(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) A61K 36/185 (2006.01) A61P 39/06 (2006.01) (21) 출원번호 10-2006-0071100 (22) 출원일자 2006 년 07 월 28 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 3 항 2006 년 07 월 28 일 (54) 생리활성을갖는애기달맞이추출물 (11) 공개번호 10-2008-0010720 (43) 공개일자 2008년01월31일 (71) 출원인 재단법인제주하이테크산업진흥원 제주제주시아라 1 동 4-8 번지 (72) 발명자 박수영 제주제주시오등동 1653-1 영도그린빌라 C 동 30 8 호 정용환 제주서귀포시서홍동 446-13 화신빌라 A 동 201 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 김형준 (57) 요약 본발명은생리활성을갖는애기달맞이추출물에관한것이다. 본발명의생리활성을갖는애기달맞이추출물은, 애기달맞이 (Oenothera laciniata) 전초 ( 全草 ) 를준비하고, 음건한다음분쇄하여미세분말로만들어 80 % 에탄올에침적하고, 이에탄올침적물을초음파를이용하여 1 시간씩 3 회추출한다음, 추출액의상층액을회수하여감압농축하고, 농축물을물에현탁시킨후, 현탁액을헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로순차적으로추출하여애기달맞이추출물을제조하는것으로구성된다. 본발명에의해항산화활성, 항염활성, 항암활성및항균활성의생리활성이뛰어난애기달맞이추출물이제공되며, 애기달맞이추출물을활성성분으로포함하는생리활성이뛰어난조성물이제공된다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자 이욱재 충북청주시흥덕구개신동대우푸르지오아파트 408-508 이정아 제주제주시용담 1 동 235-17 평화아파트 701 호 김지영 제주북제주군추자면대서리 114-1 윤원종제주제주시노형동 1047-10 오대주제주서귀포시서홍동 378-13 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 달맞이꽃추출물에있어서, 애기달맞이 (Oenothera laciniata) 전초 ( 全草 ) 를미세분말로만들어 80 % 에탄올에침적하고, 이에탄올침적물을초음파를이용하여 1 시간씩 3 회추출한다음, 추출액의상층액을회수하여감압농축하고, 농축물을물에현탁시킨후, 현탁액을헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로순차적으로추출하여제조한추출물로서, 생리활성을나타내는애기달맞이추출물. 청구항 2 제1항에있어서, 생리활성은항산화활성, 항염활성, 항암활성, 항균활성중 1 종이상인것이특징인, 생리활성을나타내는애기달맞이추출물. 청구항 3 제1항의애기달맞이추출물을활성성분으로포함하는조성물. 명세서 발명의상세한설명 발명의목적 <19> <20> <21> <22> <23> <24> <25> 발명이속하는기술및그분야의종래기술본발명은생리활성을갖는애기달맞이추출물에관한것이다. 최근약용식물로부터특정성분을추출하여천연물이가지는 2차대사산물인생리활성물질에대한관심이증대되고있다. 생리활성을나타내는물질중식품의기능강화를위해주로활용되고있는것은항산화, 항염, 항암, 항균활성관련물질이다. 그중식물체내의페놀성화합물은페놀하이드록실기 (phenolic hydroxyl) 를가지고있기때문에단백질등의거대분자들과결합하는성질을가지며, 항산화활성, 항미생물활성및세포의산화적손상을보호하여심장질환이나암과같은질병의진정효과가보고되어있다. 한편, 달맞이꽃 (Oenothera odorata Jacquin) 은바늘꽃과 (Onagraceae) 에속하는 2 년생초본으로서, 최근에귀화가이루어진관상용및식용작물이다. 이식물은남아메리카원산이며우리나라에야생하는동속식물로는큰달맞이꽃, 겹달맞이꽃, 애기달맞이꽃등 4종이알려져있다. 달맞이꽃은아메리카인디안들이그추출액을피부의염증또는발진에바르거나해소기침약으로사용했던약초로한방에서는대소초 ( 待宵草 ) 라하여해열및소염제로사용하였고민간요법으로는달인물로인후염이나피부염의환부를세척하는것으로전해지며, 뿌리와전초를감기, 해열, 인후염, 신장염, 고혈압등에사용한다고알려져있다. 그러나, 애기달맞이 (Oenothera laciniata Hill) 는근래에도래한귀화식물로서바닷가의모래밭에자라는식물로서, 제주도를제외하고는찾아보기가힘든식물로알려져있어달맞이꽃에비해활성성분이나약리연구는거의보고된바가없는실정이다. <26> 발명이이루고자하는기술적과제 본발명은항산화, 항염, 항암및항균활성의생리활성이뛰어난애기달맞이추출물을제공하는데목적이있다. - 3 -
