(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) A61K 36/54 (2006.01) A61P 1/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2006-0104224 (22) 출원일자 2006 년 10 월 25 일 심사청구일자 2006 년 10 월 25 일 (65) 공개번호 10-2007-0045121 (43) 공개일자 2007 년 05 월 02 일 (30) 우선권주장 1020050101034 2005 년 10 월 26 일대한민국 (KR) (56) 선행기술조사문헌 KR1020000003053 A KR1020030012359 A (45) 공고일자 2008년06월30일 (11) 등록번호 10-0842053 (24) 등록일자 2008년06월23일 (73) 특허권자 한국한의학연구원 대전유성구전민동 461-24 (72) 발명자 고병섭 충청남도천안시신부동대림아파트 208-604 전원경 서울특별시도봉구창동주공아파트 405 동 411 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이원희 전체청구항수 : 총 7 항심사관 : 강태현 (54) 계피추출물을유효성분으로함유하는장내균총개선및면역기능증진용조성물 (57) 요약 본발명은계피추출물을유효성분으로하는장내균총개선및면역기능증진용조성물에관한것으로, 구체적으로장내유익균인비피도박테리움롱검 (Bifidobacterium longum), 락토바실러스에스피 (Lacotobacillus sp.) 와락토바실러스아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 의생육을촉진하고일반면역계림프구와같은면역세포를증식시키는기능과함께장관면역계면역세포활성기능을갖는계피추출물을유효성분으로함유하는조성물에관한것이다. 본발명의조성물은장내유익균의생육을촉진하여장내균총조성을바람직하게변화시키고면역세포를증가시켜면역기능을증진특히장면역을활성시키므로변비또는장관련질환치료제및면역증진제로이용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자김영은대전유성구전민동 461-24 임신혁광주광산구월계동금광아파트 103동 1302호권호근서울노원구중계동신동아아파트 115동 602호 황지선경북경주시안강읍양월3리 1133-1번지권대영경기성남시분당구백현동산46-1 한국식품연구원 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 계피추출물을유효성분으로함유하는장내균총개선용조성물. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기계피추출물은물, 에탄올및메탄올로이루어지는군으로부터선택되는용매로부터추출되는것을특징으로하는장내균총개선용조성물. 청구항 3 제 1항에있어서, 장내균총은비피도박테리움롱검 (Bifidobacterium longum), 락토바실러스에스피 (Lactobacillus sp.) 및락토바실러스아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 로이루어진군으로부터선택되는하나이상의균주를포함하는것을특징으로하는장내균총개선용조성물. 청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 계피추출물을유효성분으로함유하는장내균총개선건강식품. 청구항 8 제 7항에있어서, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상또는환의형태로제조되는것을특징으로하는장내균총개선건강식품. 청구항 9 계피추출물을유효성분으로함유하는장관계면역증진용조성물. 청구항 10 제 9항에있어서, 면역증진은장림프절의면역세포증식촉진또는장림프절의 T-세포의사이토카인분비능향상을통해이루어지는것을특징으로하는면역증진용조성물. 명세서 발명의상세한설명 발명의목적 <9> 발명이속하는기술및그분야의종래기술본발명은계피추출물을유효성분으로하는장내균총개선및면역증진용조성물에관한것으로, 보다상세하게는장내유익균인비피도박테리움롱검 (Bifidobacterium longum), 락토바실러스에스피 (Lacotobacillus sp.) 와락토바실러스아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 의생육을촉진하고일반면역계림프구와같은면역세포를증식시키는기능과함께장관면역계의면역세포활성기능을갖는계피추출물을유효성분으로함유하는약학적조성물에관한것이다. - 3 -
<10> <11> <12> <13> <14> <15> <16> <17> 사람은출생과동시에, 미생물이장내에서식하기시작하여그집단이평형에도달하면안정된장내균총을형성한다. 장내균총은숙주의생리적조건, 음식물, 약물및스트레스등과같은여러가지요인에따라변동한다. 정상균총을구성하는미생물의숫자와활동은외래성인자 (aloogenic factor) 와내인성인자 (autogenic factor) 에의해서조절되는데 (Yazawa T., Letters in applied Mocrobiology 10: 229-232, 1990), 전자는숙주의환경이나식이등에서유발되며후자는균총내의미생물들사이에서주로일어나게된다. 즉, 정상균총의균형은장내의강한혐기적조건, 장의연동운동, 연속적인배설하에서장관내의서식처와영양원에대하여경쟁하는과정에서이루어지고일부는 ph, 산화환원전위, 담즙산, 생산되는박테리오신 (bacteriocin), 지방산, 유화수소등에의하여정상균총의균형이이루어지는것으로보고되어있다 (Yazawa K. and Tamura Z. Bifidobacteria Microflora 1(1): 39-44, 1982). 