Korean J Clin Microbiol Vol. 13, No. 1, March, 2010 DOI: 10.5145/KJCM.2010.13.1.34 Identification of Bacterial and Fungal Isolates by Sequence Analysis of 16S rrna and Internal Transcribed Spacer Younhee Park 1, Hee Bong Shin 2,7, Chang Ki Kim 3,7, Kyoung Ho Roh 4,7, Jong Hwa Yum 5,7, Dongeun Yong 6,7, Seok Hoon Jeong 6,7, Kyungwon Lee 6,7 Department of Laboratory Medicine, 1 Kwandong University College of Medicine, Goyang, 2 Soonchunhyang University College of Medicine, 4 Korea University College of Medicine, Seoul, 5 Department of Clinical Laboratory Science, Dongeui University, Busan, 6 Department of Laboratory Medicine and 7 Research Institute of Bacterial Resistance, Yonsei University College of Medicine, 3 Korean Institute of Tuberculosis, Seoul, Korea Background: Accurate and rapid identification of pathogens is one of the most important tasks of the clinical microbiology laboratory, and, in cases of rare pathogens, the identification is difficult and time-consuming upon the use of conventional methods alone. Herein, we will report our molecular work involving the identification of bacteria and fungi. Methods: Sixty bacterial isolates had been collected from November 2004 to May 2007, and 15 fungal isolates had been collected from September 2005 to May 2007. Species identifications were performed using sequence analyses of the 16S rrna region of bacteria and the internal transcribed spacer (ITS) region of fungi. The data were compared with those of GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) or EMBL (http:// www.ebi.ac.uk/embl/). Results: Sixty bacterial isolates included: 23 isolates with genus information (group 1), 17 isolates (group 2) that were too fastidious for genus or species identification, 16 isolates (group 3) with results from identification kits having low confidence, and 4 isolates (group 4) with odd antibiograms according to the species. In 58 of 60 isolates, identification of the genus or species could be obtained using molecular genetic methods. Thirty-eight isolates (63%) and 20 (33%) of 58 isolates could be identified at the species and genus levels, repectively. Among the total of 15 fungal isolates, 11 (73%) and 4 (27%) isolates were identified at the species and genus levels, respectively. Conclusion: 16S rrna and ITS sequencing analyses are very useful for identifying the species or genus of a pathogenic microorganism in the clinical microbiology laboratory. (Korean J Clin Microbiol 2010;13: 34-39) Key Words: 16S rrna, Internal transcribed spacer, Nucleotide sequence, Bacterial identification 서 정확하고신속한원인균의동정은감염증진단과치료에필수적인임상미생물검사실의주요업무이다. 