Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 18, No. 1 pp. 295-301, 2017 https://doi.org/10.5762/kais.2017.18.1.295 ISSN 1975-4701 / eissn 2288-4688 박홍규 1, 최미영 2* 1 ( 주 ) 에이티지씨 R&D 본부연구개발전략팀, 2 선문대학교 BT 융합제약공학과 Production and Characterization of a Recombinant Antibody Neutralizing Botulinum Neurotoxin A Hong-Gyu Park 1, Mieyoung Choi 2* 1 R&D Department, ATGC Co., LTD. 2 Department of BT-Convergent Pharmaceutical Engineering, Sun Moon University 요약보툴리눔신경독소는콜린성신경말단 ( 부 ) 을선택적으로공격하여신경마비를일으키는신경독소로서, 그람양성을띠고내성포자를형성하는절대혐기성세균인보툴리눔균 (Clostridium botulinum) 이만들어낸다. 이중보툴리눔 A형독소 (BoNT/A) 는음식물과물을오염시킬수있으며생물무기나생물협박물질로사용될수도있다. 이때문에독성을탐지할수있는예민한분석방법과중독을치료할수있는효능있는항독소를개발해낼필요성이제기되어왔다. 본연구에서는 BoNT/A를중화할수있는단일클론항체 (mab) 를생산하기위하여 BoNT/A로면역된토끼의항혈청에서유래한 scfv 라이브러리를인간 IgG와융합시켰다. 그렇게재조합된 scfvigg 항체단백질을안정된세포주에서발현시켰고항체친화크로마토그래피를사용하여 scfvigg mab 단백질을정제하였다. ELISA로정제된 scfvigg mab 단백질의효율성을확인하였고, in vivo 실험으로 BoNT/A에대한중화능을시험하였다. 독성중화능실험은마우스를사용하여수행하였는데, 그결과 scfvigg 항체 (10 ug) 는 BoNT/A(100,000 LD 50) 의독성이주입된마우스를완전히방어하지는못하지만마우스의생존기간을현격하게연장시키는것이확인되었다. 이러한결과들은이 scfvigg mab가 BoNT/A를중화하는효능을가지고있다는점을제시한다. Abstract Botulinum neurotoxin (BoNT/A) is a neurotoxin that selectively attacks the peripheral cholinergic nerve endings. It is produced by Gram -positive, endospore-forming strict anaerobic bacteria, Clostridium botulinum. Since BoNT/A could be a biothreat agent, as well as a contaminator of food and water supplies, the development of sensitive assays for toxin detection and potent antitoxin for the treatment of intoxication is necessary. In this study, for the purpose of producing monoclonal antibodies (mabs) that are capable of neutralizing Botulinum neurotoxin type A (BoNT/A), scfv (single-chain variable domain fragment) libraries from the rabbit antisera against BoNT/A was fused to a human IgG. The resulting recombinant scfvigg antibody protein was expressed in stable cell lines and was purified using a protein A affinity chromatography. The efficacy of scfvigg mab was confirmed by ELISA and was evaluated for the neutralization of BoNT/A in vivo. Such an in vivo toxin neutralization assay was performed using mice. Although scfvigg antibody proteins (10 ug) failed to fully protect