장내균총을구성하는개개의미생물은물질생산또는분해능에의해숙주에게피해또는이익을주기도하는데장내균총전체적으로볼때는비타민공급, 감염방지및장기능 ( 연동운동및흡수 ) 을돕는데관여하고있고이로인해균총의조성은변비, 장관련질환발생등과밀접한관계가있는것으로알려져있다 (Mistuoka T. Bifidobacteria Microflora, 1(1): 3, 1982). 노인들과장이좋지않은사람들은장내에비정상의균총 (Mitsuoka T, Journal of Industrial Microbiology, 6:263, 1990) 이형성되어있는데, 보통소장에서의균수가현저히증가하거나유익균인비피도박테리움 SPP(Bifidobacterium spp) 이줄어들거나없어지는반면 C. perfringers 등의 clostridium spp. 는현저히증가한상태인경우가많다. 따라서건강하게장수하기위하여비피도박테리움 spp 등의유용세균은많이, 그리고 c. perfringers 등의유해세균은적은상태로유지시키는이상적인장내균총을유지시키는것이제안되고있다 (Mitusoka T., Ecology and role of intestinal flora., Japan Scientific Society Press, Tokyo, p.1, 1989). 한편, 계피 (Cinnamomum cassia bark) 는녹나무과의사철푸른교목의껍질로중국의남부나월남등지에자생한다. 계피는교목의껍질, 계지는그가지, 육계는두터운껍질을말하며, 계심은오래된나무의두터운껍질을펴서말린것을의미한다. 계피에는정유 ( 계피알데히드75~90%, 신나밀알데히드등 ) 1~3.4%, 탄닌질 2~3%, 점액, 탄수화물등이포함되어있는데 5~6년자란나무에서정유함량이높다고한다. 계피는예로부터발한제, 해열제, 진통제뿐아니라식료품의향료등다양하게사용되어왔다. 또한, 장연동운동을촉진하고장내의이상발효를억제하는방부효과가있다고알려져있으나구체적인기작은알려져있지않다. 또한, 계피는예로부터체질이허약하고기혈이허한사람을위한한방약재로쓰여면역능력을촉진하는효과가있을것으로예상되어왔으나그정확한기작역시알려진바가없다. 따라서면역반응에관여하는기관인백혈구계세포 ( 림프구, 혈장세포, 식세포, 과립구 ) 또는림프기관 ( 임파절, 비장, 흉선, 장 ) 에계피가어떠한영향을미치는지관찰하면그기작을알아낼수있을것이다. 특히, 장관면역체계는외부에서들어오는많은음식항원들과정상균총들이함께공존하는곳에서면역관용이일어나고있는것을보여주는단적인예이다. 장관면역체계는음식이나정상세균총과같은무해한항원에대해서는반응하지않으면서도유해균이나바이러스같은해로운항원에대해서는선택적으로반응하는체계 ( 면역학적항상성 ) 를유지하고있다. 장내의면역항상성은정상인경우무해한항원들에대한구강면역관용과해로운항원들에대한면역작용에의해유지되나장내에서어떤기작에의해구강면역관용이깨지게되면음식에섞인항원에대한반응이나정상세균총및장벽자체에대한면역반응이발생하는염증성장염이유발되어장의소화기능및배설기능에큰장애를받게된다. 장관면역은 1차와 2차로나누어지는림프조직계중 2차림프조직계로분류되는생체림프조직의 1/3이상을차지하는점막림프기관의 3가지중에서장관관련림프상조직에속하면서장관의점막부위에존재하고장관면역계내면역글로블린에이반응 (IgA response) 을비롯하여생체방어에대단히중요한역할을담당한다 (Bienestock, J. et. al., Immunol., 41, 249 270(1980)). 장관면역의주요역할은가용성항원, 세균, 바이러스등을세포흡수작용 (pinocytosis) 이나식작용 (phagocytosis) 에의해섭취하여림프세포에이동시킴으로써세포의활성화에기여한다 (Trier, J., Gastroenterol. Clin. North Am., 20, 531 547(1991). 계피추출물을함유하는조성물관련특허로는계피추출물을함유하는동맥경화증예방및치료용조성물 ( 대한민국특허 10-1998-0021474), 육계피추출물을함유하는화장료조성물 ( 대한민국특허 10-1999- 0034707) 및나노입자화된계피추출물을함유하는구강위생증진용조성물 ( 대한민국특허 10-2002-0074210) 에관한것이있으나, 상기특허중어느것도계피의장내균총개선과면역증진활성에대해서는기술하고있지 - 4 -
않다. <18> 이에, 본발명자들은본발명의계피추출물을유효성분으로하는조성물이장내유익균인 Bifidobacterium longum, Lacotobacillus sp. 와 Lactobacillus acidophilus 에대해생육촉진효과를나타내고, 비장과장관내의림프구와같은면역세포를증식시키는기능이있어, 변비, 장관련질환치료제및면역증진제, 특히장관계면역증진제로사용할수있음을확인함으로써본발명을완성하였다. <19> 발명이이루고자하는기술적과제 본발명의목적은계피추출물을유효성분으로함유하는장내균총개선용조성물을제공하는것이다. <20> 한다. 또한, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는면역증진용조성물을제공하는것을목적으로 <21> 적으로한다. 또한, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는장관계면역증진용조성물을제공하는것을목 <22> 한다. 