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Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 3, pp. 278-285 pissn 0440-2413 DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2016.6053 eissn 2383-9902 Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea Article E. coli 유래 phea 유전자의되먹임제어저항성돌연변이의구축과그단백질의생화학적특성연구 카오틴팟 1 이상현 2 홍광원 3 이성행 1 * 1 조선대학교의과대학세포분자의과학교실, 2 고려대학교대학원생명공학과, 3 동국대학교식품생명공학과 Development of the feedback resistant phea FBR from E. coli and studies on its biochemical characteristics Thinh-Phat Cao 1, Sang-Hyun Lee 2, KwangWon Hong 3, and Sung Haeng Lee 1 * 1 Department of Cellular and Molecular Medicine, Chosun University School of Medicien, Gwangju 61452, Republic of Korea 2 Department of Biotechnology, Graduate School, Korea University, Seoul 02841, Republic of Korea 3 Department of Food Science and Biotechnology, Dongguk University-Seoul, Goyang 10326, Republic of Korea (Received September 1, 2016; Revised September 22, 2016; Accepted September 23, 2016) ABSTRACT: The bifunctional PheA protein, having chorismate mutase and prephenate dehydratase (CMPD) activities, is one of the key regulatory enzymes in the aromatic amino acid biosynthesis in Escherichia coli, and is negatively regulated by an end-product, phenyalanine. Therefore, PheA protein has been thought as useful for protein engineering to utilize mass production of essential amino acid phenylalanine. To obtain feedback resistant PheA protein against phenylalanine, we mutated by using random mutagenesis, extensively screened, and obtained phea FBR gene encoding a feedback resistant PheA protein. The mutant PheA protein contains substitution of Leu to Phe at the position of 118, displaying that higher affinity (about 290 μm) for prephenate in comparison with that (about 850 μm) of wild type PheA protein. Kinetic analysis showed that the saturation curve of PheA FBR against phenyalanine is hyperbolic rather than that of PheA WT, which is sigmoidal, indicating that the L118F mutant enzyme has no cooperative effects in prephenate binding in the presence of phenylalanine. In vitro enzymatic assay showed that the mutant protein exhibited increased activity by above 3.5 folds compared to the wild type enzyme. Moreover, L118F mutant protein appeared insensitive to feedback inhibition with keeping 40% of enzymatic activity even in the presence of 10 mm phenylalanine at which the activity of wild type PheA WT was not observed. The substitution of Leu to Phe in CMPD may induce significant conformational change for this enzyme to acquire feedback resistance to end-product of the pathway by modulating kinetic properties. Key words: E. coli, aromatic amino acid biosynthesis, chorismate mutase/prephaenate dehydratase, enzyme assay, feedback inhibition resistance (FBR), phenylalanine production, random mutagenesis 방향족아미노산들은그자체또는엽산과같은효소보조제의생합성전구물질이어서유용한식품첨가물이다 (Krishnaswamy, 2001; Krishnaswamy and Madhavan Nair, 2001). 