지방조직의 Stromal Vascular Fraction에서다양한분화방법에따른지방세포로의분화 김민경 1 박용순 1 박희순 2 최정묵 2 김원준 3 박세은 3 이은정 3 박철영 3 이원영 3 오기원 3 박성우 3 김선우 3 한양대학교생활과학대학식품영양학과 1, 강북삼성병원당뇨병연구소 2, 성균관대학교의과대학강북삼성병원내분비내과 3 Adipose Tissue Stromal Vascular Fraction Cells Differentiate Depending on Various Methods Min Kyung Kim 1, Yong Soon Park 1, Hee Soon Park 2, Jung Mook Choi 2, Won Jun Kim 3, Se Eun Park 3, Eun Jung Rhee 3, Cheol-Young Park 3, Won Young Lee 3, Ki Won Oh 3, Sung Woo Park 3, Sun Woo Kim 3 Department of Food and Nutrition, Hanyang University, Seoul, Korea 1 ; Diabetes Research Institute, Kangbuk Samsung Hospital, Seoul, Korea 2 ; and Departments of Internal Medicine, Kangbuk Samsung Hospital, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea 3 Abstract Objective: Adipogenic medium of fat cells can be induced using culture medium supplemented with insulin, 3-isobutyl-methylxanthine (IBMX), glucocorticoid and indomethacin. The purpose of this study was to determine medium conditions for promoting differentiation of stromal vascular fraction (SVF) cells towards adipocyte. Methods: SVFs were isolated subcutaneous adipose tissues and retroperitoneal adipose tissue of Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rat and Sprague-Dawley rat. Post-confluent SVFs were cultured MDI medium (520 μm 3-isobutyl-methylxanthine (IBMX), 1 μm dexamethasone, 1 μg/ml insulin) for 2 days 3 times or MDII medium (MDI medium, 200 μm indomethacin) for 3 days 3 times or MDIT medium (MDI medium, 20 μg/ml troglitazone) for 2 days. Results: SVF cells adipogenic differentiation were higher to add the MDI medium 3 times, MDII medium or MDIT medium than add the MDI medium. Conclusion: Adipogenic differentiation was enhanced adding the adipogenic medium multiple times and using the different PPARγ ligands (indomethacin, troglitazone). ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Stromal vascular fraction, Density gradient, Indomethacine, PPARγ agonist, Differentiation 책임저자 : 박철영서울시종로구평동 108 번지강북삼성병원성균관대학교의과대학내과학교실 Tel: 02)2001-2440, Fax: 02)2001-1588, E-mail: cydoctor@chol.com * 본연구는 2007 년한국지질동맥경화학회연구비지원을받았음. - 241 -