또한, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는면역증진용건강식품을제공하는것을목적으로 <23> <24> <25> <26> <27> <28> <29> <30> <31> <32> <33> <34> <35> 발명의구성및작용상기목적을달성하기위하여, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는장내균총개선용조성물을제공한다. 또한, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는면역증진용조성물을제공한다. 또한, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는장관계면역증진용조성물을제공한다. 또한, 본발명은장내균총을개선할수있는양의계피추출물을대상에게투여하는단계를포함하는장내균총개선방법을제공한다. 또한, 본발명은면역증진이요구되는환자에게면역증진에적합한양의계피추출물을투여하는단계를포함하는면역증진방법을제공한다. 또한, 본발명은약리학적유효용량의계피추출물을대상에게투여하는단계를포함하는치료를필요로하는환자의장관련질환의치료방법을제공한다. 아울러, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는면역증진용건강식품을제공한다. 이하, 본발명을상세히설명한다. 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는장내균총개선용조성물을제공한다. 계피 (Cinnamomum cassia bark) 는녹나무과의사철푸른교목의껍질로중국의남부나월남등지에자생한다. 예로부터발한제, 해열제, 진통제뿐아니라식료품의향료등다양하게사용되어왔고장연동운동을촉진하고장내의이상발효를억제하는방부효과가있다고알려져있으나구체적인기작은알려져있지않다. 한편, 미생물이장기관내에서식하기시작하여집단이평형에도달함으로써장내균총을형성하는데장내균총을구성하는개개의미생물은비타민공급, 감염방지및장기능등에관여하고이로인해균총의조성은변비, 장관련질환발생등과깊은관계가있다고알려져있다 (Mistuoka T. Bifidobacteria Microflora, 1(1): 3, 1982). 본발명자들은장기능개선효과가있다고알려진계피추출물이장내유익균에어떠한활성을나타내는지알아보았다. 먼저, 건조한상태의계피 ( 화진유통 ) 를수득하여이를열탕추출기에서 3시간추출한후, 상기추출액을여과지로여과하고감압증류장치로농축하여동결건조하고이를분말로만들었다. 상기추출분말시료를실험마다필요한농도가되도록멸균증류수에현탁시킨후, 여과하여사용하였다. 본발명의계피추출물은물, 단일또는혼합에테르, 에탄올, 메탄올및에틸아세테이트로이루어지는군으로부터선택되는하나이상의용매로추출하고감압농축함으로써제조되며, 상기용매는물을사용하는것이바람직하고, 상기추출은열탕, 냉침, 환류또는초음파등의방법에의할수있으며열탕추출인것이바 - 5 -
람직하다. <36> <37> <38> 한편, 다양한장내균총중장내유익균의지표로비피도박테리움롱검 (Bifidobacterium longum ATCC 15707), 락토바실러스에스피 (Lactobacillus sp. KCTC 3930), 락토바실러스아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus ATCC 4356) 를사용하는데상기균주들은 Reinforced Clostridial Media(RCM) 배지에서 37 BBL GasPak (Becton Dickinson and Company) 에넣은혐기적조건으로배양시켜사용하였다. 본발명자들은계피추출물이비피도박테리움롱검, 락토바실러스에스피및락토바시러스아시도필러스균주의생육활성에미치는영향을알아보기로하였다. 이를위하여분말시료로제작한계피추출물이여러가지농도로첨가된배지를만들고비피도박테리움롱검, 락토바실러스에스피및락토바시러스아시도필러스의전배양액을배지에접종하여배양한후, O.D (optical density) 를측정하여균의생육상태를조사하였다. 그결과, 계피추출물의양을늘릴수록균주의생육이증가하여 O.D. 값이높아지고생육활성비 ( 실험군의 O.D 값 / 대조군의 O.D. 값 ) 도증가함을관찰하였다 ( 도 1 참조 ). 또한, 직경 6 mm 디스크페이퍼에다양한농도로계피추출물을적하한후, 디스크페이퍼를굳힌배지위에일정간격을두고배치하여상기균주를배양한후생육활성환의크기를관찰하였다. 그결과, 표 1에나타난바와같이, 계피추출물 10mg/disc를배치한고체배지에서비피도박테리움롱검, 락토바실러스에스피및락토바시러스아시도필러스균주는모두넓은생육활성환을나타내어본발명의계피추출물이장내유익균에생육활성효능을갖는것을확인하였다 ( 표 1 참조 ). <39> <40> <41> <42> <43> <44> <45> <46> 또한, 계피추출물을마우스에경구투여하여마우스의혈액구성성분이어떻게변화하는지도관찰하기로하였는데이를위하여, 15일동안 500mg/kg/ 일의양으로계피추출물을경구투여하고그결과를관찰하였다. 15일후혈액구성성분은대조군과비교하여유의적으로차이를나타내지않았다 ( 표 2 참조 ). 또한, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는면역증진용조성물을제공한다. 본발명자들은기혈보충을위한한약재로사용되어온계피추출물이실제로생육활성효능뿐아니라면역세포증식능을갖는지관찰하기로하였다. 이를위하여, 계피추출물을투여한마우스의비장에서 T세포를분리하여분열능력을측정한결과과높은분열능력을나타내었다 ( 도 5). 또한, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는장관계면역증진용조성물을제공한다. 