구조상환상구조의아민기를벤젠으로치환이가능하여산업적으로유용한염료, 플라스틱같은폴리머의전구체로사용될수있다 (Masuo et al., 2016). 특이하게도방향족아미노산의생합성경로는미생물에만특정되고인간간세포에는발생경로에 *For correspondence. E-mail: sunglee@chosun.ac.kr; Tel.: +82-62-230-6381; Fax: +82-62-233-6337 서제외되어있어서, 의학적으로 Mycobacterium tuberculosis 등의병원성미생물치료제의타겟이될수있다 (Parish and Stoker, 2002). 위와같은다양한생물학적유용성때문에방향족아미노산인페닐알라닌, 티로신및트립토판은오래전부터화학적으로합성되어왔으나, 현재는포도당또는미생물생합성경로의중간물질탄소원으로부터직접발효및미생물의특정효소를이용하는미생물전환 (microbial conversion) 법을이용하여생산하고있다 (Hwang, 1985; Parish and Stoker, 2002). 그예로써, 방향족아미노산중 L-페닐알라닌은동물사

phea 단백질의되먹임제어저항성돌연변이의생화학적연구 279 료첨가제뿐아니라 (Aida, 1986), 펩타이드감미료인아스파탐 (aspartame) 의원료물질로써쓰여지고있다 (Alleva et al., 2011). E. coli 에서방향족아미노산들의합성은 phosphoenolpyruvate (PEP) 와 erythrose-4-phosphate (E4P) 의효소적중합으로시작하여 chorismate을만드는 shikimate pathway라고알려진공통경로를통한다 (Parish and Stoker, 2002) (Fig. 1). 이생합성경로에서페닐알라닌은 phea 유전자에의해암호화되는 chorismate mutase/prephenate dehydratase (CMPD 또는 PheA) 라는이중기능효소 (bifunctional enzyme) 에의하여 chrismate로부터합성이시작된다. 이효소는 shikimate pathway에의하여생성된 chrismate를 prephenate로전환하는 chorismate mutase 기능과, 다음반응인 prephenate를 phenylpyruvate로전환시키는 prephenate dehydratase 기능을한효소에서동시에가지고있다 (Fig. 1). 이두가지기능이융합된 PheA 단백질은 386개의아미노산으로구성되어있고, 합성경로의마지막산물인 L-페닐알라닌에의하여다른자리입체성조절 (allosterically regulated) 을받는다고알려져있다 (Pohnert et al., 1999; Prakash et al., 2005) (Fig. 1). 이러한사실은, 세포안에서이 PheA 단백질의활성체는이량체로존재하지만, 페닐알라닌의세포내농도증가에따라각단량체의기질결합부위간의협동적결합으로인한높은수준의다량체상태 (oligomeric state) 로전환된효소결합체가발견됨으로써증명되어지고있다 (Davidson, 1987). 또한, 페닐알라닌생합성경로에서다른자리입체성조절을받는조절단백질로서의 PheA 단백질의가장중요한특징은경로의마지막산물인페닐알라닌에의하여되먹임저해에저항성 (feedback inhibition) 을갖게된다는점이다 (Garner and Herrmann, 1985; Muday and Herrmann, 1990; Gunel-Ozcan et al., 1997). 위와같은생화학적저해시스템은산업적으로유용한물질의미생물전환법및발효법에의한생산측면에서극복해야할요소이다 (Choi and Tribe, 1982). 이를극복하기위하여, 단백질공학적방법으로페닐알라닌에의한되먹임저해가해제 (feedback inhibition resistance) 된 PheA FBR 단백질을디자인하는것이고려되어질수있다. 하지만, 이러한시도는이단백질의삼차원적구조가규명이선행되어야하나, 아직까지 E. coli와같은그람음성균으로부터 CMPD 융합단백질형태의구조가보고된바없다. 따라서, 두가지기능을가진도메인들 (CM/PD) 이융합된 PheA 단백질에서정확한기질결합부위와다른자리입체성조절부위에대한정보가부재하므로, 되먹임저해를구조적으로저항성을나타낼수있는정확한부위를예측할수가없는실정이다. 이에, 본연구에서는방향족아미노산생산에산업적으로유용하게쓰일수있는되먹임저해에저항성을보이는 phea FBR 유전자를확보하기위하여, 무작위적돌연변이유발법 (random mutagenesis) 을이용하여유전자원을확보하고, 그유전자산물인 PheA FBR 단백질의생화학적연구를통하여돌연변이위치의기능을다른자리입체성조절측면에서의분석하고자하였다. 재료및방법 균주및플라스미드 Fig. 1. Biosynthetic pathway of phenylalanine in Escherichia coli. The bifunctional enzyme PheA functions as a chrismate mutase-prephenate dehydratase (CMPD) and is negatively regulated by an end-product phenylalanine. E4P, erythrose-4-phosphate; PEP, phosphoenolpyruvate. 본연구에서사용된균주및플라스미드는 Table 1에명시하였다. E. coli JH24 균주는페닐알라닌생합성관계효소들중 phea 유전자를결손시켜, 본연구의목적에최적화시켰다. plc150 플라스미드는 pbc322 (pbr322-δtet) 플라스미드에 E. coli의 phea 유전자를함유하는 DNA 절편은 EcoRI-BamHI 제한효소부위에클로닝하여구축하였다. PheA 단백질의분리정제를위하여, 이에상응하는 DNA 절편을 plc150을 template로사용하여올리고뉴클레오티드프리이머로 (pheafor: 5 -GGTGGTCATATGACATCGGAAAACCCGTTACTGGCGC-3, phearev: 5 -ACCACCGAATTCTCAGGTTGGATCAACAG GCACTACG-3 ) PCR하여획득하였다. 얻어진 1.1 kb의 DNA 절편을 NdeI-EcoRI 제한효소로절단하여, 과발현벡터인 pet28a(+) 에클로닝하였다. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