이를위하여순수배양된세균의그람염색성과형태, 성장촉진및필수요소, 당발효혹은동화등생화학적특성을이용한전통적인방법이사용되어왔다. 그러나표현형에의존한전통적인동정법만으로는 1) 동일한세균종 (species) 내의모든균주가동일한표현형을보이지않을수있으며, 2) 참고자료의부족으로동정이어려울수있다 [1]. 또한노령인구와면역억제환자의증가로진균에의한감염증이늘어나고, 과거에는드물던세균의분리가 Received 31 August, 2009, Revised 7 February, 2010 Accepted 18 February, 2010 Correspondence: Dongeun Yong, Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine, 250, Seongsanno, Seodaemun-gu, Seoul 120-752, Korea. (Tel) 82-2-2228-2442, (Fax) 82-2- 364-1583, (E-mail) deyong@yuhs.ac 론 점차로증가하고있어서세균의종동정이더욱어려워지고있다 [2]. 최근감염균동정에유전자염기서열분석법을이용할수있음이보고되고있다. 그중 16S rrna 는세균의종간보존염기서열과종특이염기서열을함께지니고있어서세균분류및동정에널리이용되고있고 [3-7], internal transcribed spacer (ITS) rrna 유전자염기서열분석법은진균의동정에사용되고있다 [8-11]. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 에서 2008년염기서열분석을통한미생물동정의기준을승인하였지만, CLSI 기준외에도세균의종및속 (genus) 동정기준은다양하게이용되어왔다 [12-15]. 최근국내임상미생물검사실에서도 16S rrna, ITS 염기서열분석법이감염균의동정에사용되고있으나, 분리빈도가매우낮은, 제한된세균의동정에서만일부보고가되었다 [16,17]. 이에저자들은최근 20 30개월간국내대학병원임상미생물검사실에서분자유전학적방법을이용한세균과진균동정 34
Younhee Park, et al. : Identification of Bacterial and Fungal Isolates by Sequence Analysis 35 경험을정리하여보고하고, 이를통하여분자유전학적동정법의유용성을평가해보고하고자하였다. 재료및방법 1. 대상 2004년 11월부터 2007년 5월까지 30개월간배양의뢰된임상검체에서증식된세균중전통적인생화학적방법혹은동정용키트 (VITEK system, biomerieux, Marcy l'etoile, France) 만으로는동정이어려웠던세균 60주를대상으로하였다. 또한 2005년 9월부터 2007년 5월까지 20개월간분리된진균중역시전통적인방법만으로는동정이어려웠던진균 15주에서분자유전학적방법으로동정을시도하였다. 2. 세균의 16S rrna 염기서열분석대상균주를부유시킨증류수 100μL 를 100 o C에서 10분간중탕후 4 o C에서 13,000 rpm으로 5분간원심분리하여불순물을침전시켰다. 상청액 10μL를 DNA template로사용하여중합효소연쇄반응을시행하였다. 한쌍의시발체 (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 및 5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3') 를사용하여 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany) 로 16S rrna 유전자를증폭시켰다 [18]. 증폭조건은 94 o C에서 5분간열변성후 94 o C 20초, 50 o C 40초, 72 o C 2분의과정을 35회반복후 72 o C에서 5분간연장반응을실시하였다. 증폭된 DNA는전기영동을통해 band를확인한후 QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) 를이용하여증폭산물을정제하였다. 정제된 DNA는 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) 를사용하여양방향으로염기서열을분석하였다. 3. 진균 ITS 염기서열분석 DNA 추출과정은세균의 16S rrna 염기서열분석과동일하였다. 한쌍의시발체 (5'- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3' 및 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') 를사용하여 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany) 로 ITS 부위유전자를증폭시켰다 [19]. 증폭조건은 95 o C에서 5분간열변성후 95 o C 30초, 55 o C 1분, 72 o C 1분의과정을 35회반복후 72 o C에서 6분간연장반응을실시하였다. 나머지과정은세균의 16S rrna 염기서열분석과동일하게시행하였다. 4. 