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소량의시료에서노로바이러스검출방법에관한연구 김천현, 서규석, 소향아, 정진화, 진찬문, 강미숙, 임석춘 인수공통감염과 Development of Norovirus Detection Method in a small water sample Cheon-hyeon Kim, Kyeu-seok Seo, Hang-ha So, Jin-hwa Jeong Chan-mun Jin, Mi-suk Kang, Seok-chun Lim Division of Zoonosis

제 1 장서론 소화기계바이러스로분류되는노로바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스, 사포바 이러스등은인체및동물의분변을통해환경중으로배출되어하수뿐아니라지표수와 지하수에도존재하며(Gerba,C.P. et al., 1990; ; Rockx B et al., 2002 ), 크기가 5nm- 10nm 로크기가매우작기때문에일반여과에의해서는거의처리되지않으며겨울철에 지하수에서수개월동안안정적으로살아있으면서바이러스성집단식중독사고를일으키 고있다 (Parshionikar SU et al., 2003; Sung-Han Kim et al., 2005). 바이러스를농축하는방법은양이온필터법, PEG 침전법, 유기산농축법, 양이온플록법, 초고속원심분리법등이있으며대용량(1500L) 의지하수에서바이러스를농축하는시스템 은양이온필터법인미국의 EPA 방법을이용하여분석하고있다(USEPA manual, 2001). 일반적으로유기, 무기오염물질들은이온화된상태로수중에분포하고있으며바이러 스와같은미생물들은수중에서음전하를띠게된다. 이러한오염물질들의정전기적특 징을이용하여 Glass fiber, cellulose등에양전하를띠게함으로써음전하를띠는바이 러스를흡착시킨후 ph를이용하여탈리하는과정으로바이러스를농축하여바이러스를 검출하게된다(Kenneth Hou et al., 1980). 본연구에서는 nitrocellulose에양전하를 띠는필터를제작하여기존의방법과비교하고자하였다. 이러한양전하를띠는필터는 필터의기공사이즈보다더작은바이러스나내독소(endotoxin) 등을분석하는데이용되 며지하수나하천수의바이러스오염이나급성위장관염을일으키는바이러스성식중독의 원인병원체를규명하는데이용된다 (Georgios T.P. et al., 2000; Mohammad R.K, 2009). 정수장이나지하수의바이러스조사를위하여국립환경과학원및식품의약품안전청에서는 양이온필터인 1MDS 필터나 Nanoceram 필터를이용하여분석하고있다. 바이러스성식중 독의원인병원체는대부분노로바이러스이며노로바이러스에의한집단발병사례가최근 들어증가하는추세에있다. 대부분이오염된지하수로세척하거나식품을제조할때 발생하며어패류에의한원인으로보고되고있으며 G1 형과 G2형의다양한아형의노로 바이러스들이존재하여감염을유발하고있는것으로확인되고있다 (Fankhauser RL et al.,1998, Gallimore CI et al., 2004). 노로바이러스는 1990년이후보고가되고있으며소아뿐아니라청소년과성인에이르 기까지전연령층에서설사를유발하는전염성이매우높은 바이러스로선진국형장염 질환의원인으로알려져있으며미국의경우바이러스성장염의약42%, 네덜란드의경우 에는 90% 이상이노로바이러스에의한것으로알려져있다.

우리나라식약청통계보고자료에의하면바이러스성식중독중대부분이노로바이러스 가차지하고있으며 2002-2005년에는노로바이러스발생율이 6.8% 에서 2006-2010년 7월 까지에서는 18.2% 로 3배정도증가하고있으며바이러스성식중독발생이중요하게대두 되고있다. 그렇지만환경시료에서의원인규명율이 2009년 32건중 1 건(3.1%) 이지하 수에서규명되었고 2010년에는 21건중 2 건(9.5%) 에서지하수와굴무침으로인한식중독 으로확인되어바이러스성원인으로추정되는지하수및식품에서는대부분원인불명인 경우가대부분인실정이며환경시료에서원인불명율이높아그에대한연구가시급한 실정이다. 현재환경부및식품의약품안전청에서고시된시험방법에는상용화된제품인 1MDS나 Nanoceram 필터제품을사용하여 500-1,500L의지하수를 25mL로농축하여 PCR방법으로분 석하고있으나소량의시료(4-10L) 에서는아직고시된방법이없어연구를해야할필요 성이있다. 본연구는소량의시료에서바이러스를농축하는방법을개발하고자수처리 제로사용하고있는양전하부가물질인폴리알루미늄클로라이드(PAC) 를이용하여 Nitrocellulose membrane 필터에 Positive charge기술을적용하여필터에전하를띠게 함으로써바이러스를흡착시켜검출할수있는필터를개발하여바이러스성집단식중독 발병시환경시료에서바이러스농축하는방법에대한연구를통하여원인규명율향상에 기여하고자한다.