韓國脂質 動脈硬化學會誌 19 卷 3 號 서 론 조성에서 ASCs의특성에차이를나타내는지에대한여부를확인하였다. 지방전구세포의지방세포로의분화는세포의형태적변화와유전자발현양상의변화와같은생화학적변화를보이며, 3T3-L1 세포와같은지방전구세포나지방유래기질세포는 in vitro에서지방세포생성과정을관찰하는데널이이용되고있다. 1,2 지방세포의분화과정에서지방전구세포혹은중간엽줄기세포를지방세포로분화를유도하는데다양한약물과호르몬들이사용된다. Insulin은체내에서다양한기능을수행하는호르몬으로분화된지방세포의수를증가시키는작용을하고 insulin growth factor (IGF) receptor의교차활성을통해지방을축적시킨다. Dexamethasone 은 glucocorticoid receptor와결합하여 C/EBP (CCAAT enhancer binding protein) β와 C/EBPδ를유도하고 pref-1의발현을억제하며, 3,4 3-isobutylmethylxanthine (IBMX) 은세포내에 camp의양을증가시켜지방세포로분화를유도한다. 5 Thiazolidinedion, prostaglandin 및 indomethacin은 PPARγ의 ligand로써지방세포분화를유도하며 6 growth hormone, thyroid hormone, Retinoic acid 등도지방세포분화에영향을미친다고알려져있다. 지방세포의일반적인분화방법은 3-isobutylmethylxanthine (IBMX), dexamethasone, insulin이들어간전통적인 3제요법인 MDI medium을 adipogenic medium으로이용한다. 그러나지방조직에서지방전구세포를얻어분화시키는경우지방전구세포주보다효율이낮아이를개선시키기위한여러가지방법들이시도되고적용되고있다. 본연구에서는지방조직으로부터추출한 stromal vascular fraction (SVF) 를지방조직으로분화를유도하기위해분화에영향을미치는약물의투여방법을다르게하여분화효율성이높은방법을찾고자하였다. 또한추출한 SVF와 1 번의계대배양을하여지방조직의 SVF 내세포 재료및방법 1. Stromal Vascular Fraction의분리지방조직은수컷 Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rat과 Sprague-Dawley (SD) rat으로부터 subcutaneouse adipose tissue (SAT) 와 retroperitoneal adipose tissue (RAT) 를채취하였다. LETO rat은사람의제2형당뇨병및인슐린저항성모델인 Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) 의대조군이며, 오츠카제약회사 ( 일본 ) 로부터공급받았다. Rat으로부터채취한지방조직은 Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco, USA) 에 2% bovine serum albumin (BSA, Gibco, USA) 를넣은용액으로여러번세척한다음작은조각으로분쇄하였다. 37 에서 30분간 0.075% collagenase Type II (Sigma-Aldrich, USA) 로분해시킨후 10% fetal bovine serum (FBS), 0.2% Fungizone, 1% Penicillin Streptomycin (Gibco, USA) 을함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA) 으로효소반응을정지시켰다. 100 μm 나일론여과지 (mesh filter, BD bioscience, USA) 를이용하여불필요한조직을제거하고 200 g에서 10분동안원심분리하여하부의모아진세포를 RBC lysis buffer (ebioscience, San. Diego, CA, USA) 에 10분간처리, 원심분리하여 SVF를모은다. 밀도차등원심분리법을이용하여분화율이높은분획을사용하였다. 7 농도별비연속 nycodenz (Sigma, USA) buffer는 30, 19, 13, 11% 로만든다음지방조직의 SVF를 11% nycodenz buffer에넣어 250 g에서 30분동안원심분리하였다. 상층액과각농도별경계면에서수집한 SVF 중에서 11~13% nycodenz 경계면에서수집한 SVF를사용하여지방세포로의분화를유도하였다. - 242 -
지방조직의 Stromal Vascular Fraction 에서다양한분화방법에따른지방세포로의분화 2. 지방세포로의분화유도 SVF는 growth medium (high glucose DMEM, 10% FBS, 0.2% Fungizone, 1% Penicillin Streptomycin) 으로희석하여 37, 5% CO 2 환경에서포화상태에도달할때까지배양하였으며, 지방세포주인 3T3-L1의일반적인분화방법인 MDI medium과 Insulin medium을각각 2일씩처리하여분화를유도시키는방법을기본으로하여반복처리하거나 MDI medium에 PPARγ ligand를첨가하는방법으로분화를유도하였다 (Table 1). LETO rat의 SAT로부터수집한 SVF (S-SVF) 한번계대배양 (1 passage) 하여 6-well plate에 1 ml당 2 10 5 으로배양하였고, 2~3일간격으로새로운배지로교환하면서포화상태에이르도록하였다. 지방세포로의분화를위해 3일동안 MDII medium (520 μm 3-isobutyl-methylxanthine (IBMX), 1 μm dexamethasone, 1 μg/ml insulin, 200 μm indomethacin) 를처리한다음 1일은 insulin medium (1 μg/ml insulin) 을처리하는방법을 3회반복한후 growth medium으로 2일배양하였다. LETO rat의 RAT의 SVF (R-SVF) 는초기얻어 진세포 (0 passage) 와한번계대배양하여얻어진세포 (1 passage) 의분화율을비교하였다. 