염기서열상동성분석을통한세균및진균동정 16S rrna와 ITS 유전자의염기서열을 GenBank (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/) 또는 EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ embl/) 의자료와비교하였다. 세균의종및속동정을위한기준은자료분석의일관성을위하여 CLSI의기준대신연구시작부터적용하였던기준을사용하였다 [13,15]. 즉, 세균은참고염기서열과 99% 및 95% 이상의일치율을보일때특정종및속으로동정하였고, 진균은 98% 이상일치율을보일경우특정종으로 95% 이상일치율을보일경우특정속으로동정하였다 [13,15]. 결과 1. 16S rrna 유전자염기서열분석을통한세균의동정염기서열분석을시행하였던균의검체는혈액이 31건 (52%) 으로가장많았고, 창상 14건 (23%), 체액 6건 (10%), 소변 4건 (7%), 객담 2건 (3%) 순이었다. 그람음성막대균이 56% ( 포도당비발효그람음성막대균포함 ), 그람양성막대균이 23%, NTM (non-tuberculous mycobacterium) 이 3%, 그리고동정이되지않은균이 3% 였다. 16S rrna 유전자염기서열분석한균주는총 60주였고, 종까지동정된경우는 38주 (63%) 였으며, 속까지동정된경우는 20주 (33%) 였다. 16S rrna 염기서열분석을시행한경우는 1군 ) 전통적인생화학적방법과동정용키트를이용하여세균의속은동정할수있었으나, 종의감별이어려웠던 23주 (38%), 2군 ) 증식에오랜시간이소요되거나동정이까다로워세균의속명을밝히기전에염기서열분석을시행한 17주 (28%), 3군 ) 동정키트결과의 Table 1. Summary of bacterial identification by 16S rrna sequence analysis Group Reasons for 16S rrna sequencing No. of tests (%) Results of 16S rrna sequencing No. of isolates 1 To identify bacterial species 23 (38) Species identified 10 Genus identified 13 2 Sequencing without presumptive identification due to difficulties 17 (28) Species identified 14 in identifying organisms by conventional methods Genus identified 1 Unidentified 2 3 Low confidence in presumptive identification results 16 (27) Inconsistent with presumptive results 9 Consistent with presumptive results 7 4 Inappropriate antibiogram with presumptive identification results 4 (7) Inconsistent with presumptive results 0 Consistent with presumptive results 4
36 Korean J Clin Microbiol 2010;13(1):34-39 신뢰도가낮았던 16주 (27%) 및 4군 ) 동정된세균이그세균의일반적인감수성양상과달라서추가확인하기위해검사하였던 4주 (7%) 였다 (Table 1). 세균종의결정을위해분자생물학적방법을추가시험한 23 주 (1군) 중종이동정된경우는 10주 (44%) 였다. 동정된종의속은표현형을이용한동정결과와동일하였다. 이들은 Bacillus cereus, Bordetella bronchiseptica, Corynebacterium pseudogenitalium, Enterococcus faecium, Pseudomonas otitidis, Segniliparus rugosus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus sciuri 및 Streptococcus intermedius 이었다. 분자유전학적방법으로도속까지만동정된 13주는 Acinetobacter spp. 2주, Brucella spp. 3주, Corynebacterium spp. 2주, Lactobacillus spp. 1주, NTM 2주및 Salmonella spp. 3주이었다 (Table 2). 증식에오랜시간이소요되거나증식조건이까다로워균명을추정하기어려웠던 17주 (2군) 중 14주는 16S rrna 염기서열분석으로세균의종동정이가능하였다. Brevundimonas diminuta, Clostridium septicum, Kingella kingae, Lactobacillus paracasei, Moraxella atlantae, Moraxella nonliquefaciens, Moraxella osloensis, Neisseria elongata 3주, Neisseria subflava, Neisseria weaveri, Rahnella aquatilis, Tsukamurella tyrosinosolvens와같이일반적인배지및배양조건에서증식이어려웠거나분리빈도가낮은세균이었다. 