(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) G01N 33/50 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) (52) CPC 특허분류 G01N 33/5011 (2013.01) G01N 33/68 (2013.01) (21) 출원번호 10-2016-0026187 (22) 출원일자 2016 년 03 월 04 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 EP2868326 A1 JP2011501741 A US8119366 B2 2016 년 03 월 04 일 Cancer Biology & Therapy 14:5, 390-398; May 2013 (45) 공고일자 2016년07월25일 (11) 등록번호 10-1642264 (24) 등록일자 2016년07월19일 (73) 특허권자 서울시립대학교산학협력단 서울특별시동대문구서울시립대로 163 ( 전농동, 서울시립대학교 ) (72) 발명자 조익훈 서울특별시서초구반포대로 275, 122 동 1501 호 김완태 서울특별시중랑구용마산로 669, 109 동 1507 호 김영은 서울특별시동대문구답십리로 45 가길 8 (74) 대리인 이원희 전체청구항수 : 총 8 항심사관 : 기광용 (54) 발명의명칭 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 2 단백질의결합억제제를스크리닝하는방법 (57) 요약 본발명은 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 2 단백질의결합억제제를스크리닝하는방법에관한것으로, 구체적으로 MAML(mastermind-like)1 또는 2 가 YAP 또는 TAZ 와결합하고, MAML1/2 의발현을억제하였을때, YAP 또는 TAZ 의전사활성이억제되며, TAZ 의 WW domain 및 MAML1/2 의 PPxY 서열이상호간의결합에중요한역할을함을확인하고, MAML1 의발현을억제하였을때, YAP 의핵내이동이억제되고, 세포의이동이억제됨을확인함으로써, 본발명의스크리닝방법을통한 YAP/TAZ 와 MAML1/2 의결합을억제할수있는억제제는 YAP/TAZ 의핵으로의이동을막아, 암의형성을억제하는데유용하게사용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -
(52) CPC 특허분류 G01N 2500/02 (2013.01) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 2011-0019353 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/2 미래창조과학부 한국연구재단 바이오ㆍ의료기술개발사업 줄기세포조절에관여하는 niche 신호전달체계규명및세포치료기술개발 주관기관 서울시립대학교 연구기간 2011.06.01 ~ 2016.05.31 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 1420060 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/2 보건복지부 국립암센터 암정복추진연구개발사업 Hippo 신호전달의조절에의한암치료기술의개발 주관기관 서울시립대학교 연구기간 2014.05.01 ~ 2017.04.30-2 -
명세서청구범위청구항 1 1) YAP 및 TAZ로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질및 MAML1 및 MAML2로구성된어느하나이상의단백질을발현하는세포에피검물질을처리하는단계 ; 및 2) 상기단계 1) 의세포에서 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합을감소시키거나, MAML1 또는 MAML2에의해매개되는 YAP 또는 TAZ의핵내이동을억제시키는피검물질을식별하는단계를포함하는암치료후보물질스크리닝방법. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기 YAP 단백질은서열번호 1, TAZ 단백질은서열번호 2, MAML1 은서열번호 3, MAML2 는서열 번호 4 의아미노산서열을갖는것을특징으로하는암치료후보물질스크리닝방법. 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기단계 2) 의 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합은 YAP 또는 TAZ 의 WW 도메인 (W 는트립토판 ) 에의해매개되는것을특징으로하는암치료후보물질스크리닝방법. 청구항 4 제 1항에있어서, 상기단계 2) 의 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합은 MAML 1 또는 MAML2의 PPxY 모티프 (P는프롤린, x는임의의아미노산, Y는타이로신 ) 에의해매개되는것을특징으로하는암치료후보물질스크리닝방법. 청구항 5 제 1항에있어서, 상기단계 2) 의식별은웨스턴블롯 (western blot), 면역침강법 (immunoprecipitation assay), 근접접합분석법 (proximity ligation assay), 이중루시퍼라제측정법 (dual luciferase reporter assay), 또는면역형광법 (immino-fluorescence) 에의해실시되는것을특징으로하는암치료후보물질스크리닝방법. 청구항 6 제 1 항에있어서, 상기암은대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암및췌장암으로구성된군으로부터선택되는것을특징으로하는암치료후보물질스크리닝방법. 청구항 7 1) YAP 또는 TAZ로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질및 MAML1 또는 MAML2로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질에피검물질을처리하는단계 ; 및 2) 상기단계 1) 에서 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합을감소시키는피검물질을식별하는단계를포함하는암치료후보물질스크리닝방법. - 3 -