제 2 장연구방법 2.1 양이온필터제작및농축 양이온 (Al 3+ ) 필터를만들기위하여그림 1과같이밀리포아여과기세트에 Nitrocellulose membrane 필터(0.45ul pore size, 47mm, Millipore, Billerica, Ireland) 를장착한후에 15-20 PSI 로감압여과하면서 5mL의 500mM AlCl 3 을통과시켜필 터에양이온을형성시켰다. 이후에질병관리본부에서제공받은 10 4 CCID(Cell culture infectious dose) 의표준주(Poliovirus 1) 3mL을 500ml의멸균증류수에넣고균질화시 킨다음밀리포아여과기세트에감압여과하면서통과시켜양이온필터에바이러스를수 집하였다. 또한식중독바이러스인노로바이러스분리주로동일한방법으로실험하였다. 필터에있는알루미늄이온을제거하기위하여 50mL의 0.5mM H 2 SO 4 (ph 3.0) 용액으로세 척하였다. 필터에결합되어있는바이러스를탈리하기위하여 3mL의 5mM NoOH(pH 11.0) 용액을첨가한후에 1분간정치한후에 15-20 PSI 로감압하면서용출하였다. 필터된액 을중화시키기위하여 100mM H 2 SO 4 용액 5uL 을첨가하여실험용액으로사용하였다. 또한 동일한방법으로노로바이러스도실험하였다. 그림 1. 양이온필터제작및바이러스농축을위한그림.

2.2 RNA 추출및정량 RNA 추출은 QIAamp viral RNA minikit(qiagen GmbH, Hilden, Germany ) 을이용하였으며 표준주 Poliovirus 1 및 Norovirus G2-4 를제조자의실험방법에따라서실험하였다. Buffer AVL (carrier RNA 포함) 560uL을 1.5 ml tube에넣은후시료 140uL을넣고 15초 동안혼합 (pulse-vortex) 한다. 실온에서 10분동안정치한후 Ethanol (96-100%) 560 ul을넣고 15초동안혼합한후 spin-down 한다. 혼합된시료 630uL을 QIAamp Mini spin column에넣은후 6,000 x g에서 1분동안원심분리한후필터된액과 tube는버린후 QIAamp spin column을새로운 2uL tube 에옮긴다. 세척을위하여 Buffer AW 1과 Buffer AW 2 를순서대로 500 ul을 QIAamp spin column에넣은후 6,000 x g에서 1분동안원심 분리한후 QIAamp spin column을새로운 2 ml tube 에옮긴다. 남아있는알콜을제거하기 위하여 20,000 x g에서 3분동안원심분리한후 1.5 ml tube에 QIAamp spin column을 장착한다. Buffer AVE 100 ul을 column에주입하고 1분동안정치한후 6,000 x g에서 1 분동안원심분리하여용출하였다. 용출된여과액으로정량을위한 template RNA로사용 하였다. 이 RNA 용액을형광측정원리를이용하는 Qubit fluorometer (Invitrogen, Oregon, USA) 장비로 Quant-iT RNA assay kit(invitrogen, Oregon, USA) 를사용하여정 량하였다. 2.3 Real time RT-PCR 정량시험 폴리오바이러스및노로바이러스정량시험을위한증폭은 Exiprep 96(Bioneer Daejeon, Korea) 장비를이용하여 EV Real time PCR kit(bioneer Daejeon, Korea) 로증폭하였다. Realtime PCR mixture 튜브에 RNA 용액 10uL와 DEPC DW 40uL를넣고 cdna 합성한후사 이클이끝날때마다증폭이될때증가되는 FAM dye 의정량을검출기로측정하였다. 폴리오바이러스및노로바이러스온도조건는동일하게 47 30분로 cdna 합성한후 9 4 10min으로 inactivation 후 94 15s, 55 1min 으로 40cycle 반응시켜정량하였 다. 2.4 CCID 50 (Cell culture infectious dose) 50 시험 여과농축된바이러스용액의생존력을확인하기위하여 Karber 방법에따라서시험을 하였다. 즉 96웰마이크로플레이트에 RD(human rhabdomyosarcoma)cell를 monolayer가 형성될때까지 5% CO 2 Incubator에서키운다음표준주폴리오바이러스용액과필터통 과시킨바이러스용액를 x10단계씩희석하면서각각플레이트에 50uL씩분주한후 5%