장관계면역은일반체액성면역과그작용영역및기작에있어서큰차이가존재하므로, 특정물질이체액성면역증진작용이있다고하여, 당해물질이곧바로장관계면역증진작용이있다고볼수는없다. 본발명자들은계피추출물을마우스에경구투여하여장관면역계와일반면역계미치는영향을관찰하기위하여, 마우스에계피추출물을경구투여한후, 장내면역반응의지표가되는장면역세포 ( 장림프절 T 세포와 B 세포, 라미나프로프리아단일핵세포 ) 의사이토카인발현량을관찰하였다. 그결과, 놀랍게도계피추출물을투여시, 대조군에비해면역반응을촉진및제어하는사이토카인의분비제어를통해장내면역활성이조절되어짐을확인하였다 ( 도 2, 3, 4 및 6 참조 ). 본발명의장내균총개선및면역기능증진용약학조성물은상기계피추출물을유효성분으로함유하고상기계피추출물은임상투여시에경구또는비경구로투여가가능하며일반적인의약품제제의형태로사용될수있다. 바람직한약제학적제제는정제, 경질또는연질캅셀제, 액제, 현탁제등과같은경구투여용제제가있으며이들약제학적제제는약제학적으로허용가능한통상의담체, 예를들어경구투여용제제의경우에는부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제또는증량제등을사용하여조제할수있다. 본발명의장내균총개선및면역기능증진용약학조성물에서, 계피추출물의투여용량은환자의상태, 연령, 성별및합병증등의다양한요인에따라전문가에의해결정될수있지만일반적으로는성인 1kg 당 0.1mg내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 1g의용량으로투여될수있다. 또, 단위제형당상기계피추출물의 1일용량또는이의 1/2, 1/3 또는 1/4의용량이함유되도록하며, 하루 1 내지 6 회투여될수있다. 그러나, 건강및위생을목적으로하거나또는건강조절을목적으로하는장기간의섭취의경우에는상기양은상기범위이하일수있으며, 유효성분은안전성면에서아무런문제가없기때문에상기범위이상의양으로도사용될수있음은확실하다. 본발명의계피추출물의원료인계피는천연약재로서안전성이확보되어있으며, 특히본발명의계피 - 6 -
추출물을랫트에경구투여하여독성실험을수행한결과, 독성시험에의한 50% 치사량 (LD 50 ) 은적어도계피추 출물 10 g/kg 이상인안전한물질로판명되었다. <47> <48> <49> <50> <51> <52> <53> <54> <55> <56> <57> <58> <59> <60> 아울러, 본발명은계피추출물을유효성분으로함유하는장내균총개선및면역기능증진용건강식품을제공한다. 본발명의계피추출물을식품으로사용할경우, 상기추출물을그대로첨가하거나다른식품또는식품성분과함께사용되고, 통상적인방법에따라적절하게사용될수있다. 유효성분의혼합양은그의사용목적 ( 예방, 건강또는치료적처치 ) 에따라적합하게결정될수있다. 일반적으로, 본발명의계피추출물을식품또는음료의제조시에원료에대하여 40 내지 70 중량 %, 바람직하게는 50 내지 60 중량 % 의양으로첨가될수있다. 건강식품의계피추출물의유효용량은상기약학적조성물의유효용량에준해서사용할수있으나, 건강및위생을목적으로하거나또는건강조절을목적으로하는장기간의섭취의경우에는상기범위이하일수있으며, 유효성분은안전성면에서아무런문제가없기때문에상기범위이상의양으로도사용될수있음은확실하다. 상기식품의종류에는특별한제한은없다. 상기계피추출물을첨가할수있는식품의예로는육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를포함한낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료및비타민복합제등을들수있다. 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 하기실시예는본발명을예시하기위한것이지본발명의내용이하기실시예로한정되지는않는다. < 실시예 1> 실험재료 <1-1> 계피추출물의제조화진유통에서구입한건조계피를분쇄한후, 열수추출기에서 3시간추출하였다. 계피열수추출물은여과지로여과하여상층액은회전식진공농축증발기로농축한후동결건조기 ( 일신 ) 를이용하여동결건조하여추출분말시료를만들었다. 상기추출분말시료를필요한농도가되도록멸균증류수에현탁시킨후, 여과하여사용하였다. <1-2> 장내세균준비장내유익균의지표로비피도박테리움롱검 (Bifidobacterium longum ATCC 15707), 락토바실러스에스피 (Lactobacillus sp. KCTC 3930), 락토바실러스아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus ATCC 4356) 를사용하였다. 균주들은 Reinforced Clostridial Media(RCM, Difco, USA) 배지에서 37 BBL GasPak(Becton Dickinson and Company, USA) 에넣은혐기적조건으로배양하여사용하였다. < 실시예 2> 계피추출물이장내유익균의생육활성에미치는영향확인본발명의계피추출물이장내유익균중비피도박테리움롱검, 락토바실러스에스피및락토바실러스아시도필러스균주의생육활성에미치는영향을알아보기위하여, 하기와같은실험을수행하였다. 계피추출물이장내유익균의생육활성에미치는영향에대한실험은 3번반복하여실시하였고, 실험결과는물로처리한대조군에대해계피추출물을처리한실험군의 O.D. 값에대한비로나타내었다. <2-1> 액체배양에의한생육활성실험계피추출물이장내세균의생육에미치는영향을조사하기위해계피추출물을동결건조시켜만든엑기스기질을 100ug, 1mg, 10mg/ml 농도로첨가한변형된 EG(Eggerth Gagnon) 배지 (beef extract 2g, proteose peptone No.3 10g, yeast extract 5g, Na 2 HPO 4 4g, soluble starch 0.5g, glucose 1.5g, L-cysteine 0.4g, silicon antifoamer 0.25ml, Tween 80 0.5g, D.W 1,000ml) 를만들었다. 