청구항 8 1) 피검시료로부터 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합수준을측정하는단계 ; 2) 상기단계 1) 의결합수준을정상대조군시료와비교하는단계를포함하는암의발병소인을갖는개체진단의정보를제공하기위한단백질간결합수준측정방법. 발명의설명 [0001] 기술분야 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 2 단백질의결합억제제를스크리닝하는방법에관한것으로, 상기스크리닝 방법을통해 YAP 또는 TAZ 의핵으로의이동을막아, 암의형성을억제하는억제제를개발할수있다. [0003] [0004] [0005] [0006] [0008] [0010] 배경기술개체의크기, 심장, 또는간의크기를조절하는세포신호전달기전은잘알려져있지않다. 비교적최근에밝혀진 Hippo 신호전달이개체의크기를조절하는기초연구로시작되었지만최근에는암의형성및진행과의관련성이밝혀지면서기초및임상에서많은연구가이루어지고있다 (Kim and Jho, 2014). Hippo 신호전달에관련된연구결과가최고수준의저널 (journal) 에발표된다는사실은이분야의연구가세계적인관심을받고있다는것을나타낸다. Hippo 신호전달은초파리와사람을포함한포유류에서진화적으로보존된경로로서초파리가갖고있는단백질의유사체가포유류에서도발견되었고기능적으로도유사함이확인되었다. Hippo 신호전달은초파리에서이유전자에돌연변이가생겼을때나타나는표현형이하마 (Hippopotamus) 를닮아서 Hippo 라는이름이붙여진것으로, 이의포유류의유전자인 Mst1/2 유전자가결실되었을때, 간의크기가커지는것이관찰됨으로써, Hippo 신호전달이개체내의기관의크기를결정하는역할을한다는것이밝혀졌다 (Halder and Johnson, 2011). 일반적으로 Hippo 신호전달은세포밀도 (cell density) 에따라조절이되는데 (Kim and Jho, 2014), 세포밀도가낮은경우에는 Wnt 신호전달에서 β-catenin과비슷한역할을하는 YAP(Yes-associated protein) 또는 TAZ(WW domain-containing transcription regulator protein 1, WWTR1) 단백질이핵내로들어가서전사인자인 TEAD와결합하여세포사멸 (apoptosis) 을억제하거나, 세포증식 (cell proliferation) 에관련된유전자의발현을촉진함으로써, 세포의지속적인성장을가능하게한다. 최근, YAP 또는 TAZ의발현수준이암세포에서증가되어있음이밝혀져서, 암의형성과 Hippo 신호전달의연관성이밝혀지기시작하였다. 하지만, 세포밀도가높은경우, 아직까지정확하게밝혀지지않은상위신호 (upstream signal) 에의해 Kibra나 NF2와같은단백질이활성화되고, 이로인해활성화된 Mst1/2가결합하고있는 Salvador(SAV) 와하위단계 (downstream) 키나아제 (kinase) 인 Lats1/2를인산화시키게되며, 활성화된 Lats1/2는 YAP/TAZ를인산화시키고, 인산화된 YAP/TAZ는 14-3-3이라는단백질과결합하여세포질 (cytoplasm) 에유지 (retention) 되며, 이는프로테아좀분해경로 (proteasomal degradation pathway) 에의해분해된다. 결과적으로세포사멸을촉진하거나세포증식에관련된유전자의발현이억제되어세포의성장이멈추게된다. 따라서, YAP/TAZ의핵내의발현수준이세포의성장조절및암의형성과밀접한관계가있음을알수있다. 핵내로이동하는단백질에는핵위치시그널 (Nuclear localization signal; NLS) 이라는펩티드시그널 (peptide signal) 을갖고있는데, YAP/TAZ의경우는 NLS가없어서어떤방법으로핵내로들어가는지알려진바가없다. 한가지가능성은 NLS가있는다른단백질과결합하여함께핵내로이동하는것인데, 암의형성에긴밀한역할을한다고알려진 Wnt 신호전달의경우도 NLS가없는 β-catenin이 FoxM1 이라는단백질과결합하여핵내로이동한다는것이알려져있다 (Zhang et al. 2011). YAP/TAZ의암형성과관련한선행연구로서, W. Hong 등은암과밀접한관련이있는 Hippo pathway의중요한두개의전사활성인자로알려져있는 YAP 및 TAZ에관한연구내용을개시하였고 (Seminars in Cell & Developmental Biology 23 (2012) 785-793), Chunling Yi 등은 Angiomotin의 p130 isoform(amot-p130) 이 YAP- 매개의간상피세포증식및종양발생에역할을함을개시하였으나 (Sci. Signal. 6, ra77 (2013)), YAP/TAZ이어떻게핵내로이동하는지에대하여는현재까지알려진바가없다. 이에, 본발명자들은 YAP/TAZ가핵내로이동하는기전을밝히고자노력하던중, MAML(mastermind-like)1 또는 - 4 -