CO 2 인큐베이터에넣어서 CPE(Cytopathogenic effect) 를매일관찰하였으며 Cell control과 Virus control을대조로사용하면서아래의 Kärber 공식에따라서비교분석 하였다. Log CCID 50 = L - d (S - 0.5) 50 L = log of lowest dilution used in the test; d = difference between log dilution steps; S = sum of proportion of "positive" tests

제 3 장결과및고찰 3.1 폴리오및노로바이러스농도분석 표준주바이러스인 10 4 CCID polio virus 100uL의시료를 QIAamp Viral RNA kit를이용 하여추출한후최종적으로 100uL의핵산을얻어형광분석핵산측정장비인 Qubit fluorometer로 RNA 농도를측정하였다. 측정한결과표 2와같이 0.944ug/ml±20% 의 RNA 농도값을얻었으며표준주바이러스를양이온필터에여과농축하여얻어진 RNA 농도값은 0.562ug/ml± 20 으로측정되었다. 또한 A회사양이온필터를사용하여동일한방법으로 측정한결과 0.265 ± 20 ug/ml 이었고, B 회사의양이온필터를이용하였을경우에는 0.364 ±20 ug/ml 이었다. 이번에자체제작하여사용한필터에서는 0.562 ±20 으로회 수율이 59.5% 였다. 표 2. Poliovirus 1 RNA 농도및회수율분석결과단위 :ug/ml 실험방법바이러스 A filter B filter This study Standard Poliovirus 1 0.265 ±20 0.364 ±20 0.562 ±20 Recovery rate 28.1% 38.5%% 59.5% 0.944±20 또한확인이된 Norovirus G2-4를이용하여동일한방법으로측정한결과 5.3±20ug/ml 이었으며표 3과같이 A회사양이온필터를사용하여측정한결과 1.612±20ug/ml 이었 고,B 회사의양이온필터를이용하였을경우엔2.074±20ug/ml 이었다. 이번에자체제작 하여사용한필터에서는 3.338±20 으로회수율이 62.8% 였다. 표 3. Norovirus G2-4 RNA 농도및회수율분석결과단위 :ug/ml 실험방법바이러스 A filter B filter This study Standard Norovirus G2-4 1.612±20 2.074±20 3.338±20 Recovery rate 30.4% 39.1% 62.8% 5.3±20

3.2 Real time RT-PCR 정량비교시험 10 4 CCID 폴리오바이러스 100ul를가지고 Qiagen Viral mini kit를가지고추출하였으 며 100uL 로용출하여 real time pcr kit 50uL volume에 RNA 용액 10uL와 DEPC DW 40uL 를넣고실시간으로형광을측정하였다. 표준시료원액으로그림 2와같이 Standard curve를이용하여 viral copy number 수를계산하였다. Poliovirus 1 의 NCR gene에대 해 Real time PCR 정량시험으로비교분석한결과그림 3과같이 CT(cycle threshold) 값 은 24.9 ±20 이었다. 동일한농도로양이온제작필터에여과농축한바이러스용액을추 출한실험에서는그림 3 및표 4와같이 CT value는 25.7 ±20 로약 60% 의회수율을보 여주었고, A회사제품에서는 CT 값이 27.3 ±20 이었으며, B 회사제품에서는 26.7±20이 었다. 표 4. Poliovirus 1 CT(cycle threshold) value 및회수율분석결과 실험방법바이러스 A filter B filter This study Standard Poliovirus CT 27.3±20 26.7±20 25.7±20 Recovery rate 29.1% 38.5% 61.5% 24.9±20 그림 2. 표준주바이러스의 Standard curve를이용한 viral copy number.