the mice challenged with BoNT/A (100,000 LD50), it significantly prolonged the survival time. These results suggest that scfvigg mab may be capable of neutralizing BoNT/A single-chain variable domain fragment. Keywords : Botulinum neurotoxin type A(BoNT/A), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), in vivo toxin neutralization assay, monoclonal antibody(mab), scfv(single-chain variable domain fragment) * Corresponding Author : Mieyoung Choi(Sun Moon Univ.) Tel: +82-41-530-2274 email: choimy@sunmoon.ac.kr Received November 15, 2016 Accepted January 6, 2017 Revised December 1, 2016 Published January 31, 2017 295
한국산학기술학회논문지제 18 권제 1 호, 2017 1. 서론보툴리눔신경독소는신경마비를일으키는독소로절대혐기성세균인보툴리눔균 (Clostridium botulinum) 으로부터만들어지는데, 생산된독소의항원성에따라 7가지 (A형 ~G형 ) 유형으로구분된다. 그중에서독소 A형이인체에가장치명적인것으로알려져있다 [1]. 보툴리눔신경독소 A형은먼저하나의폴리펩티드 (150 kda, 비활성상태 ) 로합성된후에트립신과유사한단백질분해효소 (trypsine-like protease) 에의해잘리고활성화형태로되는데, 이것은 C 말단의중쇄 (heavy(h) chain: 100 kda) 와 N 말단의경쇄 (light(l) chain: 50 kda) 의두조각이이화황결합 (disulfide bond) 으로연결된구조이다 [2]. 체내에유입된보툴리눔독소는혈관순환계를따라표적부위인신경- 근접합부의전신경말단 (presynaptic nerve ending) 으로이동하여신경말단의세포질로유입된다. 이곳에서신경전달물질인아세틸콜린의분비를억제하여근육운동을조절하는신경신호전달을차단함으로써근수축이일어나지않고이완된상태가유지되는이완성근육마비를일으킨다 [3]. 보툴리눔균이사람몸에들어가다량으로증식하면강한신경독소단백질이생성되어신경마비등보툴리눔중독증 (botulism, 보툴리즘 ) 을일으킨다. 보툴리즘은독소성분에노출되는경로에따라식품유래보툴리즘, 유아보툴리즘, 상처보툴리즘, 흡인형보툴리즘으로구분된다 [4]. 보툴리눔독소는자연계에서생산되는독소중인체에가장치명적인것중하나로알려져있고 [5], 평상시에도환자가발병할수있을뿐아니라생물테러무기로사용될수도있다 [6,7]. 지금까지보툴리눔독소의화학적길항제 (chemical antagonist) 는없는것으로알려져있으며동물 ( 주로말 ) 에서유래한항-독소혈청을환자에게투여하는방법이유일한치료법으로알려져있다 [8]. 유사시에있을생물테러나식중독혹은자연발생보툴리즘등잠재적위험요소에대비하기위하여항독소와독소치료제및독성을탐지할수있는분석방법을개발해내는것에대한필요성이제기되어왔고국내외에서연구가진행되고있다 [9,10]. 본연구의목적은보툴리눔 A형독소 (BoNT/A) 를중화하는재조합항체를개발해내고그특성을분석하는데있다. 이를위하여먼저항원에대한결합력을높이는방법으로알려진 scfv 유전자 [11] 를 BoNT/A로면역된토 끼의항체로합성하였다. 다음, 사람에게적용할수있는중화항체로개발하기위해 scfv를인간 IgG와융합시킨 scfvigg를재조합한후, scfvigg 항체단백질을정제하였다. 이정제된단백질의특성분석은 ELISA와 Western blotting을통해수행하였으며, 그리고 BoNT/A 에대한중화능은 in vivo 실험으로확인하였다. 2. 재료및방법 2.1 scfvigg 항체유전자의재조합이실험에서사용한토끼는뉴질랜드산흰토끼로약 3 Kg, 15주령의암컷을구입하였고 (Samtako, Korea), BoNT/A는 Miprolab (Germany) 사에서구입하여사용하였다. 보툴리눔독소를토끼에주사하기직전에먼저면역전혈청을모았다. 2 마리의토끼에 500 μl의불완전프로인트항원보강제 (Freund's Incomplete Adjuvant) (Difco, USA) 와 500 μl의 BoNT/A를혼합한후각각의토끼에주사하였다. 