6-well plate에 1 ml당 2 10 5 으로배양하였고, 2~3일간격으로새로운배지로교환하면서포화상태에이르도록하였다. MDI medium (520 μm 3-isobutyl -methylxanthine (IBMX), 1 μm dexamethasone, 1 μ g/ml insulin) 과 Insulin medium (1 μg/ml insulin) 을각각 2일씩 3회반복처리한다음 growth medium으로 2일동안배양하여지방축적여부를확인하였다. SD rat의 S-SVF와 R-SVF는초기얻어진세포 (0 passage) 를사용하였으며, 12-well plate에 1 ml 당 0.5 10 5 으로 37, 5% CO 2 환경에서배양하였다. 분화를유도하기위해 MDIT medium (520 μm 3-isobutyl-methylxanthine (IBMX), 1 μm dexamethasone, 1 μg/ml insulin, 20 μg/ml troglitazone) 2일, insulin medium (1 μg/ml insulin) 2일을처리하고 6일동안 growth medium으로배양하였다. 3. 분화도의측정세포내지방축적여부는 Oil red O stain을하여지방세포로분화되었음을확인하였다. 세포를 Table 1. Adipogenesis of Adipose-derived stem cells (ASCs) by Media Supplementation Medium Media Serum Supplementation Growth medium high glucose DMEM 10% FBS 1% Penicillin Streptomycin, 0.2% Fungizone MDI medium high glucose DMEM 10% FBS 1% Penicillin Streptomycin, 0.2% Fungizone IBMX (3-isobutyl-methylxanthine) 520 μm Dexamethasone 1 μm Insulin 1 μg/ml MDII medium high glucose DMEM 10% FBS 1% Penicillin Streptomycin, 0.2% Fungizone IBMX (3-isobutyl-methylxanthine) 520 μm Dexamethasone 1 μm Insulin 1 μg/ml Indomethacin 200 μm MDIT medium high glucose DMEM 10% FBS 1% Penicillin Streptomycin, 0.2% Fungizone IBMX (3-isobutyl-methylxanthine) 520 μm Dexamethasone 1 μm Insulin 1 μg/ml Troglitazone - 243 -
韓國脂質 動脈硬化學會誌 19 卷 3 號 10% formaldehyde로 30분고정한후에 60% isopropanol로세척한다음 60% isopropanol에 Oil Red O (Sigma-Aldrich, USA) 를녹인 Oil red O solution으로 30분이상염색하였다. 염색한세포는현미경으로관찰하였으며, 100% isopropanol로 Oil red O de-stain을하여 ELISA Reader (Model 680 Microplate Reader, Bio-Rad, USA) 로 490 nm 에서흡광도를측정하였다. 결과 1. 지방조직의양 LETO rat의 SAT와 RAT의지방양은 20.56± 3.29 g와 12.60±1.50 g으로 RAT의지방양이적었으며, SD의지방양은 SAT가 17.31 g, RAT가 20.56 g으로 SAT의지방양이적었다 (Fig. 1). Fig. 1. Amount of adipose tissue. Fig. 2. The optical density of Oil red O positive cells (LETO rat S-SVF). - 244 -
지방조직의 Stromal Vascular Fraction 에서다양한분화방법에따른지방세포로의분화 2. LETO Rat의 S-SVF 의분화정도 - MDI medium에 indomethacin을첨가 (MDII medium) 하여 3일, Insulin medium을 1일씩 3 회반복처리시 SVF의분화정도 S-SVF가포화상태가되었을때 MDII medium 3일, insulin medium 1일을 3회반복처리하여분화를유도한것이 MDI medium으로분화를유도한것보다약 1.5배더높은분화율을보였다 (Fig. 2). MDII medium을지속적으로처리한경우에도 MDI medium으로분화를유도한것보다는분화율이높았지만 MDII medium을반복처리한것보다는분화율이떨어졌다. 3. LETO Rat의 R-SVF 의분화정도 - MDI medium과 Insulin medium을각각 2일씩 3회반복처리시기질세포의분화정도 Adipogenic medium과 insulin medium을 2일씩 3회반복처리했을때 R-SVF의분화율이더좋음을현미경을통하여확인하였다 (Fig. 3A). Oil red O de-stain 결과를통해서도확인할수있었는데, 0 passage에서는 R-SVF의분화율이 2배이상증가되었고 1 passage에서는분화율이 5배이상증가되었다 (Fig. 3B). 그러나 passage에따른분화율을비교했을때두가지분화방법에서모두 0 passage가 1 passage보다분화효율이더좋 A B Fig. 3. Adipogenic differentiation ofleto rat R-SVR A. Oil red O stain (magnification, 200) B. The optical density of Oil red O positive cells. - 245 -