1 2 3 4 그림 3. Poliovirus 1 의 NCR gene Real time PCR 정량비교분석. ( 1: 표준원액, 2: This study, 3: B filter, 4: A filter) 동일한방법으로식중독바이러스인노로바이러스에대해서도실험을하였다. 노로바이 러스 G2-4 100uL를가지고 Qiagen Viral mini kit를가지고추출하였으며 100uL 로용출 하여 real time pcr kit 50uL volume 에 RNA 용액 10uL와 DEPC DW 40uL 를넣고실시간 으로형광을측정하였다. 표준시료원액으로그림 4와같이 Standard curve를이용하여 viral copy number 수를계산하였다. Norovirus G2-4 의 Capsid gene에대해 Real time PCR 정량시험으로비교분석한결과그림 5와같이표준바이러스로실험한결과 CT(cycle threshold) 값은 28.0 ±20이었으며동일한농도로양이온제작필터에여과농축한바이 러스용액을추출한실험에서는 CT value는 28.9 ±20 로약60% 의회수율을보여주었고, A회사제품에서는 CT 값이 30.5 ±20 이었으며, B 회사제품에서는 30.2±20 이었다. 표 5. Norovirus G2-4 CT(cycle threshold) value 및회수율분석결과 실험방법바이러스 A filter B filter This study Standard Poliovirus CT 30.5±20 30.2±20 28.9±20 28.0±20 Recovery rate 30.3% 35.1% 60.0%

그림 4. Norovirus G2-4의 Standard curve를이용한 viral copy number. 1 2 3 4 그림 5. Norovirus G2-4의 NCR gene Real time PCR 정량비교분석. ( 1: 표준원액, 2: This study, 3: B filter, 4: A filter)

3.3 폴리오바이러스검출민감도시험 폴리오바이러스검출민감도시험을위한바이러스생존능을확인하기위하여 96well plate에 RD(human rhabdomyosarcoma) cell를 monolayer가형성될때까지 5% CO 2 Incubator 에키웠다. 단계별로희석한 100 CCID 50, 10 CCID 50, 1 CCID 50 의폴리오바이러 스를제작한양이온필터에통과시켜농축한용액을준비한세포에접종하였으며접종한 후매일도립현미경(Olympus, Japan) 으로세포병변효과(cytopathogenic effect) 관찰하여 바이러스생존능을확인하였다. 동일한방법으로 A filter 및 B filter도동일한방법으 로실험하였다. 실험결과는직접제작한양이온필터에서는 1 CCID 까지생존능을확인하 였으며 A필터는 10 CCID 에서 ± 를보였으며 B 필터는 10 CCID 까지생존능을확인하였 다. 표 6. 시험방법별로바이러스검출감도생존능시험 바이러스 (CCID) 실험방법 A filter B filter This study 100 + + + 10 ± + + 1 - + RD cell CPE negative RD cell CPE Positive 그림 4. RD cell culture 를이용한바이러스검출감도시험.