280 Cao et al. Table 1. Bacterial strains and plasmids Bacterial strains Genotype Reference or source W3110 wild type C. Yanofsky JH24 supe, supf, hsdr, gal, phea - this work BL21 (DE3) F ompt gal dcm lon hsds B(r B m B ) λ(de3 [laci lacuv5-t7p07 ind1 sam7 nin5]) [malb + ] K-12(λ S ) Novagen DH5α F enda1 glnv44 thi-1 reca1 rela1 gyra96 deor nupg purb20 φ80dlaczδm15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdr17(r K m + K ), λ ThermoFisher Plasmids Description Size (kb) Reference or source plc150 Ap r, pbr322-δtet-phea WT 4.4 this work plc151 Ap r, pbr322-δtet-phea FBR 4.4 this work pbc322 Ap r, pbr322-δtet 3.2 this work 무작위적돌연변이유발법을통한 phea FBR 유전자돌연변이유도및선별 phea 유전자는이미클로닝된플라스미드 (plc150) 를얻어사용하였다 (Hwang et al., 1985) (Table 1). phea WT 유전자가클로닝된플라스미드 (plc150) 로형질전환된 E. coli JH24(pheA-) 를대수기까지배양한후, 돌연변이유발물질인 nitrosoguanine (NTG) 를 citrate buffer (ph 5.5) 를이용하여 50 mg/ml 농도로맞추어 JH24/pLC150 형질전환된 E. coli과 37 o C에서 30분동안반응시켰다. 위의처리에서반응후잔존하는 NTG를제거하기위하여, NTG가처리된 E. coli 를원심분리한뒤 phosphate buffer (ph 7.0) 로두번세척하였다. 이 E. coli들을세척즉시완전배지 (LB broth) 에서 24시간배양후, NTG가처리된 plc150 플라스미드를추출하였다. 이추출된 plc150을제한효소 NdeI-EcoRI으로처리한후다시새로운플라스미드에클로닝하여 JH24(pheA-) 에형질전환시킨후, 페닐알라닌구조유사체 (analogue) 인 p-fluorophenylalanine (p-fp) 과 m-fluorophenylalanine (m-fp) 을 5 mg/ml 농도로포함하는최소고체배지에서 3 7일동안 37 o C에서배양하였다. 생성된 E. coli 군락으로부터 plc150 플라스미드를추출하여 phea 유전자의염기서열을결정하였다. 에서배양한후, 1 mm IPTG로 37 o C에서 5시간동안과발현을유도하였다. 분리정제를위한세포조효소액준비는사용한완충용액 (50 mm Tris-Cl, ph 7.5, 500 mm NaCl, 1 mm DTT) 을제외하고위와동일하게시행하였다. 단백질분리및동정 N-말단에 6x His tag을가진 PheA WT 또는 PheA FBR 단백질이발현된세포조효소액을 Ni-NTA affinity resin (Qiagen) 이충진된컬럼을통과시킨후, 50 mm imidazole이함유된완충용액으로결합하지않은 E. coli 단백질들을씻어내고원하는단백질을용출용액 (50 mm Tris-Cl; ph 7.5, 500 mm NaCl, 200 mm imidazole) 을이용하여회수하였다 (Fig. 2). 얻어진단백질에서 N-말단에 6x His tag을 thrombin 처리로제거하기위하여, 단백질용액을투석하여 NaCl의농도를 150 mm로낮춘후에 7 unit의 α-thrombin (Hematogolic Technology Inc.) 을 (A) (B) 세포조효소액 (crude extract) 추출및단백질발현 원심분리로회수된 E. coli (JH24/pLC150) 을적당한부피의완충용액 (50 mm Tris-Cl, ph 8.2, 1 mm Na 2EDTA, 10 mm β-mercaptoethanol) 에현탁시켜초음파파쇄한후 (Sonics Vibra Cell), 30,000 g에서 30분간원심분리하여 lysate에서비용해성부분을제거하였다. 나머지세포조효소액을효소활성측정에사용하였다. PheA 단백질과발현은 pet28a(+)-phea WT 또는 phea FBR 를포함하는 E. coli BL21(DE3) 을 Kanamycin (50 μg/ml) 이포함된 LB 배지에서대수기 (OD 600~0.6) 까지 37 o C Fig. 2. SDS-PAGE analtysis of purified PheA WT (A) and L118F mutant PheA FBR (B). Bacterial lysate and purified recombinant proteins were analyzed using 12% SDS-PAGE as described in Materials and Methods. Notably, 6 x His tag was removed by treating with thrombin, resulting in producing the lower molecular weight protein (lane 6) than that uncut protein (lane 5). Lanes: 1, molecular marker (kda); 2, crude extract from non-induced cells; 3, crude extract from induced cells; 4, unbound fractions from Ni-NTA agarose column; 5, purified 6x His tag protein (~43 kda); 6, thrombin-digested protein (~41 kda). 미생물학회지제 52 권제 3 호

