J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 43(5), 705~711(2014) http://dx.doi.org/10.3746/jkfn.2014.43.5.705 백합뿌리추출물의멜라닌생성억제효과 윤훈석 1 양경월 2 김정은 1 김정미 2 이남호 1 현창구 1,3 1 제주대학교화장품과학연구센터 2 ( 주 ) 제주사랑 3 제주대학교 LINC 사업단 Hypopigmenting Effects of Extracts from Bulbs of Lilium Oriental Hybrid Siberia in Murine B16/F10 Melanoma Cells Hoon Seok Yoon 1, Kyung-Wol Yang 2, Jung Eun Kim 1, Jeong Mi Kim 2, Nam Ho Lee 1, and Chang-Gu Hyun 1,3 1 Cosmetic Science Center, Dept. of Chemistry and 3 LINC Agency, Jeju National University, Jeju 690-756, Korea 2 Jeju Love Co., Ltd., Jeju 690-756, Korea ABSTRACT In order to develop a skin-whitening agent, melanin contents and intracellular tyrosinase activity were determined by western blotting. Ethyl acetate fractions of 80% ethanol extracts from lily (Lilium Oriental Hybrid Siberia ) bulbs (R-EA) inhibited melanin synthesis in a dose-dependent manner in α-melanocyte stimulating hormone (α-msh)- treated B16/F10 murine melanoma cells. Intracellular tyrosinase activity and melanin contents were suppressed by 45% and 74%, respectively, in response to treatment with 100 μg/ml of R-EA. Examination of protein expression associated with α-msh-induced melanogenesis showed that tyrosinase related protein (TRP)-1 was inhibited more strongly than tyrosinase, and these results were correlated with stronger inhibition of melanin synthesis than intracellular tyrosinase activity. Taken together, R-EA containing p-coumaric acid and resveratrol could be used as a hypopigmentation agent through suppression of sustained extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation via melanogenic induction. Key words: lily bulbs, hypopigmentation, melanin, extracellular signal-regulated kinase 서 백합 (Lilium longiforum Thunb.) 은아시아의대부분지역에서식재료와약초로사용되어져왔고전세계적으로매력적인화훼용식물로재배되고있다. 백합뿌리는중국과일본등지에서염증과폐질환치료에가장널리사용되는일반적인약재였다. 많은연구를통해서다양한종류의백합들로부터얻은뿌리를함유한처방이피부의찰과상및화상의회복과외과수술시발생하는상처의회복에도움을주는것으로알려졌다 (1). 백합은천연화합물을많이포함하고있으며이중 phenolic glycosides, flavonoids, carotenoids, sterols, steroidal saponins, steroidal glycoalkaloids 등의많은이차대사산물들이백합에서분리되었다. 백합꽃에서분리된화합물들이항염증활성을가지는것으로확인되었고백합뿌리에서분리된여러가지 steroidal saponin류의화합물들이항암활성을가지는것으로알려졌다 (2-6). 론 Received 22 January 2014; Accepted 1 April 2014 Corresponding author. E-mail: cghyun@jejunu.ac.kr, Phone: +82-64-754-4419 피부색은표피와진피의경계부위에위치한멜라닌생성세포가합성해내는멜라닌의양과종류에따라결정된다. 노화나멜라닌의과생산에따라피부의생리적기능이떨어지게되면피부표면에멜라닌색소가침착되면서일광흑색점 ( 노인성흑자 ) 등과같은다양한형태의과색소침착이발생하게된다 (7). 