장바이러스는수인성집단식중독의주요한원인병원체중의하나로널리알려져왔으며 이들바이러스는감염된환자의배설물에서방출되어하수를거쳐환경수계에널리분 포하게되며바다로들어가여기에사는어패류를오염시키는데어패류의중장선이필터 역할을하여바이러스가농축되어진다. 이러한바이러스에오염된물을먹거나어패류를 날것으로먹게될경우집단식중독을일으키는것으로보고되고있다. 식중독바이러스들 은세균보다적은농도로분포하지만세균에비하여환경에서수개월생존하고적은수 로도감염이가능한것으로보고되고있다. 소량의시료에서바이러스를농축하는방법에는양이온필터법, PEG 침전법, 유기산농축 법, 양이온플록법, 초고속원심분리법등이있으며 PEG농축법과양이온필터법에우수한 민감도를보여주고있으며초고속원심분리법에는많은양(4L) 을하기에는적합하지않은 것으로보고되고있다. 이중에서민감도가우수하고농축하는시간이빠른양이온필터법 을이용하여변형하여사용하였다. 또한바이러스를농축하는방법은여러가지가있지 만농축할시료의상태와양, 실험자에따라다른농축법을사용하는등확립된방법이 없다. 본연구에서는 Nictrocellulose filter로세균을여과하는여과장치를이용하여 NC filter에 PAC(poly aluminium chloride) 용액으로양이온을코팅하여바이러스를농축 하는방법을개선하고자하였다. 표준주바이러스인 Poliovirus 1 으로국내에시판중인 A 및 B 회사의양이온필터로농축했을경우회수율이 20-40% 을보여주었으나이번연구 에서는 60% 의회수율로유의성있는결과를나타내었다. 검출한계에서도 A 및 B 회사의 필터에서는 10 CCID까지나타내었으며본연구에서는 1 CCID 까지검출이되고있음을 확인하였다. 환경수계에서검출감도의차이를나타내는경우가불순물에의한효소반응의억제를들 수있는데환경시료에서핵산을추출할때추출방법에따라서검출감도가차이가발생 하는데다양한종류의물질이많이존재하며특히부식산이나다당류가많이혼합되어 있다. 부식산은 10ug/ml 농도만으로 PCR 반응을저해하며, 다당류의경우에는 12.5% 정 도만있으면심각히저해한다는보고가있다(Atmar, et al., 1993). 따라서표준시료와 달리환경수계에서샘플링할때는핵산추출시에컬럼방법보다는 하는 Magnetic bead 방법으로추출을해야할필요성이있겠다. 노로바이러스는 Inhibitor를많이제거 Caliciviridae에속하며전세계적으로급성바이러스성위장관염을일으 키는주요한원인병원체로알려져있으며 (Koopmans M, Duizer E., 2004; Lees D., 2000) 모든연령층의환자에서발생하며(Green, K.Y., et al., 2001) 유전자형은 G1과 G2로구 성되어있다(Ando, et al., 1995). 위장관염을일으키는바이러스에는로타바이러스,

노로바이러스, 장아데노바이러스, 아스트로바이러스등이있다.(Ando et al., 1994; Estes et al., 1983) 이중에서노로바이러스는집단식중독위장관염의중요한원인체 로알려져있으며 (Chikhi-Brachet et al., 2002), 인체및동물의분변을통해환경중 으로배출되어하수뿐아니라지표수와지하수에도존재하며 (Gerba,C.P. et al., 1990; ; Rockx B et al., 2002 ), 하수, 하천수, 바닷물, 패류등에서검출되며겨울철에환경 수계에서수개월동안안정적으로살아있으면서바이러스성집단식중독사고를일으키고 있다. ( Parshionikar SU et al., 2003; Sung-Han Kim et al., 2005) 2002년 2월경에발생한급성위장염의집단발병예는노로바이러스에오염된음식물을 섭취하여발생한대규모발병예로보고되었으며, 이후에도국내에서노로바이러스에의 한집단식중독의발병예가수차례보고된바있다. 식약청노로바이러스실태조사보고자료에따르면전체식중독건수중노로바이러스가 차지하는비율이 2006년도에 51 건/259 건, 2007년도에는 97 건/510 건, 2008년도에는 69/354건으로 19.0% 에서 19.6% 로바이러스가차지하는비율이상당하지만원인병원체 를환경가검물에서규명하는건수는거의전무한상황이다. 따라서원인병원체를규명 하는데도움을주고자한다. 4L의물에확인된노로바이러스 G2-4를첨가하여양이온필터여과장치에통과시켜 3ml 로농축을하였다. 노로바이러스표준시료원액으로그림 4와같이 Standard curve를이 용하여 viral copy number 수를계산하였다. Norovirus G2-4 의 Capsid gene에대해 Real time PCR 정량시험으로비교분석한결과그림 5와같이표준바이러스로실험한결 과 CT(cycle threshold) 값은 28.0 ±10이었으며동일한농도로양이온제작필터에여과 농축한바이러스용액을추출한실험에서는 CT value는 28.9 ±10 로약60% 의회수율을 보여주었고, A회사제품에서는 CT 값이 30.2 ± 10(42%) 이었으며, B 회사제품에서는 30.5±10(28%) 이었다. 따라서이번실험결과소량의시료인 4L-10L의물에서식중독바 이러스인노로바이러스등을농축하는데효과적인방법으로확인되다. 전세계적으로지 하수에서바이러스를확인하기위한농축방법으로미국의 EPA 검사법인 500-1,500L의지 하수를양이온필터에통과하면서흡착시켜농축하는방법을채택하여확인하고있다. 우 리나라에서도노로바이러스식중독발생시원인규명을위하여 1,500L의지하수를농축하 여검사하고있는데식당이나급식소등현장에나가면정수기등소량의물이나환경가 검물들이존재하는데검사방법이없어서실험을못하게되는경우가있다. 따라서소량 의시료에서양이온필터를이용한농축방법을이용하면약 1시간정도면농축할수있고 환자대변과비슷한시간대에결과물을확인할수있어서환자발생시역학조사에유용한