첫면역 1주후, 동일한혼합액으로토끼에다시한번더주사하였다. 첫면역 8주후, 토끼를희생시키고즉시혈액을모아토탈 RNA(total RNA) 를추출하였다. 랜덤헥사머 (random hexamers) 와역전사효소 (superscript reverse transcriptase) (Promega, USA) 를사용하여토탈 RNA로부터 cdna library를합성하였다. 이 cdna로부터프라이머 3부터 6 (Table 1) 을이용하여항체단백질의무거운사슬의가변부위 (V H, variable region of heavy chain) 유전자와항체단백질의가벼운사슬의가변부위 (V L, variable region of light chain) 유전자를 PCR (polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응 ) 로증폭하여얻었다. 확보한 V H 유전자와 V L 유전자를 V H-LINKER(Gly 4Ser 1) 3 -V L 의단일유전자, 즉 scfv(single-chain variable domain fragment, 단일사슬로이뤄진가변부위 ) 유전자로만들기위하여 V H 유전자와 V L 유전자및 pcantab5e phagemid kit (Amersham Pharmacia, UK) 의연결 DNA (Linker DNA) 를주형으로사용하고, 프라이머 1에서 6 (Table 1) 을이용하여 PCR을실시하였다. 합성된 scfv 유전자를포함하는 DNA 조각을제한효소 SfiI/NotI으로절단한후 pcantab5e 벡터에클로닝하여 pcantab5e -scfv를재조합하였다. pcantab5e-scfv와 EcoRI과 PstI이각각포함된 296
프라이머 7 과 8 (Table 1) 을사용하여 PCR 을실시하여 scfv이포함된 DNA 조각을증폭한후 EcoRI/PstI으로절단하였다. 이 DNA 조각을인간 IgG의 Fc(constant region, 불변부위 ) cdna가재조합된 pcr3 벡터, 즉 pcr3-igg 에클로닝하였다. 후보플라스미드 DNA 를 EcoRI/Xba I 으로절단하여삽입 DNA(insert DNA) 의크기를확인하였다. 재조합된 DNA의염기서열분석을마크로젠 (Korea) 에의뢰하였다. 플라스미드 pcr3-igg 는인간 IgG의 Fc의 cdna를포유동물세포발현벡터인플라스미드 pcr3 (Invitrogen, USA) 에클로닝한것이다 (Park, unpublished). Table 1. Sequence of primers 1 Linker forward 5 GGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCA 3 2 Linker reverse 5 TGGAGTCTGGGTCATCACGACATCCGAT CCGC 3 3 VH forward 5 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTC 3 4 VH reverse 5 TGAAGAGACAGTGACCAGGGTGCC 3 5 VL forward 5 GCGGATCGGATGTCGTGATGACCCAGAC TCCA 3 6 VL reverse 5 ACCACCTCGGWYCCTCCGCCGAAA 3 7 scfv forward 5 CCGGAATTCATGGAGACTGGGCTGCGCT GG 3 8 scfv reverse 5 AAAACTGCAGGTTTACCTTTGACCACCAC CTCGG 3 2.2 scfvigg mab 단백질의발현및정제 재조합된 scfvigg 단백질의발현을확인하고이단백질의중화능을분석하기위하여항체친화크로마토그래피를이용하여 scfvigg 단백질을정제하였는데, 그과정은다음과같다. 먼저, 재조합된 pcr3-scfvigg 플라스미드 DNA를리포펙타민 (Lipofectamine) (Invitrogen, USA) 을사용하여 CHO-DUKX (ATCC, USA) 세포에주입하였다. G418 (Cambrex, USA) 를처리하여얻은 colony 들을 96-well 플레이트 (Falcon 3912) 의웰당 1 개의세포씩배양하여선별하였고, methotrexate (Sigma, USA) 를처리하여안정된단일세포주 (stable cell line) 를확보하였다. 이 CHO-DUKX 세포는 150 mm 접시 (dish) 에서배양하였다. 그다음으로, 세포배양액을모아서 scfvigg 유전자가클로닝된 CHO-DUKX 세포로부터분비된 scfvigg 단백질을 HiTrap protein A (Amersham Pharmacia, UK) 를사용하여정제하였다. 