<27> 또한, 본발명은애기달맞이추출물을활성성분으로포함하는생리활성이뛰어난조성물을제공하는데그목적 이있다. <28> <29> <30> <31> <32> <33> <34> <35> <36> <37> <38> <39> 발명의구성및작용 본발명은생리활성을갖는애기달맞이추출물에관한것이다. 본발명의생리활성을갖는애기달맞이추출물은, 애기달맞이 (Oenothera laciniata) 전초 ( 全草 ) 를준비하고, 음 건한다음분쇄하여미세분말로만들어 80 % 에탄올에침적하고, 이에탄올침적물을초음파를이용하여 1 시간 씩 3 회추출한다음, 추출액의상층액을회수하여감압농축하고, 농축물을물에현탁시킨후, 현탁액을헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로순차적으로추출하여애기달맞이추출물을제조하는것으로구성된다. 본발명의주재료인애기달맞이 (Oenothera laciniata Hill) 는근래에도래한귀화식물로서바닷가의모래밭에 자라며, 줄기는밑에서부터가지가갈라지고높이 20 ~ 60 cm로달맞이꽃에비해아주작은것이특징이다. 특히, 애기달맞이는제주도를제외하고는찾아보기가힘든식물로알려져있어달맞이꽃에비해활성성분이나 약리연구는거의보고된바없는식물이다. 본발명은애기달맞이를이용하여생리활성이큰추출물을제조하고, 그생리활성을가진애기달맞이추출물을 활성성분으로하는각종질병의예방및개선용조성물로서의가능성을모색하는데목적을두고연구를 하였다. 애기달맞이전초를 80 % 에탄올로추출하고극성이다른 4 가지용매 ( 에탄올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이 트, 부탄올 ) 로분획하여본발명의애기달맞이추출물의폴리페놀함량을분석한결과에탄올추출물및모든분 획물에서폴리페놀이나타났으며, 그중가장높은폴리페놀함량을나타낸분획물은에틸아세테이트분획물로 서, 에탄올추출물에비해 2.7 배가량높은함량을나타냈다 ( 도 1). 이는본발명의애기달맞이추출물이다양한생리활성을가지는페놀성화합물을다수함유하고있는것을추측 할수있는결과였다. 또한, 본발명의애기달맞이추출물의항산화활성에대해실험한결과, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 의자유라디칼소거활성은 80 % 에탄올조추출물과에틸아세테이트, 부탄올 분획물에서다른용매분획물에비해대단히높은라디칼소거활성을나타냈으며, 크산틴옥시다제활성억제 는 80 % 에탄올추출물과에틸아세테이트분획물에서, 과산화물라디칼소거활성은에틸아세테이트와부탄올 분획물이가장높은과산화물라디칼소거활성을나타내었다. 전반적으로가장항산화활성이높게나타난에틸아세테이트분획물의 DPPH 자유라디칼소거활성의 50 IC값은 16.19 μg / ml, 크산틴옥시다제억제활성은 220.37 μg / ml, 과산화물자유라디칼소거활성은 42.07 μg / ml 이었다. 특히, 이값은대조군으로사용된아스코르빈산 (ascorbic acid), BHA (butylated hydroxy anisole), 트롤록스 (trolox), 알로푸리놀 (allopurinol) 값에비해조금도뒤떨어지지않는활성이라할수있다. 따라서, 산소유리기의자유기를소거할수있는물질또한산화적손상의예방에유용하게쓰일수있으므로, 본발명의애기달맞이추출물도산화적손상의예방에사용될수있는항산화물질임을확인할수있었다. 또한, 본발명의애기달맞이에탄올추출물의 RAW264.7 에서의세포독성이나타나지않는농도로추출물을처리 - 하여 NO 생성억제효과를세포배양액중에존재하는 NO 2 의형태로측정한결과, LPS 단독처리군에서는 NO가과량생성되는것을확인할수있었으며, 애기달맞이추출물을동시에처리한시험구에서는 NO 생성량이감소됨을확인할수있었고, 특히헥산과디클로로메탄, 에틸아세테이트분획물에서 NO의생성량이현저히저해됨을볼수있었다 ( 도 2). <40> <41> 따라서, 본발명의애기달맞이추출물이항염활성을가지고있음을확인할수있었다. 또한, 본발명의애기달맞이추출물에대한항암활성실험결과, 애기달맞이 80 % 에탄올추출물의 IC 50 값은 72.848 μg / ml를보였으며, 헥산분획물은 47.72 μg / ml, 디클로로메탄 12.40 μg / ml, 에틸아세테이트 43.03 μg / ml로나타났다. - 4 -