자료로이용할수있으며환자확산방지에도기여할수있을것으로사료된다. 또한환경 가검물에서원인규명을할때지하수를검사할뿐만아니라음식물을조리시사용하는 물이나정수기등의물등중간매개체를검사하면원인규명율향상에도움이될것이 라생각된다.

제 4 장결론 소량의지하수( 약 4L) 에서바이러스를농축하기위하여양이온필터를제작한후질병관 리본부에서분양받은 Poliovirus 1 및 Norovirus G2-4를이용하여실험한결과와시판중 인양이온필터제품과비교분석한결과는다음과같다. 1. 형광분석측정장비인 Qubit fluorometer 로 RNA 농도를측정한결과표준주바이러 스를양이온필터를통과하기전에핵산을추출하여정량한결과 0.944ug/mL±20% 이었으 며양이온필터여과장치에농축하여얻어진 RNA 농도값은 0.562ug/mL±20으로측정되어 회수율이 59.5% 로조사되었다. 또한 A회사양이온필터를사용하여동일한방법으로측 정한결과 0.265ug/mL 이었고, B 회사의양이온필터를이용하였을경우엔 0.364ug/mL이 었다. 2. 10 4 CCID 폴리오바이러스를 real time PCR 장비로형광을측정하여 Standard curve 를이용하여 viral copy number 수를계산한후 CT(Cycle Threshold) 값은 24.9 ±20이 었다. 동일한농도로양이온제작필터에여과농축한바이러스용액을추출한실험에서는 CT value는 25.7 ±20 로약60% 의회수율을보여주었고, A회사제품에서는 CT 값이 27.3 ±20 이었으며, B 회사제품에서는 26.7±20 이었다. 3. 노로바이러스 G2-4에대한 Real time PCR 정량시험으로비교분석한결과표준시료 원액에서는 CT value는 28.0 ±20이었으며동일한농도로양이온제작필터에여과농축 한바이러스용액을추출한실험에서는 CT value는 28.9 ±20 로약60% 의회수율을보여 주었고, A회사제품에서는 CT 값이 30.5 ±20 이었으며, B 회사제품에서는 30.2±20 이 었다. 4. 폴리오바이러스검출감도시험에서는직접제작한양이온필터에서는 1 CCID까지생 존율을확인하였으며 A필터는 10 CCID 에서 ± 를보였으며 B 필터는 10 CCID 까지생존능 을확인하였다. 5. 식중독규명시환경가검물인음식물을조리에사용하는물이나정수기의물등소량 의시료에서중간매개체를검사하면원인규명율향상에도움이될것이라판단된다.

제 5 장참고문헌 지영미, 김기순, 천두성, 박정구, 강영화, 정윤석, 고운영, 신영학, 윤재득.1999a, " 원 주지역설사환자에서분리한 대한바이러스학회지, 29(4):247-259(1999). Small Round Structured Viruses (SRSV) 염기서열분석", 지영미, 김기순, 천두성, 안정배, 박정구, 강영화, 정윤석, 윤재득. 1999b. " 바이러스성 설사질환의역학조사및원인체분석을통한예방대책수립에관한연구", 보, 36:94-105(1999). 국립보건원 지영미, 김기순, 천두성, 안정배, 강영화, 정윤석, 이선화, 김운호, 윤재득.. " 바이러스 성설사질환의역학조사및원인체분석을통한예방대책수립에관한연구", 국립보건 원보, 37:96-112(2000). 지영미, 안정배, 천두성, 최우영, 김운호, 이정수, 이강범, 이회규, 윤재득 " 국내유행 바이러스성장염의역학", 소아감염. 11(1):S7-S19(2004). Gerba, C.P., and J.B.Rose, "Viruses in source and drinking water, p.. In McFeters, G.A. (ed.), Drinking water microbiology", Springer-Verlag New York Inc., New York, 380-396(1990). Sung-Han Kim,Odd-sung Cheon, Jin-Hyeun Kim, dong-han Lee, Won-hwa Jheong, Young-Joo Heo, Hyeon-Mi Chung, Youngmee Jee, and Joo-Shil Lee. "Outbreaks of gastroenteritis that occurred during school excursions in Korea were associated with several waterborne strains of norovirus", J. Clin. Micro., 43(9): 4836-4839(2005). Rockx B, Wit M de, Vennema H, vinje J, Bruin E de, van Duynhoven Y, "Koopmans M. Natural history of Human Calicivirus infection": a prospective cohort study, Clin. Infect. Dis., 35, 246-253(2002). Parshionikar SU, S Willian-True, GS Fout, DE Robbins, SA. Seys, JD Cassady, and R Harris, "Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with norovirus", App. Environ. Microbiol., 69: 5263-5268(2003).