이에실시예 <1-2> 와같이혐기적조 건에서활성화시킨비피도박테리움롱검, 락토바실러스에스피및락토바실러스아시도필러스의전배양액을접 종하여혐기적으로 37 에서 18 시간배양한후, 600nm 에서 O.D. 를측정함으로써균의생육상태를조사하였다. <61> 실험결과는물로처리한대조군의 O.D. 값에대해계피추출물을처리한실험군의 O.D. 값에대한비로나타내었다. 계피추출물을포함한액체배지에서장내유익균의생육활성정도를측정한결과, 도 1에나타난바와같이계피추출물의양을늘릴수록균주의생육이증가하여 O.D. 값이높아졌는데계피추출물 10 mg/ml로첨가하였을때, 대조군에비해최대 2.4배락토바실러스에스피의생육을촉진하였고비피도박테리움롱검과락 - 7 -
토바실러스아시도필러스균주도계피추출물의농도가증가함에따라균주의생육활성비도증가함을관찰하였 다. <62> <63> <64> <2-2> 아가분산법 (Agar diffusion method) 에의한생육활성실험 EG 한천배지를멸균한후 50 로식히고 3 종의균주가각각 2~3% 포함되도록군주를접종한플레이트 3개를만든후, 상온에서배지를굳혔다. 직경 6 mm 디스크페이퍼 (Whatman paper No.41) 에 0.1mg, 1mg, 10mg 농도가되도록계피추출물을적하한후, 이를굳힌배지위에일정간격을두고배치하였다. 상기배지를혐기적조건으로 37 에서 48시간배양한다음생육활성환의크기를관찰하였다. 그결과, 표 1에나타난바와같이, 계피추출물 10mg/disc를배치한고체배지에서비피도박테리움롱검균주는 + 정도의생육활성환을나타내었고락토바실러스에스피균주는 + 정도의생육활성환을나타내었고락토바실러스아시도필러스균주는 +++ 정도의넓은생육활성환을나타내어본발명의계피추출물이높은생육활성효능을갖는것을확인하였다. 표 1: 계피에대한장내균총개선활성결과 표 1 <65> Strain Dose (mg/disc) 0.1 1 10 B. longum n n + C. perfringens n - - Lactobacillus sp. n + + L. acidophilus + ++ +++ <66> n : no effect, + : 직경 10-14 mm ++ : 직경 15-19 mm, <67> <68> <69> +++ : 직경 20-24 mm - : inhibitory zone 직경 10-14 mm < 실시예 3> 마우스경구투여시계피추출물이혈액에미치는영향확인본발명자들은계피추출물을마우스에경구투여하였을때혈액구성성분의변화를관찰하기로하였다. 이를위하여, 6 주령의수컷 (male) 마우스를대조군, 계피추출물경구투여군 ( 각군당 3마리씩 ) 으로나누고 15일동안 500mg/kg/ 일의양으로계피추출물을경구투여하였다. 혈액조성의분석은쿨터카운터 (coulter counter, COLUTER JT) 를사용하였고, 결과는표 2로나타내었다. 표 2 <70> 테스트정의대조군계피추출물 체중체중 38.49±2.356b) 36.61±3.192 WBC 백혈구 (leukocyte) 2.77±0.831 2.5±1.127 LY 림프구 71.77±6.725 53±9.582 MO 단핵구 (mononuclear cell) 9.83±3.85 6.4±4.667 GR 과립구 (Granulocytes) 18.40±5.449 38.73±13.462 LY# 림프구 2.00±0.648 1.3±0.656 MO# 단핵구 0.28±0.117 0.2±0.141 GR# 과립구 0.48±0.223 1±0.656 RBC 적혈구 (erythrocyte) 6.18±0.939 6.34±0.333 HGB 헤모글로빈 10.13±1.568 10.33±0.416 HCT 적혈구용적률 31.57±4.807 33.13±1.115 MCV MCH 평균혈구부피 (Mean corpuscular volume) 평균혈구헤모글로빈 (Mean corpuscular hemoglobin) 51.11±1.426 52.3±1.646 16.39±0.306 16.3±0.529 MCHC 평균혈구헤모글로빈농도 32.06±0.712 31.17±0.252-8 -
RDW 적혈구부피분포폭 (distribution width) 16.54±0.677 15.73±1.415 PLT 혈소판 (thrombocyte) 88.00±21.463 108.67±16.773 MPV 평균혈소판 (thrombocyte) 부피 4.24±0.374 4.23±0.153 <71> <72> <73> <74> <75> <76> <77> <78> <79> <80> <81> <82> 표 2에나타난바와같이, 마우스에서계피추출물을경구투여하였을때, 투여군과대조군은유의적으로차이를나타내지않았다. < 실시예 4> 마우스의장관계면역증진효능확인 <4-1> 마우스장면역세포분리계피추출물의구강투여시호스트의면역체계에미치는영향을알아보기위해서마우스비장 (spleen), 림프절 (lymph node), 장림프절 (mesentric lymph node), 라미나프로프리아 (Lamina propria mononuclear cells) 을각각분리하였다. 구체적으로, 계피추출물의구강투여를마친후실험용마우스를희생하여비장, 장림프절그리고장을적출한후비장과장림프절에서 T 세포와 B 세포의분리를위하여 자기적방법 을사용하였다. 