<42> 그러나, 부탄올과물분획물은 IC 50 값을구할수가없었으며, 농도의존적으로세포성장억제효과가가장좋은 분획물은에틸아세테이트분획물이었다. <43> <44> <45> <46> <47> <48> <49> <50> <51> <52> <53> <54> <55> <56> <57> <58> 에틸아세테이트분획물을여러농도로처리하였을때의세포성장억제율은 12.5 μg / ml농도에서 22.00 ± 6.97 %, 25 μg / ml농도에서 30.44 ± 2.83 %, 50 μg / ml농도에서 54.92 ± 6.35 %, 100 μg / ml농도에서 77.67 ± 2.29 % 로유의적인세포성장억제효과를보였다 ( 표 3). 애기달맞이분획물의세포독성효과에의한 HL-60 세포증식억제작용이세포사멸 (apoptosis) 유도에의한것인 지그기전을알아보기위하여, 세포사멸유도에의하여나타나는 DNA 단편화현상을전기영동으로관찰한결 과, 애기달맞이에틸아세테이트분획물은 HL-60 세포에 100 μg / ml의농도로처리시 DNA 단편화현상이두드러 지게나타났다 ( 도 3). 이에에틸아세테이트분획물을갖고세포사멸이일어난세포에서볼수있는가장특징적인변화인형태학적 관찰을실시하였다. 그결과, 정상세포들의핵들의형태는정상적인둥근형태이나에틸아세테이트추출물이처리된세포에서는시 간이경과될수록세포의크기가축소되며, 핵의모양이불규칙하고부분적인핵의응집현상을관찰할수있었 다 ( 도 5). 또한, 애기달맞이추출물에의한세포사멸유도에의하여 Sub-G1 이배수성 (hypodiploid) 세포가증가하는지 DNA 에결합하여형광을나타내는물질인 PI 를처리하여유세포분석기로분석하였다. 그결과, 처리시간이경과될수록 sub-g1 hypodiploid 세포가증가되는됨을확인할수가있었다 ( 도 4). 또한, 본발명의애기달맞이추출물에대한항균활성실험결과, 그램양성균에서는 80 % 에탄올추출물, 에틸 아세테이트, 부탄올및물분획물에서처리농도가증가할수록항균활성을나타내는억제환 (inhibition zone) 의 크기도비례적으로증가하였으며, 특히에틸아세테이트분획물의경우황색포도상구균 Staphylococcus ( aureu s) 에서 2,000 ppm 농도에 18 mm 의생육저해환이나타나다른추출물보다높은항균력을나타냈다 ( 도 6). 그램음성균에대한항균활성결과는표 4 에서보는바와같이애기달맞이조추출물과분획물모두에서모든균 주를대상으로우수한항균활성을나타냈으며, 특히에틸아세테이트분획물이살모넬라 (Salmonella typhimurium) 균주에서 2,000 ppm 으로처리시 19 mm 로가장우수한생육저해환 (clear zone) 을나타내었다 ( 도 7). 한편, 헥산과디클로로메탄분획물은모든균주에서항균활성을보이지않았으며, 특히에틸아세테이트분획물 은그램양성, 그램음성모든균주를대상으로폭넓은항균력을보여주었다. 애기달맞이추출물과분획물들의농도를 TBS 배지 10 ml에 2,000 ppm 으로처리하여미생물에대한생육저해를 흡광도 (A=650 nm) 를측정하여저해율을구하였다. 그결과, 에탄올추출물은본실험에서사용된모든균주에대해약 25 ~ 53 % 정도의생육저해효과를나타내 었고, 특히살모넬라엔테리티디스균 (Salmonella enteritidis) 에대해 53.8 % 로가장높은저해율을나타내었다 ( 도 8). 그리고, 분획물중에는에틸아세테이트분획물과부탄올분획물이 44 ~ 62 % 로가장높은생육억제율을보였으 며, 거의모든미생물균주에대해약 50 % 이상의강력한생육저해를나타냈다. 특히, 에틸아세테이트분획물은리스테리아식중독균 (Listeria monocytogenes) 에대하여 62.4 % 로가장높은 미생물생육저해율을나타내었다. 따라서, 본발명의애기달맞이추출물은항산화활성, 항염활성, 항암활성및항균활성이뛰어난것을확인할 수있었으며, 특히전반적으로폴리페놀함량이높게나타난에틸아세테이트분획물에서높은항산화, 항염, 항 암및항균활성을보이는것을알수있었다. 한편, 본발명의생리활성을가지는애기달맞이추출물은식품첨가제, 사료첨가제, 음료조성물, 화장료조성물 등다양하게활용할수있으며, 다양한질병에대한예방및개선용조성물로활용할수도있다. 또한, 본발명의애기달맞이추출물을활성성분으로포함하는항산화활성, 항염활성, 항암활성및항균활성의 생리활성을갖는기능성조성물을제조할수있다. - 5 -