2가 YAP 또는 TAZ와결합하고, MAML1/2의발현을억제하였을때, YAP 또는 TAZ의전사활성이억제되며, TAZ의 WW domain 및 MAML1/2의 PPxY 서열이상호간의결합에중요한역할을하는것을확인하고, MAML1의발현을억제하였을때, YAP의핵내이동이억제되고, 세포의이동이억제됨을확인함으로써, 이를통해 YAP/TAZ와 MAML1/2 의결합을타깃으로하여상기결합을억제할수있는억제제를개발한다면, YAP/TAZ에의해유도되는암의치료에유용하게사용될수있음을밝힘으로써, 본발명을완성하였다. 발명의내용 [0012] 해결하려는과제 본발명의목적은 YAP/TAZ 의핵으로의이동을막는 YAP/TAZ 와 MAML1/2 의결합억제제를스크리닝하는방법을제 공하는것이다. [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은 1) YAP 및 TAZ로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질및 MAML1 및 MAML2로구성된어느하나이상의단백질을발현하는세포에피검물질을처리하는단계 ; 및 2) 상기단계 1) 의세포에서 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합을감소시키거나, MAML1 또는 MAML2에의해매개되는 YAP 또는 TAZ의핵내이동을억제시키는피검물질을식별하는단계를포함하는암치료후보물질스크리닝방법을제공한다. 또한, 본발명은 1) YAP 또는 TAZ로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질및 MAML1 또는 MAML2로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질에피검물질을처리하는단계 ; 및 2) 상기단계 1) 에서 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합을감소시키는피검물질을식별하는단계를포함하는암치료후보물질스크리닝방법을제공한다. 아울러, 본발명은 1) 피검시료로부터 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합수준을측정하는단계 ; 2) 상기단계 1) 의결합수준을정상대조군시료와비교하는단계를포함하는암의발병소인을갖는개체진단의정보를제공하기위한단백질간결합수준측정방법을제공한다. [0024] 발명의효과본발명에서, MAML(mastermind-like)1 또는 2가 YAP 또는 TAZ와결합하였고, MAML1/2의발현을억제하였을때, YAP 또는 TAZ의전사활성이억제되었으며, TAZ의 WW domain 및 MAML1/2의 PPxY 서열이상호간의결합에중요한역할을함을확인하였고, MAML1의발현을억제하였을때, YAP의핵내이동이억제되고, 세포의이동이억제됨을확인함으로써, 본발명의 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 2 단백질의결합억제제의스크리닝방법을통해개발된억제제는 YAP 또는 TAZ의핵으로의이동을막아, 암의형성을억제하는데유용하게사용될수있다. [0026] 도면의간단한설명 도 1 은 MAML1/2 과 YAP 및 TAZ 의결합을확인한도이다. 도 2는 MAML1과 YAP의결합을근접접합분석 (proximity ligation assay) 을통해확인한도이다. 도 3은 MAML1와 YAP 및 TAZ의결합을면역형광법 (Immuno-Fluorescence, IF) 를통해확인한도이다. 도 4는 MAML1/2의발현억제로인한 YAP 및 TAZ의전사활성변화및 YAP의타겟유전자들의 mrna 발현변화를확인한도이다. 도 5는 TAZ의 WW 도메인 (W: 트립토판 ) 의결실로인한 MAML1과의결합및전사활성변화를나타낸도이다. 도 6은 MAML1, MAML2, MAML3에의한 TAZ 및 YAP의전사활성을확인한도이다. - 5 -
도 7 은 MAML1 의억제로인한 YAP 의핵내로의이동억제를확인한도이다. 도 8 은 MAML1/2 의억제로인한세포의이동억제를확인한도이다. [0028] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0037] [0038] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명을상세히설명한다. 본발명은 1) YAP 및 TAZ로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질및 MAML1 및 MAML2로구성된어느하나이상의단백질을발현하는세포에피검물질을처리하는단계 ; 및 2) 상기단계 1) 의세포에서 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합을감소시키거나, MAML1 또는 MAML2에의해매개되는 YAP 또는 TAZ의핵내이동을억제시키는피검물질을식별하는단계를포함하는암치료후보물질스크리닝방법을제공한다. 상기 YAP(Yes-associated protein, NP_001269030.1) 단백질은서열번호 1, TAZ(WW domain-containing transcription regulator protein 1, WWTR1, NP_056287.1) 단백질은서열번호 2, MAML1(mastermind like protein 1, NP_055572.1) 은서열번호 3, MAML2(mastermind like protein 2, NP_115803.1) 는서열번호 4의아미노산서열을갖는것이바람직하고, 상기단계 2) 의 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합은 YAP 또는 TAZ의 WW 도메인 (W는트립토판 ) 에의해매개되고, MAML 1 또는 MAML2의 PPxY 모티프 (P는프롤린, x는임의의아미노산, Y는타이로신 ) 에의해매개되는것이바람직하다. 