자기적방법이란 T 세포와 B 세포에특이적인자기적비드를이용하여 T, B 세포에결합시킨뒤이것을강한자기장위에위치하게하여자기적비드가붙은 T, B 세포가자기장에고정되게하여비특이적세포들을제거하고후에자기장을제거함으로서원하는 T 세포와 B 세포를획득하는방법이다. 장에서라미나프로프리아단일핵세포를분리하기위해일단장을적출한후그것을콜라겐네이즈효소 (Type I collagenase, Sigma, USA) 를이용하여장의근육조직을일차적으로제거한후 (3시간동안 1% 콜라겐네이즈처리 ) 근육조직의밑에위치하고있는라미나프로프리아층에서세포를단일세포화시킨후마지막으로퍼콜 (fercoll) 농도구배방법을이용하여살아있는라미나프로프리아단일핵세포를획득하였다. <4-2> 마우스장림프절의 T 면역세포가분비하는사이토카인발현량측정 PMA(Sigma, USA) 와이오노마이신 (Ionomycin, Kalbiochem, Switzerland) 을이용하여세포에자극을주었으며, 생체내조건과가깝게하기위해생체내 T 세포를대상으로수행하는실험에서쓰이는 CD3와 CD28 항체 (BD bioscience, USA) 를이용하여일정시간 (48시간) 자극을가한뒤장림프절에위치하는 T 세포에서나타나는변화양상을확인해보았다. 그결과, 장림프절에 T 세포에서의미있게나타난단백질 ( 면역유도물질 ) 의변화는약 2가지정도를확인할수있었는데, 먼저, 장림프절 B 세포에서나타났던티엔에프알파 (TNF-α, tumor necrosis factoralpha) 의경우 B 세포의결과와동일하게자극에관계없이대조군세포에비해 mrna 발현양이많음을확인할수있었다. 그러나현재계피추출물에의해유도된다고보고되었던인터페론감마 (Interferon gamma) 의경우는세포가받는자극에따라다른패턴을나타내나계피추출물에의해서는증가하는경향을확인할수있었다 ( 도 2a 및도2b) <4-3> 마우스장림프절의 B 면역세포가분비하는사이토카인발현량측정마우스에 10일동안계피추출물을 500mg/kg/ 일, 5000mg/kg/ 일을구강투여한뒤생쥐를희생하고자기적방법에의해장림프절에서 T 세포와 B 세포를분리하였다. 상기 PMA와이오노마이신을이용하여분리한세포에자극을주었으며, 보다더동물의실제상황에가깝게접근하기위해 in vivo B 세포를자극하기위해사용되는 LPS (lipopolysscaride) 를이용하여역시 B 세포에 4시간자극을가한후각그룹의 B 세포가나타내는변화를확인하였다. 삭제 <83> 그결과, 대조군에비해실험을통해확인하였던분자물질중실험군에서의미있는변화가있음을확인하였는데, 우선 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha) 의경우대조군에서는발현양이거의확인되지못할정도로미비하였으나 500mg/kg/ 일, 5000mg/kg/ 일경구투여두그룹모두에서대조군에비해자극에관계없이특이적인과발현패턴을확인하였다 ( 도 3a). 인터루킨-10의경우도앞의티엔에프알파단백질경우와같은발현양상을보여주었으며 ( 도 3b), 인터루킨-4의경우는자극이없을때와 PMA/ 이오노마이신자극이가해졌을때는 - 9 -
대조군에비해소폭의증가를보였으나 LPS 를이용하여자극을주었을때는대조군에비해약 100 배이상발현 양이증가함이확인되었다 ( 도 3c). 뿐만아니라인터페론감마의발현양역시농도에의존적인경향성을보이 며자극의종류에관계없이뚜렷이증가함을확인할수있었다 ( 도 3d). <84> <85> <86> <87> 일반적으로장관면역계에대한연구를할때가장중요시되는세포가라미나프로프리아단일핵세포이다. 이세포는장의외피세포바로아래위치하는면역세포로서장관면역을조절하는가장큰세포라인식되어지고있다. 하지만많은연구자들이그세포의획득에어려움으로그것을이용한실험을못하고있는실정이다. 그러나본실험에앞서실험방법에서언급했던것과같은방법으로라미나프로프리아단일핵세포를획득하는방법을확립하였고그에따라그세포를이용하여앞서진행하였던실험과동일한방법으로자극을주어 (PMA/Ionomycin, LPS, 항-CD3/ 항-CD28) 계피추출물에대한 mrna 발현양의변화를확인하였다. 라미나프로프리아단일핵세포에대한계피추출물에대한반응물질분석결과는특이적으로인터페론감마 (Interferongamma) 가대조군에비해큰변화를나타내는것으로확인할수있었다.( 도 4). < 실시예 5> 마우스비장과장림프절면역증진효능확인 <5-1> 마우스비장 T 헬퍼세포분리마우스비장에서 CD 4+ T 헬퍼세포를분리하기위하여실험용쥐를희생한후그것에서비장을적출하였다. 비장의적출후비장의조직을물리적힘을통해파괴하여단일세포가통과할수있는정도의필터 (40μm nyron mesh; Falcon) 에흘려주어단일세포화하였다. 비장세포의단일화후 CD 4+ T 세포의분리를자기적방법을통해분리한후 CD4에특이적으로결합할수있는금속성비드 (Miltenyi Biotec, USA) 를첨가하여우선 CD 4+ T 세포표면에붙도록하였다. 그후세포를강한자기장위에위치시켜금속성비드가붙어있지않은세 포들을제거하고그후자기장을제거하는방법을통해 CD 4+ T 세포를마우스비장에서획득할수있었다. <88> <89> <5-2> 계피추출물의구강투여시마우스비장과장림프절 T 세포에분열능력에미치는영향의평가한방에서알려진사실을바탕으로하여본실험자는계피추출물의구강투여가호스트 T 세포에분열능력에미치는영향을평가해보았다. 실험에앞서 8주간 20회에걸쳐실험용쥐에계피추출물을 (500mg/kg/1회) 을구강투여하였으며구강투여가끝난후쥐를희생하여비장과장림프절을적출하였다. 적출된두조직에서앞서언급한방법과같은방법으로 CD 4+ T 헬퍼세포를분리하였다. 