119 B16 Melanoma 세포에서 Chitosan Oligosaccharide 에의한 Melanin 생성과 Tyrosinase 활성및발현과의관계 조남영 ( 주) 태평양 Abstract Relation of Chitosan oligosaccharide-induced Melanin Production to The Activity and Expression of Tyrosinase in B16 Melanoma Cells Cho, Nam-Young AMOREPACIFIC To investigate the effect of chitosn oligosaccharide on cosmetic and skin care, we measured tyrosinase activity and melanin production in B16 melanoma cells, and elastase and hyaluronidase activity. Chitosan oligosaccharide itself did not have any anti-oxidant activity in DPPH radical scavenging, and did not affect the proliferation of B16 melanoma cells. Chitosan oligosaccharide dose-depednetly increased melanin production in the absence or presence of MSH. However, chitosan oligosaccharide did not have any influence on the tyrosinase activity and tyrosinase expression in B16 melanoma cells. These results suggest that chitosan oligosaccharide-induced melanin production may be independent on tyrosinase in B16 melanoma cells. On the other hand, chitosan oligosaccharide increased neutrophil elastase activity but decreased hyaluronidase activity in a dose-dependent manner. From the above results, chitosan oligosaccharide dose-dependently appears to increase melanin production in B16 melanoma cells and inhibit hyaruronidase activity, suggesting that chitosan oligosaccharide may be used as sun-tan agent and water conservative agent. Key words: chitosan oligosaccharide, melanin, hyaluronidase, elastase Ⅰ. 서론 Chitin chitosan 은자연계에서거의유일하게 존재하는다가양이온의특성을가진생고분자 물질이다. 하지만 Chitin 은일반유기용매에불용 성1이기때문에그연구가극히제한되다가최근 에와서 chitin chitosan 이다양한생리, 약리작 용및항균작용이밝혀지면서많은주목을받게 되었다. 또한 chitin chitosan 보다분자량이낮은 chitosan oligosaccharide 는 chitin chitosan 보다 높은생리활성을나타내어식품과약품그리고 향장품분야에까지이용되고있는생물신소재 (biomaterials) 로알려지게되었다. Chitin chitosan 의향장학적이용은 1979 년
120 독일의 Wella 사에서처음으로 chitosan 의성질 을이용하여최초로두발용화장품 - 샴프, 린스, 헤어세트등의제품에보습제, 모발보호제, 유 연제, 헤어세트용수지등에사용하여응용되었 다. Chitosan 이두발용화장품에사용된가장큰 이유는모발흡착성에기인한다. 모발의단백질 성분인 keratin 의등전점 (isoelectric point) 은 3.8 부근이며, 물에젖은상태에서는음의전하를띠 게된다. 반면 chitosan 은 ph 3.8~6.1 에서양의 전하를띠게되므로모발의표면에강하게결합 하여얇은피막을형성하게된다. 뿐만아니라모 발에흡착후대전방지성, 광택성등의기능을나 타내며, 액정(liquid crystal) 을형성하는성질이 있어적절한보습효과도나타내어 chitosan 이두 발용화장품에가장먼저이용되어졌다. 이렇게 chitosan 이향장학적으로활용되기시작했고최 근에는생리활성을증진시키고피부에대한침투 가용이한저분자 chitosan oligosaccharide 가연 구되면서기능성화장품으로의응용연구가필요 한상태이다. Chitosan oligosaccharide 를이용한향장품의 예상되는특성은몇가지가있다. 