과색소침착이일어나는원인에는자외선및열등의원인이있다. 이중자외선에피부가오래노출되면 α-melanocyte stimulating hormone(α-msh), endothelin-1(et-1) 그리고 nitric oxide(no) 등의멜라닌생성촉진인자가각질형성세포에서분비된다 (8). 멜라닌생성세포와피부색소침착을조절하는인자중의하나인 α-msh는국지적으로생산되어지는 melanocortin peptide들중하나이다. α-msh가 melanocortin-1 receptor(mc1r) 에붙게되면세포내에서는 adenylate cyclase가활성화되면서세포내 cyclic adenosine monophosphate(camp) 의농도가증가하게되고, protein kinase A(PKA) 세포신호전달경로를거쳐멜라닌생성경로의속도조절효소인 tyrosinase를활성화시킨다 (9). 이외에도자외선의영향으로멜라닌생성을촉진하는 basic fibroblast growth factor(bfgf) 와 stem cell factor(scf) 등도역시각질형성세포에서분비된다 (10).
706 윤훈석 양경월 김정은 김정미 이남호 현창구 멜라닌생성은멜라노좀에서일어나며멜라노좀은소포체가기원인특이적인세포내막으로감싸여진기관이다. 멜라노좀의발달과정중에 tyrosinase, tyrosinase-related protein-1(trp-1) 그리고 tyrosinase-related protein-2 (TRP-2) 가생성되어지며, 이중 tyrosinase는 L-tyrosine 에서 dopaquinone까지의변환과정을촉진하는멜라닌생성에연관된핵심효소이며, eumelanin과 pheomelanin의합성에모두관여한다. Tyrosinase는 tyrosine hydroxylase, dihydroxyphenylalanine(dopa) oxidase 그리고 5,6-dihydroxyindole(DHI) oxidase의여러가지효소활성을가진다. TRP-1은 5,6-dihydroxyindole carboxylic acid(dhica) oxidase의효소활성을가지는것으로보고되어있으나기능은아직확실하지않다. TRP-1이 tyrosinase를안정화시키는데기여할것이라는보고도있었다 (11). TRP-2의기능은 dopachrome tautomerase이며, 멜라닌생중합체에있어서 carboxylated subunit들의비율을조절하는역할을한다 (12). Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, peroxidase 등의효소활성을모두또는일부분을억제함으로써피부미백효과가나타나게되며, 이중 tyrosinase와 TRP-1은흑갈색을띠는 eumelanin의생합성에연관된핵심효소단백질이다. 대부분의피부미백소재들은여러가지기전을통해 tyrosinase 에특이적으로작용하여제기능을못하게한다. 예를들어 C 2-ceramide와 tretinoin은 tyrosinase 유전자가전사되는것을막고, hydroquinone과 arbutin은 tyrosinase의경쟁적저해제로작용하기도하며, linoleic acid와 α-linolenic acid는 tyrosinase의단백질분해를유도하기도한다 (13). 최근에는제주조릿대와해조류인새발의추출물들을이용한연구에서 α-msh에의해 24시간이상에서지속적으로나타나는 extracellular signal-regulated kinase(erk) 의활성화현상을관찰하였고, 이지속적인 ERK의활성화가저해되면서멜라닌생성연관단백질의발현및멜라닌생성이저해되는것이밝혀졌고, nobiletin이라는멜라닌생성촉진인자에대해서도 ERK의활성화저해제인 U0126 처리시 phosphorylated ERK(p-ERK) 와 tyrosinase의발현이줄어들고이에따라 nobiletin에의해유도된멜라닌생성이줄어든다는보고가있었다 (14-17). 그러므로본연구에서는 α-msh에의해활성화된 p- ERK, tyrosinase, TRP-1과 TRP-2의발현이백합뿌리분획물에의해서저해되는지를알아보고자하였다. 재료및방법시료의추출및분획본연구에사용된시료는제주시신촌리백합농가에서 2012년 12월에구입한백합뿌리를사용하였다. 백합뿌리시료 200 g에 80% 에탄올 (ethanol) 1 L를첨가하여실온에서 3일간 2회추출하였고이를여과, 감압농축, 동결건조 하여사용하였다. 백합뿌리 80% 에탄올추출물 (20 g) 을물 (H 2O) 에현탁시킨후헥산 (haxane), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 부탄올 (butanol), 물순으로극성이낮은용매부터극성이높은용매순으로순차적으로용매분획을각각 3회씩반복수행하여분획층 (fraction) 을수득하였고각분획층을감압농축, 동결건조하여헥산분획물 0.1 g(0.1%), 에틸아세테이트분획물 1.1 g(5.5%), 부탄올분획물 3.9 g (19.5%), 물분획물 13.5 g(67.5%) 을얻어실험시료로사용하였다. 