韓國脂質 動脈硬化學會誌 19 卷 3 號 았으며, passage를넘긴 R-SVF의분화율은 2배이상감소하는것으로나타났다. 4. SD Rat 의 S-SVF 와 R-SVF 의분화정도 - MDI medium에 troglitazone을첨가 (MDIT medium) 하여 2일, insulin medium 2일처리시기질세포의분화정도 MDI medium으로분화를유도하였을때와 MDIT medium으로분화를유도하였을때모두 S-SVF의분화가가장잘이루어졌고 R-SVF는 S-SVF 보다는분화율이떨어졌다 (Fig. 4). S-SVF 는 MDIT medium으로분화를유도하였을때 MDI medium으로분화를유도한것보다분화율이높게나왔다. 그러나 R-SVF는 MDIT medium 으로분화를유도한것이 MDI medium보다분화율이낮았다. A B Fig. 4. Adipogenic differentiation of SD rat A. Oil red O stain (magnification, 200) B. The optical density of Oil red O positive cells. - 246 -
지방조직의 Stromal Vascular Fraction 에서다양한분화방법에따른지방세포로의분화 고찰 본연구는지방조직으로부터추출한 SVF를지방조직으로분화시키는데있어분화에영향을미치는약물의투여를다르게하여분화율의차이를관찰하는한편, 계대배양으로 passage를넘긴 SVF를분화시킴으로써 ASCs로써의특성변화를비교하였다. IBMX와 dexamethasone, insulin 을포함하고있는 MDI medium은지방세포로의분화를유도하는전통적인방식이다. 1 본연구에서시행된 MDI medium과 insulin medium의 3회반복처리는 1회처리로분화가유도되지않은세포들이 2~3회의처리로자극을받아지방세포분화될수있는가능성을나타내는분화효율의증대를보여주었다. LETO rat의 RAT로부터분리한 SVF는 MDI medium의반복처리에의해분화율이 2배증가된것을통해 ASCs를많이포함하고있다고여겨진다. 지방조직으로부터추출한 SVF는계대배양을통해세포수를증대시켜이용하기도하는데본연구에서는 LETO rat의 RAT 로부터추출한 SVF를계대배양하여분화를유도하였을때 0 passage와비교하여분화율이현저하게반감되었다. SVF 내에는혈구세포, 섬유아세포, 내피세포및지방전구세포등다양한세포를포함 8-11 하기때문에부착후자라는세포의조성도계대배양횟수및사용하는 media의성분에따라달라질수있다. 이전의연구에서도 passage를넘긴경우세포의증식속도가감소되고, 세포의모양과크기가변형이되며분화능력의감소와같은줄기세포로서의기능이저하된다고보고하였다. 12-14 그러나계대배양한경우분화율의감소비율이 MDI medium을 1회처리한경우보다 2~3회처리한경우에더적었다. 즉, MDI medium의반복처리가 0 passsage와 1 passage 모두에서분화율을증대시켰다는것을의미한다. 지방조직으로부터추출한 SVF를지방조직으로분화를유도시키는데 Zuk 등 15 의분화방법이 가장일반적으로사용되고있다. PPARγ ligand인 indomethacin 6 을지방세포로의분화유도에사용하여기존의 MDI medium만을처리한경우와비교하였고 indomethacin의사용이분화효율을증가시켰음을알았다 (Fig. 1). 그러나본연구의한계점는 indomethacin을첨가한 MDII medium을한번이아닌 3회반복처리를하거나중간에 insulin medium 처리없이지속적으로 MDII medium 만을처리하였기때문에 MDII medium 을한번만처리했을때의분화효율은알수가없었으며, indomethacin의반복처리가세포에미치는영향또한비교하기어렵다는데있다. 따라서 PPARγ ligand가들어간 adipogenic medium을이용하여추가연구를진행하였으며, indomethacin과같은 PPARγ ligand로써잘알려진 thiazolidinedione (TZD) 6 계열의약물인 troglitazone을분화 medium에첨가하여 MDI medium과의분화효율을비교하였다. PPARγ ligand인 troglitazone은 in vitro상에서 MSCs의분화를촉진한다고알려져있다. 16 본연구에서는 SAT로부터추출된 SVF의분화율은증가된반면, RAT는오히려분화율이감소되었다. 이는어떤지방조직으로부터유래한 SVF인지에따라 ASCs의함량이다르다는것을의미하며, 기존의다른연구 17,18 를통해서도알수있다. 그러나 SAT와 Omental adipose tissue (OAT) 로부터추출한 SVF에 adipogenic medium 처리시분화율에차이가없었다는연구도있다. 19 그러나이러한상반된연구들은지방조직을추출한대상이무엇인지, 어떤지방조직으로부터추출된것인지에따라다를수있으며, adipogenic medium의성분에따라달라질수있다. 본연구에서지방조직에따른 Troglitazone의분화율차이는 PPARγ ligand인 indomethacin을사용했을때에나타났던분화경향과비슷하였으나 RAT로부터추출한 SVF의분화율이감소된것에대해서는추가적인연구가필요할것이다. 본연구는 SVF를분리하는데있어보다순도가높은 ASCs를포함하는 SVF의분리를위해 - 247 -