이때 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography) (Amersham Pharmacia, UK) 를이용하였고, 정제된분획 (fraction) 을모두모아 Amicon Ultra 30 kda 제한필터 (cut-off filter) (Millipore, USA) 를사용하여단백질용액을농축하였다. 농축된단백질은 PBS(137mM NaCl, 10mM Na 2HPO 4, 2.7mM KCl, 1.8mM KH 2PO 4 (phis7.4)) 로투석한후에 in vivo 실험에사용하였다. ELISA로항체의농도를측정하였다. 2.3 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, 효소면역분석법 ) scfvigg mab 단백질의 BoNT/A에대한결합친화력 (binding affinity) 을조사하고가장높은결합력을나타내는 scfvigg mab를생산하는단일세포를선별하기위하여발현된 scfvigg가포함된배양액을사용하여 ELISA를수행하였는데, 그과정은아래와같다. BoNT/A (Miprolab, Germany) 를 96-well 플레이트의웰당 1 μg/ml이포함되도록희석용액 (dilution buffer) (2.5 % FBS, 0.5 % Tween 20, 1 X PBS) 에희석하여 100 μl 씩넣고 4 C에서 16시간동안반응하여코팅하였다. 그다음에는차단용액 (blocking buffer) (1 % FBS, 5 % sucrose, 0.05 % sodium azide) 을첨가하여실온에서 1시간 30분동안반응하여차단하였다. scfvigg mab를포함하고있는세포배양액을 100μl 씩따서웰에첨가하고실온에서 1시간 30분동안반응하였다. scfvigg의결합여부는퍼록시데이즈가결합된 ( 인간 IgG 단백질에대항하는 ) 염소의항체 (peroxidase conjugated goat anti-human IgG) (KPL, USA) 로반응하여조사하였다. TMB (3,3,5,5 - Tetra methyl benzidine) microwell peroxidase substrate system (KPL, USA) 을이용하여색반응분석실험을수행하였고, Microplate Reader (BIO-RAD) 를사용하여 655 nm 파장에서흡광도 (Optical Density, O.D) 를측정하였다. 2.4 Western blotting( 웨스턴블랏 ) 정제된단백질을 10 % SDS-polyacrylamide gel에서전기영동하여단백질의크기를조사하였다. 전기영동하여분리된단백질을멤브레인 (polyvinylidene fluoride transfer membrane) (Pall. Corporation, USA) 으로전기영동하여옮겼다. 멤브레인을 5 % 탈지유가포함된 PBS 297
한국산학기술학회논문지제 18 권제 1 호, 2017 에담구고 4 C에서 16시간반응하여 ( 비특이적인결합을 ) 차단하였다. 멤브레인을 PBST(137mM NaCl, 10mM Na 2HPO 4, 2.7mM KCl, 1.8mM KH 2PO 4, 0.1% Tween 20) 로씻어낸후, peroxidase conjugated goat anti-human IgG(KPL, USA) 를 1:10,000으로희석하여첨가하고실온에서 1시간동안반응하였다. 결합되지않은항체는 PBST로씻어서제거하였고, 결합된항체는 DAB peroxidase development kit (Vector Lab, Inc., USA) 를이용하여시각화하였다. 2.5 in vivo 독성중화분석실험 BoNT/A에대한 scfvigg mab의중화능력을조사하기위하여 in vivo 실험을수행하였다. 이실험에는 6 주령에서 8 주령의암컷 Balb/C와 ICR 마우스 ( 오리엔트바이오, Korea) 를사용하였다. 먼저 BoNT/A (Miprolab, Germany) 에의해모두죽는범위를설정하기위하여 BoNT/A를단계별로희석한후 ICR 마우스에주입하여사망유무를조사하였다. BoNT/A의생물활성도는 1.0x10 5 LD 50(50% lethal dose) 으로확인하였다. 그룹당 5 마리씩의 ICR 마우스를사용하여총 4개의그룹 (PBS only, BoNT/A, BoNT/A+scFvIgG (CH#1-1), BoNT/A+scFvIgG (CH#1-2)) 을실험하였다. BoNT/A 독소 (1.0x10 5 LD 50) 와 10 μg의 scfvigg 단백질을넣고전체용량이 0.5 ml이되도록 PBS와혼합하여사용하였다. 