UESPA manual of methods for virology, EPA 600/4-84/013(N14)(2001). Kenneth Hou et al., "Capture of latex Beads, Bacteria, Endotoxin, and Viruses by Charge-Modified Filters", App. Environ. Microbiol,. 5(40), 892-896(1980). Georgios T. P., Laura M, ChristinaG.C, Francisco L, Dina A, Eleni I, "A simple methodological approach for counting and identifying culturable viruses adsorbed to cellulose nitrate membrane filters", App. environ. Microbiol., 66(1): 194-198(2000). Mohammad R.K., Eric R.R., Nichole B., Larry W., "New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water", App. Environ. Microbiol., 75(8): 2393-2399 (2009). Atmar, R.L., T.G. Metcalf, F.H. Neil, and M.K. Estes., "Detection of enteric viruses in oysters by using the polymerase chain reaction", App. Environ. Microbiol., 59, 631-635(1993). Artines J, Philillips M and Feachem RG., "Diarrheal diseases. In: Jamison DT, Mosely WH, Measham AR, Bobadilla JL, editors. Disease control priorities in developing countries", Oxford Univ. Press, 91-116(1993). Mayo MA., "A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV", Arch Virol,, 147:1655-1663(2002). Seto Y, Iritani N, Kubo H, Kaida A, Murakami T, Haruki K, Nishio O,Ayata M, and Ogura H., "Genotyping of Norovirus Strains Detected in Outbreaks between April 2002 and March 2003 in Osaka City, Japan", Microbiol Immunol., 49(3):275-283(2005). Vinje J and Koopmans MPG., "Molecular detection and epidermiology of small round-structured viruses in outbreaks of gastroenteritis in the Netherlands", J. Infect. Dis., 174:610-615(1996).. Fankhauser RL, Noel JS, Monroe SS, Ando T, and Glsss RI., "Molecular epidemiology of "Norwalk-like viruses" in outbreaks of gastroenteritis in the United States", J. Infect. Dis., 178:1571-1578(1998).

Gallimore CI, Green J, Richards AF, Cotterill H, Broun DWG, and Gray JJ. 2004c.,"Methods for the detection and characterization of noroviruses associated with outbreaks of gastroenteritis : Outbreaks occurring in the north-west of England during two norovirus seasons", J. Med. Virol., 73:280-288(2004). Inouye K, Yamashita K, Yamadera S, Yoshikawa M, Kato N, and Okabe N., "Surveliiance of viral gastroenteritis in Japan: pediatric cases and outbreak incidents", J. Infect. Dis., 181:S270-S274(2000). Kukkula M, Maunula L, Silvennoinen E, and von Bonsdorff CH., "Outbreak of viral gastroenteritis due to drinking water contaminated by Norwalk-like viuses", J. Infect. Dis., 180:1771-1776(1999). P. W. Huang, D. Laborde, V. R. Land, D. O. Matson, A. W. Smith, and X. Jiang., "Concentration and Detection of Caliciviruses in Water Samples by Reverse Transcription-PCR", Appl. Envir. Microbiol., Vol. 66(10), 4383-4388(2000). D R Preston, T V Vasudevan, G Bitton, S R Farrah, and J L Morel Novel, "approach for modifying microporous filters for virus concentration from water", Appl. Envir. Microbiol., 54: 1325-1329(1988).