나머지 1주는 Paenibacillus 속까지동정되었고 2주는 95% 이상일치하는염기서열을찾을수없었다. 동정키트결과의신뢰도가낮았던 16주 (3군) 중 11주는종까지, 5주는속까지동정할수있었다. 동정키트로 Burkholderia mallei로추정된 1주는 Chromobacterium spp. 로, Chryseobacterium spp. 로추정된 1주는 Burkholderia cepacia로, Clostridium perfringens로추정된 1주는 Propionibacterium acnes 로, Haemophilus parainfluenzae로추정된 3주는 Pasteurella multocida로, Microbacterium spp. 로추정된 1주는 Arthrobacter woluwensis로, Pseudomonas spp. 로추정된 1주는 Acinetobacter spp. 로, Sphingomonas paucimobilis로추정된 1주는 Leptotrichia spp. 로각각동정되었다. 나머지 7주는각각 Bacillus cereus, Moraxella osloensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia, Vibrio fluvialis 와 Vibrio vulnificus로동정되어키트의결과와동일하였다. 동정된세균의항균제감수성이그세균의일반적인양상과달랐던 4균주 (4군) 모두추정한세균명과염기서열분석결과가일치하였다. 4군은 Enterococcus faecium 1주, Enterococcus spp. 1주및 Staphylococcus lugdunensis 2주였다. 문제가되었던감수성양상을살펴보면, E. faecium 와 Enterococcus spp. 는 cephalosporin계항균제에대해감수성을보였고, S. lugdunensis는 oxacillin에감수성, cefoxitin에내성을보였던균주였다. 2. ITS 유전자염기서열분석을통한진균의동정효모형진균은동정키트결과의신뢰도가낮은경우, 곰팡이형진균은전통적방법으로동정이어려웠던경우염기서열분석을시행하였다. 전체검체는창상검체 5건, 안구검체가 4 건으로가장많았고혈액검체 2건, 체액검체 2건및기타검체 1건이었다. 진균별로는효모형진균 5주 (33%), 곰팡이형진균 9주 (60%), 그리고이상성진균 1주 (7%) 였다 (Table 3). 그중 11주 (73%) 는종까지, 4주 (27%) 는속까지동정되었다. 효모형 Table 2. Bacterial identifications of group 1 Identification level Phenotypic methods Results (No. isolates) of 16S rrna gene sequencing Species Enterococcus spp. E. faecium Staphylococcus spp. (3) S. haemolyticus S. hominis S. sciuri Streptococcus spp. S. intermedius Bacillus spp. B. cereus Corynebacterium spp. C. pseudogenitalium Bordetella spp. B. bronchiseptica Pseudomonas spp. P. otitidis Mycobacterium spp. Segniliparus rugosus Genus Lactobacillus spp. (3) Corynebacterium spp. (2) Lactobacillus spp. Mycobacterium spp. (2) Mycobacterium spp. (2) Brucella spp. (3) Brucella spp. (3) Salmonella spp. (3) Salmonella spp. (3) Acinetobacter spp. (2) Acinetobacter spp. (2) Table 3. Summary of fungal identification by ITS sequence analysis Type Specimen types Identification by ITS region gene sequencing Identity (%) Yeast Blood Pichia ohmeri 100 Pichia guilliermondii 100 Body fluid Cryptococcus neoformans 100 Tissue C. neoformans 100 Wound C. neoformans 100 Mould Body fluid Cladosporium spp. 100 Wound Phaeoacremonium aleophilum 100 Pseudozyma spp. 99 Trichosporon debeurumannianum 100 Eye Alternaria spp. 99 Alternaria spp. 98 Aspergillus fumigatus 99 Pseudallescheria boydii 99 Environment Paecilomyces variotii 100 Dimorphic Wound Coccidioides immitis 100 Abbreviation: ITS, internal transcribed spacer region.
