Korean J. Ichthyol. 13(4), 248~253, 2001 대농갱이 (Leiocassis ussuriensis) 의초기생식소형성및성분화 박상용 이윤아 최경철 * 강언종 ** 방인철 순천향대학교해양생명공학과, * 충북내수면연구소, ** 국립수산진흥원진해내수

Korean J. Ichthyol. 13(4), 248~253, 2001 대농갱이 (Leiocassis ussuriensis) 의초기생식소형성및성분화 박상용 이윤아 최경철 * 강언종 ** 방인철 순천향대학교해양생명공학과, * 충북내수면연구소, ** 국립수산진흥원진해내수면연구소 Early Gonadogenesis and Sex Differentiation in the Bagrid Catf ish, Leiocassis ussuriensis Sang Yong Park, Youn-A Lee, Kyong Cheol Choi*, Eon-Jong Kang** and In Chul Bang Department of Marine Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 336-745, Korea, *Chungbuk Inland Fisheries Research Institute, Chungju 380-250, Korea, **Chinhae Inland Fisheries Research Institute, NFRDI, Chinhae 645-806, Korea An histological study was conducted to determine the initial treatment time and treatment duration in the use of sex-reversal hormones in relation to gonadal development and sexual differentiation in the bagrid catfish, Leiocassis ussuriensis. The primordial germ cell, which could be recognized from one-day-old fry, began to protrude into the peritoneal cavity between the mesonephric duct and the gut. The primordial gonad with a genital ridge was developed at 5~10 days after hatching. Sex differentiation of the ovary was identified by the ovarian cavity and meiotic oocytes from 20-day-old larvae. Testicular differentiation was also identified by spermatogonial cells from 20-day-old larvae. It may therefore be concluded that this species belongs to the differentiated type of gonochoristic teleost. Key words : Bagrid catfish, Leiocassis ussuriensis, early gonadogenesis, sexual differentiation 서론 대농갱이, Leiocassis ussuriensis는분류학상메기목 (Order Siluriformes) 동자개과 (Family Bagridae) 에속하며여기에는 Leiocassis longirostris, L. nitidus, L. ussuriensis, Pseudobagrus breicorpus, P. fulvidraco, P. koreanus 6종이있다. 대농갱이는전장이 50 cm에이르는대형종으로한강과금강등우리나라의각종하천에서식하며북한과중국, 러시아에도분포한다 (Lee and Kim, 1990). 하천의중류나하류, 비교적물이맑은곳에 서살며어린물고기, 물고기의알, 새우무리, 물에서사는곤충, 실지렁이등을잡아먹는육식성이다. 본종은매운탕으로기호도가높은중요식용어이나최근자연자원의감소와수요의증가로양식의필요성이점차요구되고있다. 따라서현재자원증식및국내수요를증식시키기위한인위적인양식은아직이루어지진않았으나본연구진들에의해종묘생산은시도되고있으며차후담수양식어류의새로운대체품종으로기대되는종이다 ( 정, 1977). 대농갱이는수컷의성장이암컷보다월등히빨라실제양식현장에서는전수컷종묘의생산이생산성을높일 248

대농갱이의초기생식소형성및성분화 249 수있다. 전수컷집단을생산할수있는방법에는유전학적성전환과생리학적성전환이있는데, 유전학적성전환은우선자성호르몬처리에의해생산된 phenotypic female (genetic male) 을친어로사용하여단순교배에의한전수컷집단을생산하는방법이다 (Yamamoto, 1969). 이는간편한방법이기는하나, 실제종간교배에사용되는친어가유전적으로순수하지못할경우 100% 단성개체를생산하기어렵다는단점이있다 (Fishelson, 1966). 이러한문제점을해결하기위한방편으로호르몬처리에의해미분화된자어의성전환을유도하여전수컷집단을생산하는생리학적성전환방법이그효용성이높아널리이용되고있다 (Nakamura, 1982; Hunter and Donaldson, 1983). 하지만이를위해선호르몬에대한대상종의민감성, 호르몬의농도, 처리방법, 최초처리시기및처리기간등을알아야한다 (Pandian and Sheela, 1995). 따라서정확한성전환처리방법을구명하기위해선우선성분화과정을조직학적인방법으로조사하는것이필요하다. 본연구에서는성전환에의해수컷대농갱이를생산하기위한기초연구의일환으로우선본종의생식소기관형성과초기생식소발달을조직학적으로조사하여, 대농갱이의성종류및초기미분화생식소의난소또는정소로분화하는양상을구명하고정확한호르몬처리시기및기간을결정하고자하였다. 