화장품을만들때기본적인구비조건은자극 이나알레르기, 독성이없어야하는안전성, 제품 이분리되거나침전, 미생물등에오염, 변색, 변 취되지않아야하는안정성, 피부에사용했을때 자연스럽게퍼져야하고매끄럽게잘스며들어야 하는사용성, 피부에적절한보습, 노화억제, 자외 선차단, 미백, 세정, 색채효과등을부여하는유효 성을갖추고있어야한다. 그런데 chitosan oligosaccharide 는인체에무해하면서세균에대한항 균성을나타내고있어피부에안전하고고분자 chitosan 과달리물과알코올에쉽게용해되어피 부에안정성을갖추고있다. 뿐만아니라고분자 chitosan 보다분자량이적어피부각질층침투가 용이해사용면에서도높은효과가있으리라고 생각된다. 화장품에사용되는미백( 美白 ) 제로는피부의 멜라닌 (melanin) 색소합성을저해하는것과이미 생성된멜라닌색소를벗겨내는박피제가있다. 미백화장품에사용되는원료는 90 년대이후, arbutin, kojic acid, vitamin C 및그유도체등2 이개발되어이를함유한미백화장품이시판되 고있고이외에도식물추출물 - 상백피, 당귀, 고 삼, 지엽, 금은화, 감초, 반하, 백작약, 음약곽 3 및 essential oil4 등이미백효과가있는것으로나타 나고있다. 현재장업계에서는 chitosan oligosaccharide 을이용한미백화장품의연구가꾸준 히진행되고있지만보고된연구결과는없는실 정이다. 그러므로이논문에서는 chitosan oligosaccharide 가피부미용에어떠한영향을미치는 지를규명하기위하여 B16 melanoma cell 을이용 해서 tyrosinase activity 와 melanin 생성을관찰 하였으며 hyaluronidase 와 elastase 활성에미치 는영향을관찰하였다. Ⅱ. 1. 실험방법 시약 Chitosan oligosaccharide [(glucosamine)2-6], Raffinose, melezitose, hyaluronidase, hyaluronic acid, elastase, p-nitroanilide, 1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl(dpph), α-melanocyte stimulat - ing hormone(msh), tyrosinase, L-DOPA, mela- nin들은 Sigma Chemical Co. 로부터구입. B16 melanoma cell 은서울대학교세포주은행으로부 터구입하였으며, tyrosinase 항체는 Santa Cruz
121 Biotechnology, Inc. 에서구입하였다. 2. 세포배양 B16 melanoma cell 은 10% fetal bovine serum 과 penicillin/streptomysin(100 IU/50 μg/ml) 을함 유한 Dulbecco s modified Eagle s me- dium(dmem) 용액으로 37 로유지되는 5% CO 2 배양기에서배양하였다. B16 melanoma cell 를이용한 melanin 측정시 phenol red가없는 DMEM 을사용하였다. 24well plate 에 5 104 cells/ml 로분주하고 12시간이지난뒤세포가 plate 에완전히부착된것을확인한후 chitosan oligosaccharide 를 10 분간전처치하였다. Melanin 생성을촉진하기위하여 1μM α-melanocyte stimulating hormone 를처치하고 48시간지난뒤 에 tyrosinase 활성과 melanin 을정량하였다. 3. Sulforhodamine assay B16 melanoma cell를 96well plate 에 200μl (104cells/ml) 씩가한후 를처치하고 chitosan oligosaccharide 48 시간배양하였다. 배양이끝난후 얼음에보관한 50% TCA 용액을 50μl를상층액 위에가볍게가하며, 최종농도가 10% 되게하였 다. 4 에서 1시간방치한후수돗물로 5회세척 하고물기를제거하여공기중에서건조시켰다. 1%acetic acid에 0.4%(W/V) sulforhod- amine(srb) 을녹인용액 100 μl 가하고실온에 서 30 분간방치하였다. 염색액을버리고 1% acetic acid로 4회세척한후물기를제거하여공 기중에서완전히건조시켰다. buffered Tris base(ph 10.5) 를 전물을완전히녹인후에 측정하였다. 200μl 10mM un- 가하고침 564nm 에서흡광도를 4. 