또한, 상기단계 2) 의식별은웨스턴블롯 (western blot), 면역침강법 (immunoprecipitation assay), 근접접합분석법 (proximity ligation assay), 이중루시퍼라제측정법 (dual luciferase reporter assay), 또는면역형광법 (immino-fluorescence) 에의해실시되는것이바람직하고, 상기암은대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암및췌장암으로구성된군으로부터선택되는것이바람직하다. 본발명의스크리닝방법에의해분석되는피검물질은단일화합물, 화합물들의혼합물 ( 예컨대, 천연추출물또는세포또는조직배양물 ), 항체또는펩타이드이거나, 합성또는천연화합물의라이브러리로부터얻을수있다. 이러한화합물의라이브러리를얻는방법은당업계에공지되어있다. 합성화합물라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma- Aldrich(USA) 에서상업적으로구입가능하며, 천연화합물의라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA) 에서상업적으로구입가능하다. 본발명의구체적인실시예에서, MAML(mastermind-like)1 또는 2가 YAP 또는 TAZ와결합하였고 ( 도 1 내지도 3 참조 ), MAML1/2의발현을억제하였을때, YAP 또는 TAZ의전사활성이억제되었으며 ( 도 4 참조 ), TAZ의 WW domain 및 MAML1/2의 PPxY 서열이상호간의결합에중요한역할을함을확인하였고 ( 도 5 및도 6 참조 ), MAML1 의발현을억제하였을때, YAP의핵내이동이억제되고, 세포의이동이억제됨을확인하였다 ( 도 7 및도 8 참조 ). 따라서, YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 2 단백질의결합억제제의스크리닝방법을통해개발된억제제는 YAP 또는 TAZ의핵으로의이동을막아, 암의형성을억제하는데유용하게사용될수있다. 또한, 본발명은 1) YAP 또는 TAZ로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질및 MAML1 또는 MAML2로구성된군으로부터선택된어느하나이상의단백질에피검물질을처리하는단계 ; 및 2) 상기단계 1) 에서 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합을감소시키는피검물질을식별하는단계를포함하는암치료후보물질스크리닝방법을제공한다. 아울러, 본발명은 1) 피검시료로부터 YAP 또는 TAZ 단백질과 MAML1 또는 MAML2 단백질간의결합수준을측정하는단계 ; 2) 상기단계 1) 의결합수준을정상대조군시료와비교하는단계를포함하는암의발병소인을갖는개체진단의정보를제공하기위한단백질간결합수준측정방법을제공한다. - 6 -
[0047] [0048] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0064] [0065] 이하, 본발명을실시예및실험예에의해서상세히설명한다. 단, 하기실시예및실험예는본발명을예시하기위한것일뿐, 본발명이하기실시예및실험예에의해서한정되는것은아니다. < 실시예 1> 플라스미드제작 V5-MAML1 플라스미드는 Addgene사 (USA) 에서구입하였고 (Plasmid#37049), Flag-MAML1 플라스미드는 Dr. Lizi Wu (University of Floroda, USA) 로부터제공받았다. Flag-YAP과 Flag-TAZ 플라스미드는 PCR을수행하여제작하였다. 이때사용한프라이머는하기와같다 : YAP Forward; TGACAAGGATCCCGGGCAGCA( 서열번호 5), Reverse; GCGGCCGCCTATAACCATGTAAGA( 서열번호 6), TAZ Forward; AAATGAATCCGGCCTCGGCG( 서열번호 7), Reverse; TTACAGCCAGGTTAGAAAGGGCT( 서열번호 8). < 실시예 2> sirna 제작 MAML1과 MAML2 발현을조사하기위하여, 합성 sirna 이중체올리고머 ST Pharm사에의뢰하여제작하였다. sirna 이중체서열은하기와같다 : sirna-maml1: 5'- GAG GAA TCT TGA CAG CGC C-3'( 서열번호 9), sirna-maml2: 5'- GTA ATC AAC CTA ACA CAT A -3'( 서열번호 10). 비특이적 sirna 이중체올리고머는음성대조군으로사용하였다. < 실시예 3> 형질전환세포주제작 60mm 세포배양접시에 5 10 5 세포 / 웰 (well) 농도로 HEK293 세포를분주하였다. 그런다음, 상기 < 실시예 2> 에서제작한 sirna 이중체및 YAP/TAZ 발현벡터를 3차증류수, 1 M CaCl 2, 2 HeBs(HEPES-buffered saline solution, 50 mm HEPES(pH 7.0), 1.5 mm Na 2 HPO 4, 10 mm KCl, 280 mm NaCl, 12 mm glucose) 와함께혼합하여 세포를형질전환하였다. 그후, 37, 5% CO 2 조건에서 4 시간배양한뒤, 새배지로바꿔주었다. 형질전환 24 시간후, 세포를용해하여하기방법으로웨스턴블롯을수행하여형질전환세포주를확인하였다. [0066] [0068] [0069] [0070] 구체적으로, V5-MAML1와 HA-TAZ 플라스미드를이용하여형질전환된 HEK293세포를 Tris-HCl 버퍼 (20 mm Tris- HCl, ph 7.4, 150 mm NaCl, 1% Triton X-100, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 2.5 mm Sodium Pyrophosphate, 1 mm β- glycerophosphate, 1 mm Sodium ortho-vanadate, 1 mm PMSF, 1μg / ml Leupeptin) 로용해시킨후, Bradford법을이용해용해물내의단백질농도를측정하였다 (Bio-Rad Laboratories, USA). 