시료는실험에사용하기전밀봉하여냉동보관 (-20 C) 하였다. 세포생존율측정시료가세포의성장에미치는영향을측정하기위하여 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(mtt; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 분석을수행하였다. 대사가왕성한살아있는세포는세포내 mitochondria의탈수소효소작용에의하여수용성의노란색인 MTT를환원시켜자주색을띠는비수용성 formazan 을형성한다. 생쥐의 B16/F10 흑색종세포를 10% fetal bovine serum(fbs: GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 이첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(dmem: GIBCO BRL) 을이용하여 2 10 4 cells/well로 24 well plate에넣고 24시간배양후시료와 α-msh 50 nm을동시에처리하고 48시간배양하였다. 이후 MTT 용액 50 μl를첨가하여 4시간동안반응시켰다. 배양배지를완전히제거하고 dimethylsulfoxide(dmso; Sigma-Aldrich) 를 200 μl 가하여침전물을완전히용해시킨후 microplate reader (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) 를사용하여 540 nm 흡광도를측정하였다. 각시료군에대한평균흡광도값을구하였으며대조군의흡광도값과비교하여세포생장률을평가하였다. 멜라닌함량측정멜라닌함량측정은생쥐 (Mus musculus) 의 B16/F10 흑색종세포주를 6 well plate에 1 10 5 cells/well이되게준비한후 24시간동안 37 C CO 2 세포배양기 (Heraeus BB15, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 에서배양하고, 멜라닌생합성유도물질인 α-msh 50 nm을처리하고동시에시료를각각처리하였다. 48시간동안 37 C CO 2 세포배양기에서배양하였으며 24시간이지난후배지교체와동시에 α-msh 50 nm과시료를다시처리하였다. 세포를 trypsin-edta(gibco BRL) 를이용하여수확했다. 이렇게수확된세포에 0.2 mm phenylmethylsulfonyl fluoride(pmsf; Sigma-Aldrich) 와 1% Triton X-100(Sigma- Aldrich) 을함유한 67 mm sodium phosphate buffer(ph 6.8) 를 500 μl 처리하고초음파로분쇄하였으며, 이상태로 1시간동안얼음에서보관하였다. 1시간후 4 C 원심분리기
백합뿌리추출물의멜라닌생성억제효과 707 (Combi-514R, Hanil, Incheon, Korea) 에서 12,000 g로 20분간원심분리하였으며, 이때상층액을버리고분리된침전물에 1 N NaOH 용액을첨가하여 70 C 항온수조에서 20분동안보관하면서침전물이용해되기를기다린후이용해된용액을멜라닌함량분석에사용하였다. α-msh만처리한대조구와비교하여상대적인멜라닌함량을 405 nm 에서측정하였고각각의데이터는단백질의양으로보정하여나타내었다. 세포내 tyrosinase 저해활성측정세포내 tyrosinase 저해활성측정은생쥐의 B16/F10 흑색종세포를 6 well plate에 1 10 5 cells/well이되게준비한후 24시간동안 37 C CO 2 세포배양기에서배양하고 α -MSH 50 nm을처리하고 25, 50, 100 μg/ml 농도로백합뿌리에틸아세테이트분획물시료를처리하여멜라닌생성유도조건에서의저해효과를관찰하였다. 48시간동안 37 C CO 2 세포배양기에서배양하였으며배양도중 24시간이지난후배지교체와동시에위와같은조건으로다시처리하였다. 세포를 trypsin-edta를이용하여수확한후 0.2 mm phenylmethylsulfonyl fluoride와 1% Triton X-100 을함유한 67 mm sodium phosphate buffer(ph 6.8) 를 500 μl 처리하고초음파분쇄를실시하였으며이후 1시간동안얼음에서보관하였다. 1시간후 4 C 원심분리기에서 12,000 g로 20분간원심분리하였으며상층액을취하여세포내 tyrosinase 활성분석에사용했다. 세포내 tyrosinase 활성분석은세포내에존재하는 tyrosinase의작용결과생성되는 DOPAchrome을비색법에의해측정했다. 33 mm sodium phosphate buffer(ph 6.8), 9 μm L-tyrosine (Sigma-Aldrich) 과 4 mm L-DOPA(Sigma-Aldrich) 를혼합한후위에서얻은상층액 100 μl를처리하여 37 C 항온기에서 2시간반응시켰다. 반응액중에생성된 DOPA chrome을 475 nm에서측정하여멜라닌생성을유도한대조구 (α-msh 처리구 ) 를기준으로하여상대적인활성을나타내었다. 