항산화활성측정 96 well plate 에에탄올에녹인 0.1mM DPPH 용액 180 μl와각농도별로조제한 chitosan oli- gosaccharide 와 raffinose, melezitose 20μ l를가하 고 37 에서 30 분간배양한후 FL 600 spectro - fluorometer 를이용하여 517nm 에서흡광도를측 정하였다. 5. Tyrosinase 활성측정 세포내 tyrosinase 활성에미치는영향을관찰 하기위하여 배양이끝나면 B16 melanoma cell에약물처치후 1%(w/v) Triton X-100 을함유한 10mM sodium phosphate buffer(ph 6.8) 를 100 μl 를가하고 5 분간 shaking 한후에세포와용액을 모두 eppendorf tube로이전시키고원심분리하여 상층액은 tyrosinase 활성과단백질정량에이용 하고, cell pellet 은멜라닌정량에사용하였다. 96 well plate 에약물처치후얻은상층액 40μl 를분 주하고 0.1M sodium phosphate buffer(ph 7.2) 에 녹인 2mg/ml L-DOPA 200μ l를가하여 37 에서 1 시간동안배양하였다. Tyrosinase 에의해생성 된 DOPA chrome 은 475nm 에서흡광도를측정하 였다(Ohkura et al., 1984). Tyrosinase 활성은순 수하게정제된 tyrosinase 를효소활성의표준검 량선으로이용하여산출하였다. Bovine albumin 을표준용액으로하여상층액내의단백질양을 정량하였으며, tyrosinase 효소활성은 unit/mg protein 으로표기하였다. 6. 멜라닌정량 Tyrosinase 활성을측정하는과정에서얻은 pellet 을 1N NaOH 100μ l와증류수 200μ l를가하 고 60 에서 1시간배양하여멜라닌을완전히녹 인후 96 well plate 에 200μ l를옮긴후 405nm 에
122 서흡광도를측정하였다. 멜라닌표준품으로얻은 표준검량선을이용하여각 well 에서생성된멜라 닌양을산출하였다. 멜라닌생성량은각 well 에 서측정한단백질농도를기준으로 tein 으로표기하였다. μg/mg pro- 2. Chitosan oligosaccharide 가세포증식에미 치는영향 Chitosan oligosaccharide 가세포독성이있는 지를확인하기위하여단백질정량및 sulfo- rhodamin 정량을하였다. 7. Tyrosinase immunoblotting MSH를 48시간처치한 B16 melanoma cell을 extracting buffer(1% Triton X-100 을함유한 0.1M sodium phosphate buffer, ph 6.8) 를가하여 세포를파괴시키고얻은균질액을 8~20% SDS-PAGE 를이용하여전기영동하고 nitro- cellulose membrane 으로이전시켰다. 1% BSA를 함유한 Tris 완충용액에서 30분이상배양한후 tyrosinase 항체와 alkaline phosphatase 가결합된 항체를가한후 alkaline phosphatase 기질용액 을가하여발색시켰다. 8. 자료분석및통계적검정 실험결과는평균 실험성적은 ± 표준오차로표기하였으며, non-paired Student s t- test 로검정 하였고 P 값이 5% 미만일때통계적으로유의하 다고간주하였다. 3. B16 melanoma cell에서 tyrosi- nase 는영향 활성과 melanin 생성에미치 Chitosan oligosaccharide 는 MSH 가없는상태 에서 B16 melanoma cell를자극하여 melanin 생 성을농도의존적으로증가시켰으며 100 μg/ml 농도에서는 MSH에의한 melanin 생성보다 1.7배 정도더증가시켰다. 4. Tyrosinase immunoblotting Chitosan oligosaccharide 는 tyrosinase 활성과 는상관없이 melanin 생성을증가시켰다. chito- san oligosaccharide 에의한 melanin 생성증가가 tyroinase 발현과연관성이있는지를알기위하 여 tyrosinase 항체를이용하여 immunoblot 를수 행하였다. Ⅳ. 고찰 Chitosan oligosaccharide 가세포독성이있는 Ⅲ. 실험결과 1. Chitosan oligosaccharide 의항산화작용항산화작용이있는지를확인하기위하여 DPPH 를이용한유리라디칼소거반응을관찰하였다. 지를관찰하였다. DPPH 를이용한유리라디칼 소거반응에서 DPPH vitamin C는농도의존적으로 라디칼을소거하였지만 chitosan oligo- saccharide 는별다른영향을주지않았으며, 자연 계에존재하는삼당류인 raffinose(o- α-d-gal - actopyranosyl-[1-6]- α-d-glucopyranosyl- β -D-fructofuranoside) 와 melezitose( α-d-gal - actose-[1-3]- β-d-fructose-[2-1]- α-d-gal -