<59> <60> <61> <62> <63> <64> <65> <66> <67> <68> <69> <70> <71> 이하, 본발명의생리활성을갖는애기달맞이추출물에대하여실시예및실험예를통하여상세히설명하나, 이들이본발명의범위를제한하는것은아니다. < 실시예 1> 본발명의애기달맞이추출물의제조제주도해안가에자생하고있는애기달맞이 (Oenothera laciniata) 를 2006년 4월에채집하여준비하였다. 준비한애기달맞이전초 ( 全草 ) 를음건한다음마쇄기로분쇄하여미세분말을 80 % 에탄올에침적하고초음파를이용하여 1 시간씩 3 회추출하였다. 그후, 상층액을회수하여감압농축하여에탄올추출물을얻었다. 농축한에탄올추출물을물에현탁시킨후에헥산 (1l 3), 디클로로메탄 (1l 3), 에틸아세테이트 (1l 3), 부탄올 (1l 3) 로순차적으로추출하여본발명의애기달맞이추출물을제조하였다. < 실험예 1> 본발명의애기달맞이추출물에대한폴리페놀함량분석실험페놀성물질은식물계에서널리분포되어있는 2차대사산물의하나로다양한구조와분자량을가진다. 이들은페놀릭하이드록실 (phenolic hydroxyl) 기를가지기때문에단백질및기타거대분자들과결합하는성질을가지며, 항산화효과등의생리활성기능도가진다. 탄닌산 (Tannic acid) 표준곡선을이용하여본발명의애기달맞이추출물의총폴리페놀함량을측정하여비교분석하였다. 폴리페놀화합물의함량은 Folin-Denis법 (Gutfinger, T: Polyphenols in olive olis. J. Am. Oil Chem. Soc., 58, 966-968(1981) 을약간변형시켜측정하였다. 즉, 애기달맞이추출물을 1 mg / ml로녹인다음 0.2 ml를시험관에취하고증류수를가하여 2 ml로만든후, 여기에 0.2 ml Folin-ciocalteu's phenol reagent (Sigma) 를첨가하여잘혼합한후 3 분간실온에방치하였다. 그리고, 2 M Na 2 CO 3 용액 0.4 ml를가하여혼합하고증류수를첨가하여 4 ml로만든후, 실온에서 1 시간동안방 치하여상징액을 725 nm 에서흡광도를측정하였 RH, 표준물질은탄닌산 (Tannic acid, Sigma Chemical co. USA) 을이용하였다. <72> <73> <74> <75> <76> <77> <78> <79> <80> <81> 표준곡선을작성한후애기달맞이꽃추출물및분획물시료의총폴리페놀함량은mg /g 탄닌산으로나타내었다. 그결과, 총폴리페놀함량은에탄올추출물에서 6.396 mg /g ± 0.185, 헥산분획물에서 0.849 mg /g ± 0.038, 디클로로메탄분획물에서 2.811 mg /g ± 0.090, 에틸아세테이트분획물에서 17.264 mg /g ± 0.473, 부탄올분획물에서 11.456 mg /g ± 0.319, 그리고잔사인물층에서 3.491 mg /g ± 0.108로나타났으며, 그중가장높은폴리페놀함량을나타낸것은에틸아세테이트분획물로에탄올조추출물에비해 2.7 배가량증가하는경향을보였다 ( 도 1). 이와같은결과로서본발명의애기달맞이추출물이페놀성화합물을다수함유하고있다는것을알수있었다. < 실험예 2> 본발명의애기달맞이추출물에대한항산화활성실험본발명의실시예 1에서제조한애기달맞이추출물을준비하여실험에사용하였다. 대조군으로는아스코르빈산 (ascorbic acid), BHA(butylated hydroxy anisole), 트롤록스 (trolox), 알로푸리놀 (allopurinol) 을사용하였다. 1. DPPH 라디칼소거활성에의한항산화활성검색전자공여능 (electron donating ability) 측정은 Blosis 방법 (Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use a stable free radical. Nature 26: 1199-1200) 에의한 DPPH 자유라디칼소거법에따라측정하였다. 메탄올에녹인시료각각의농도를 96 well plate에 100 μl씩분주하고 0.4 mm DPPH용액을동량첨가하여실온에서 10 분간방치한후 517 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거활성은아래식으로부터산출하였고, DPPH의흡광도가 50 % 감소할때나타나는시료의농도 - 6 -