지물벼룩을공급하였으며, 매일 1/3 정도의사육수를교체하였다. 생식소관찰을위한자치어의표본은단계별로부화직후에서 7일까지는매일, 7~10일까지는 3일, 10~30일까지는 5일, 30~80일까지는 10일, 80~120일까지는 20 일, 120~150일까지는 30일간격으로무작위로 20~30 마리씩표본하였다. 표본된 20~30마리전어체를버어니어캘리퍼스로전장은 0.01 mm 단위까지, 체중은전자저울 (Sartorius, Germany) 을사용하여 1 mg 단위까지측정하였다. 측정이끝난표본은중성포르말린또는 Bouin s solution으로고정한후 24시간후에 70% alcohol로교체하였다. 4. 생식소조직관찰생식소조직관찰을위하여고정한표본을전어체, 또는생식소출현부위를파악하여부위별로파라핀에포매하여 5 µm 두께로 transverse section하였다. 이후각절편은 Harris s haematoxylin과 Eosin-phloxine B 로비교염색하였다. 작성한조직절편슬라이드를생물현미경 (Olympus, Japan) 하에서검경하여생식소발달과정과암 수로의생식소성분화양상을조사하였다. 각단계별특징적인조직상을생물현미경에부착된디지털카메라 (Olympus, Japan) 로촬영하였다. 재료및방법 1. 실험어대농갱이의초기생식소형성및성분화과정을조사하기위하여충남부여의백마강에서그물망으로채집 한친어 ( 평균전장 : 20.6 cm, 평균체중 : 57.9 g) 를사용하였다. 2. 산란유도및부화대농갱이의산란유도를위하여인간융모막성성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin, hcg, Sigma, USA) 을어체중당 20,000 IU/kg로주사하고 24 시간이경과한후복부를가볍게눌러알을얻었다. 건식법에의해알과정자를수정시킨후수정란의점착력을제거하기위하여 1.5% 의 Na 2 SO 3 에침지하여젤리층을제거한다음 25 C 에서부화시켰다. 3. 사육및표본부화한자치어는인공배합사료섭식이가능한시기까 Table 1. Growth on the total length and body weight of bagrid catfish during the rearing days Days after Total length Body weight hatching (mm)* (g)* 0 5.2±0.03-1 6.2±0.02-2 7.3±0.47-3 8.7±0.10-4 10.3±0.50-5 10.8±0.10-6 11.0±0.10-7 11.2±1.30-10 13.6±1.30-15 16.3±2.20-20 19.4±2.50-25 20.3±4.30 0.11±0.1 30 24.9±4.00 0.17±0.1 40 31.7±5.60 0.34±0.3 50 35.7±7.30 0.61±0.3 60 36.7±7.60 0.68±0.3 70 44.8±1.80 1.17±0.2 80 48.9±4.40 1.23±0.2 100 74.0±13.30 4.94±2.8 120 84.6±16.50 6.88±3.9 150 109.2±26.40 14.37±8.1 * Mean±SD - Not measured

250 박상용 이윤아 최경철 강언종 방인철 결 1. 사육기간에따른성장 과 0.03 mm이었으며부화후 150일에는 109.2±26.4 mm 로성장하였고, 체중은부화후 25일에 0.11±0.1 g에서부화후 150일에는 14.37±8.1 g으로성장하였다 (Table 1). 대농갱이의크기와사육일수에따른성분화과정을관찰하기위하여부화후사육일수에따른전장및체중성장을조사하였다. 전장은부화직후에평균 5.2± 2. 초기생식소형성 원시생식세포 (primordial germ cell) 의출현과원시생 Fig. 1. Transverse section of the gonad in bagrid catfish, L. ussuriensis. a~d; undifferentiated gonads, e~h; differentiated ovaries, i~l; differentiated testes. (a) 0.62 cm in total length (TL) fry. Scale bar, 10 µm. Arrows indicate primordial germ cells; MD, mesonephric duct. (b) 1.08 cm in TL larva. Scale bar, 25 µm. Arrows indicate primordial gonads. (c) 1.10 cm in TL larva. Scale bar, 10 µm. GR, Genital ridge. (d) 1.36 cm in TL larva. Scale bar, 10 µm. PGO, primordial gonad. (e) 1.94 cm in TL female. Showing meitotic divisions and ovarian cavity of germ cells. Scale bar, 10 µm. MP, meiotic prophase; OC, ovarian cavity. (f) 3.57 cm in TL female. Scale bar, 25 µm. PNO, peri-nucleolus oocyte. (g) 7.40 cm in TL female. Scale bar, 50 µm. PNO, peri-nucleolus oocyte. (h) 8.46 cm in TL female. Scale bar, 25 µm. (i) 1.94 cm in TL male. Scale bar, 10 µm. SG, spermatogonia. (j) 3.17 cm in TL male. Scale bar, 10 µm. SG, spermatogonia. (k) 7.4 cm in TL male. Scale bar, 25 µm. SG, spermatogonia. (l) 10.92 cm in TL male. Scale bar, 25 µm. SC, spermatocytes; ST, spermatids.