각각의데이터는단백질의양으로보정하여나타내었다. 멜라닌생성연관단백질분석생쥐의 B16/F10 흑색종세포를 6 well plate에 1 10 5 cells/well이되게준비한후 24시간동안 37 C CO 2 세포배양기에서배양하고멜라닌생합성유도물질인 α-msh 50 nm을처리하고동시에 25, 50, 100 μg/ml 농도로백합뿌리에틸아세테이트분획물시료를처리하였다. 48시간동안 37 C CO 2 세포배양기에서배양하였으며배양도중 24시간이지난후배지교체와동시에위와같은조건으로다시처리하였다. 이렇게배양된세포는먼저배지를제거하고 1 PBS 1 ml를첨가하여 scraper로수거하고 4 C, 250 g 에서 5분동안원심분리하여상층액을제거한후 100 μl RIPA buffer(10 RIPA, 0.1 M PMSF, 0.1 M Na 3VO 4, 0.5 M NaF, 5 mg/ml aprotinin, 5 mg/ml leupeptin) 로용해시키고원심분리하였다. 여기서얻은상층액을이용하여 12% SDS-PAGE로전기영동하고이를 polyvinyldene fluoride membrane(millipore, Billerica, MA, USA) 에이전시켰다. 그리고이를 5% 탈지분유가함유된 Tris buffered saline tween 20(TBST; 50 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm NaCl, 0.1% Tween 20) 용액에서상온에 1시간동안방치하였다. Phosphorylated ERK의활성을검토하기위한항체로는 mouse monoclonal anti-p-erk 1/2(Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA), tyrosinase의항체로는 goat polyclonal anti-tyrosinase(santa Cruz Biotech), Trp-1의항체로는 goat polyclonal anti-trp-1(santa Cruz Biotech), Trp-2의항체로는 rabbit polyclonal anti-trp-2(santa Cruz Biotech), β-actin의항체로 mouse monoclonal anti-β-actin(sigma-aldrich) 을 5% 탈지분유가함유된 TBST 용액에희석하여 4 C, 24시간동안반응시켰다. TBST 용액으로세척한후 2차항체로는 horse radish peroxidase가결합된 anti-goat, anti-mouse IgG 를 5% 탈지분유가함유된 TBST 용액에희석하여상온에서 1시간동안반응시켰다. 그후 membrane을 TBST로세번세척후 ECL kit(amersham Pharmacia Biotech) 를사용하여 1~3분간반응시킨후 X-ray 필름으로현상하였다. HPLC fingerprint 분석백합뿌리 80% 에탄올추출물및에틸아세테이트분획물을 DMSO에녹여 1 mg/ml의농도가되게만들어준후 syringe filter로여과하고 p-coumaric acid 및 resveratrol의함량을 high performance liquid chromatography (HPLC; Alliance TM Waters 2695, Waters 2998 photodiode array detector, Waters Corporation, Milford, MA, USA) 로측정하였다. 분석에사용한칼럼은 Sunfire TM 4.6 mm 250 mm C18 column(particle size 5 μm, Waters Corporation) 이며, 이동상으로는 0.1% acetic acid, acetonitrile을사용하였고, 유속 0.5 ml/min으로하여 25~35% acetonitrile의조건으로 30분동안 340 nm의자외선파장으로분석하였다. 표준품은 DMSO에녹여각각 10, 25 50, 100 μg/ml의농도로제조하여 peak 면적을구하고회귀방정식을이용한검량선을작성하여정량하였다. 통계처리실험결과는 mean±sd로나타냈으며 Student's t-test (Microsoft Office Excel 2007) 의단측검정을사용하여통계학적유의성을검증하였다. 결과및고찰백합뿌리분획물의멜라닌생성억제효과생쥐의 B16/F10 흑색종세포에백합뿌리분획물 (100 μg/