혼합액을마우스의복강에주입한후, 죽거나생존한마우스의개체수및생존시간을조사하였다. 서보여주고있다. 아가로즈젤전기영동으로 410 bp 의 V H 유전자와 340 bp의 V L 유전자를포함하는 DNA를얻었는데, 예상과그크기가일치하였다.( 그림 1. lane 1, 2). 항원에대한친화력이높은 mab 단백질을제조하기위한수단으로 scfv를사용하는방법이널리응용되고있다 [11]. 본연구에서는 BoNT/A에대한친화력이높은항체단백질을만들기위하여 V H 유전자와 V L 유전자사이에 LINKER(Gly 4Ser 1) 3 DNA를포함하는, V H-LINKER(Gly 4Ser 1) 3-V L 로된 scfv 유전자를 PCR로증폭하였다. 그결과약 800 bp의단일조각의 DNA 밴드를얻었는데, 이것은 scfv의예상크기와일치하였다 ( 그림 1. lane 3). 이 DNA 조각을 pcantab5e phagemid vector에클로닝함으로써 scfv DNA library 를구축하였다. Fig. 1. PCR products of V H,V L,andscFv lane 1:V L, lane 2:V H, lane 3:scFv, M:DNA size standard 1kb ladder 3. 결론 3.1 scfvigg 항체단백질유전자의재조합본연구에서는보툴리눔 A형독소 (BoNT/A) 에높은친화력을가지며또한감염된환자에게중화능을갖는효율적인중화항체를만들기위하여토끼에서유래한 scfv와인간 IgG가연결된융합단백질을제조하고자하였다. 이를위하여, 먼저 BoNT/A로두번주사한토끼에서혈액을얻어토탈 RNA를추출하였다. 이 RNA로 RT-PCR을수행하여항토끼항체단백질의 V H 와 V L 에대한 cdna library를확보하였다. 이실험에는프라이머 3에서 6 (Table 1) 을사용하였고 V H 유전자와 V L 유전자를포함하는 DNA 조각을증폭한결과는그림 1에 (a) (b) Fig. 2. Confirmation of recombinant plasmid pcr3-scfvigg(#1) by EcoRI/XbaI digestion (a) Diagram of the pcr3 expression vector containing the scfv(vh, linker, VL) and human IgG cdna. (b) Agarose gel electrophoresis of pcr3-scfvigg(#1) M : DNA size standard 1kb ladder, Lane 1 : uncut DNA, Lane 2 : The insert DNA (scfvigg gene, 1560 bp) was obtained after cleavage with EcoRI and XbaI. 298
그다음으로, 사람에게적용할수있는중화항체로제조하기위하여 scfv 단백질을인간 IgG와융합된단백질로발현시키고자하였다. 이를위해 scfv 유전자를인간 IgG (Fc) cdna를포함하는발현벡터인 pcr3-igg 에넣어 pcr3-scfvigg를재조합하였다 ( 그림. 2. (a)). 재조합된 scfvigg DNA를분석하기위하여플라스미드 DNA를추출하였고, EcoRI과 XbaI으로절단하여약 1,560 bp의 DNA 밴드를확인하였다 ( 그림. 2. (b) lane 1, 2). 이결과는삽입된 scfvigg DNA의예상크기와일치하는것이다. 총 18개의플라스미드 DNA의염기서열분석을의뢰하였다 ( 마크로젠, Korea). 그중 15개의플라스미드 DNA에는기존에밝혀진염기서열 (Synthetic construct single chain Fv antibody fragment, AY307933, gi:43730092) 과동일한 scfv DNA가들어있다는것을알수있었다. 나머지 3개의플라스미드 DNA는모두 V H 유전자와 V L 유전자가아직까지밝혀지지않은새로운염기서열을포함하고있다는것을알수있었다. 그림 2에서는그중하나인플라스미드 #1의결과를보여주고있다. 3.2 scfvigg mab 단백질의정제및분석재조합된 scfvigg mab 단백질을발현하는안정된세포주를구축하고 BoNT/A에결합력이뛰어난단백질을얻기위하여, 먼저플라스미드 pcr3-scfvigg를 CHO-DUKX 세포에주입하여안정된단일세포주인 CH#1을확보하였다. 이 CH#1 세포를단일클론 (monoclonal) 으로제작하기위하여 G418을처리하여생긴콜로니 (colony) 를 96-well 플레이트에웰당세포하나씩옮겨서배양하였고 ELISA를실시하여 BoNT/A 에결합능력이높은단백질을생산해내는세포주를선별하였다. 