동의생리병리학회지제 22 권 5 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(5):1196 1201, 2008 유명자 김보미 이정호 1 이영행 채규윤 * 백승화 2 * 원광대학교자연과학대학생명나노화학부, 1 : 송호대학자연건강관리과, 2 : 한의학전문대학원한약자원개발학과 Inhibitory Effect of Sorbus cortex Extract on (1,3)-β-Glucan Synthase Myung Ja You, Bo Mi Kim, Jeong Ho Lee 1, Young Hang Lee, Kyu Yun Chai*, Seung Hwa Baek 2 * Division of Nanobiochemistry, College of Natural Sciences, Wonkwang University, 1:Department of Natural Health Management, Songho College, 2:Department of Herbal Resources, Professional Graduate School of Oriental Medicine, Wonkwang University A examination of the kinetic properties of UDP-glucose : (1,3)-β-glucan (callose) synthase from mung bean seedings (Sorbus cortex) shows that these enzymes have a complex interaction with UDP-glucose and various effectors. Deoxynojirimycin increased the inhibitory effect of (1,3)-β-glucan synthase at the concentration-dependent manner by fluorescence assay. The inhibitory effect of Fr. 2-16 (97.15%) showed higher than that of deoxynojirimycin (80.63%). Fr. 2-3 inhibited the growth of the Candida albicans at 1 mm inhibition zone by disk diffusion method. These results suggest that Sorbus cortex extract can be used as a stable antifungal material. Key words : Kinetic properties, (1,3)-β-glucan (callose) synthase, Sorbus cortex, fluorescence assay, inhibitory effect, Candida albicans 서론 Candida albicans는건강한사람에게는주로효모형태로존재하지만, 면역력약화된사람이환경이변화되는경우에는, 균사를생성하여병원성 (virulence) 이증가되기도한다 1,2). 칸디다증 (candidiasis) 에대한화학요법치료에는 polyene 계열의 amphotericin B, azole 계열의 fluconazole, itraconazole, ketoconazole 등이있으며, 대부분독성이있으나생체투과율이낮아많은부작용이수반되고, 항진균효과에대한내성이빈번하여치료효과가낮다 1,3,4). 현재까지진균세포벽의조성과관련된 1,6-β-glucan synthase, 1,3-β-glucan synthase 등이밝혀져있다. 특히 1,3-β-glucan은진균세포벽의주성분으로서 1,3-β -glucan synthase에의하여, UDP-glucose로부터생성되는 D- glucose의복합체이다. 즉, 진균류의세포벽은다당류또는당단백질형태로존재하는탄수화물이주된구성성분이며, 세포벽의약절반가량은 β-glucan 결합으로연결되어있다 1,2,5,6). 포유류의세포에는 1,3-β-glucan synthase와 1,6-β-glucan synthase 등의 * 교신저자 : 채규윤, 익산시신용동 344-2, 원광대학교자연과학대학백승화, 익산시신용동 344-2, 원광대학교한의학전문대학원 E-mail : shbaek@wku.ac.kr, Tel : 063-850-6225 접수 : 2008/06/09 수정 : 2008/07/22 채택 : 2008/09/17 성분이진균류의세포벽에는특이적으로존재하고있어, 이들의합성을저해하고차단할수있는물질은인체에부작용을일으키지않고, 진균에만선택적으로작용하는항진균제의개발가능성을시사한다 1,5,7,8). 정공피 (Sorbus cortex) 는한반도전역고산지대에서자생하는마가목 (Sorbus commixta) 의수피를채취하여말린것으로, 한방에서진해, 거담, 해소, 기관지염, 폐결핵, 수종, 위염, 신체허약등을치료하고, 성분은 beturine, lupeol, β-sitosterol, aucuparin, dihydrocinnamic aldehyde, sorbic acid, parasorboside 등이함유되어있다 9). 본연구에서는정공피추출물에대한 Candida albicans의항진균효과를측정하여, 유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 실험 1. 시약및기기실험에사용된모든용매는사용기전에감압증류기로증류하여사용하였으며, 컬럼크로마토그라피법은실리카겔 (35-70 μ m silica gel 60, Alltech) 과 Optical rotation은 Perkin-Elmer 241 Polarimeter로측정하였다. Mass, UV와 IR spectra는 Kratos MS-80, Shimadzu UV 240와 Perkin-Elmer 1600 FT-IR - 1196 -