phea 단백질의되먹임제어저항성돌연변이의생화학적연구 281 가하여상온에서 5시간동안반응하였다. 잘려진 6x His tag과남아있는 thrombin을제거하기위하여 prephenate dehydratase (PD) 활성측정용액 (50 mm Tris-Cl; ph 8.2, 1 mm Na 2EDTA, 10 mm β-mercaptoethanol) 으로평형을이룬 HiLoad TM 16/600 Superdex 200 pg column (GE Health) 에위단백질용액을통과시켜 size-exclusion chromatograpy를시행하였다. 최종적으로얻어진단백질은효소활성측정실험에사용되었다. Prephenate dehydratase (PD) 효소활성측정 phea 유전자산물인 PheA WT 및 PheA FBR 단백질의효소활성은 prephenate dehydratase의활성측정으로확인하였다 (Davidson et al., 1972). 이효소의반응산물인 phenylpyruvate 는알칼리용액에서 (1.5 M NaOH) 강한자외선영역파장 (320 nm) 에서흡광도를보인다. 0.4 ml의 0.5 mm prephenate 용액을 (Tris-Cl, ph 8.2, 20 mm β-mercaptoethanol) 을미리 37 o C에서항온처리한후, 세포조효소액또는순수분리된단백질 (20 μl) 을첨가하여 37 o C에서 5분간반응시켰다. 효소반응은 0.8 ml의 1.5 M NaOH 용액을첨가하여정지시키고, 원심분리후상층액의흡광도를 320 nm에서측정하였다 (Biochrom Libra S22). 생성된 phenylpyruvate의농도는 320 nm에서의몰흡광계수 (17,500) 를이용하여계산하였다. 대조실험군 (blank) 인기질자체에대한흡광도는단백질첨가전에 NaOH 용액을가한상층액의흡광도를이용하여측정하였다. 효소활성은위실험조건에서 prephenate 1.0 μm 기질을전환시키는효소의양을 1 unit으로정의하였다. 효소동력학 (enzyme kinetics) 지표결정 PheA 단백질의기질인 prephenate에대한농도의존성동력학적지표결정실험은각기질농도에대하여 triplicate 실험에의한통계적처리에의하여수행되었다. K m 과 V max 는 Sigmaplot curve-fitting 프로그램 (JandelScientific) 을사용하여계산되었다. 결과 되먹임저해저항성 phea FBR 유전자선별아미노산유사체 (analogue) 는상응하는아미노산생합성단계에관여하는주요효소 (key enzyme) 을저해한다. 그러므로야생균주는이러한유사체가존재하는환경에서는필요한아미노산을정상적으로합성할수없기때문에성장이저해된다. 마찬가지로, 유사체대신상응하는아미노산이제공되 면그저해가지속된다 (Dopheide et al., 1972). 이러한관찰은해당아미노산유사체에의하여더이상활성이저해되지않는주요효소의돌연변이단백질또한더이상그아미노산에의하여도되먹임저해를받지않는것을의미한다. 따라서이러한돌연변이유전자를가지고있는미생물은그아미노산생합성과정의조절메커니즘을상실하여특정아미노산의축척이일어난다 (Hwang et al., 1985; Pohnert et al., 1999). 방향족아미노산인페닐알라닌생합성과정에서주요효소인 PheA 단백질을대상으로페닐알라닌에의한되먹임제어저항성 (feedback resistance) 돌연변이유전자를확보하기위하여 NTG를이용한무작위적돌연법이법을사용하였다. phea 유전자를함유한 plc150 플라스미드로형질전환된페닐알라닌요구주 (auxotroph) 인 E. coli JH24를 NTG로처리한후, 5 mg/ml의페닐알라닌유사체인 m-pf 또는 p-pf를포함하는최소배지에서 3 7일이지난후최종적으로 p-pf 함유배지에서만 8개의콜로니를얻을수있었다. 이유전자들은다시새로운벡터 (pbc322) 에클로닝시켜벡터부분의손상에의한실험적오류를없애고자하였다. 얻어진유사체저항성유전자들의페닐알라닌에대한저해도를알아보기위하여, 이 p-pf 에저항성이있는플라스미드를함유하는 E. coli JH24의세포조효소액에포함된 PheA 단백질의기능인 prephenate dehayratase (PD) 의활성을 0 10 mm페닐알라닌존재하에서측정하였다. 플라스미드를함유하지않은 JH24 균주자체의세포조효소액에서는예상대로활성이측정되지않았다. E. coli 야생균주인 W3110의세포조효소액은 1 mm 페닐알라닌존재하에서약 91% 의활성이저해되었고, 5 mm에서는활성이거의측정되지않았다 (Table 2). 반면에 E. coli JH24/pLC150 (pbr322: phea WT ) 에서얻어진추출물은페닐알라닌이존재하지않는조건에서균주자체보다약 6배의활성을보였고, 5 mm의페닐알라닌존재하에서도약 20% 의활성이남아있었다. 이는 gene dosage 효과에의한되먹임제어저항성인것으로사료된다. 이와비교하여, 8종류의유사체저항가능성을가진돌연변이중에서한종류의클론만이페닐알라닌에대해유의한정도의활성저항성을나타내었다. 이유전자를 phea FBR 이라명명하고, 이를포함하는플라스미드를 plc151 (pbr322:phea FBR ) 이라명명하였다 (Table 1). 이유전자의산물인 PheA FBR 단백질은야생형단백질과비교하여약 3.5배이상의활성을보였다. 또한, E. coli JH24/pLC150 세포조효소액은 1 mm 및 5 mm 페닐알라닌농도에서보여준활성과비교하여 7.2배및 15배의활성을나타내었다 (Table 2). E. coli JH24/pLC150 세포조효소액의활성이측정되지않는 10 mm 페닐알라닌존재하에서도 E. coli JH24/pLC151의추출물은여전히 5배정도의 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