분리한 T 세포의분열능력의측정을위해일단동일수의세포에항-CD3 항체 (1ug/ml) 및항-CD28 항체 (1ug/ml) 로자극후약 3일간세포배양을통해세포 가자극에대해충분히반응및분열할수있는시간을주었다. 그후방사선동위원소 ([ 3 H]-thymidine) 를일정량첨가하여그것이세포내 DNA에결합하도록하여증가한세포의수를방사성동위원소의방사능을측정함으로서세포의분열정도를비교하였다. 그결과, PBS를구강투여한 T 세포에비해계피추출물을투여한 T 세포가비장과장림프절모두에서자극에대해더높은분열능력을가지고있음을확인할수있었다 ( 도 5). <90> <91> <92> <5-3> 계피추출물의구강투여시마우스비장과장림프절 T 세포에인터페론-감마와 TNFα의발현능력측정선행실험을통해계피의구강투여가 T 세포에서면역증강작용을하며면역에대표적인사이토카인 (cytokine) 인 INFγ와 TNFα의발현양을자극에반응하여비투여그룹의 T 세포에비해 mrna 레벨을증가시킴을확인할수있었다. 이러한실험결과를바탕으로하여단백질수준에서위의두가지사이토카인의발현을평가해보았다. 이를위해상기실험과같은방법으로계피를구강투여한실험쥐와 PBS를구강투여한실험쥐에서비장과장림프절각각에서 T 세포와 B 세포를분리하였다. 이렇게분리된 T 세포와 B 세포가사이토카인을생산할수있도록일정시간동안 PMA와이오노마이신을이용하여자극을준뒤, 이렇게자극에의해생산된사이토카인이세포외부로의방출을막기위해 Brefeldin A(Epicentre biocompany; B901MG, USA) 를자극을받은세포에처리하여 ER에서의생성단백질의이동을막는작업을하였다. 이렇게일정시간 ER내에서의단백질의이동을막은뒤, 세포에투과완충용액 (permeabilization buffer; 0.5% saponin, 1% BSA in D.W) 를이용하여세포막에구멍을만들고그렇게구멍이만들어진세포에특정형광물질 ( 항-IFN-PE, 항-TNFa-PE) 로표지되어있는 INFγ와 TNFα를첨가하여세포내부에서만들어진사이토카인의양을유세포측정기를이용하여측정하였다. 그결과, 계피를구강투여하였을경우대조군 (PBS 투여실험쥐 ) 에비해비장의 T 세포에서는 TNFα의발현이경미하게증가함을알수있었으며장림프절 T 세포에서는그발현양의증가가대단히커짐을확인할수있었다. 하지만 INFγ의발현증가는거의확인할수없었으며 B 세포에서는두사이토카인모두가대조군과 - 10 -
실험군에서차이를확인할수없었다 ( 도 6). <93> <94> <95> <96> <97> <98> <99> <100> < 실시예 6> in vitro 리포터어세이시스템에서면역증진효능확인 <6-1> 계피추출물이사이토카인의발현에미치는영향에대한 in vitro 스크리닝 in vivo 실험에앞서계피추출물이호스트의면역체계에어떠한영향을미치는지에대한간접적실험으로루시퍼라제리포터어세이시스템 (TaKaRa, Japan) 을이용하여계피추출물이면역세포의사이토카인 (cytokine) 의발현에미치는영향을스크리닝하였다. 먼저, 루시퍼라제유전자를가진벡터 (pxpg vector, Plasmid 44, 173-182, 2000) 앞쪽에 IL2, IL4, IL10, IL24, TNFα 사이토카인의프로모터지역을클로닝방법을통해삽입하여루시퍼라제의활성이업스트림의사이토카인프로모터의발현정도에의해조절될수있도록재조합벡터를만들었다. 상기제조과정은구체적으로, XhoI 그리고 KpnI 제한효소를이용하여루시퍼라제가발현되기시작하는부위의앞부분을잘라벡터를준비하고인서트의경우는생쥐에서 T 세포를분리한뒤게놈 DNA를뽑아낸후그것에서각프로모터특이적이며양쪽끝에 XhoI과 KpnI 제한효소자리를그리고앞쪽에시작코돈을가지는프라이머를이용하여 PCR 방법을이용하여프로모터부위를증폭후증폭되어진프로모터를두제한효소를이용해자른후그것을다시정제하여준비한후, 이렇게준비된벡터와인서트를리가제 (New England Biolabs) 를이용하여연결시켰다. 상기와같이만들어진재조합벡터로마우스 T 세포주의한종류인 EL4 세포 (ATCC; TIB-39) 를 lipoplex 방법 (Invitrogen; Lipofectamine 2000) 을이용하여형질감염시킨뒤계피추출물만으로또는계피추출물과 PMA+ 이오노마이신으로 T 세포주에자극을일정시간준뒤루시퍼라제활성을루시퍼라제분석용키트 (Dual luciferase assay system, Promega, USA) 를이용하여측정하였다. 실험에사용된유전자프로모터는앞서언급한것과같이 IL2, IL4, IL10, IL24, TNFα 다섯가지를측정하였으나여러번의반복적인실험을통해계피추출물의자극에의해활성이증가하는사이토카인이 TNFα임을확인할수있었다. 즉계피추출물로세포주에자극을주었을경우자극을주지않았을경우에비해농도별로그활성이증가하며 1% 의계피추출물로자극을주었을경우약 5~6배의루시퍼라제활성을나타냄을확인할수있었고계피추출물과 PMA+ 이오노마이신으로함께자극을주었을경우에는 0.1% 와 0.3% 농도로함께자극을주었을때그활성이단지 PMA+ 이오노마이신으로자극을주었을때보다증가하는것을확인할수있었다 ( 도 7). < 실시예 7> 래트에대한경구투여급성독성실험 6주령의특정병원체부재 (specific pathogen-free, SPF) SD계랫트를사용하여급성독성실험을실시하였다. 군당 5 마리씩의동물에실시예 1에따라조제된계피추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈용액에현탁하여 1g/ kg, 5g/ kg및 10g/ kg의용량으로 1회단회경구투여하였다. 시험물질투여후동물의폐사여부, 임상증상, 체중변화를관찰하고혈액학적검사와혈액생화학적검사를실시하였으며, 부검하여육안으로복강장기와흉강장기의이상여부를관찰하였다. 