Instruments를사용하였으며,NMR spectra (300 MHz; 1H, 75 MHz ;13C) 은 Varian VXR-300 spectrometer로측정하였다. 2. 추출정공피를익산소재약재상에서구입하여, 외부형태를비교한후실험에사용하였다. 정공피 (1.2 kg) 를메탄올 (5 L) 로추출하여, 0.4 μm 필터로여과하여진공증류기로감압농축시킨다음, 물에현탁시켜 n-hexane, 에틸아세테이트, 부탄올순으로계통분획하여각각의분획물을얻었다. 한분획물중 ethyl acetate 층 4 g을 silica gel 150 g 로충진된 flash column으로 ethyl acetate, methylene chloride, methanol을이용하여 19개의 fraction으로분리하였다. 수치가낮은것을항균효과가높은것으로판단하였다 1,7). 6. Fluorescence 측정 Candida albicans를 PDB 1.5% 가포함된액체배지에접종하고, 37 의배양기에 12시간진탕배양한균주를일정량접종하고, 시료를각각 500, 300, 200, 100, 50 mg/ml 농도로첨가한후, 48시간동안배양하였다. 배양된균주에 6N NaOH를넣고 30분간배양시킨다음, aniline blue (0.1% aniline blue 수용액 : 1 N HCl : 1 M glycine/naoh buffer (ph 9.5)-40 : 21 : 59) 를넣고, 30분간배양한다음실온에 30분간방치한후 fluorescence로측정하였다 (Excitation wavelength; 400 nm/slit width 30. emission wavelength; 460 nm/slit width 40) 10,12). 3. Mung bean (1,3)-β-glucan (callose) synthase의성장, 수확, 제법 Mung bean (Vigna radiata) 종자는시장에서구입하여, 증류수에하룻동안담가둔후, 상온에서물포화된 vermiculite을암실에서 5일동안성장시켰다. 모든실험은 47 에서분리하였으며, Hypocotyl은 10 mm hepes/koh은 1 mm DTT (ph 7.3) 로차가운상태에서수확한후에무게를측정하였다. Hypocotyl 은 50 mm hepes/koh은 5 mm EDTA, 1 mm DTT, 5 μm leupeptin과 20 mm pefabloc (ph 7.3) 를 polytron homogenizer 로균일화한후, miracloth로 3회여과하여, 12,000 rpm으로 5분동안회전시킨후에제거시켰다. 상등액은 100,000 rpm으로 5분동안회전시킨후에박막으로여과하여, 50 mm Hepes/KOH (ph 7.3.) 로다시현탁시켰다. 현탁액을 -80 에서저장하여, Bio-Rad protein assay kit로단백질의함량을측정하였다 10,11). 4. Mung bean (1,3)-β-glucan synthases의측정법 Flat-bottomed 96-well microtiter의 50 ml로표준검량선법과효소를측정하였다. 50 mm Hepes/KOH, ph 7.3, 0.01% digitonin, 1 mm CaCl 2, 10 mm cellobiose, 0.4 mm UDP-Glc과 2.5 mg of membrane protein를포함한 mung bean enzyme은상온에서 30분동안세균을배양한후, 6 N NaOH용액 (10 ml) 을첨가하였다. 얻어진 glucan은 0.1% aniline blue 수용액 (40 ml), 1 N HCl (21 ml), 1 M glycine/naoh buffer (59 ml), aniline blue (ph 9.5) 이혼합물 (210 ml) 로만들어, vortex로회전시킨후, 50 에서 30분간동안세포배양한후, aniline blue과 fluorochrome와탈색반응하도록, 30분간반응시킨다. Fluorescence 정량은 fluorescence plate reader로흡광파장 (400 nm) 와방출파장 (460 nm) 에서측정한다 10-12). 5. 탁도측정 Candida albicans를 PDB 1.5% 가포함된액체배지에접종하고, 37 의배양기에 12시간진탕배양한균주를일정량접종하고, 시료를각각 500, 300, 200, 100, 50 mg/ml 농도로첨가한후, 48시간동안배양하였다. 배양된균주는 ELISA reader로파장 620 nm 에서흡광도를측정하여, 배지의탁도를확인하였고, 순수배양액의흡광도값과대조하여 MIC를결정하였으며, MIC 7. 고체배지 Candida albicans의고체배지를이용한항진균효과를측정하기위하여, 디스크확산법을사용하였다. PDB가포함된 agar를멸균시킨후완전히굳힌다음, 37 에서 12시간배양기에배양된 Candida albicans가 10 5 CFU/mL를접종하였다. 2시간후시료가 200 μg 흡수된 filter paper disk를올려놓고, 37 에서 48시간배양한후, Candida albicans에대한발육저지능으로서나타나는 clear zone 유무를확인하여, 항균력을판정하였다. 발육저지환은모두 mm까지측정하여판정하였다 13,14). 성 적 1. Deoxynojirimycin의효소활성억제효과 UDP-glucose를기질로사용하는 fluorescence assay 방법을기초하여, deoxynojiri -mycin이 1,3-β-glucan synthase에대한활성을측정한결과, deoxynojirimycin의농도가증가함에따라, 1,3-β-glucan synthase활성의저해율이감소하였으며, 1,3-βglucan synthase에대한 deoxynojirimycin의활성은 IC 50 1.47 mg/ml로관찰할수가있었다 (Table 1) 1,10,12,15). Table 1. Inhibition effect of deoxynojirimycine on (1,3)-β-glucan synthase. Concentration (μg/ml) Inhibition (%) 0 100.00 100 93.41 150 88.63 250 83.76 500 81.23 1,000 68.34 1,500 47.23 2,000 33.54 2. 