282 Cao et al. Table 2. Enzyme activities and feedback inhibition of prephenate dehydratase by phenylalanine in E. coli Specific activities (U/mg protein) b Strain a 0 mm (Phe) 1 mm (Phe) 5 mm (Phe) 10 mm (Phe) W3110 0.37 (100) 0.035 (9.4) ND (ND) ND (ND) JH24 ND (ND) ND (ND) ND (ND) ND (ND) JH24/pLC150 1.98 (100) 0.85 (42.9) 0.35 (17.7) 0.06 (3) JH24/pLC151 7.44 (100) 6.11 (82.1) 5.18 (69.6) 4.86 (65.3) ( ), Relative Activity (%) ND, Not Detected a Cultures for enzymatic analysis were grown in minimal medium agar lacking methionine (0.2 g/l). b Crude extract was used as enzyme sources for all the strains 활성 (4.86 U/mg) 을유지하고있었다. 이는 plc151 추출물은 0 mm 페닐알라닌존재하에서의저항성과비교하여 10 mm 페닐알라닌존재하에서도 65.3% 의저항성을유지한다는것을의미한다. 또한, 높은농도의페닐알라닌 (5, 10 mm) 존재하에서의야생유전자함유세포조효소액 (plc150) 보다각각 4배와 22배의증가된저항성을나타내었다 (Table 2). 위결과는선별된돌연변이유전자단백질이세포내생화학경로에서주요효소로써어느정도조절능력이상실 (deregulated) 되었고, 해당경로의마지막산물에의한되먹임저해에대한민감도에저항성을획득했다고판단되어진다. 하지만, 위실험은동일한플라스미드숫자와발현정도를가정한상태에서의해석이므로, 각형질전환된 E. coli의배양조건및세포조효소액준비과정에서나타난실험의부정확성이있을수있다. 따라서정확한되먹임제어저항성돌연변이유전자의정보와그산물에대한효소동력학적관점에서의해석이필요하므로, phea FBR 유전자의염기서열결정과그단백질의분리정제를실시하였다. phea FBR 유전자의염기서열결정과야생유전자와비교분석되먹임저해에대한민감도에저항성을나타내는유전자 (phea FBR ) 의돌연변이부위를정확히알기위하여, 총 1,158 뉴클레오타이드에대한염기서열을결정하였다 (Macrogen). 그결과야생유전자서열의 352번째시토신이티민으로치환 (C T) 되었다 (Table 3). 이뉴클레오타이드치환은유전자산물인단백질에서야생 PheA WT 단백질의 118번째아미노산인류신 (Leu, CTT) 이페닐알라닌 (Phe, TTT) 으로전환됨을의미한다. 아미노산수준에서류신이페닐알라닌으로의치환은아미노산잔기의화학적특성및구조적으로큰변화가일어난것으로판단된다. 류신의잔기는크기는상대적으로다른아미노산에비하여작지만단백질삼차구조에서대표적인소수성성질에기여한다. 하지만, 페닐알라닌은다른방향족아미노산인티로신 (Tyr) 과트립토판 (Trp) 에비하여상대적으로더 Table 3. Location of mutation and change in the corresponding amino acid in PheA FBR Nucleotide position Amino acid position 352 118 Change Leu118 Phe118 (CTT TTT) 큰소수성성질을나타내지만, 잔기의상대적인크기는류신에비하여비대하다. 따라서이치환은단백질의삼차원구조상의변화를초래할수도있다. 더나아가, 페닐알라닌은주위의다른방향족아미노산과고리구조-매개성 stacking을통한강한결합을할수있어단백질의전체적인구조와기능에변화가예상된다. 과발현단백질의정제 세포조효소액을이용한선행된활성연구로되먹임제어저항성유전자원을선별한후, 선별된 PheA FBR 단백질의되먹임제어저항의메커니즘을치환된아미노산과연계하여정확히이해하기위하여효소동력학연구를수행하였다. 효소동력학연구는분리정제된 PheA WT 와 PheA FBR 단백질이준비되어야하기때문에, 각단백질을 E. coli에서대량발현시키기위하여 pet28a(+) 과발현벡터에클로닝하여각단백질을대량발현시켰다. 과발현과정을거친세포를분쇄하고원심분리를통하여불용성물질들을제거하여목적단백질을함유하는용해성상등액 (Fig. 2: lanes 2 and 3) 을 Ni-NTA resin에통과시켰다. 이어서 resine에결합하지않거나약하게결합한단백질을씻어낸후 (Fig. 2: lane 4), 높은 imidazole 농도의완충용액으로 N-terminal에 6x His tag을함유한 PheA WT 와 PheA FBR 단백질을추출하였다 (Fig. 2: lane 5). 그림에서와같이발현정도는높았으며, His tag과친화도가높은 resine에목적단백질의크기 (~43 kda) 와결합하는정도로보아정상적인전사와번역을거 미생물학회지제 52 권제 3 호

phea 단백질의되먹임제어저항성돌연변이의생화학적연구 283 친융합단백질이발현되었음을알수있었다. 얻어진단백질은 His-tag과목적단백질사이에단백질분해효소인 thrombin 절단부위를포함하기때문에, 이단백질분해효소를이용하여 His-tag을함유한부위 (~2 kda) 를절단하였다. 최종적으로얻어진단백질은예상과같이 ~41 kda 크기의고순도로정제되었다 (Fig. 2: lane 6). 이결과는구축된과발현시스템으로용해성목적단백질이발현되었고, 효소동력학연구에적합한농도와순도로순수분리되었다는것을의미한다. PheA FBR 단백질의효소동력학적연구 PheA WT 와 PheA FBR 단백질의효소동력학적특성연구는돌연변이된아미노산부위가효소전체의기능에미치는역할을이해하는데필수적이다. 따라서 PheA 단백질의기능인 prephaenate dehaydratase (PD) 의활성에대한동력학적변수와페닐알라닌존재시활성을비교연구하였다 (Table 4). 