708 윤훈석 양경월 김정은 김정미 이남호 현창구 ml) 과 α-msh(50 nm) 를동시처리하여 48시간배양한후 MTT 분석을이용하여세포생존율을확인하였다. 백합뿌리분획물은 100 μg/ml의농도에서 90~100% 의생존율을보여세포독성을나타내지않음을확인하였다 (Fig. 1A). 또한분획물중에틸아세테이트분획물이핵산분획물에비해수율이좋고부탄올분획물에비해멜라닌생성억제능력과세포내 tyrosinase 효소활성억제능력이우수함을확인하였다 (Fig. 1B, 1C). 그러므로에틸아세테이트분획물을선택하여실험을진행하였다. 에틸아세테이트분획물의세포내멜라닌생성억제효과멜라닌생성세포및흑색종세포는 UV 자극에의해멜라닌생성이촉진되어진다. 이때멜라닌생성을촉진시키기위해 α-melanocyte stimulating hormone(α-msh), stem cell factor(scf), endothelin-1(et-1) 등이분비된다. 이중 α-msh는멜라닌생성세포및흑색종세포의분화및멜라닌생성을유도한다. 그결과멜라닌생성세포및흑색종세포의수상돌기가많아지거나수상돌기부분에멜라닌색소가침착되어대조군에비해 α-msh 처리군의멜라닌함량이늘어나게된다. 멜라닌생성저해활성이우수한에틸아세테이트분획물을먼저 MTT 분석을통해분획물이 100 μg/ml 농도범위 에서세포독성을갖지않음을재차확인하였고 (Fig. 2A) 이를바탕으로에틸아세테이트분획물을 25, 50 및 100 μg/ ml 농도로처리하여멜라닌생성억제활성을측정하였다. 그결과 α-msh 단독처리군에비해에틸아세테이트분획물은각각의처리농도에서 21%, 44% 및 74% 의멜라닌생성억제활성을확인하였다. 또한에틸아세테이트분획물은세포내 tyrosinase 활성을농도의존적으로억제함도규명하였다 (Fig. 2B, 2C). 그러므로 α-msh로유도된멜라닌생성억제가세포내 tyrosinase 활성억제와연관됨을알수있었다. 멜라닌생성연관단백질발현억제활성멜라닌은흑색과갈색을띄는 eumelanin과적색과황색을띄는 pheomelanin으로나누어지는데, 피부미백화장품소재의목표가되는연구는 eumelanin의생성을억제하는방향으로초점이맞추어져있다. Eumelanin의생성에연관된단백질은 tyrosinase, TRP-1 그리고 TRP-2이고, 이중 tyrosinase의활성화에 ERK의지속적인활성화가연관되어있음을나타내는연구결과가있으므로, 에틸아세테이트분획물에의해감소된멜라닌생성억제활성이 p-erk, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질발현억제가그원인임을확인하기위해 Western blot analysis로세포질내에서 A B C Fig. 1. Anti-melanogenic effects of 80% ethanol extracts and 4 fractions from lily bulbs. A: cell viability using MTT assay. B: relative melanin contents, # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.005 compared to positive control by Student's t-test. C: relative intracellular tyrosinase activity, # P<0.05, ## P<0.001, ### P<0.0001 compared to positive control by Student's t-test. Insert represents the raw data of melanin contents. MSH-, negative control without α-msh; MSH+, positive control with 50 nm of α-msh; R-EtOH, 100 μg/ml of 80% ethanol extracts from lily bulbs with 50 nm of α-msh; R-HEX, 100 μg/ml of hexane fractions form lily bulbs with 50 nm of α-msh; R-EtOAc, 100 μg/ml of ethyl acetate fractions from lily bulbs with 50 nm of α-msh; R-BuOH, 100 μg/ml of butanol fractions from lily bulbs with 50 nm of α-msh; R-water, 100 μg/ml of water fractions from lily bulbs with 50 nm of α-msh; Arbutin, 100 μg/ml of arbutin with 50 nm of α-msh.
백합뿌리추출물의멜라닌생성억제효과 709 A B C Fig. 2. Hypopigmenting effects of ethyl acetate fractions from 80% ethanol extracts of lily bulbs. A: cell viability using MTT assay. B: relative melanin contents, # P<0.01, ## P<0.001, ### P<0.0001 compared to positive control by Student's t-test. C. relative intracellular tyrosinase activity, # P<0.005, ### P<0.001 compared to positive control by Student's t-test. Insert represents the raw data of melanin contents. MSH-, negative control without α-msh; MSH+, positive