그결과 BoNT/A에결합력이가장뛰어난 scfvigg mab 단백질을분비하는세포주는 CH#1-1과 CH#1-2이었다. 이세포들을배양하여배양액을모은다음, 세포배양액으로분비된 scfvigg 단백질을 protein A 친화크로마토그래피를이용하여정제하였다. 정제된 scfvigg 단백질로 SDS-PAGE를실시하여 55 kda의단일밴드를관찰하였고, peroxidase conjugated goat anti-human IgG antibody를사용하여 Western blotting 을실시한결과, 단일밴드를확인할수있었다 ( 그림 3.). 정제된 scfvigg 단백질의항체특이성을 ELISA로분석하였는데, scfvigg mab는높은농도에서는농도의존 적으로 (BoNT/A 와 ) 반응하는것을보였다. 이것은 BoNT/A의 polyclonal antibody (NIBSC, UK) 와유사하게반응한다는것을알수있었다 ( 그림 4.). 이와는대조적으로, negative control로사용된 IgG는 BoNT/A에반응하지않았다. 이결과는 scfvigg mab(#1-1, #1-2) 에는 BoNT/A와특이적으로결합하는활성이있다는것을제시한다. Fig. 3. Western blotting analysis The scfvigg protein was purified using protein A affinity chromatography. Proteins were separated on a 10% SDS-PAGE gel and were analyzed by Western blotting with peroxidase conjugated goat anti-human IgG antibody. Fig. 4. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 96-well plates were coated with BoNT/A. scfvigg was added and incubated. The binding of scfvigg was detected via peroxidase conjugated goat anti-human IgG. 3.3 scfvigg mab의 BoNT/A 에대한독성중화능분석 BoNT/A에대한 scfvigg mab의중화능을시험하기위하여 ICR 마우스를이용하여 in vivo에서독소중화분석실험을수행하였다. BoNT/A의생물활성도는 299
한국산학기술학회논문지제 18 권제 1 호, 2017 1.0x10 5 LD 50 이었는데, 이 BoNT/A와 10μg의 ScFvIgG mab(#1-1, #1-2) 를혼합한후, ICR 마우스의복강에주입하였고마우스의증상발현및생존여부를최소 48시간동안관찰하였다 ( 그림 5). 수행한결과 10μg의 scfvigg 항체는 BoNT/A(100,000 LD 50) 의독성이주입된마우스를완전히방어하지는못했으나마우스의생존기간을현저히연장시킨다는것을알수있었다. 이결과들은 scfvigg mab는 BoNT/A를중화하는효능을가지고있음을제시하며, 보툴리즘을치료할수있는생물치료제로개발될수있는잠재력도가지고있음을보여준다. 그것은또한보툴리눔독성의감염여부를판단하는데활용될수있으며보툴리눔독소를정제하는데에도활용될수있을것으로사료된다. References Fig. 5. In vivo toxin neutralization assay The mixture of ten microgram of scfvigg Ab and BoNT/A was injected intraperitoneally in mice. The time to death and the survival number of mice were determined. 그결과, PBS를주입한군은모두생존하였고, BoNT/A를주입한군은 15시간이내에모두사망하였으며, BoNT/A+ScFvIgG (#1-1) 를주입한군의경우 36시간이내에모두사망하였다. 이와반면에 BoNT/A+ ScFvIgG (#1-2) 를주입한군의경우 36시간이내에 2마리만사망하였고, 3마리는 40 48시간까지생존하였다. 이결과들은 scfvigg mab(#1-1, #1-2) 에는 BoNT/A에대한중화능이있다는것을제시한다. 그렇지만, 10μg의 scfvigg mab로는 BoNT/A(100,000 LD 50) 를중화하는능력을오랜동안유지하지못하여완전한방어를할수가없었고, 그로인해 48시간안에모두사망하였다고생각된다. 이는 scfvigg mab가높은농도의 BoNT/A에대해친화력이충분히높지못하여 BoNT/A를오랜시간동안중화하지못했거나, 또는 BoNT/A(100,000 LD 50) 를완전하게중화하기위해서는더높은농도의 scfvigg mab가필요하다는것을의미하는것으로사료된다. 