기질인 prephenate에대한 PD의동력학적변수들은 Michaelis- Menten equation에의한초기속도로측정되었다 (Table 4). PheA WT 와 PheA FBR 의 K cat 은거의비슷하나, 기질인 prephenate 와의친화도를나타내는 K m 은 PheA WT (0.847 mm) 이 PheA FBR (0.287 mm) 보다약 3배정도높았다. 하지만, 효소효율도의척도인 K cat/k m 은 PheA FBR 이약 3배더높았다. 이는, PheA FBR 단백질이 PheA WT 보다기질친화도가더높으며, 더효율적으로반응을촉매한다는것을의미한다. 본연구에서선별된 PheA FBR 단백질의정확한되먹임제어저항성에대한동력학적성상을알아보기위하여, 분리정제된단백질로 PD 활성에대한되먹임저해 (feedback inhibition) 실험을수행하였다 (Fig. 3). 이단백질활성의조절자인페닐알라닌이 1 mm 존재시, 야생주단백질 (PheA WT ) 은 95% 의활성을잃었지만선별된 PheA FBR 단백질은같은페닐알라닌농도에서 50% 의활성을유지하고있었다 (Fig. 3). 그이상의페닐알라닌의농도 (5 10 mm) 에서는 PheA FBR 은거의 30 40% 의활성을유지하는반면, 야생주의활성은거의보이지않았다. 이결과는 PheA FBR 단백질에서일어난 L118F 아미노산치환돌연변이가 PheA WT 단백질이정상적으로되먹임제어를받는세포내페닐알라닌농도 (0.6 1 mm) 에서도 50% 이상저해를 받지않는효과를가져왔다고판단된다. 위두단백질의기질친화도와활성과의관계를더정확히알기위해, 일정농도의페닐알라닌존재시기질농도의존적활성을측정하였다 (Fig. 4). 페닐알라닌이각각 0, 0.2와 0.5 mm 존재시, 기질을 0 2 mm로변화시킨결과, 동력학적성상은서로상이한결과를보였다. PheA WT 단백질은페닐알라닌존재시기질포화도커브 (substrate saturation curve) 가 sigmoidal 하지만 (Fig. 4A), PheA FBR 단백질은같은조건에서 hyperbolic 커브를보였다 (Fig. 4B). 이결과는, 야생단백질은조절자의존재시효소활성자리들이기질과협동적 (cooperative) 인방법으로결합을보인다는것을시사한다. 반면에, 돌연변이단백질은조절자의존재와상관없이기질과단독적인방법으로결합하는것으로사료된다. 고찰 본연구에서는 E. coli에서의방향족아미노산생합성경로를조절하는주요효소인 PheA 단백질의되먹임제어저항성돌연변이 (PheA FBR ) 를선별하고, 그효소의효소동력학적 (enzyme kinetics) 성상을연구하였다. 되먹임제어저항성돌연변이유전자를고농도의페닐알라닌유도체존재하에서선별하였다. 이돌연변이는 118번째아미노산인류신 (Leucine) 이페닐알 Table 4. Determination of kinetic parameters of WT and L118F mutant PheA FBR Prephentae Protein K cat (min -1 ) K m (mm) K cat/k m (min -1 mm -1 ) WT 2061 0.847 2433 L118F 2027 0.285 7112 Fig. 3. Effect of phenyalalanine on PheA activities. The prephenate dehydratase activity was measured in the presence of various phenylalanine concentrations. PheA FBR (open circle) sustains its activity by 40 50% at 1 and 2 mm phenylalanine concentrations, respectively, at which the activity of PheA WT (closed circle) is almost negligible. All experiments were performed with triplicate for statistics. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

284 Cao et al. (A) (B) Fig. 4. Substrate dependent PheA function in the presence of phenylalanine. The prephenate dehydratase activity was examined as functions of PheA WT (A) and PheA FBR (B) proteins in the fixed inhibitor (Phe) concentrations (0, 0.2, and 0.5 mm). PheA WT shows sigmoidal fitting in the presence of end-product phenylalanine (A), whereas the mutation occurred at L118F in PheA FBR changes inhibitor-dependent binding of substrate to hyperbolic (B), indicating that the amino acid substitution might prevent the oligomerization of mutant protein. Data are averages of triplicate determinations and were fitted to Michelis-Menten equation. 라닌 (Phenyalanine) 으로치환된돌연변이로판명되었다 (Table 3). 효소활성은발현주의세포조효소액과고순도로분리정제된단백질모두비슷한활성을보였다. 흥미롭게도, 야생주단백질과그활성을비교해볼때, 3배이상의활성증가를보였다 (Table 4). 방향족아미노산들인타이로신또는트립토판에의한조절을받지않는돌연변이단백질은보고된바있으나 (Choi and Tribe, 1982; Hwang et al., 1985), 페닐알라닌에의한저해저항성돌연변이는보고된바없었다. 따라서, 본연구에서무작위적돌연변이방법에의해선별된 phea FBR 유전자는방향족아미노산생합성경로의조절기작을더세밀하게이해하는데유용하게이용될것으로사료된다. 