보였다. 또한심혈관위험지수역시대조군에비해엉겅퀴꽃추출물과잎추출물을투여한실험군은현저히억제되는효과를보였다. 마지막으로비만은제 2형당뇨병을유발할수있기때문에실험기간동안 2주간격으로혈당을조사하였다. 엉겅퀴부위별추출물은대조군에비해서공복혈당을감소시키는경향이있었으나유의한차이가없었다. 그러나 11주에내당능을검사한결과엉겅퀴부위별추출물은혈당강하에대한유의한효과가있음을검증하였다 (Fig. 6). 특히엉겅퀴꽃추출물은내당능검사전시간에걸쳐혈당강하효과가참고약물인 apigenin과유사하거나높았다. 비만은제 2형당뇨병, 고혈압, 골관절및심혈관계질환을유발할수있는주요요인으로 WHO는 1992년부터질환으로규정할정도로전세계에서현대인의건강을위협하는요소로인식하고있다 1-5). 그러므로비만을치료할수있는약물개발에대한연구가활발히진행되고있다. 그러나현재까지부작용이없고안전성이확보된치료약은없는실정으로비만을개선시킬수있는천연물을대상으로연구가활발히전개되고있다. 엉겅퀴는모든부위를식용과약용으로사용할수있는한국식품의약안전처의공시된소재로본연구는엉겅퀴꽃, 잎과뿌리를대상으로열수추출하여비만을개선할수있는지여부를조사하였다. 그결과엉겅퀴꽃과잎추출물은항산화효과는물론체지방감소에우수한효과가있는소재임을밝혔다. 더욱이엉겅퀴꽃과잎추출물은혈당을강하시킬수있는좋은소재임을검증하였다. 그러므로엉겅퀴꽃과잎추출물은비만을개선하고비만과관련된대사성질환을개선하는데유용하게사용할수있는소재라사료된다. 결론 본연구는엉겅퀴부위별열수추출물을대상으로항산화효과를검증한결과엉겅퀴꽃추출물은엉겅퀴잎과뿌리추출물에비해서총폴리페놀함량과 DPPH 라디칼소거활성및환원력이가장우수하였다. 그러나 ABTS 라다칼소거활성은엉겅퀴꽃추출물에비해서엉겅퀴잎추출물이높았다. 엉겅퀴부위별열수추출물을대상으로 3T3 지방세포에서 oil red O와중성지방생성능을조사한결과엉겅퀴꽃추출물이가장우수한억제효과를보였다. 이러한연구결과를바탕으로엉겅퀴부위별추출물이고지방사료로유도된비만모델동물에서체지방감소에어떠한영향을미치는지조사한결과엉겅퀴꽃추출물과잎추출물은체중과복부지방중량뿐만아니라중성지방, 총콜레스테롤및 LDL를현저히억제시키는효과가있었다. 더불어엉겅퀴꽃추출물과잎추출물은 HDL 함량을유의하게증가시켜동맥경화지수와심혈관위험지수를억제시키는효과가있었다. 더욱이엉겅퀴꽃추출물과잎추출물은비만모델동물에서당부화에의한혈당을효과적으로억제하는효과가있었다. 그러므로본연구결과는엉겅퀴꽃추출물과잎추출물이고지방사료로유도된비만모델동물에서비만과혈당을개선시킬수있음을제시했다. 이상의결과를종합해볼때엉겅퀴꽃추출물과잎추출물은비만치료를위한기능성소재로서활용할수있을것이라사료된다. 감사의글 본논문은중소기업청에서지원하는 2014년도산학연협력기술개발사업 (C0187369) 의연구수행으로인한결과물임을밝힙니다. References 1. Calle, E.E., Rodriguez, C., Walker-Thurmond, K., Thun, M.J. Overweight, obesity, and mortality from cancer in a prospectively studied cohort of U.S. adults. The New England Journal of Medicine 348(17):1625-1638, 2003. 2. Kannel, W.B., Cupples, L.A., Ramaswami, R., Stokes, J., Kreger, B.E., Higgins, M. Regional obesity and risk of cardiovascular disease; the Framingham Study. Journal of Clinical Epidemiology 44(2):183-190, 1991. 3. Bray, G.A., Tartaglia, L.A. Medicinal strategies in the treatment of obesity. Nature 404(6778):672-677, 2000. 4. Wang, C., Wang, L., Yang, Z. Role of protein tyrosine phosphatase 1B in the type 2 diabetes and obesity. Yi Chuan 26(6):941-946, 2004. 5. González-Castejón, M., Rodriguez-Casado, A. Dietary phytochemicals and their potential effects on obesity: A review. Pharmacological Research 64(5):438-455, 2011. 6. Yun, J.W. Possible anti-obesity therapeutics from nature A review. Phytochemistry 71(14-15):1625-1641, 2010.
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