본연구에서얻은재조합항체, scfvigg mab의특성을 ELISA와 Western blot으로분석한결과, scfvigg mab는농도의존적으로 BoNT/A와반응하는것을알수있었고, BoNT/A와특이적으로결합한다는것을확인하였다. 마우스를이용한 in vivo 독성중화능실험을 [1] J. Thanongsaksrikul and W. Chaicumpa, Botulinum Neurotoxins and Botulism: A Novel Therapeutic Approach, Toxins, 3, pp. 469-488, 2011. DOI: https://doi.org/10.3390/toxins3050469 [2] D. B. Lacy, W. Tepp, A. C. Cohen, B. R. Das Gupta, R. C. Stevens, Crystal structure of botulinum neurotoxin type A and implications for toxicity, Nat. Struct. Biol. 10, pp. 898-902, 1998. DOI: https://doi.org/10.1038/2338 [3] C. Montecucco, G. Schiavo, Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins, Mol Microbiol, 13, pp. 1-8, 1994. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1994.tb00396.x [4] C. O. Tacket and M. A. Rogawski, Botulinum Neurotoxin and Tetanus Toxin, In: Simpson, L.L., (Ed.), p.351 378, Academic Press, 1989. [5] L. L. Simpson, The study of clostridial and related toxins. The search for unique mechanisms and common denominators, J. Physiol. 84, pp. 143-151, 1990. [6] R. K. Dhaked, M. K. Singh, P. Singh, P. Gupta, Botulinum toxin: bioweapon and magic drug, Indian J Med Res., 132, pp. 489-503, 2010. [7] S. S. Arnon, R. Schechter, T. V. Inglesby, D. A. Henderson, J. G. Bartlett, M. S. Ascher, E. Eitzen, A. D. Fine, J. Hauser, M. Layton, S. Lillibridge, M. T. Osterholm, T. O Toole, G. Parker, T. M. Perl, P. K. Russell, D. L. Swerdlow, K. Tonat. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management, J. Am. Med. Assoc. 285, pp. 1059 1070. 2001. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.285.8.1059 [8] C.O. Tacket, W. X. Shandera, J. M. Mann, N. T. Hargrett, and P. A. Blake, Equine antitoxin use and other factors that predict outcome in type A foodborne botulism, Am. J. Med., 76, pp. 794-798, 1984. DOI: https://doi.org/10.1016/0002-9343(84)90988-4 [9] H. Bigalke, Botulinum toxin: application, safety, and limitations, Curr Top Microbiol Immunol, 364, pp. 307-317. 2013. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-662-45790-0_14 [10] J. W. Froude, B. Stiles, T. Pelat, P. Thullier, Antibodies 300
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