단백질시료는 60μg용해물과 Tris-HCl 버퍼, SDS 염색액 (50mM Tris-HCl, ph6.8, 4% SDS, 40% Glycerol, 50 mm β-mercaptoethanol) 을혼합해 95 에서 10분간가열해준비한뒤, 10% SDS-PAGE 겔 (10% acrylamide mix: ELPIS Biotech, Korea, 375mM Tris, ph8.8, 1% ammonium persulfate, 0.04% TEMED) 에 140V로전기영동하였다 (Green and Sambrook, Molecular Cloning: 4th Ed., p. 1602, Cold Spring Harber: USA). 분리된시료는 PVDF 막에 230mA로이동시킨후, TBST(100 mm Tris-Cl, ph8.0, 1.5 M NaCl, 0.05% TWEEN 20: AMRESCO, USA) 로 5% 스킴밀크 (skim milk powder: Merck, Germany) 를만들어차단하였다. 이후 V5 및 HA 항체를 4 에서 16시간반응시킨후, 2차항체 (goat anti-mouse IgG-HRP: Santa Cruz Biotechnology, USA, 1:10,000 희석 ) 와 25 에서 1시간동안반응시켰다. 최종결과는 ECL 키트 (ELPIS Biotech, Korea) 를사용하여제조사의방법대로처리해확인하였다. < 실험예 1> MAML1/2와 YAP/TAZ의결합확인 MAML1/2와 YAP/TAZ의결합을확인하기위하여, 하기의면역침강법 (Immunoprecipitation) 실험을수행하였다. 구체적으로, 상기 < 실시예 3> 을통해 MAML1/2과 YAP/TAZ를과발현시킨세포를 Tris-HCl 버퍼 (20 mm Tris HCl at ph 7.4, 150 mm NaCl, 1% triton X-100, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 2.5 mm sodium pyrophosphate, 1 mm β- glycerophosphate, 1 mm sodium ortho-vanadate) 로용해시킨후, Bradford 방법 (Bradford, MM., Anal. Biochem. 72:248-254, 1976) 으로단백질을정량하였다 (Bio-Rad Laboratories, USA). 세포용해물의상층액 - 7 -
(Supernatant) 으로부터단백질시료 1000μg을 HA 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 를사용하여 4 에서 overnight으로배양하였다. 그후, Protein G Agarose 비드 (Fast Flow 10ml, packed beads 50% slurry, Millipore) 와함께다시 4 에서 2시간동안배양하였고, 5회세척후, SDS 염료 (1 M Tris-HCl at ph 6.8, 20% SDS, 0.4% BPB, 20% Glycerol, β-mercaptoethanol 14.3 M) 와함께혼합하여 95 끓는물에서 10분간가열하였고, 웨스턴블롯을통해확인하였다. [0071] [0073] [0074] [0075] [0077] [0078] [0079] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] 그결과, 도 1A에나타난바와같이, 과발현된 MAML1/2가 YAP/TAZ와결합함을확인하였고, 형질세포주가아닌일반세포주를사용하여상기의면역침강법을수행한결과, 도 1B에나타난바와같이, 세포내 MAML1이 YAP/TAZ와결합함을확인하였다 ( 도 1). 또한, 근접접합법 (Proximity Ligation Assay) 를수행하여 MAML1과 YAP/TAZ의결합을확인하였다. 구체적으로, 근접접합법은 Sigma-aldrich(Cat # DUO92101) 에서키트를구입하여제조사의프로토콜을따라수행하였으며, 세포를 humid-chamber 슬라이드에적당한양을배양한뒤, 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde) 로하루동안고정하였고, 다음날 blocking 용액을세포가잠길정도로떨어뜨린후 37 에서 30분동안반응시켰다. 그후, 1차항체반응을위하여, 사용하고자하는 1차항체 (YAP 또는 MAML1) 를적당한농도로희석시킨뒤 (YAP 1:100, MAML1 1:100), blocking 용액을슬라이드챔버에서제거하였고, 희석된일차항체를 2시간이상반응시킨후, wash A 용액으로 5분간 5번세척해준뒤, 1/5로희석된 PLA 프로브를 37 에서 1시간동안반응시켰다. 한시간후에 PLA 프로브를제거한뒤 wash A 용액으로다시 5분간 5번이상세척하였고, ligase가포함된 ligation 용액을샘플에넣고 37 에서 30분동안반응시켰다. 그런다음, Wash A 용액으로 2분간 5번이상세척한뒤 polymerase가함유된 amplification 용액을샘플과 37 에서 100분동안반응시켰으며, wash B용액으로 2분간 10번이상세척한후, 슬라이드글라스에봉입용액을떨어뜨린후, 커버글라스로덮은뒤현미경으로관찰하였다. 그결과, 도 2에나타난바와같이, 근접접합법실험을통해서도 MAML1과 YAP/TAZ가결합함을확인하였다 ( 도 2). 