(IC 50 ) 로표시하였으며, 각시료는 3 회반복하여실험을실시하여평균값을구하였다. <82> <83> <84> <85> <86> <87> <88> <89> <90> <91> <92> <93> DPPH radical 소거활성 (%) = (A control - A sample )/ A control 100 A sample = 시료를첨가한반응액의흡광도 A control = 시료대신메탄올을첨가한반응액의흡광도 2. 크산틴산화효소억제활성및과산화물소거활성실험 크산틴 / 크산틴산화효소 (Xanthine/xanthine oxidase) 에의한요산 (uric acid) 생성은 290 nm 에서증가된흡광 도에의해측정하였고, 과산화물 (superoxide) 의양은 NBT(nitroblue tetrazolium) 환원방법에의해 측정하였다. 반응액은각시료의여러농도와 0.5 mm 크산틴과 1 mm EDTA 를 200 mm 인산버퍼 (phosphate buffer, ph 7.5) 100 μl에서준비하였고, 50 mu/ml 크산틴산화효소를첨가하여요산의생성을유도하였다. 과산화물 (Superoxide) 소거활성은위반응액에 0.5 mm NBT 를첨가하여반응시켰다. 크산틴산화효소억제활성및과산화물소거활성은생성된요산과과산화물의흡광도가 50 % 감소할때나타 나는시료의농도 (IC 50 ) 로표시하였다. 3. 항산화활성실험결과 항산화활성실험결과는아래의표 1 에나타내었다. 즉, DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 의자유라디칼소거활성으로본발명의애기달맞이추출물의항산화 활성을측정한결과, 80 % 에탄올조추출물과에틸아세테이트, 부탄올분획물에서다른용매분획물에비해대 단히높은라디칼소거활성을나타냈으며, 크산틴옥시다제활성억제는 80 % 에탄올추출물과에틸아세테이 트분획물에서, 과산화물라디칼소거활성은에틸아세테이트와부탄올분획물이가장높은과산화물라디칼소 거활성을나타내었다. 전반적으로가장항산화활성이높게나타난에틸아세테이트분획물의 DPPH 자유라디칼소거활성의 50 IC값은 16.19 μg / ml, 크산틴옥시다제억제활성은 220.37 μg / ml, 과산화물자유라디칼소거활성은 42.07 μg / ml 이었다. <94> <95> <96> 특히, 이값은대조군으로사용된아스코르빈산 (ascorbic acid), BHA(butylated hydroxy anisole), 트롤록스 (trolox), 알로푸리놀 (allopurinol) 값에비해조금도뒤떨어지지않는활성이라할수있다. < 표 1> 본발명의애기달맞이추출물에대한항산화활성실험결과 IC 50 ( μg / ml ) a) 처리 DPPH 라디칼 크산틴산화효소 과산화물라디칼 소거활성 억제활성 소거활성 80% 에탄올추출물 44.21 ± 1.65 773.00 ± 2.89 62.15 ± 1.79 헥산분획물 611.07 ± 2.79 > 1000 > 1000 디클로로메탄분획물 108.00 ± 2.03 > 1000 91.43 ± 1.96 에틸아세테이트분획물 16.19 ± 1.21 220.37 ± 2.34 42.07 ± 1.66 부탄올분획물 40.53 ± 1.61 > 1000 46.07 ± 1.66 물분획물 342.76 ± 2.53 > 1000 95.32 ± 1.98 BHA b) 22.70 ± 0.61 NA c) NA c) 아스코르빈산 3.90 ± 3.22 - - 트롤록스 8.62 ± 2.20 288.60 ± 4.4 189.9 ± 2.03 알로푸리놀 NA c) 3.12 ± 0.17 22.65 ± 0.35 <97> * a) IC 50 값은흡광도가 50 % 감소할때나타나는시료의농도로써 3 회반복실험하여계산된값임. - 7 -
<98> <99> <100> <101> <102> <103> <104> <105> <106> <107> <108> <109> <110> <111> <112> <113> <114> <115> <116> <117> <118> * b) BHA : 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxy anisole) * c) NA : 적용되지않음항산화물질의가장특징적인기작은유리기와반응하는것으로유기리소거작용은활성라디칼에전자를공여하여식물중의항산화효과나인체에서노화를억제하는척도로사용된다. 크산틴산화효소는산화적환경에서크산틴탈수소효소 (xanthine dehydrogenase) 로부터생성된다. 크산틴산화효소는하이포크산틴 (hypoxanthine) 을산화시켜최종적으로요산 (uric acid) 과산소를생성하며, 산소유리기와수소과산화기가이산소로부터발생하게된다. 요산의축적은고요산혈증과통풍을유발하는것으로알려져있으므로요산형성의억제제가이들질환을위한치료물질로서유용할것이다. 크산틴산화효소에의해생성된산소유리기는세포의손상을초래한다. 그러나, 이내인성항산화방어체계가세포내산화-환원균형을유지하는데에문제가생길경우결과적으로산화스트레스가일어나게되며, 이산화스트레스는직접적으로세포내거대분자의손상을일으키거나세포손상을일으키는데중요한역할을한다. 