그결과, 시험물질을투여한모든동물에서특기할만한임상증상이나폐사된동물은없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부검소견등에서도독성변화는관찰되지않았다. 이상의결과, 본발명의계피추출물은랫트에서 10 g/ kg까지독성변화를나타내지않으며따라서, 경구투여중간치사량 (LD 50 ) 은실시예 1 에따라조제된계피추출물 10 g/kg 이상인안전한물질로판단되었다. <101> <102> <103> <104> <105> < 제제예 1> 연질캅셀제의제조실시예 1에따라조제된계피추출물 100.0mg, 콩기름 175.0mg, 황납 45.0 mg, 야자경화유 127.5mg, 대두인지질 21.0mg, 젤라틴 212.0mg, 글리세린 ( 비중 1.24) 50.0mg, 디-소르비톨 76.0mg, 파라옥시안식향산메칠 0.54mg, 파라옥시안식향산프로필 0.90mg, 메칠바닐린 0.56mg, 황색 203호적량의성분이 1 캅셀중에함유되도록약전제제총칙중연질캅셀의제법에따라제조하였다. < 제제예 2> 정제의제조실시예 1에따라조제된계피추출물 100.0mg, 옥수수전분 90.0mg, 유당 175.0mg, 엘-하이드록시프로필셀룰로오스 15.0mg, 폴리비닐피롤리돈90 5.0mg 및에탄올적량의원료를균질하게혼합하여습식과립법으로과립화하고스테아린산마그네슘 1.8mg을가하여혼합한후 1정이 400mg이되도록타정하였다. < 제제예 3> 캅셀제의제조 - 11 -
<106> <107> 실시예 1 에따라조제된계피추출물 100.0mg, 옥수수전분 83.2mg, 유당 175.0mg 및스테아린산마그네 슘 1.8mg 의원료를균질하게혼합하여 1 캅셀에 360mg 이함유되도록충전하였다. < 제제예 4> 산제의제조 <108> <109> 계피추출물 유당 2g 1g <110> <111> <112> <113> <114> <115> <116> 상기의성분을혼합하고기밀포에충진하여산제를제조하였다. < 제제예 5> 츄잉껌의제조실시예 1에따라제조된계피추출물 0.24 0.64%, 껌베이스 20%, 설탕 76.36 76.76%, 후르츠향 1% 및물 2% 의조성및함량으로하여통상적인방법을사용하여츄잉껌을제조하였다. < 제제예 6> 음료의제조실시예 1에따라제조된계피추출물 0.48 1.28mg, 꿀 522mg, 치옥토산아미드 5mg, 니코틴산아미드 10mg, 염산리보플라빈나트륨 3mg, 염산피리독신 2mg, 이노시톨 30mg, 오르트산 50mg및물 200ml의조성및함량으로하여통상적인방법을사용하여음료를제조하였다. < 제제예 7> 소세지의제조실시예 1에따라제조된계피추출물 0.24 0.64%, 돈육 63.6%, 계육 27.5%, 전분 3.5%, 대두단백 1.7%, 식염 1.62%, 포도당 0.5% 및기타첨가물 ( 글리세린 ) 0.94 1.34% 의조성및함량으로하여통상적인방법을사용하여소세지를제조하였다. <117> 발명의효과본발명의계피추출물을유효성분으로함유하는조성물은장내균총개선및면역기능증진용조성물은장내유익균인비피도박테리움롱검 (Bifidobacterium longum), 락토바실러스에스피 (Lacotobacillus sp.) 와락토바실러스아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 에대해생육활성효과를나타내고, 일반면역계및장관계면역계림프구와같은면역세포증식능을높이는기능이있으므로계피추출물을첨가한요구르트제품, 계피추출물을첨가한유제품, 소화능력이떨어진노인이나와병환자의소화능력을향상시켜줄수있는계피음료, 한방소화제, 변비, 숙변치료제등의장관련질환치료제및면역증진제로이용될수있다. <1> <2> <3> <4> <5> <6> <7> 도면의간단한설명도 1은계피추출물을포함한액체배지에서장내유익균의생육활성정도를측정한결과를나타낸그래프이다. 도 2a는계피추출물을경구투여하였을때마우스장림프절에서분리한 T 면역세포에의한 IFNgamma의발현양을측정한결과를나타내는그래프이고, 도 2b는계피추출물을경구투여하였을때마우스장림프절에서분리한 T 면역세포에의한 TNF-α발현량을측정한결과를나타낸그래프이다. 도 3은계피추출물을경구투여하였을때마우스장림프절에서분리한 B 면역세포에의한각종사이토카인의발현량을측정한결과를나타내는그래프로서, 도 3a는 TNF-α, 도 3b는 IL-10, 도 3c는 IL-4 및도 3d 는 IFN-gamma의발현량을측정한결과를나타낸다. 도 4는계피추출물을경구투여하였을때마우스라미나프로프리나에서분리한단일핵세포에의한 IFN-gamma 발현량을측정한결과를나타낸그래프이다. 도 5는계피추출물을경구투여한후비장과장림프절에서 CD 4+ T-세포분리후항-CD3 항체및항- CD28 항체로자극을준후 T-세포증식력을측정한그래프이다. 도 6은마우스에계피추출물을경구투여한후비장과장림프절에서 CD 4+ T-세포와 B-세포분리후 PMA와이오노마이신으로 6시간자극후 TNFα와 IFN-gamma의세포내생성량을유세포분석기로측정한그래프이다. 도 7은마우스림포마 T-세포인 EL4세포에 TNFαlapha 리포터벡터를발현시킨후계피추출물처리했을때투여농도에따라변화되는리포터유전자의발현정도를측정한그래프와 PMA 및이오노마이신과계피추출 - 12 -
물을함께처리한후변화되는리포터유전자의발현정도를측정한그래프이다. <8> 도면 도면 1 도면 2a - 13 -
도면 2b 도면 3a 도면 3b - 14 -
도면 3c 도면 3d 도면 4-15 -
도면 5 도면 6-16 -
도면 7-17 -