또한, 면역형광법 (Immuno-Fluorescence, IF) 을수행하여 MAML1/2과 YAP/TAZ의결합을확인하였다. 구체적으로, 형질전환된 NIH3T3 세포에 3.7% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde) 를첨가하여상온에서 20분간고정하였다. 그후, PBS로 3번세척하였고, 세포의투과성을높이기위해 0.1% Triton-X100을 15분간처리하였다. 다시 PBS로 3번세척한후, 10% FBS (fetal bovine serum) 를 1시간처리하였다. anti-ha 및 anti- VSVG 항체를 10% FBS에희석하여상온에서 2시간 ( 또는 4 에서하룻밤 ) 동안반응시키고 1% FBS로 10분씩 3번세척한후, 2차항체 (Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG) 를 10% FBS에희석하여암실에서 2시간반응시키고 1% FBS로 10분씩 3번세척하였다. 이때, 2번째세척시 300 ng/ml DAPI를 1% FBS에넣어주었다. 그런다음, 슬라이드글라스에봉입용액을떨어뜨린후커버글라스를덮었다. 주변의봉입용액을제거하고에나멜로덮은후현미경으로관찰하였다. 그결과, 도 3에나타난바와같이, YAP/TAZ를단독으로과발현시키면주로세포질에존재하지만, MAML1을동시에과발현시키게되면 YAP/TAZ가핵내로이동함을확인하였다 ( 도 3). < 실험예 2> MAML1/2가 YAP/TAZ의전사활성을촉진함을확인 MAML1/2가 YAP/TAZ의전사활성조절에대한효과를확인하기위하여하기실험을수행하였다. 구체적으로, MAML1 또는 MAML2의발현억제를위해 < 실시예 2> 에서제작한 sirna를혼합사용하여, MAML1 및 MAML2의발현을억제하고, 이중루시퍼라제측정법 (Dual Luciferase Reporter Assay) 을통해 YAP/TAZ의전사활성을측정하였다. 12 웰 (well) 플레이트에서배양된형질전환 HeLa 세포로부터배지를제거하고 1X Passive Lysis Buffer (5 PLB : Promega) 150μl를첨가한후 15분동안상온에서용해하였다. 용해물을 750 g에서 5분동안원심분리후상층액 10μl를측정에사용하였다. 시료에 LARII (Promega) 50μl를넣고루미노미터에서 firefly luciferase 활성을측정하고, 이어 Stop & Glo (50 Stop & Glo substrate, 버퍼 : Promega) 50μl를넣고루미노미터에서 Renilla luciferase 활성을측정하여측정값을보정하였다. 그결과, 도 4에나타난바와같이, MAML1/2의발현억제로인해, YAP/TAZ에의한활성이감소함을확인하였고 ( 도 4A), 또한, YAP/TAZ의세포내재적 (endogenous) 타켓유전자들의발현이감소함을실시간 (real-time) PCR로 - 8 -
확인하였다 ( 도 4B). 사용한프라이머의서열은하기와같다. [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0099] [0100] [0101] [0102] [0104] [0105] [0106] CTGF, for: AGGAGTGGGTGTGTGACGA( 서열번호 11); rev: CCAGGCAGTTGGCTCTAATC( 서열번호 12); ANKRD1, for: AGTAGAGGAACTGGTCACTGG( 서열번호 13); rev: TGGGCTAGAAGTGTCTTCAGAT( 서열번호 14); CYR61, for: CAGGACTGTGAAGATGCGGT( 서열번호 15); rev;gcctgtagaagggaaacgct( 서열번호 16); HES1, for: GGCTGGAGAGGCGGCTAA( 서열번호 17); rev: GAGAGGTGGGTTGGGGAGTT( 서열번호 18); NRARP, for: TGCACCAGTCGGTCATCG( 서열번호 19); rev:ttgaccagcagcttcacgag( 서열번호 20); GAPDH, for: AGCCACATCGCTCAGACAC( 서열번호 21); rev: GCCCAATACGACCAAATCC( 서열번호 22). < 실험예 3> MAML1/2와 YAP/TAZ의결합에중요한도메인 (domain) 의확인. MAML1/2과 YAP/TAZ의결합에중요한 YAP/TAZ의도메인을확인하기위하여, 하기실험을수행하였다. 도 5A와같이 TAZ에서 WW 도메인 (W, 트립토판 ) 을제거한플라스미드를제작하여, 상기 < 실험예 1> 및 < 실험예 2> 의실험을수행한결과, 도 5B 내지 5D에나타난바와같이, TAZ에서 WW 도메인을제거한경우는 MAML1을동시에과발현시켜도 TAZ가핵내로이동하지못함을확인하였고 ( 도 5B 및 5C), TAZ의전사활성이증가하지않음을확인하였다 ( 도 5D). 또한, 포유류는 MAML1, MAML2 및 MAML3 가존재하는데, YAP/TAZ의 WW 도메인과의결합에중요하리라고생각되는 PPxY 서열이 MAML3에는존재하지않음을확인하여 ( 도 6A), 상기 MAML1, MAML2, 및 MAML3에의한 YAP 및 TAZ의전사활성을측정한결과, 도 6B에나타난바와같이, MAML1, MAML2는 YAP 또는 TAZ의전사활성을증가시키는반면에 PPxY 도메인이없는 MAML3는효과가없음을확인하였다 ( 도 6B). < 실험예 4> MAML1/2가세포의이동에필수적임을확인. MAML1/2의발현저해가세포의이동에미치는영향을확인하고자, 하기실험을수행하였다. 구체적으로, 접착세포상처치유어세이 (Wound healing assay) 는상기 < 실시예 2> 에서제작된 sirna-maml1/2 및 YAP으로형질전환한 HEK293A 세포주를사용하였고, 상기세포주에살균한플라스틱팁을이용하여빈공간을만든후 37, 5% CO 2 조건에서 18시간동안배양하였다. 세포이동능력은현미경으로실시간측정하였다. 또 한, YAP 의발현은 anti-yap 항체로 MAML1 의발현은 anti-maml1 항체를사용하여 < 실험예 1> 의면역형광법을수 행하였다. [0107] [0108] 그결과, 도 7에나타난바와같이, sirna를사용하여 MAML1의발현을억제하였을때, YAP이핵내에존재하지않음을확인하였다. 또한, 도 8에나타난바와같이, YAP을과발현시키면세포의이동이증가하지만, sirna를사용하여 MAML1/2의발현을억제할경우 YAP을과발현시켜도세포이동이현저하게억제됨을확인하였다 ( 도 8). - 9 -