123 actose) 도 DPPH 유리라디칼소거에영향을주 지않았다. Fibroblast 에서도 chitosan oligo- saccharide 는 1 mg/ml 농도에서세포독성을일 으키지않는것으로보고되었다 5. 위의결과로미루어볼때 chitosan oligosaccharide 는항산화작용도없으며또한세포증 식에있어서별다른영향을주지않는물질로사 료된다. Chitosan oligosaccharide 는 MSH 가없는상태 에서 B16 melanoma cell를자극하여 melanin 생 성을농도의존적으로증가시켰으며 100 μg/ml 농도에서는 MSH에의한 melanin 생성보다 1.7배 정도더증가시켰다. 이러한결과로미루어볼때 chitosan oligosaccharide 에의한 melanin 생성은 MSH 와는다른기전을통해작용하는것으로생 각되며, 미백제와는반대로 sun tan 제제로서의 개발가능성이있는것으로사료된다. 이상의결과들을종합하여볼때 chitosan oli- gosaccharide 는항산화작용은없지만 melanin 생성을증가시키며, hyaluronidase 활성을억제하 는것으로보아 sun tan 제제및보습제로서개발 가능성이있는물질로사료된다. anoma cell를자극하여 melanin 생성을농도의 존적으로증가시켰으며 MSH를처치한실험군에 서도 chitosan oligosaccharide 는 MSH만을처치 한실험군보다더많은 melanin 을생성하였다. 이 러한결과로미루어볼때 chitosan gosaccharide 는 MSH 가없는상태에서 B16 mel- oligo- saccharide 에의한 melanin 생성은 MSH와는다 른기전을통해작용하는것으로생각된다. MSH 는대조군에비하여 tyrosinase 활성을 2.4배증가 시켰지만 chitosan oligosaccharide 는안정상태시 나 MSH로자극한 B16 melanoma cell에서 ty- rosinase 활성에는별다른영향을주지않았다. MSH는 tyrosinase 의발현을증가시켰지만 chitosan oligosaccharide 는별다른영향을주지않 았다. 한편 chitosan oligosaccharide 는 elastase 활성을증가시키는반면 hyaluronidase 활성은농 도의존적으로억제하였다. 이상의결과들로미루 어볼때 chitosan oligosaccharide 는항산화작용 은없지만 melanin 생성을증가시키며, hyalur- onidase 활성을억제하는것으로보아 sun tan 제 제및보습제로서개발가능성이있는물질로사 료된다. 참고문헌 Ⅴ. 결론 Chitosan oligosaccharide 가향장품으로개발가 능한지규명하기위하여 B16 melanoma cell 를이 용해서 tyrosinase 활성및발현과 melanin 생성 을관찰하였으며 hyaluronidase 와 elastase 활성 에미치는영향을관찰하였다. Chitosan oligosaccharide 는항산화작용이없으며세포증식에 있어서별다른영향을주지않았다. Chitosan oli- 1. Minke R, Blakwell J. The structure of α-chitin. J. Mol. Biol. 120, 1167, 1978. 2. Sannan T, Kurita K, Iwakura Y. Studies on chitin. 2. Effect of deacrtylation on solubility. Macromol. Chem. 177, 3589, 1976. 3. Higuchi M, Miura Y, Boohena J, Kinoshita Y, Yamamamoto Y, Yushimura I, Yamaha Y. Inhibition of tyrosinase activity by cultured lichen tissues and bionts. Planta. Med. 59,
124 253-255, 1993. 4. Ryu KY, Kang WS, Kim YH, Jang HD, Hong JT, Yoo HS, Yun YP. Antioxidative effects of the rhizomo of Rhodiola sa halinensis. Yakhak Hoeji. 42(3), 312-318, 1998. 5. Park JH, YG, Shin UK, Baek SK, Lee SK, Hee Chung, Park YI. Tyrosinase inhibition activity of some herbal drugs. Yakhak Hoeji. 41(4), 518-523, 1997. 6. Lee SH, Park Js, Kim SY, Kim JJ, Chung SR. Isolation of Inhibitory components on tyrosinase activity from the bark of paeonia moutan. Yakhak Hoeji. 