정공피추출물의효소활성에미치는효과 표준물질인 deoxynojirimycin과정공피추출물을 1 mg/ml 동일한농도로처리한후, 효소의저해율을비교하여항진균효과를비교한결과, 표준물질인 deoxynojirimycin은 80.63 % 의저해율을보였으며, 정공피메탄올추출물에서는 69.70 % 의저해율이관찰되었다. 에틸아세테이트분획물 (Fr. 2) 에서는표준물질 - 1197 -
유명자 김보미 이정호 이영행 채규윤 백승화 의저해율보다낮은 68.23 % 의활성을관찰할수가있었으나, Fr. 1, 3과 4의저해율은약 75% 의비숫한활성이나타났다. Fr. 2를컴럼크로마토그라피법으로분획한분획물의경우에서는 Fr. 2-1 (100% methylene chloride) 으로부터 ethyl acetate를 10% 씩증가시켜서, Fr. 2-7 (methylene chloride : ethyl acetate = 40 : 60) 까지는 63.4-79.6% 범위의저해율이나타났으며, Fr. 2-3 (methylene chloride : ethyl acetate = 80 : 20) 의이동상에서 flavonoid의특성피크에기인된것으로, 63.4% 의가장높은저해율이관찰되었다. Fr. 2-8 (methylene chloride : ethyl acetate = 30 : 70) 으로부터 ethyl acetate를 10% 씩증가시켜서, Fr. 2-11 (100% ethyl acetate) 로이동상으로이루어졌으며, Fr. 2-12 (ethyl acetate : methanol = 90 : 10) 으로부터메탄올을 10% 씩증가시켜서, Fr. 2-19 (ethyl acetate : methanol = 20 : 80 ) 으로이동상이구성되어, 저해율이보다낮은 85.6-97.2% 범위의저해율이관찰되었다. 그러나에틸아세테이트분획물 (Fr. 2) 에서가장낮은저해율 (97.2%) 은 Fr. 2-16 (ethyl acetate : methanol = 50 : 50) 50% 의이동상비율로혼합하였을때에, Fr. 2-3의활성보다약 1.5배정도로낮은활성이측정된것은, 이동상의극성에기인하는것으로생각된다 (Table 2) 1,10,12). Table 2. Inhibition effects of Sorbus commixta extracts (1 mg/ml) on (1,3)-β-glucan synthase Inhibition (%) Inhibition (%) Fr. 2-7 79.64 Standard compound Deoxynojirimycin 80.63 Fr. 2-8 85.58 Extract MeOH 69.70 Fr. 2-9 87.64 Solvent fraction Fr. 1 74.96 Fr. 2-10 94.89 Fr. 2 68.23 Fr. 2-11 93.54 Fr. 3 75.90 Fr. 2-12 94.25 Fr. 4 74.79 Fr. 2-13 92.15 Column fraction Fr. 2-1 78.65 Fr. 2-14 94.49 Fr. 2-2 68.56 Fr. 2-15 96.48 Fr. 2-3 63.35 Fr. 2-16 97.15 Fr. 2-4 70.58 Fr. 2-17 89.25 Fr. 2-5 75.45 Fr. 2-18 94.25 Fr. 2-6 77.56 Fr. 2-19 91.25 Candida albicans의 Fluorescence가낮은측정값 (128.08) 으로관찰되었으나, 에틸아세테이트분획물 (Fr. 2) 의 500 mg/ml Fr. 2-13 (ethyl acetate : methanol = 80 : 20) 에서는가장낮은 Fluorescence의측정값 (39.52) 으로관찰된것은, 혼합용매로사용된이동상의상승작용효과에기인된것으로사료된다 (Table 4). Table 3. Absorbance of Candida albicans in various concentrations of Sorbus commixta extract. Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) 100 200 300 500 100 200 300 500 MeOHex 0.987 0.895 0.842 0.823 Fr. 2-9 0.985 0.895 0.845 0.863 Fr. 1 1.213 1.158 1.095 0.973 Fr. 2-10 0.856 0.849 0.812 0.804 Fr. 2 0.945 0.917 0.743 0.657 Fr. 2-11 0.957 0.923 0.912 0.905 Fr. 3 0.801 0.730 0.667 0.625 Fr. 2-12 0.845 0.835 0.831 0.829 Fr. 4 0.953 0.923 0.918 0.895 Fr. 2-13 1.058 1.007 0.995 0.966 Fr. 2-1 0.842 0.837 0.824 0.801 Fr. 2-14 1.141 1.098 1.050 0.932 Fr. 2-2 1.012 1.002 0.983 0.912 Fr. 2-15 0.783 0.679 0.391 0.067 Fr. 2-3 0.985 0.926 0.845 0.756 Fr. 2-16 0.954 0.874 0.847 0.834 Fr. 2-4 0.824 0.812 0.789 0.756 Fr. 2-17 1.037 1.005 1.002 0.594 Fr. 2-5 1.023 1.021 0.985 0.879 Fr. 2-18 0.985 0.958 0.945 0.932 Fr. 2-6 1.125 1.089 1.045 1.005 Fr. 2-19 1.136 1.103 1.003 1.080 Fr. 2-7 0.891 0.845 0.824 0.816 Ampicillin 0.603 0.340 0.246 0.130 Fr. 2-8 1.123 1.089 1.075 1.071 Table 4. Fluorescence of Candida albicans in various concentrations of Sorbus commixta extract. Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) 100 200 300 500 100 200 300 500 MeOH 195.68 188.73 182.36 178.89 Fr. 2-9 179.23 155.48 144.26 131.23 Fr. 1 210.31 175.30 172.94 165.25 Fr. 2-10 186.45 182.34 180.42 177.52 Fr. 2 184.26 183.68 172.75 145.29 Fr. 2-11 187.45 164.26 161.23 160.72 Fr. 3 154.88 136.75 130.43 128.08 Fr. 2-12 156.45 152.92 131.26 122.42 Fr. 4 165.23 162.78 161.92 158.45 Fr. 2-13 130.93 113.46 103.17 39.52 Fr. 2-1 145.25 142.26 141.37 139.84 Fr. 2-14 149.40 149.17 105.90 96.95 Fr. 2-2 168.23 154.23 140.26 132.45 Fr. 2-15 128.84 117.53 109.93 106.19 Fr. 2-3 158.45 153.24 152.62 147.21 Fr. 2-16 149.21 133.74 115.60 112.81 Fr. 2-4 169.26 155.56 142.81 131.36 Fr. 2-17 117.89 89.47 61.76 52.98 Fr. 2-5 153.45 151.26 150.26 149.62 Fr. 2-18 125.45 128.46 111.45 102.45 Fr. 2-6 178.45 172.95 168.45 157.26 Fr. 2-19 167.48 158.09 142.52 142.40 Fr. 2-7 189.45 175.65 172.45 170.25 Ampicillin 63.526 55.167 54.121 52.110 Fr. 2-8 167.45 152.45 140.75 136.70 3. 액체배지에의한항진균측정탁도측정에의한 Candida albicans의항진균효과는정공피추출물과분획물을농도별로처리한후흡광도를분석한결과, 정공피메탄올추출물과분획물의처리농도가증가할수록항진균효과도증가하였으며, 에틸아세테이트분획물 (Fr. 2) 과 Fr. 2-3 (methylene chloride : ethyl acetate = 80 : 20) 에서항진균효과가높게나타났지만, 표준물질인 ampicillin의항진균효과보다는낮게관찰되었다. 정공피메탄올추출물에의한비교적극성용매로분획한부탄올분획물 (Fr. 3; 500 mg/ml) 에서, Candida albicans의항진균효과는낮은흡광도 (0.625) 가측정되었으나, 에틸아세테이트분획물 (Fr. 2) 의 Fr. 2-15 (ethyl acetate : methanol = 60 : 40) 에서는가장낮은흡광도 (0.067) 가관찰되었다 (Table 3). 정공피메탄올추출물과분획에대한 Candida albicans의 fluorescence도농도증가에의존적으로흡광도가감소되어관찰되었으며, 부탄올분획물 (500 mg/ml Fr. 3) 에서 4. 여지디스크확산법에의한항진균효과여지디스크확산법에의한항진균효과를측정하기위하여, 항진균제로쓰이는 ampicillin을표준물질로사용하였고, 정공피추출물을 paper disk plate를이용하여항진균효과를측정한결과, 정공피메탄올추출물과에틸아세테이트분획물, 부탄올분획물과 Fr. 2-2, Fr. 2-4, Fr. 2-11에서 0.5 mm 저지환이나타났으며, Fr. 2-3 (methylene chloride : ethyl acetate = 80 : 20) 의이동상에서 1.0 mm의저지환이나타난것은 flavonoid에기인한것으로생각되나, ampicillin에서측정된 2.5 mm의저지환보다낮은활성이관찰되었다 (Table 5 & Fig. 1) 13,14,16). Candida albicans 세포벽의주성분인 1,3-β-glucan synthase에대한활성측정결과, 표준물질인 deoxynojirimycin의농도가증가함에따라 1,3-β-glucan synthase활성에대한저해율이증가하였으며, deoxynojirimycin과정공피메탄올추출물을 1 mg/ml 로처리한결과 deoxynojirimycin은 80.63 % 로우수한저해율을 - 1198 -