대농갱이의초기생식소형성및성분화 251 식소를구성하는조직의초기분화는부화 1일째부터 15일을전후한자어에서일어나고있는것이관찰되었다 (Fig. 1a~d). 원시생식세포는부화직후자어에서는발견되지않았으며부화 1일째자어 ( 평균전장 : 0.62 cm) 에서처음으로출현하였는데중신관 (mesonephric duct, MD) 과장 (gut, G) 사이의장간막양측면에위치하고있었다. 원시생식세포는주변세포와쉽게구별될수있는난형의세포로직경이 10 µm이며 hematoxylin에약하게염색되어투명한세포질과둥근핵을포함하고있었으며, 이는다른경골어류에서관찰된것과비슷한위치와특성을가지고있었다 (Fig. 1a). 부화후 5일째 ( 평균전장 : 1.08 cm) 자어에서는처음으로초기생식소로판별할수있는생식융기 (genital ridge, GR) 의형성이관찰되었는데이후원시생식세포의크기및수적증가와더불어체세포 (somatic cell, SC) 분열이생식소끝부분에서활발히일어남도함께관찰할수있었다 (Fig. 1b). 부화후6일째 ( 평균전장 : 1.10 cm) 부터부화후 10일째 ( 평균전장 1.36 cm) 자어까지초기생식소 (primordial gonad, PGO) 는점점커져장경이 12 µm로늘어난생식세포와함께체세포가분열되는것이관찰되었다 (Fig. 1c, d). 그후 15일까지의자어 ( 평균전장 : 1.63 cm) 의생식소는자어의성장과함께생식소의길이도더욱커져장경이신장되었으며, 생식소내부의체세포와원시생식세포도양적증가를나타내었다. 3. 난소의분화부화후 20일을전후한자어 ( 평균전장 : 1.94 cm) 의난소에서는생식소의양끝으로부터세포분열이활발하게이루어져난소강 (ovarian cavity, OC) 이형성되고감수분열전기단계 (meiotic prophase, MP) 의생식세포들이나타나기시작하였다. 난소소강의형성은중앙부분에나타나는 entovarian sac의구조를가지고있어난소로의분화가이때시작됨을확인하였다 (Fig. 1e). 부화후 50일째자어 ( 평균전장 : 3.57 cm) 의난소에서는난소강이더욱뚜렷하게형성되고내부에는약직경 10 µm 크기의주변인기난모세포 (peri-nucleolus oocyte, PNO) 들이나타나기시작하였다 (Fig. 1f). 부화후 100일째 ( 평균전장 : 7.40 cm) 난소에서는초기난모세포 (peri-nucleolus oocyte, PNO) 가난소내에가득차기시작하여기능적난소의형태로분화하였다 (Fig. 1g). 부화후 120일째자어 ( 평균전장 : 8.46 cm) 에서는난소의크기가더욱커지고핵막주위에많은인이관찰되는난모세포 (perinucleolus oocyte, PNO) 의크기도직경 24 µm 정도로성장하였다 (Fig. 1h). 4. 정소의분화부화후 20일째자어 ( 평균전장 : 1.94 cm) 의정소에서원시생식세포의확실한유사분열단계 (germ cell mitosis) 를관찰함으로서정소로의분화를확인할수있었다 (Fig. 1i). 이에반하여정원세포 (spermatogonia, SG) 의활발한증식은부화후 40일째자어 ( 평균전장 : 3.17 cm) 의정소에서야관찰할수있었다 (Fig. 1j). 부화후 100 일째 ( 평균전장 : 7.40 cm) 정소에서는정원세포가더욱분열증식하였으며 (Fig. 1k), 부화후 150일째 ( 평균전장 : 10.92 cm) 정소에서는더많은정원세포의분열과함께정모세포 (spermatocyte, SC) 도관찰되었다 (Fig. 1l). 고찰 대농갱이의원시생식세포출현은전장 0.62 cm인부화후 1일로, 이러한결과는 pejerrey (Odontesthes bonariensis) 와나일틸라피아 Oreochromis niloticus에서부화직후에출현한것 (Strüssmann et al., 1996; Kim et al., 1988) 과거의유사하였다. 그리고미꾸라지 Misgurnus mizolepis와은어 Plecoglossus altivelis에서부화후 2일에원시생식세포가출현한결과 (Kim et al., 1990; Bang et al., 2000) 와도역시유사하였다. 반면버들치 Rhynchocypris oxycephalus, Tilapia mossambics와 T. zillii에서는각각부화후 8일, 8~10일그리고부화후 15일에원시생식세포가발견되고있다 (Park et al., 1998; Yoshikawa and Oguri, 1978; Nakamura and Takahashi, 1973). 이러한원시생식세포출현시기는종특이성을나타내며, 냉수성어류인산천어 Oncorhynchus masou인경우부화후 24일로다소늦게출현하고있다 ( 박등, 1997). 대농갱이는부화후 5일째생식융기의형성에의해처음초기생식소로판별되어부화 9 일째에초기생식소가발견된나일틸라피아 O. niloticus 와비슷한양상을보여주었다 (Kim et al., 1988). 대농갱이에서성분화가이루어지는시기는부화후 15~25일째로나타났다. 이러한성분화시기는어종에따라달라, 산천어 O. masou에서는부화후 40일에성분화가일어나며 ( 박등, 1997), 은어 P. altivelis에서는 90~100일로약간늦게성분화가일어난다 (Bang et al., 2000). 또한은연어 O. kisutch의경우특이적으로이시기에염색체의연접사복합체 (synaptonemal complex) 형성을볼수있으며응축된염색질을가진원시생식세포가나타난다고보고된바있고 (Foyle, 1993), 무지개송어 O. mykiss에서는난황이완전히흡수되고첫먹이를