韓國脂質 動脈硬化學會誌 19 卷 3 號 Nycodenz를이용하여밀도차등원심분리에의한 SVF를추출하였으며지방세포로의분화효율을높이기위해추가적인약물을사용하여 ASCs의분화율을증대시키기위한방법을찾았다. 지방조직에따라 SVF 내에세포들간에차이가있으며, 분화시키기위해동일한약물의사용에도분화율에차이가나타나는것은이러한 SVF 내세포특성이미치는영향때문이라는결론을내릴수있다. 그러나다양한세포를함유하고있는 SVF의특성때문에추가적인약물의사용이지방세포로의분화를증대시키는효과이외의반감효과에대한연구는미흡하였다. 또한서로다른 rat을사용함으로써분화효율을비교하기어려운제한점을가지고있으므로향후추가적인연구를통해각각의분화방법에따른비교를진행하는것이필요할것으로사료된다. 요약 연구배경 : 지방세포의분화를유도하는가장일반적인방법은 insulin, IBMX, glucocorticoid 및 indomethacin이다. 본연구에서는지방조직으로부터추출한 SVF를분화에영향을미치는약물의투여방법을다르게하여분화율의차이를살펴보았다. 또한계대배양에따라각지방조직의기질세포내세포조성에서 ASCs의특성에차이를나타내는지알아보았다. 방법 : Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rat 으로부터수집한 SAT의 SVF는 MDII medium (MDI medium, 200 μm indomethacin) 를처리한다음 1일은 insulin medium을처리하는방법을 3회반복하였다. RAT의 SVF는 MDI medium (520 μm 3-isobutyl-methylxanthine (IBMX), 1 μm dexamethasone, 1 μg/ml insulin) 과 Insulin medium (1 μg/ml insulin) 을각각 2일씩 3회반복처리하여분화를유도하였다. Sprague-Dawley (SD) rat은 SAT와 RAT를채취하여 MDIT medium (MDI medium, 20 μg/ml troglitazone) 2일, insulin medium 2일을처리하여분화를유도하였다. 결과 : MDI medium의반복처리는 LETO rat의 R-SVF의지방세포로의분화율을향상시켰으며, indomethacin의첨가역시 S-SVF의분화율을증가시켰다. 또한 troglitazone은 SD rat에서 S-SVF 와 R-SVF의분화율을증가시켰다. SVF를계대배양한경우 0 passage에비해지방세포로의분화율이 2배이하로반감되었다. 결론 : Adipogenic medium의반복처리또는 PPARγ ligand의첨가는지방세포로의분화를향상시키며계대배양은기질세포내지방유래줄기세포의특성을감소시켰다 참고문헌 1. Rosen OM, Smith CJ, Hirsch A, Lai E, Rubin CS. Recent studies of the 3T3-L1 adipocyte-like cell line. Recent progress in hormone research 1979;35:477-499 2. Cornelius P, MacDougald OA, Lane MD. Regulation of adipocyte development. Annual Review of Nutrition 1994;14:99-129 3. Wu Z, Bucher NL, Farmer SR. Induction of peroxisome proliferator-activated receptor gamma during the conversion of 3T3 fibroblasts into adipocytes is mediated by C/EBPbeta, C/EBPdelta, and glucocorticoids. Molecular and Cellular Biology 1996;16:4128-4136 4. Smas CM, Chen L, Zhao L, Latasa MJ, Sul HS. Transcriptional repression of pref-1 by glucocorticoids promotes 3T3-L1 adipocyte differentiation. Journal of Biological Chemistry 1999;274:12632-12641 5. Tang QQ, Jiang MS, Lane MD. Repressive - 248 -
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