보였다 2,6,7). 여지디스크확산법에의한항진균활성은현재항진균치료제로쓰이고있는 ampicillin에서는 2.5 mm의저지환이나타났다 7,13). Table 5. Antifungal activity of Sorbus commixta extract against Candida albicans. Concentration Inhibition Concentration Inhibition (mg/ml) (%) (mg/ml) (%) MeOH 1.0 + Fr 2-10 1.0 - Fr. 1 1.0 - Fr. 2-11 1.0 + Fr. 2 1.0 + Fr. 2-12 1.0 - Fr. 3 1.0 + Fr. 2-13 1.0 - Fr. 4 1.0 - Fr. 2-14 1.0 - Fr. 2-1 1.0 - Fr. 2-15 1.0 - Fr. 2-2 1.0 + Fr. 2-16 1.0 - Fr. 2-3 1.0 ++ Fr. 2-17 1.0 - Fr. 2-4 1.0 + Fr. 2-18 1.0 - Fr. 2-5 1.0 - Fr. 2-19 1.0 - Fr. 2-6 1.0 - Ampicilin 1.0 +++ Fr. 2-7 1.0-0.5 ++ Fr 2-8 1.0 + 0.25 ++ Fr. 2-9 1.0 - Positive control (+) : 0-0.5 mm +, 0.5-2 mm ++, 2-4 mm +++, Negative control (-) MeOH Fr. 2 Fr. 2-3 Fig. 1. Inhibition zone of ampicillin and Sorbus cortex extract on Candida albicans. A: 0 mg/disc (control) B: Ampicillin 200 μg/disc C: 200 μg/disc D: 100 μg/disc. 고 찰 진균에의한감염은피부및머리카락등에감염되는 superficial infection과생명까지도위협하는전신감염 (systemic infection) 등이있다. 특히최근생명을위협하는진균감염의발생빈도는급격히증가하고있다. 20여년전단지배양과정에서오염될수있는종 (culture contamminants) 으로간주되던 Candida 균의경우 90 년대이후중요한병원균으로인식되고있다. 미국의 National Nosocomial Infection Surveillance (NNIS) 에참여한병원들을대상으로실시된 1991년조사에의하면 candidemia 증의발생빈도가 80 년대에비하여 75-87% 증가한것으로보고된바있으며이러한추세는계속증가하고있다 17,18). 또한최근의한연구결과에의하면, 장기이식수술후의빈번한진균감염발생이보고되고있다 ( 신장이식 : 5%, 폐및심장 : 15 ~ 30 %, 간 : 40% 이상 ) 19). 특히인체에치명적인감염은주로기회감염진균 (opportunistic fungi) 에의한것으로서, 정상적인개체에서는병을일으키지못하지만, 방어기전에이상이생기는경우발병소인이있는숙주에병을일으킨다. 이러한심각한진균감염에의한발병증가추세는주로다음의여러가지원인에의한것으로현 재추정하고있다 20,21). 첫째 ADIS, 암치료등을위한화학요법, 또는장기이식술에사용되는면역억제제의사용등에기인한면역기능이약화된환자수의증가, 둘째의료기술의발달에따른수술및보다공격적인치료법 ( 다양한의료기구의인체내사용등 ) 의사용빈도증가, 셋째다양한항생제의사용, 넷째인구의고령화에따른면역력이약화된인구의상대적인증가, 인간의생명을위협하는진균감염은다양한진균류 (Candida spp, Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis 및 Pneumoctstis carinii 등 ) 가관계되어있으며, 그중에서도특히 Candida albicans ( 칸디다증 ) 와 Aspergillus fumifatus ( 아스페르갈루스증 ) 에의한감염이가장빈번하고심각한것으로보고되고있다 22). Candida 종은혈관내감염을유발하는주된원인진균이며, Aspergillus종은급성백혈병환자 (acute leukemia), 골수 (cone marrow) 혹은 / 조혈간세포 (fematopoietic stem cell) 이식환자에게서빈번히발생되는폐렴성사망의주된원인균으로알려져있다 22). 일반적으로진균세포벽의화학성분은균류의그것과는차이가있다. 예를들면, 균세포벽형성의저해제 (inhibitor) 로알려져있는 β-lactam이나 vancomycin 등은진균세포벽에는아무런영향도미치지못한다. 진균세포벽은그종에따라서차이는있으나, 다당류 (80%), 단백질 (3-20%), 지질과그외의미량물지로이루어져있다. 현재까지세포벽의조성과관련된효소는 chitin synthase, (1,6)β-glucan synthase 및 (1,3)β-glucan synthase 등이밝혀져있다. 특히 (1,3)β-glucan 은세포벽의주성분으로서 (1,3)β-glucan synthase에의하여 UDP-glucose로부터생성되는 D-glucose의복합체이다. (1,3)β-glucan synthase 는 plasma membrane에위치하고있으며, 여러가지의연구결과에의하면 (1,3)β-glucan synthase 의활성은진균세포벽의형성및성장에필수적이며 (1,3)β-glucan synthase 농도의저하는세포벽이나세포형상의이상을유발시킨다고알려져있다 23,24). 포유류의세포는위에서언급된 chitin synthase, (1,6)β-glucan synthase 및 (1,3)β-glucan synthase 등진균류의세포벽에존재하는효소를가지고있지않기때문에위의효소들을효과적으로차단할수있는물질은인체에는부작용이없이진균류에만선택적으로작용하는항진균약물로의개발가능성이크다고판단된다. 특히현재임상에서사용되는항진균치료제중이러한작용기전에근거한약물은아직알려져있지않다. 따라서진균세포벽의형성및성장에필수적인 (1,3)β-glucan synthase의차단효과를확인할수있는생리활성측정방법에근거하여 (1,3) β-glucan synthase에선택적으로작용하는항진균효과를지닌천연물의개발은중요하다고사료된다. 본연구에서는문헌조사를기초로하여항진균효과가있을것으로예상되는한약재를선정하고, 특히 (1,3)β-glucan synthase 차단효과를중심으로항진균성천연물질을탐색함으로써궁극적으로새로운작용기전에근거한효과적이며안전한항진균제의개발에기여하고자한다. 문헌조사에의하면국내의한약재 25,26) 나자생버섯류 27) 에대한기존의항진균활성검색법을이용한항진균활성에관한검색연구가이루어진바있으나진균세포벽의작용과연관된활성검 - 1199 -