Younhee Park, et al. : Identification of Bacterial and Fungal Isolates by Sequence Analysis 37 진균과이상성진균은모두종까지동정할수있었으나곰팡이형진균 9주중 4주는속까지동정할수있었다. 고찰유전자염기서열분석과같은분자유전학적방법은흔히분리되지않거나표현형에대한자료가부족한미생물, 균주에따라다양한생화학적성상을나타낼수있는미생물의동정에유용할뿐아니라, 그동안밝혀지지않았던새로운병원균을찾을수있는장점이있다 [12,20]. 진균의경우일반적으로세균에비하여동정에장시간이요구되는데분자유전학적방법을이용하면비교적단시간에동정이가능하다. 세균의분자유전학적동정에서초기에는 5S, 16S 및 23S rrna 유전자와이들사이에위치한유전자가대상으로사용되었으며, 현재는 16S rrna 유전자가세균의분류에서가장흔히사용되고있다 [3-7]. 16S rrna 유전자의염기서열은약 1,550 bp의길이를가지며보존서열과다형성을보이는서열부위로구성되어있어서염기서열을이용한세균의동정에유용하다. 그이유는 16S rrna 유전자가세포의구조형성에필수적인역할을하지않으므로세균마다차이를보일수있는변이발생이용인되기때문이다 [6,7]. 16S rrna의염기서열은많은균주에서밝혀져있는데, 가장흔히이용할수있는 GenBank에는 90,000가지이상의 16S rrna 유전자염기서열정보가저장되어있어비교를통한세균의동정이가능하다. 또한 16S rrna는모든세균에존재하므로, 이유전자를이용한동정법은거의모든세균에적용할수있다. 1군에속하는균주중에서 16s rrna 염기서열분석으로종까지동정된 9균주와속까지동정된 11균주는표현형을이용하여동정되었던세균의결과와일치하였다. 나머지 3균주중 2 균주는표현형검사에서는 Lactobacillus spp. 로추정하였으나염기서열분석에서는 Corynebacterium spp. 로, 1균주는 Mycobacterium spp. 로추정하였으나염기서열분석에서 Segniliparus rugosus 로동정되었다. 전통적표현형검사법이대부분의세균의동정에있어다른추가적인검사를필요로하는경우는높지않음을알수있었고, 임상미생물담당전문의가검사실의인력상황과환자중증도를고려하여염기서열분석을추가로시행할수있을것으로판단되었다. Acinetobacter spp., Brucella spp., NTM 및 Salmonella spp. 는 16S rrna 염기서열분석만을통해서는세균의종까지동정이어려운것으로보고된바있다 [12,21-23]. 예를들어, Brucella spp., Acinetobacter spp., Salmonella spp. 는속수준까지만동정되고종의구분은되지않는경우가흔하다. 이연구에서도세균의종을알기위해염기서열분석을시행한 1군 23주중속까지만동정된 13주의대다수 (10주) 가이들에속하였다. 각세균은염기서열분석을시행한유전자에따라서동정신뢰성이 상이할수있으므로 rpob, gyrb, dnaj 등세균의다른유전자도이용할수있다. Acinetobacter spp. 의경우는 16S-23S ribosomal ITS 유전자염기서열이종의동정에더유용하다는보고도있다 [12,14,21,24]. 대부분전향적시발체에의해증폭되는부위가종간다형성을보이는데비해 Vibrio spp. 는후향적시발체에의해증폭되는염기서열에서다형성을보인다. Vibrio spp. 의동정을위해서 toxr 유전자가유용하다는보고도있다 [23]. 이와같이시발체, 균주, 유전자부위에따라염기서열분석을통해얻을수있는동정의수준이상이할수있으므로이에대한충분한이해와적절한적용이필요할것이다. 동정키트결과의신뢰도가낮았던 16검체중 9검체가키트의결과와다르게동정되었다. 드문세균이나생화학적표현형의특성이약한세균이분리동정된경우검체를고려하여분자유전학적확인이필요할것으로판단되었다. 진균의분자유전학적동정에서는주로리보솜의 ITS 부위와 RNA 오페론 (operon) 의 D1-D2 부위의유전자를대상으로한다 [8-11]. 진균의 D1-D2 부위의염기서열은주로비병원성진균에서밝혀져있으며, 병원성진균에대해서는주로 ITS 염기서열분석이이용된다. 또한 ITS 유전자염기서열분석을이용하면중합효소연쇄반응후증폭산물의크기가달라길이의차이에따라서도균종을동정할수있다 [8,11]. 분자유전학적방법으로진균동정을시행한검체중안구검체가상대적으로많았던이유는배양에충분한양의검체를얻기어렵고조기진단과치료가예후에중요하므로안구에서진균감염이의심된경우배양과함께분자유전학적검사를의뢰하였기때문이다. 곰팡이형진균의경우대부분드물게분리되는균이어서동정이어려웠기때문에분자유전학적방법이매우유용한것으로판단하였다. 본연구에서세균에대해서는 GenBank 등의염기서열과각각 99% 및 95% 이상일치할경우, 진균에대해서는 98% 및 95% 이상일치할경우균종혹은균속으로동정하였다 [13,15]. 최근제시된 CLSI 기준외에도종및속의동정기준은다양하였고 [12-15], 본연구에서는연구시작부터적용하였던기준 [13,15] 을자료분석의일관성을위하여채택하였다. CLSI[14] 에도반영된바와같이미생물각세균의속마다같은속도로진화가이루어지는것은아니므로, 동일한기준을적용하는것보다는각각의세균속에알맞은기준이필요할것으로생각된다. 염기서열의비교를위해이용되는 GenBank, EMBL 등의자료는관련전문가들에의해검토가되지않은자료가포함되어있거나, 미생물의이름, 분류및염기서열에오류가있기도하다. 특히오래된자료의경우이런오류를포함하고있을가능성이높은것으로알려져있다 [12]. 그러므로임상미생물검사실에서이러한자료를이용하여미생물을동정하기위해서는자료들의적절성에대한검토가필요한데, 염기서열을비교할때자료의등록시점및자료에대한주의깊은검토가요구