252 박상용 이윤아 최경철 강언종 방인철 먹는시기가성분화시기에해당하였다 (Van den Hurk and Slof, 1981). 버들치 R. oxycephalus의경우암컷은 50일, 수컷으로는 100일에분화가되어암수간에분화시기가크게차이가있었다 (Park et al., 1998). 결론적으로대농갱이에서정소로의분화확인은부화후 20일에정소에서유사분열단계의원시생식세포와정모세포의출현으로하였으며, 난소로의분화확인은부화후 20일에초기생식소의감수분열단계의세포와 entovarian sac의구조출현으로가능하였다. 따라서대농갱이의성분화양상은분화형자웅이체 (differentiated gonochorism) 였다. 경골어류의난소강형성양상은난소의중앙에난소강이형성되는 entovarian sac과난소의가장자리에난소강이형성되는 parovarian sac의두가지형태로나누고있다 (Lee et al., 1996). 은어 P. altivelis (Bang et al., 2000), 큰가시고기 Gasterosteus aculeatus (Shimizu and Takahashi, 1980), 틸라피아 T. zilli (Yoshikawa and Oguri, 1978), 잉어과어류인 Barbu tetrazoa tetrazoa (Takahashi and Shimizu, 1983) 의난소에는 parovarian sac의형태가나타나고있다. 그리고청어과 (Clupeidae) 에속하는 Brevoortia patronus (Combs, 1969), 홍송어 Salvelinus leucomaenis (Nakamura, 1982), 무지개송어 (Takashima et al., 1980), 넙치 Paralichthys olivaceus ( 이와이, 1990) 등에서는 entovarian sac에속한다. 본종의경우난소의중앙에난소강이형성되는 entovarian sac의형태로나타났다. 이상의연구결과본종의호르몬처리를위한최초처리시기및처리기간은초기생식소가형성되는부화후 5~10일부터성분화가이루어지는부화후 20일까지 (10~15일간) 가적당할것으로사료된다. 요약 대농갱이, Leiocassis ussuriensis의생리학적성전환을위한기초적인연구로성분화과정을조직학적으로조사하였다. 부화후 1일째에중신관과장사이의장간막에원시생식세포가나타났으며, 부화후 5일째의초기생식소는생식융기를형성하는원시생식소구조를나타내었다. 부화후 20일째의생식소는암, 수로의분화가이루어졌는데정소는부화후 20일째에유사분열단계의원시생식세포들이분포하였으며, 난소에서는난소를특징지을수있는 entovarian sac의구조가난소중앙부분에나타났다. 부화후 40일째정소에서는정원세포의수가점점증가하였고, 부화후 50일째난소에서는난소 강이더뚜렸해지며부화후 100일째난소에서는초기난모세포가난소내에가득차기시작하여기능적난소의형태로분화하였다. 이상의결과본종은초기성분화과정은자성단계를거치지않고정소와난소로분화되는분화형자웅이체였다. 감사의글 본논문은 2000년경상남도생명공학기술개발과제연구비에의해수행되었으므로연구비지원에감사드리며, 본논문을심사하여주신익명의심사위원들께도감사드립니다. 인용문헌 Bang, I.C., S.Y. Park, Y.-A. Lee, C.-H. Lee, S.-Y. Kim and K.-K. Kim. 2000. Early gonadogenesis and sex differentiation in sweet fish, Plecoglossus altivelis. J. Aquaculture, 13 : 215~222. Combs, R.M. 1969. Embryogenesis, histology and organology of the ovary of Brevoortia patronus. Gulf Res. Rep., 2 : 333~436. Fishelson, L. 1966. Cichlidae of the genus Tilapia in Israel. Bamidgeh, 18 : 67~80. Foyle, T.P. 1993. A histological description of gonadal development and sex differentiation in the coho salmon (Oncorhynchus kisutch) for both untreated and estradiol immersed fry. J. Fish Biol., 42 : 699~712. Hunter, G.A. and E.M. Donaldson. 1983. Hormonal sex control and its application to fish culture. W.S. Hoar, D.J. Randall and E.M. Donaldson (eds), in fish Physiology, Vol. IX, Academic Press, New York, pp. 223~303. Kim, D.S., I.C. Bang and I.B. Kim. 1988. Sexual differentiation and androgen sex reversal of Oreochromis niloticus. J. Aquaculture, 1 : 53~66. Kim, D.S., K.