유명자 김보미 이정호 이영행 채규윤 백승화 색에대한연구는현재까지보고된바없다. 국외의연구동향은진균감염에대한빈도수의증가와사용가능한치료제의제한에따라서미국의 Merck 나 Eli Lilly 제약회사를비롯한많은연구진들이최근안전하고효과적인항진균제의개발의일환으로진균세포벽에작용하는물질의개발에투자하고있다 5,28,29). 현재까지의문헌조사에의하면 (1,3)β-glucan synthase에작용하는작용기전을지닌물질은 lipopeptides와 papulacandins로명명되는수종의화합물만이알려져있으며, 최근이들과는다른 terpenoids형의화합물이 (1,3)β-glucan synthase의활성을저해하는새로운형태의화합물로보고된바있다 5). 특히이들중 lipopeptides에속하는 MK991, FK463 및 LY303366 등이임상실험단계에있다. 지금까지알려진 (1,3)β-glucan synthase에작용하는대부분의항진균물질은미생물로부터유래된물질이며그종류도다양한형태의 2차대사물질이존재함에반하여 3가지형태의화합물류만이보고되고있다. 또한 radio activity assay 를이용한미생물유래의추출물에대한 (1,3)β-glucan synthase 활성검색연구는보고된바 28,30) 있으나, 식물유래의추출물에대한 (1,3)β-glucan synthase assay를이용한생물학적활성검색은아직보고된바없다. 따라서다양한 2차대사물질들이항진균성물질로알려져있음으로이들중 (1,3)β-glucan synthase에작용하는물질이규명될가능성도클것으로예상된다. 31) (1,3)β -Glucan synthase를이용한 emzyme assay는 UDP-[27C]glucose 를기지로사용하는 radio activity assay 방법이주로사용되어왔다. 특히 Selitrennikoff 등은이러한방법을이용하여 HTS (High Throughtput Screening) 에적합한 assay법을보고한바있다. 30,32) 또한 radio activity한 UDP-[27C]glucose대신 UDPglucose를기질로사용하여형성된 fluorescent complex의양을 fluorescence plate reader를이용하여측정하는방법이알려져있다 33). 일반적으로 UDP-[27C]glucose를기질로사용하는 Selitrennikoff 등이제안한 radio activity assay 방법의경우는 fluorescence reader를이용하여측정하는방법에비하여그비용이많이드는단점을가지고있다. 따라서본연구에서는안전하고경제적인 UDP-glucose를기질로사용하는 fluorescence assay 방법토대로하여항진균작용을가질것으로예상되는한약재의유기용매추출물의생리활성을검정하였다. 결론 정공피메탄올추출물을 Candida albicans에대한항진균효과의측정결과는, UDP-glucose를기질로사용하는 fluorescence assay법에서는 deoxynojirimycin의농도가증가함에따라, 1,3-β -glucan synthase 활성의저해율이증가하였다. Fr. 2-16에서측정된 97.15 % 의저해율은 deoxynojirimycin의저해율 80.63% 보다높은활성이관찰되었다. 디스크확산법에의한활성은 Fr. 2-3에서 1.0 mm의저지환이나타났고, 액체배지법에의한활성측정에서도우수한항진균효과를보여주었다. 이러한실험결과는정공피를이용하여안전한항진균제개발에활용될수있으리라사료되며, 지속적인항진균물질의분리및분석을진행하고있다. 감사의글 이논문은 2006년도원광대학교의교비지원에의해서수행되었고이에감사드린다. 참고문헌 1. Chun, H,J., Kim, Y.S., Lee, Y.H., Kwak, G.B., Kwon, S.Y., Kwon, T.O., Chai, G.Y. Screening of antifungal natural products with inhibitory effects on (1,3)β-glucan synthase. Kor. J. Orien. Physiol. Pathol. 17(6):1509-1513, 2003. 2. Park, J.H., Kang, M.S., Kim, H.I., Chung, K.H., Moon, W.K. Study on immuno-stimulating activity of β-glucan isolated from the cell wall of yeast mutant Saccharomyces cerevisiae IS2. Kor. J. Food Sci. Technol. 35(3):488-492, 2003. 3. Brayman, T.G., Wilks, J.W. Sensitive assay for antifungal activity of glucan synthase inhibitors that uses germ tube formation in Candida albicans as an end point. Am. Soc. Microbiol. 47(10):3305-3310, 2003. 4. Jang, S.Y., Yu, S.Y., Kim, S.D. Antifungal activity of plant extracts against pityrosporum ovale and Candida albicans. Kor. J. Pharmacogn. 34(4):303-307, 2003. 