효소동력학연구의결과, 이돌연변이는야생주단백질의페닐알라닌의존성기질전환을협동적 (cooperative) 인기질과의결합에서단독적인결합방법으로변환시키는것으로판단된다. 이현상은, E. coli 내야생 PheA 단백질은단량체 (monomeric) 로존재하지않고다량체 (multimeric) 로존재함을입증하고있다. 이것은기존의보고들을 (Baldwin et al., 1981) 효소동력학적으로입증하는결과이다. 그이유는, 최소배지에서 E. coli 내에축척되어지는페닐알라닌의농도는 0.6 1.6 mm로알려져있는데 (Brown, 1970), 이실험은야생에서의정상적인세포내농도와근접한 ~0.5 mm 페닐알라닌존재하에서실시하였기때문에, E. coli 내에서 PheA 단백질의다량체로의존재가페닐알라닌의축척에따른조절효소를효율적으로제어할수있도록고안되었다는것을보여준다. 이런동력학적연구의결과와단백질자체의기능사이에상관관계를설명하기위하여, 이단백질의삼차원적구조연구가필수적이라하겠다. 그러나, 현재까지보고된 E. coli의 PheA 단백질은그람양성균의단백질과는달리 N-말단부분의 chrismate mutase (CM) 와 C- 말단부분의prephenate dehydratase (PD) 기능을모두가지고있는융합단백질이다 (Tan et al., 2008). 단백질 2차구조를분석한결과, CM 도메인 (1-89 aa) 과 PD 도메인 (103-376 aa) 으로나누어져있고, 생화학적연구및다른미생물의 PD 단백질구조연구에서 309 312와 329 332 아미노산으로이루어진 motif가페닐알라닌이결합하는조절부위 (regulatory region) 로알려져있다 (Liberles et al., 2005; Vivan et al., 2006). 하지만, 본연구의 PheA FBR 단백질에서발견된치환은페닐알라닌결합부위가아닌 CM과 PD 도메인의중간또는 PD 도메인의도입부에서형성되었다. 이결과는돌연변이 (L118F) 에서나타나는되먹임제어저항성이조절자결합부위의변환으로초래된페닐알라닌친화도증가로인한효과가아니라는것을의미한다. 아마도이돌연변이부위는이융합기능효소의새로운조절기능을가진도메인일가능성이크다고사료된다. 이를정확히규명하기위하여삼차원구조분석이요구된다. 적요 E. coli의 PheA 단백질은 chorismate mutase and prephenate dehydratase (CMPD) 활성을가지며마지막산물인페닐알라닌에의하여되먹임제어가되는생합성경로의주요조절효 미생물학회지제 52 권제 3 호

phea 단백질의되먹임제어저항성돌연변이의생화학적연구 285 소중의하나이다. 그러므로, 이 PheA 단백질은필수아미노산중의하나인페닐알라닌의대량생산에이용하기위한단백질공학의타겟이될수있다. 이러한목적으로 PheA 단백질의마지막생산물인페닐알라닌에의한되먹임저해저항성유전자원을선별하였다. 이유전자의산물인 PheA FBR 은 118번째류신이페닐알라닌으로치환되었고, 기질인 prephenate에대한친화도가야생주단백질과비교하여약 3.5배정도높았다. PheA FBR 은세포내에서축척되어져되먹임저해를하는페닐알라닌농도에서 ( 약1 mm와 10 mm) 에서도 50% 와 40% 의활성을유지하고있었고, 페닐알라닌존재하에서기질의결합성향이협동적 (cooperative) 모드에서단독적 (hyperbolic) 모드로전환되었다. 이는기존연구와비교해볼때, 이돌연변이부위는이융합기능효소인 PheA 단백질의새로운조절부위의존재를암시한다. 효소동력학적결과는 PheA 단백질의되먹임저해저항성획득이아미노산돌연변이에의한단백질구조의변화유도에의한것으로생각된다. 더나아가, 본연구에서선별된돌연변이유전자는생물전환법을이용한필수아미노산생산에산업적으로응용가능성이있다. 감사의말 본연구는 2013년정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된일반연구자지원사업 (NRF-2013R1A1A2057465) 의지원을받아수행되었다. References Aida, K., Chibata, I., Nakayama, K., Takinami, K., Yamada, H. 1986. Biotechnology of amino acid production, pp. 188. Progress in Industrial Microbiology. 24. Tokyo: Kodansha; Ltd, Amsterdam: Elservier Science Publ. Alleva, R., Borghi, B., Santarelli, L., Strafella, E., Carbonari, D., Bracci, M., and Tomasetti, M. 2011. In vitro effect of aspartame in angiogenesis induction. Toxicol. In Vitro 25, 286 293. Baldwin, G.S., McKenzie, G.H., and Davidson, B.E. 1981. The self-association of chorismate mutase/prephenate dehydratase from Escherichia coli K12. Arch. Biochem. Biophys. 211, 76 85. Brown, K.D. 1970. Formation of aromatic amino acid pools in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 104, 177 188. Choi, Y.J. and Tribe, D.E. 1982. Continuous production of phenylalanine using a Escherichia coli regulatory mutant. Biotechnol. Lett. 4, 6. Davidson, B.E. 1987. Chorismate mutase-prephenate dehydratase from Escherichia coli. Methods Enzymol. 