따라서, 산소유리기의자유기를소거할수있는물질또한산화적손상의예방에유용하게쓰일수있으므로, 본발명의애기달맞이추출물도산화적손상의예방에사용될수있는항산화물질임을확인할수있었다. < 실험예 3> 본발명의애기달맞이추출물에대한항염활성실험내독소로잘알려진 LPS는그람음성균의세포외막에존재하며, RAW264.7와같은 macrophage 또는 monocyte에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와같은 pro-inflammatory cytokine을증가시키는것으로알려져있다. 또한, 이러한염증매개물질의형성은포스포리파제 A2(phospholipase A2) 의활성으로인해아라키돈산 (arachidonic acid) 이프로스타글라딘 (prostagladin) 으로바뀌는과정및질소산화물 (NO) 형성과정으로이어지게된다. 질소산화물 (Nitric oxide, NO) 은산화질소합성효소 (NOS) 에의해 L-arginine으로부터생성되는무기유리체로면역반응, 세포독성, 신경전달계및혈관이완등여러가지생물학적인과정에관여하는것으로알려져있으며, 농도에따라세포기능유지에중요한작용을하기도하고세포독성을일으키기도한다. NO를생산하는 NOS는세포내에존재하여칼슘이나칼모듈린 (calmodulin) 에의존적인형태인비유발성 NOS(constitutive NOS, cnos) 와칼슘에비의존적으로대식세포나혈관내피세포가활성화되거나, 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS) 와같은세균의내독소나여러가지사이토킨 (cytokine) 에의해유도되는형태인유발성 NOS(inducible NOS, inos) 의형태가있다. LPS 자극에의해발현된 inos는많은양의 NO를생성하게되며이에의한세포독성은염증반응, 세포의돌연변이및종양발생등에도관여하는것으로알려져있다. 염증반응과관련된조직손상에서 NO와 inos의생성이증가되어있음이보고되어있다. 이에본실험은애기달맞이추출물의뮤린마크로파지세포 (murine macrophage cell line RAW264.7) 로부터의 LPS 자극에의한 NO의형성억제효과및그독성정도를확인해보았다. 1. 세포배양마우스대식세포주인 RAW264.7 세포는한국유전자은행 (Korean Cell Line Bank) 로부터분양받아 100 units/ ml페니시린-스트렙토마이신 (penicillin- streptomycin) 과 10 % 우태혈청 (fetal bovine serum, FBS) 이함유된 DMEM 배지를사용하여 37, 5 % CO 2 항온기에서배양하였으며, 계대배양은 3 ~ 4 일에한번씩시행하였다. 지질다당류 (Lipopolysaccharide, LPS. E. coli serotype 0111:B4) 는 Sigma사로부터구입하여실험에사용하였다. 2. LDH 세포독성검색젖산탈수소효소 (Lactate dehydrogenase, LDH) 는대부분의세포에존재하는안정적인세포질효소 (stable cytoplasmic enzyme) 로서원형질막이손상을입으면세포배양액으로방출된다. 본실험에서는손상을입은세포가방출하는 LDH 활성을측정하는비색분석법 (colorimetric assay) 을사용하였 - 8 -
다. <119> <120> <121> <122> <123> <124> <125> <126> 즉, RAW264.7 세포를 1.0 10 5 cells/ ml의농도로 48 well plate의각 well에넣고 24 시간동안배양후, 시료를농도별로첨가하여세포배양이끝난후, LDH 세포독성검색키트 (LDH cytotocixity detection kit,promega) 를사용하여 492 nm에서효소활성을측정하였다. 3. NO 생성억제률검색 RAW264.7 세포를 10 % FBS가첨가된 DMEM 배지를이용하여 1.0 10 5 cells/ ml로조절한후 48 well plate 에접종하고, 시험물질과 LPS(1 μg / ml ) 를동시에처리하여 24 시간배양하였다. - 생성된 NO의양은 Griess 시약을이용하여세포배양액중에존재하는 NO 2 의형태로측정하였다. 세포배양상등액 100μl와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 μl를혼합하여 96 well plates에서 10 분동안반응시킨후 530 nm에서흡광도를측정하였다. 생성된 NO의양은 sodium nitrite (NaNO 2 ) 를표준으로비교하였다. 4. 