control with 50 nm of α-msh; R-EtOH, 100 μg/ml of 80% ethanol extracts from lily bulbs with 50 nm of α-msh; R-EA 25, 25 μg/ml of ethyl acetate fractions form lily bulbs with 50 nm of α-msh; R-EA 50, 50 μg/ml of ethyl acetate fractions from lily bulbs with 50 nm of α-msh; R-EA 100, 100 μg/ml of ethyl acetate fractions from lily bulbs with 50 nm of α-msh; Arbutin, 100 μg/ml of arbutin with with 50 nm of α-msh. 의 p-erk, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질의발현량을조사하였다. 생쥐의 B16/F10 흑색종세포에 α-msh 50 nm과에틸아세테이트분획물을 25, 50, 및 100 μg/ml 농도로처리하고 48시간배양한후에틸아세테이트분획물의 p-erk, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 발현억제활성을확인하였다. 그결과 α-msh 단독처리군은 p-erk, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의발현이현저히증가하였고에틸아세테이트분획물은농도의존적으로 p-erk, tyrosinase, TRP-1, TRP- 2의발현을억제함을확인하였다 (Fig. 3). 제주조릿대와해조류인새발의추출물들을이용한연구에서 α-msh에의해 24시간이상에서지속적으로나타나는 ERK의활성화현상을관찰하였으며, 이지속적인 ERK의활성화가저해되면서멜라닌생성연관단백질의발현및멜라닌생성이저해되는것이밝혀졌으며, nobiletin이라는맬라닌생성촉진인자에대해서도 ERK의저해제인 U0126 처리시 24시간이상에서지속적으로발현되는 p-erk와 tyrosinase의발현이줄어들고이에따라 nobiletin에의해유도된멜라닌생성이줄어든다는보고가있었다 (14-16). 백합뿌리분획물의지표물질분석백합뿌리미백소재의지표물질함량분석을위한방법으 α-msh (50 nm) - + + + + R-EA (μg/ml) - - 25 50 100 Tyrosinase TRP-1 TRP-2 P-ERK 1/2 β-actin Fig. 3. Examination of protein expression associated with α- MSH-induced melanogenesis. Western blot analysis using primary antibody of tyrosinase, TRP-1, TRP-2, phosphorylated ERK 1/2, and β-actin. β-actin was used as a loading control. 로 α-msh에의해멜라닌생성이촉진된 B16/F10 흑색종세포에서미백효과가있다고보고된 p-coumaric acid와자외선 B 조사에의해멜라닌생성이유도된 guinea pig에서피부미백효과를보이는것으로알려진 resveratrol의함유여부를 HPLC로분석하였다 (18,19). Fig. 4A와 4B는각각백합뿌리에탄올추출물과에틸아세테이트분획물의 p-coumaric acid에대한크로마토그램을나타낸것이다. 그결과 retention time과스펙트럼비교
710 윤훈석 양경월 김정은 김정미 이남호 현창구 A B Fig. 4. Fingerprint analysis using high performance liquid chromatography (HPLC). A: HPLC peaks of 80% ethanol extracts from lily bulbs using as the two standard compounds, p-coumaric acid and resveratrol. B: HPLC peaks of ethyl acetate fractions from 80% ethanol extracts of lily bulbs using as the two standard compounds, p-coumaric acid and resveratrol. 로백합뿌리에탄올추출물과에틸아세테이트분획물에 p- coumaric acid와 resveratrol이함유되어있음을알수있었다. 이러한결과를토대로백합뿌리에탄올추출물과에틸아세테이트분획물의 p-coumaric acid와 resveratrol의함량을확인하기위해 HPLC로정량을하였다. p-coumaric acid와 resveratrol을 10, 25, 50, 100 μg/ml가되게희석하고 HPLC의크로마토그램에서얻은 peak 면적을이용해회귀방정식을구한결과 p-coumaric acid는에탄올추출물과에틸아세테이트분획물에각각 4.4 μg/mg과 46.8 μg/ mg, resveratrol은각각 7.3 μg/mg과 16.0 μg/mg이함유되어있음을알수있었다. p-coumaric acid와 resveratrol 의함량이각각약 10배와 2배이상이늘어나있는것을확인할수있었고, 이에따라멜라닌생성저해활성이늘어남을알수있었다. 