42(4), 353-358, 1998. 7. Lim HW, Cho NY, Yoon MY, Cha SB, Kim KW, Park YM, Lee JY, Lee JH, Kim CJ, Sim SS. Effects of citrus essential oils on melanin production in B16 melanoma cells. Yakhak Hoeji 47, 25-30, 2003. 8. Ha BJ. Studies on the cosmetic effects of chitosan oligosaccharide. Annual Bulletin of The Bum-Suk Scholarship Foundation. 2, 393-402, 1998. 9. Allan GG, Peyron M. Molecular weight manipulation of chitosan Ⅱ. Prediction and control of extent of depolymerization by nitrous acid Carbohydr. Res. 277, 273, 1995. 10. Ha Byung-Jo, Lee Ok-Sub, Lee Yoon-Sik. Novel Hollow microbeads on hydroxypropyl chitosan by W/O emulsion cross linking method Macromolecular. Reports. A33, 297, 1996. 11. Horowitz ST, Roseman S, Blumenthal HJ. The preparation of oligosaccharide. I. Separation. J. Am. Chem. Soc, 79, 5046, 1957. 12. Itoh Y, Miyazawa F. BIO INDUSTRY. 11, 5, 1994. 13. Kendra DF, Hadwiger LA. Characterization of the smallest chitosan oligomer that is maximally antifungal to Fusarium solani and elicits pisatin formation in Pisum sativum Exp. Mycol. 8, 276-281, 1984. 14. Kim SK. Subacute oral toxicity of chitosan oligosaccharide on sparague-dawley rats. Drug Research 51(3), 2001. 15. Muzzarelli RAA. Natural Chelating Polymer Pergamon Press, New York, 1973. 16. Nishimura K, Ishihara C, Ukei S, Tokura S, Azuma I. Stimulation of cytokine production in mice using deacetylated chitin. Vaccine, 4, 151-156, 1986. 17. Shimojoh M, Masaki K, Kurita K, Fukoshima K. Batericidal effecs of chitosan from squid pens on oral streptococci. Nippon Nogeikagaku Kaishi. 70, 787-792, 1996. 18. Suzuki K, Mikami T, Okawa Y, Tokora A, Suzuki S, Suzuki M. Antitumor effect of hexa-n-acetylchitohexaose and chitohexaose. Carbohydr. Res. 151, 403-408, 1986. 19. Takahashi Y, Miki F, Nagase K. Effect of sonolysis on acid degradation of chitin to form oligosaccharides Bull. Chem. Soc. Jpn. 68, 1851, 1995. 20. Tokora A, Tatewaki N, Suzuki K, Mikami T, Suzuki S, Suzuki M. Growth-inhibitory effect of hexa-n-cetylchitohexaose and chitohexaose against Meth-A solid tumor. Chem. Pharm. Bull. 36, 784-790, 1988. 21. 김세권편역 ꡒ 키틴키토산 기초와약리ꡓ, 이화 문화출판사, 1997.
125 22. 김세권, 전유진. 키틴 키토산및그올리고당의 면역작용에의한항종양활성한국생명과학회지. 7(2), 149~159, 1997. 23. 보건복지부. 피부신호전달을이용한미백제개 발, 2001. 24. 平野茂博 化學과生物 21, 635, 1984.