도면 도면 1 도면 2-10 -
도면 3 도면 4-11 -
도면 5 도면 6-12 -
도면 7 도면 8 서열목록 <110> University of seoul Industry Cooperation Foundation. <120> Method for screening of interaction inhibitors between YAP or TAZ protein and MAML1 or MAML2 protein <130> 16P-01-012 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 508-13 -
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Pro Gly Gln Gln Pro Pro Pro Gln Pro Ala Pro Gln Gly Gln 1 5 10 15 Gly Gln Pro Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gly Gln Gly Pro Pro Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Gln Pro Ala Pro Ala Ala Thr Gln Ala Ala Pro Gln Ala Pro 35 40 45 Pro Ala Gly His Gln Ile Val His Val Arg Gly Asp Ser Glu Thr Asp 50 55 60 Leu Glu Ala Leu Phe Asn Ala Val Met Asn Pro Lys Thr Ala Asn Val 65 70 75 80 Pro Gln Thr Val Pro Met Arg Leu Arg Lys Leu Pro Asp Ser Phe Phe 85 90 95 Lys Pro Pro Glu Pro Lys Ser His Ser Arg Gln Ala Ser Thr Asp Ala 100 105 110 Gly Thr Ala Gly Ala Leu Thr Pro Gln His Val Arg Ala His Ser Ser 115 120 125 Pro Ala Ser Leu Gln Leu Gly Ala Val Ser Pro Gly Thr Leu Thr Pro 130 135 140 Thr Gly Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Thr Pro Thr Ala Gln His Leu 145 150 155 160 Arg Gln Ser Ser Phe Glu Ile Pro Asp Asp Val Pro Leu Pro Ala Gly 165 170 175 Trp Glu Met Ala Lys Thr Ser Ser Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn His 180 185 190 Ile Asp Gln Thr Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Ala Met Leu Ser 195 200 205 Gln Met Asn Val Thr Ala Pro Thr Ser Pro Pro Val Gln Gln Asn Met 210 215 220 Met Asn Ser Ala Ser Gly Pro Leu Pro Asp Gly Trp Glu Gln Ala Met - 14 -
225 230 235 240 Thr Gln Asp Gly Glu Ile Tyr Tyr Ile Asn His Lys Asn Lys Thr Thr 245 250 255 Ser Trp Leu Asp Pro Arg Leu Asp Pro Arg Phe Ala Met Asn Gln Arg 260 265 270 Ile Ser Gln Ser Ala Pro Val Lys Gln Pro Pro Pro Leu Ala Pro Gln 275 280 285 Ser Pro Gln Gly Gly Val Met Gly Gly Ser Asn Ser Asn Gln Gln Gln 290 295 300 Gln Met Arg Leu Gln Gln Leu Gln Met Glu Lys Glu Arg Leu Arg Leu 305 310 315 320 Lys Gln Gln Glu Leu Leu Arg Gln Val Arg Pro Gln Ala Met Arg Asn 325 330 335 Ile Asn Pro Ser Thr Ala Asn Ser Pro Lys Cys Gln Glu Leu Ala Leu 340 345 350 Arg Ser Gln Leu Pro Thr Leu Glu Gln Asp Gly Gly Thr Gln Asn Pro 355 360 365 Val Ser Ser Pro Gly Met Ser Gln Glu Leu Arg Thr Met Thr Thr Asn 370 375 380 Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Ser Gly Thr Tyr His Ser