항염활성실험결과애기달맞이에탄올추출물의 RAW264.7 에서의세포독성이나타나지않는농도로추출물을처리하여 NO 생성억제 - 효과를세포배양액중에존재하는 NO 2 의형태로측정한결과, LPS 단독처리군에서는 NO가과량생성되는것을확인할수있었으며, 애기달맞이추출물을동시에처리한시험구에서는 NO 생성량이감소됨을확인할수있었고, 특히헥산과디클로로메탄, 에틸아세테이트분획물에서 NO의생성량이현저히저해됨을볼수있었다 ( 도 2). <127> <128> <129> <130> 그러나, 애기달맞이에탄올추출물에서는 RAW264.7 에서의세포독성이거의나타나지않았지만, 에틸아세테이트분획물에서는세포독성이강하게나타났다. < 실험예 4> 본발명의애기달맞이추출물에대한항암활성실험 1. 세포배양급성전골수성백혈병환자에서유래한 HL-60 세포주를한국세포주은행 (KCLB) 으로부터분양받아 100 units / ml의페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin, GIBCO) 과 10 % 의우태혈청 (FBS, GIBCO) 이함유된 RPMI 1640 배지 (GIBCO) 를사용하여 37, 5 % CO 2 항온기에서배양하였으며, 계대배양은 3 ~ 4 일에한번씩 시행하였다. <131> <132> <133> <134> <135> <136> <137> <138> 2. 세포의대사활성측정 HL-60 세포에대한증식억제는세포의대사활성을측정하여알아보았다. HL-60 세포 (2.0 10 5 / ml ) 를 96 well plate의각 well에넣고, 시료를농도별로첨가하였다. 이를 3 일간배양한다음, 3-(4,5-dimehtylthiazol)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma) 100 μg을첨가하고 4 시간동안더배양하였다. 플레이트를 1,000 rpm에서 10 분간원심분리하고조심스럽게배지를제거한다음, 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide, DMSO, Sigma) 150 μl를가하여 MTT의환원에의해생성된포마즌침전물을용해시킨후마이크로플레이트리더 (microplate reader, Bio-TEK instrumenis. USA) 를사용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 각시료군에대한평균흡광도값을구하였으며, 대조군의흡광도값과비교하여성장억제정도를조사하였다. 3. DNA 단편화 (DNA fragmentation) 분석 HL-60 세포 (3.5 10 5 / ml ) 에시료를처리하여배양이끝난후세포를수집하여 Promega Wizard r 게놈 DNA 정제키트 (Genomic DNA Purification Kit) 를이용하여 DNA를분리하였다. - 9 -
<139> <140> <141> <142> <143> <144> 분리한 DNA 를 1.5% 아가로스겔에서 30 분 (100 V) 동안전기영동을한다음 EtBr(ethidium bromide) 로염색하고 자외선투사조명기 (UV transilluminator) 하에서 DNA 단편화현상을관찰하였다. 4. 핵의형태학적변화 (Morphological changes) 측정 세포사멸의형태학적특징중의하나인핵의변화를관찰하기위해 HL-60 세포 (3.5 10 5 / ml ) 에시료를처리하 여배양이끝나기 30 분전에 DNA 특이적으로결합하는생체형광염색액인 H33342 를사용하여 DNA 를염색하고 형광현미경으로관찰하였다. 5. 세포주기분석 (Cell cycle analysis) HL-60 세포 (3.5 10 5 / ml ) 에시료를처리하여시간별로배양한후, HL-60 세포를수확하여 PBS 로세척하였다. HL-60 세포를 -20 에서 70 % 에탄올로 30 분동안고정시킨후, PBS 로세척하고, RNase A 를처리한다음요오 드화프로피디엄 (propidium iodide, Sigma) 으로염색하고, 유동세포분석기 (BD FACSCalibur flow cytometer, BD, USA) 로세포주기를분석하였다. <145> <146> <147> 6. 항암활성실험결과애기달맞이추출물및용매분획물의 HL-60 세포의성장에대한효과는테트라졸리움염 (tetrazolium salt) 의하나인 MTT를사용하여 MTT의환원에의해생성되는포마즌의흡광도로측정하였다. 