백합뿌리추출물에함유된 p-coumaric acid와 resveratrol은피부미백소재로서알려져있으며, resveratrol의경우항암, 항산화소재로서의활용가치가높은것으로알려져있다 (18-21). 자외선조사전식이섭취를통해멜라닌생성정도의감소및피부암유발원인인자외선 및 phorbol ester의피부노출전식이섭취를하는방식의실험을통해피부암발생이저해되는지의여부등을확인하여먹는화장품및피부암예방기능성식품으로의적용도가능할것이라사료된다 (22,23). 요약피부미백소재를개발하기위해멜라닌함량, 세포내 tyrosinase 활성의측정및 Western blotting 실험이수행되었다. 백합 (Lilium Oriental Hybrid Siberia ) 뿌리의 80% 에탄올추출물로부터얻은에틸아세테이트분획물 (R-EA) 은 α-melanocyte stimulating hormone(α-msh) 에의해멜라닌생성이유도된 B16/F10 흑색종세포에서농도의존적으로멜라닌생성을저해하였다. 정확하게세포내 tyrosinase 활성과멜라닌함량은에틸아세데이트분획물 100 μg/ml 처리시 α-msh 단독처리군에비해각각 45% 와 74% 의저해율을보였다. α-msh에의해멜라닌생성이유도된 B16/F10 흑색종세포에서단백질발현양상을살펴본
백합뿌리추출물의멜라닌생성억제효과 711 결과 TRP-1이가장많이억제된양상을확인할수있었고이결과는세포내 tyrosinase 활성저해보다멜라닌생성저해가더많이일어난것과일맥상통하는것이다. 이를종합해볼때 p-coumaric acid와 resveratrol 함량이백합뿌리의에탄올추출물에비해많이함유된에틸아세테이트분획물은멜라닌생성유도물질에의해촉진된 ERK의활성화를억제하는피부미백소재로서그가치가입증된다고사료된다. 감사의글 이논문은 2012년도한국산업단지공단에서지원하는산업집적지경쟁력강화사업으로시행한생산기술사업화지원사업 ( 현장맞춤형기술개발부문 ) 의연구수행으로인한결과물임을밝힙니다. REFERENCES 1. Esposito D, Munafo JP Jr, Lucibello T, Baldeon M, Kormarnytsky S, Gianfagna TJ. 2013. Steroidal glycosides from the bulbs of Easter lily (Lilium longiflorum Thunb.) promote dermal fibroblast migration in vitro. J Ethnopharmacol 148: 433-440. 2. Shoyama Y, Hatano K, Nishioka I, Yamagishi T. 1987. Phenolic glycosides from Lilium longiflorum. Phytochemistry 26: 2965-2968. 3. Francis JA, Rumbeiha W, Nair MG. 2004. Constituents in Easter lily flowers with medicinal activity. Life Sci 76: 671-683. 4. Tsukida K, Ikeuchi K. 1965. Epoxycarotenoids. Ⅷ. Pollen carotenoids of Lilium longiflorum and of its cultivated hybrid. Bitamin 32: 222-226. 5. Mimaki Y, Nakamura O, Sashida Y, Satomi Y, Nishino A, Nishino H. 1994. Steroidal saponins from the bulbs of Lilium longiflorum and their antitumour-promoter activity. Phytochemistry 37: 227-232. 6. Munafo JP Jr, Ramanathan A, Jimenez LS, Gianfagna TJ. 2010. Isolation and structural determination of steroidal glycosides from the bulbs of easter lily (Lilium longiflorum Thunb.). J Agric Food Chem 58: 8806-8813. 7. Hill HZ, Li W, Xin P, Michell DL. 1997. Melanin: a two edged sword? Pigment Cell Res 10: 158-161. 8. Imokawa G, Kobayashi T, Miyagishi M, Higashi K, Yada Y. 1997. The role of endothelin-1 in epidermal hyperpigmentation and signaling mechanisms of mitogenesis and melanogenesis. Pigment Cell Res 10: 218-228. 