38 Korean J Clin Microbiol 2010;13(1):34-39 된다. 한편미생물간염기서열이거의동일한경우분자유전학적방법만을통해서는종을동정하기어려울수있다. 따라서, 생화학적인활성을이용한전통적인동정방법이앞으로도중요할것으로생각된다. 결론적으로임상미생물담당전문의의판단에따라서균집락의육안적소견및현미경관찰소견, 전통적인생화학적시험에추가하여분자유전학적미생물동정법을적절히이용한다면임상미생물검사실에서의병원성세균및진균동정에매우유용할것으로판단되었다. 감사의글 본연구는연세대학교의과대학 2008년교내연구비지원 (6-2008-0281) 을받아서수행하였습니다. 참고문헌 1. Bosshard PP, Abels S, Altwegg M, Böttger EC, Zbinden R. Comparison of conventional and molecular methods for identification of aerobic catalase-negative gram-positive cocci in the clinical laboratory. J Clin Microbiol 2004;42:2065-73. 2. Walsh TJ, Groll A, Hiemenz J, Fleming R, Roilides E, Anaissie E. Infections due to emerging and uncommon medically important fungal pathogens. Clin Microbiol Infect 2004;10(Suppl 1):48-66. 3. Patel JB. 16S rrna gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol Diagn 2001;6:313-21. 4. Chong Y, Lee K, et al. eds. Diagnostic Microbiology. 3rd ed. Seoul: Seoheung Publishing; 2000:105-15. 5. Tortoli E. 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Younhee Park, et al. : Identification of Bacterial and Fungal Isolates by Sequence Analysis 39 = 국문초록 = 16S rrna 및 Internal Transcribed Spacer 염기서열분석법을이용한세균및진균동정 1 관동대학교의과대학진단검사의학교실, 2 순천향대학교의과대학진단검사의학교실, 3 결핵연구원, 4 고려대학교의과대학진단검사의학교실, 5 동의대학교임상병리과, 6 연세대학교의과대학진단검사의학교실, 7 세균내성연구소박윤희 1, 신희봉 2,7, 김창기 3,7, 노경호 4,7, 염종화 5,7, 용동은 6,7, 정석훈 6,7, 이경원 6,7 배경 : 정확하고신속한원인균의동정은임상미생물검사실의주요업무이다. 표현형을이용하는전통적인동정법만으로는드물게분리되는균의동정에실패하거나동정에오랜시간이소요되기도한다. 세균및진균의동정에분자유전학적방법을추가하였던경험을보고하고자한다. 방법 : 2004년 11월부터 2007년 5월까지 30개월간동정결과의추가확인이필요하였던 60주의세균과 2005년 9월부터 2007년 5월까지 20개월간동일한목적으로수집된 15주의진균을대상으로하였다. 세균은 16S rrna 부위, 진균은 internal transcribed spacer (ITS) 부위의유전자염기서열을분석하였으며, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 및 EMBL (http:// www.ebi.ac.uk/embl/) 의자료와비교하였다. 결과 : 대상세균은 1군 ) 전통적인생화학적방법과동정용키트를이용하여세균의속 (genus) 은동정할수있었으나, 세균의종 (species) 감별이어려웠던 23주 (38%), 2군 ) 증식에오랜시간이소요되거나동정이까다로워세균의속을밝히기전에염기서열분석을시행한 17주 (28%), 3군 ) 동정키트결과의신뢰도가낮았던 16주 (27%) 및 4군 ) 동정된세균명과그종의일반적인감수성양상이달랐던 4주 (7%) 였다. 총 60주중 58주에서세균의종혹은속의동정이가능하였다. 이중 38주 (63%) 는종까지, 20주 (33%) 는속까지동정할수있었다. 총 15주의진균중 11주 (73%) 는종, 4주 (27%) 는속까지동정할수있었다. 결론 : 16S rrna 와 ITS 부위를이용한분자유전학적방법은임상미생물검사실에서의세균의종및속동정에많은도움을줄수있을것으로판단된다. [ 대한임상미생물학회지 2010;13:34-39] 교신저자 : 용동은, 120-752, 서울시서대문구성산로 250 연세대학교의과대학진단검사의학교실 Tel: 02-2228-2442, Fax: 02-364-1583 E-mail: deyong@yuhs.ac