5. Onishi, J., Meinz, M., Thompson, J., Curotto, J., Dreikorn, S., Rosenbach, M., Douglas, C., Abruzzo, G., Flattery, A., Kong, L., Cabello, A., Vicente, F., Pelaez, F., Diez, M. T., Martin, I., Bills, G., Giacobbe, R., Dombrowski, A., Schwartz, R., Morris, S., Harris, G., Tsipouras, A., Wilson, K., Kurtz, M.B. Discovery of novel antifungal (1,3)-beta-D-glucan synthase inhibitors. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 368-377, 2000. 6. Urbina, J.M., Cortes, J.C., Palma, A., Lopez, S.N., Zacchino, S.A., Enriz, R.D., Ribas, J.C., Kouznetzov, V.V. Inhibitors of the fungal cell wall. Synthesis of 4-aryl-4-N-arylamine-1- butenes and related compounds with inhibitory activities on beta(1-3) glucan and chitin synthases. Bioorg. Med. Chem. 8: 691-698, 2000. 7. Lee, G.D., Ha, T.J., Han, H.S., Jang, G.C., Jang, D.S. Jo, D.L., Yang, M.S. Antimicrobial activities of sesquiterpene lactones isolated from the flower of Chrysanthemum coronarium L. J, Kor. Soc. Appl. Chem. Biotechnol. 46(3):235-239, 2003. 8. Song, H.S., Moon, K.Y. In vitro antioxidant activity profiles of β-glucans isolated from yeast Saccharomyces cerevisiae and mutant Saccharomyces cerevisiae IS2. Food Soc. Biotechnol. 15(3):437-440, 2006. 9. Lee, S.M., Lee, C.G. Isolation and gas chromatographic analysis of lupenone and lupeol from Sorbus cortex. Anal. Sci. Technol. 12(2):136-140, 1999. - 1200 -
10. Hayashi, T., Read, S.M., Bussell, J., Thslen, M., Lin, F.C., Brown, J., Delmer, D.P. UDP-Glucose: (1-3)-beta-glucan synthases from mung bean and cotton, Plant Physiol. 83(4):1054-1062, 1987. 11. Thelen, M.P., Delmer, D.P. Gel-electrophoretic separation, detection, and characterization of plant and bacterial UDP-glucose glucosyltransferases. Plant Physiol. 81(3):913-918, 1986. 12. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D.P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-beta-glucan synthases. Anal. Biochem. 249(1):88-93, 1997. 13. Kim, Y.H., Lee, H.S. Antibacterial effects of oriental herb extract against Gardnerella vaginalis. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 34(1):70-73, 2006. 14. Chun, S.C. Jee, S.Y., Lee, S.K. The antimicrobial activity of Naesohwangryuntang and its composition oriental medicines. Kor. J. Herbol. 19(4):51-60, 2004. 15. Inoue, S.B., Qadota, H., Arisawa, M., Anraku, Y., Watanabe, T., Ohya, Y. Signaling toward yeast 1,3-β-glucan synthesis, Cell Struct. Func. 21: 395-402, 1996. 16. Kang, T,S., Jeong, H.S., Park, H.J., Lee, M,Y., Kong, Y.J., Jung, I.S. Biological activities of oat soluble β-glucans. Kor. J. Food Preserv. 10: 547-553, 2003. 17. Rex, J.H., Rinaldi, M.G., Pfaller, M.A. Resistence of Candida species to fluconazole. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1-8, 1995. 18. Klepser, M.E., Ernst, E.J., Pfaller, M.A. Update o n antifungal resistence. Trends in Microbiology 5: 372-375, 1997. 