-Y. Lee and T.-Y. Lee. 1990. Gonadal sex differentiation in Misgurnus mizolepis. Korean J. Ichthyol., 2 : 95~105. Lee, C.-L. and I.-S. Kim. 1990. A taxonomic revision of the family bagridae (Pisces, Siluriformes) from Korea. Korean J. Ichthyol., 2 : 117~137. Lee, Y.-D., S. Rho, Y.-J. Chang, H.-J. Baek and C.-M. An. 1996. Sex differentiation of the rockfish, Sebastes schlegeli. Bull. Korean Fish. Soc., 29 : 44~50. Nakamura, M. 1982. Gonaldal sex differentiation in whitespotted char, Salvelimus leucomaenis. Jap. J. Ichthyol., 28 : 431~436.

대농갱이의초기생식소형성및성분화 253 Nakamura, M. and H. Takahashi. 1973. Gonadal sex differentiation in Tilapia mossambica, with special regard to the time of estrogen treatment effective in inducing complete feminization of genetic males. Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ., 24 : 1~13. Pandian, T.J. and S.G. Sheela. 1995. Hormonal induction of sex reversal in fish. Aquaculture, 138 : 1~22. Park, I.-S., J.-H. Kim, I.C. Bang and D.S. Kim. 1998. Histological study of the early gonadal development and sexual differentiation in Rhynchocypris oxycephalus. Dev. Reprod., 2 : 69~74. Shimizu, M. and H. Takahashi. 1980. Process of sex differentiation of the gonad and gonoduct of the threespined stickleback, Gasterosteus aculeatus L. Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ., 31 : 137~148. Strüssmann, C.A., F. Takashima and K. Toda. 1996. Sex differentiation and hormonal feminization in pejerrey, Odontesthes bonariensis. Aquaculture, 139 : 31~45. Takahashi, H. and M. Shimizu. 1983. Juvenile intersexuality in a cyprinid fish, the Sumatra barb, Barbus tetrazoa tetrazoa. Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ., 34 : 69~78. Takashima, F., R. Patino and M. Nomura. 1980. Histological studies on the sex differentiation in rainbow trout. Bull. Jap. Soc. Sci. Fish., 46 : 1317~1322. Van den Hurk, R. and G.A. Slof. 1981. A morphological and experimntal study of gonadal sex differentiation in the rainbow trout, Salmo gairdneri. Cell Tissue Res., 218 : 487~494. Yamamoto, T. 1969. Sex differentiation. 117~175. Fish Physiology, Vol. III (W. S. Hoar and D. J. Randall). Academic Press, New York, USA. Yoshikawa, H. and M. Oguri. 1978. Sex differentiation in a cichlid, Tilapia zillii. Bull. Jap. Soc. Sci. Fish., 44 : 313 ~318. 박인석 이영돈 정의영. 1997. 산천어, Oncorhynchus masou 의성분화. 제주대해양연보, 21 : 1~9. 이영돈 이택열. 1990. 넙치, Paralichthys olivaceus의성분화와생식소발달. 제주대해양연보, 14 : 61~86. 정문기. 1977. 한국어도보. 일지사, 서울. pp. 222~230. Received : November 12, 2001 Accetped : December 18, 2001