412, 8. Davidson, B.E., Blackburn, E.H., and Dopheide, T.A. 1972. Chorismate mutase-prephenate dehydratase from Escherichia coli K-12. I. Purification, molecular weight, and amino acid composition. J. Biol. Chem. 247, 4441 4446. Dopheide, T.A., Crewther, P., and Davidson, B.E. 1972. Chorismate mutase-prephenate dehydratase from Escherichia coli K-12. Ii. Kinetic properties. J. Biol. Chem. 247, 4447 4452. Garner, C.C. and Herrmann, K.M. 1985. Operator mutations of the Escherichia coli arof gene. J. Biol. Chem. 260, 3820 3825. Gunel-Ozcan, A., Brown, K.A., Allen, A.G., and Maskell, D.J. 1997. Salmonella typhimurium arob mutants are attentuated in BALB/c mice. Microb. Pathog. 23, 311 316. Hwang, S.O., Gil, G.H., Cho, Y.J., Kang, K.R., Lee, J.H., and Bae, J.C. 1985. The fermentation process for L-phenylalanine production using an auxotrophic regulatory mutant of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 22, 6. Krishnaswamy, K. 2001. Perspectives on nutrition needs for the new millennium for South Asian regions. Biomed. Environ. Sci. 14, 66 74. Krishnaswamy, K. and Madhavan Nair, K. 2001. Importance of folate in human nutrition. Br. J. Nutr. 85 Suppl 2, S115 124. Liberles, J.S., Thorolfsson, M., and Martinez, A. 2005. Allosteric mechanisms in act domain containing enzymes involved in amino acid metabolism. Amino Acids 28, 1 12. Masuo, S., Zhou, S., Kaneko, T., and Takaya, N. 2016. Bacterial fermentation platform for producing artificial aromatic amines. Sci. Rep. 6, 25764. Muday, G.K. and Herrmann, K.M. 1990. Regulation of the Salmonella typhimurium arof gene in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172, 2259 2266. Parish, T. and Stoker, N.G. 2002. The common aromatic amino acid biosynthesis pathway is essential in Mycobacterium tuberculosis. Microbiology 148, 3069 3077. Pohnert, G., Zhang, S., Husain, A., Wilson, D.B., and Ganem, B. 1999. Regulation of phenylalanine biosynthesis. Studies on the mechanism of phenylalanine binding and feedback inhibition in the Escherichia coli p-protein. Biochemistry 38, 12212 12217. Prakash, P., Pathak, N., and Hasnain, S.E. 2005. phea (Rv3838c) of Mycobacterium tuberculosis encodes an allosterically regulated monofunctional prephenate dehydratase that requires both catalytic and regulatory domains for optimum activity. J. Biol. Chem. 280, 20666 20671. Tan, K., Li, H., Zhang, R., Gu, M., Clancy, S.T., and Joachimiak, A. 2008. Structures of open (R) and close (T) states of prephenate dehydratase (PDT)--implication of allosteric regulation by l-phenylalanine. J. Struct. Biol. 162, 94 107. Vivan, A.L., Dias, M.V., Schneider, C.Z., de Azevedo, W.F. Jr., Basso, L.A., and Santos, D.S. 2006. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of prephenate dehydratase from Mycobacterium tuberculosis h37rv. Acta. Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 62, 357 360. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3