19. Alexander, B.D., Perfect, J.R. Antifungal resistence trends towards the year 2000-Implicatioins for therapy and new approaches. Drugs 54: 657-678, 1997. 20. Selitrennikoff, C.P. Fungal infections. In Antifungal drugs: (1,3)β-glucan synthase inhibitors, Springer-Verlag: Heidelberg, pp 1-12, 1995. 21. Georgopapadakou, N.H., Tkacz, J.S. The fungal cell wall as a drug target. Trends in Microbiology 3: 98-104, 1995. 22. Walsh, T.J., Vivian, M.A., Arathoon, E., Chiou, C., Ghannoum, M., Groll, A.H., Odds, F.C. New targets and delivery systems for antifungal therapy. Medical Mycology 38, Suppl. 1: 335-347, 2000. 23. Debono, M., Gordee, R.S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Annu. Rev. Microbiol. 48: 471-497, 1994. 24. Frost, D.J., Brandt, K., Capobianco, J., Goldman, R. Characterization of (1,3)-β-glucan synthase in Candida albicans: microsomal assay from the yeast or mycelial morphological forms and a permeabilized whole-cell assay. Microbiology 140: 2239-2246, 1994. 25. Krishnaeao, T.V., Galgiani, J.H. Comaprison of the in vitro activities of the echinocandin LY303366, the pneumocandin MK-0991, and fluconazole against Candida species and Cryptococcus neoformans. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1957-1960, 1997. 26. Tawara, S., Ikeda, F., Maki, K., Morishita, Y., Otomo, K., Teratani, N., Goto, T., Tomishima, M., Ohki, H., Yamada, A., Kawabata, K., Takasugi, H., Sakane, K., Tanaka, H., Matsumoto, F., Kuwahara, S. In vitro activities of a new lipopeptide antifungal agent, FK463, against a variety of clinically important fungi. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 57-62, 2000. 27. 민병선, 방규호, 이준성, 배기환. Candida 와 Penicillium 속진균에대한천연물의항진균효과검색. 약학회지 40: 582-590, 1996. 28. 방규호, 이영하, 민병선. 계피로부터항진균물질 AF-001의분리, 정제및특성. 대한균주학회지 25: 348-353, 1997. 29. 민지영, 김은미, 민태진. 버섯중항균활성물질의개발-버섯중의식물병원성곰팡이에대한항균활성물질검색. 대한균주학회지 25: 354-361, 1997. 30. Wood, R.L., Miller, T.K., Wright, A., McCarthy, P., Taft, C. S., Pomponi, S., Selitrennikoff, C.P. Characterization and optimization of In Vitro assay condition for (1,3)-β-glucan synthase activity from Aspergillus fumigatus and Candida albicans for enzyme inhibition screening. J. antibiot. 51: 665-675, 1998. 31. Ohyama, T., Kurihara, Y., Ono, Y., Ishikawa, T., Miyakoshi, S., Hamano, K., Arai, M., Suzuki, T., Igari, H., Suzuki, Y., Inukai, M. Arborcandins A, B, C, D, E and F, Novel (1,3)β -glucan synthase inhibitors: production and biological activity. J. Antibiot. 53: 1108-1116, 2000. 32. Taft, C.S., Enderlin, C.S., Selitrennikoff, C.P. A high throughput in vitro assay for fungal (1,3)β-glucan synthase inhibitors. J. Antibiot. 47: 1001-1009, 1994. 33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D.P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)β-glucan synthases. Anal. Biochem. 249: 88-93, 1997. - 1201 -