9. Thody AJ, Graham A. 1998. Does alpha-msh have a role in regulating skin pigmentation in humans? Pigment Cell Res 11: 265-274. 10. Gilchrest BA, Park HY, Eller MS, Yaar M. 1996. Mechanisms of ultraviolet light-induced pigmentation. Photochem Photobiol 63: 1-10. 11. Hearing VJ, Tsukamoto K. 1991. Enzymatic control of pigmentation in mammals. FASEB J 5: 2902-2909. 12. Tsukamoto K, Jackson IJ, Urabe K, Montague PM, Hearing VJ. 1992. A second tyrosinase-related protein, TRP-2, is a melanogenic enzyme termed DOPAchrome tautomerase. EMBO J 11: 519-526. 13. Briganti S, Camera E, Picardo M. 2003. Chemical and instrumental approaches to treat hyperpigmentation. Pigment Cell Res 16: 101-110. 14. Yoon HS, Kim JK. 2007. The inhibitory effect of Acanthopeltis japonica on melanogenesis. J Soc Cosmet Sci Korea 33: 87-92. 15. Yoon HS, Kim JK, Kim SJ. 2007. The inhibitory effect on the melanin synthesis in B16/F10 mouse melanoma cells by Sasa quelpaertensis leaf extract. Korean J Life Sci 17: 873-875. 16. Yoon HS, Lee SR, Ko HC, Choi SY, Park JG, Kim JK, Kim SJ. 2009. Involvement of extracellular signal-regulated kinase in nobiletin-induced melanogenesis in murine B16/ F10 melanoma cells. Biosci Biotechnol Biochem 71: 1781-1784. 17. Kim HK, Han HS, Lee GD, Kim KH. 2005. Physiological activities of fresh Pleurotus eryngii extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr 34: 439-445. 18. An SM, Lee SI, Choi SW, Moon SW, Boo YC. 2008. p- Coumaric acid, a constituent of Sasa quelpaertensis Nakai, inhibits cellular melanogenesis stimulated by α-melanocyte stimulating hormone. Br J Dermatol 159: 292-299. 19. Lee TH, Seo JO, Baek SH, Kim SY. 2014. Inhibitory effects of resveratrol on melanin synthesis in ultraviolet B-induced pigmentation in Guinea pig skin. Biomol Ther (Seoul) 22: 35-40. 20. Ndiaye M, Philippe C, Mukhtar H, Ahmad N. 2011. The grape antioxidant resveratrol for skin disorders: promise, prospects, and challenges. Arch Biochem Biophys 508: 164-170. 21. Hsieh TC, Wu JM. 2010. Resveratrol: biological and pharmaceutical properties as anticancer molecule. Biofactors 36: 360-369. 22. Abel EL, Angel JM, Kiguchi K, DiGiovanni J. 2009. Multistage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nat Protoc 4: 1350-1362. 23. Driedger PE, Blumberg PM. 1980. Specific binding of phorbol ester tumor promoters. Proc Natl Acad Sci U S A 77: 567-571.