Arg Asp Glu 385 390 395 400 Ser Thr Asp Ser Gly Leu Ser Met Ser Ser Tyr Ser Val Pro Arg Thr 405 410 415 Pro Asp Asp Phe Leu Asn Ser Val Asp Glu Met Asp Thr Gly Asp Thr 420 425 430 Ile Asn Gln Ser Thr Leu Pro Ser Gln Gln Asn Arg Phe Pro Asp Tyr 435 440 445 Leu Glu Ala Ile Pro Gly Thr Asn Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Gly 450 455 460 Asp Gly Met Asn Ile Glu Gly Glu Glu Leu Met Pro Ser Leu Gln Glu 465 470 475 480-15 -
Ala Leu Ser Ser Asp Ile Leu Asn Asp Met Glu Ser Val Leu Ala Ala 485 490 495 Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ser Phe Leu Thr Trp Leu 500 505 <210> 2 <211> 400 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Asn Pro Ala Ser Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Ile His Val Thr Gln Asp Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe 20 25 30 Asn Ser Val Met Asn Pro Lys Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu 35 40 45 Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln 50 55 60 Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gln His Val Arg Ser His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu 85 90 95 Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ser Pro Ala Gln Gln His Ala His 100 105 110 Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn 130 135 140 His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Ala Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Met Asn Leu His Pro Ala Val Ser Ser Thr Pro 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Val Met Asn - 16 -
180 185 190 His Gln His Gln Gln Gln Met Ala Pro Ser Thr Leu Ser Gln Gln Asn 195 200 205 His Pro Thr Gln Asn Pro Pro Ala Gly Leu Met Ser Met Pro Asn Ala 210 215 220 Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile 225 230 235 240 Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg 245 250 255 Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Ala Glu Thr Leu 260 265 270 Ala Pro Val Gln Ala Ala Val Asn Pro Pro Thr Met Thr Pro Asp Met 275 280 285 Arg Ser Ile Thr Asn Asn Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro 290 295 300 Tyr His Ser Arg Glu Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys 305 310 315 320 Tyr Ser Val Pro Thr Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Val Asp Glu 325 330 335 Met Asp Thr Gly Glu Asn Ala Gly Gln Thr Pro Met Asn Ile Asn Pro 340 345 350 Gln Gln Thr Arg Phe Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn 355 360 365 Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile Pro Leu Phe Asn 370 375 380 Asp Val Glu Ser Ala Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe Leu Thr Trp Leu 385 390 395 400 <210> 3 <211> 1016 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3-17 -
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