그결과, 애기달맞이 80 % 에탄올추출물의 IC 50 값은 72.848 μg / ml를보였으며, 헥산분획물은 47.72 μg / ml, 디 클로로메탄 12.40 μg / ml, 에틸아세테이트 43.03 μg / ml로나타났다. <148> 그러나, 부탄올과물분획물은 IC 50 값을구할수가없었으며, 농도의존적으로세포성장억제효과가가장좋은 분획물은에틸아세테이트분획물이었다. <149> <150> <151> <152> 에틸아세테이트분획물을여러농도로처리하였을때의세포성장억제율은 12.5 μg / ml농도에서 22.00 ± 6.97 %, 25 μg / ml농도에서 30.44 ± 2.83 %, 50 μg / ml농도에서 54.92 ± 6.35 %, 100 μg / ml농도에서 77.67 ± 2.29 % 로유의적인세포성장억제효과를보였다 ( 표 2). 이중디클로로메탄분획물은처리농도가가장낮은 12.5 μg / ml에서도세포독성이너무강한탓에세포성장 억제율이 IC 50 값보다높게나와유의적인데이터를얻지못하였다. < 표 2> HL-60 세포에서의애기달맞이추출물에대한세포독성결과 처리 성장억제율 (%) IC 50 ( μg / ml ) 12.5 25 50 100 ( μg / ml ) 80 % 에탄올 10.44±7.32 22.12±7.33 34.57±5.15 56.63±5.99 72.84 헥산분획물 35.36±3.19 36.39±3.94 45.51±5.16 75.42±3.46 47.72 디클로로메탄 51.11±5.58 50.13±5.18 69.00±2.29 82.34±1.37 12.40 에틸아세테이트 22.00±6.97 30.44±2.83 54.92±6.35 77.67±2.29 43.03 부탄올분획물 3.58±1.13 4.65±4.84 14.19±4.52 42.58±9.57 NA * 물층 0.67±6.60 6.78±6.41 0.75±5.88 5.29±4.90 NA <153> <154> <155> <156> <157> * 상기데이터는 3회반복실험한값의표준편차를나타냄 * NA : 적용되지않음애기달맞이용매분획물의세포독성효과에의한 HL-60 세포증식억제작용이세포사멸 (apoptosis) 유도에의한것인지그기전을알아보기위하여, 세포사멸유도에의하여나타나는 DNA 단편화현상을전기영동으로관찰하였다. 그결과, 애기달맞이에틸아세테이트분획물은 HL-60 세포에 100 μg / ml의농도로처리시 DNA 단편화현상이두드러지게나타났다 ( 도 3). 이에에틸아세테이트분획물을갖고세포사멸이일어난세포에서볼수있는가장특징적인변화인형태학적 - 10 -
관찰을실시하였다. <158> <159> <160> <161> <162> <163> <164> <165> 그결과, 정상세포들의핵들의형태는정상적인둥근형태이나에틸아세테이트추출물이처리된세포에서는시간이경과될수록세포의크기가축소되며, 핵의모양이불규칙하고부분적인핵의응집현상을관찰할수있었다 ( 도 5). 또한, 애기달맞이추출물에의한세포사멸유도에의하여 Sub-G1 이배수성 (hypodiploid) 세포가증가하는지 DNA에결합하여형광을나타내는물질인 PI를처리하여유세포분석기로분석하였다. 그결과, 처리시간이경과될수록 sub-g1 hypodiploid 세포가증가되는됨을확인할수가있었다 ( 도 4). 세포사멸기전에대하여는확실하게증명된바는없지만세포질내칼슘치가증가되어칼슘의존성핵산중간가수분해효소 (endonuclease) 가활성화되어핵내 DNA 분절이일어나며, 단백질연결효소 (transglutaminase) 가활성화되어세포질내단백질의가교반응 (cross-linking) 이일어나면서세포질농축이일어나고수액이세포밖으로빠져나가면서세포사멸체 (apoptotic bodies) 를형성하는것으로알려져있다. < 실험예 5> 본발명의애기달맞이추출물에대한항균활성실험 1. 사용균주및배지준비애기달맞이추출물에대한항균활성을식중독을일으키는균주를그램양성균 3종과그램음성균 3종으로총 6 종의균주를사용하였다 ( 표 3). 배지는 Tryptic soybean agar(tsa), Tryptic soybean broth(tsb), Brain heart infusion는 Difco(USA) 사의제품을사용하였다. < 표 3> 항균활성실험을위한균주및배지리스트 <166> 균주명 배지 온도 ( ) Bacillus cereus TSA/TSB 30 그램양성균 Listeria monocytogenes BHI 37 Staphylococcus aureus TSA/TSB 37 Escherichia coli TSA/TSB 37 그램음성균 Salmonella enteritidis TSA/TSB 37 Salmonella trphimurium TSA/TSB 37 <167> <168> <169> <170> 2. 항균력측정본발명의애기달맞이추출물의항균성물질을검색하기위해본실험에서는페이퍼디스크방법 (16) 으로식품유해미생물을적용시켜항균활성을측정하였다 ( 표 3). 즉, 각균주 1 백금이를취하여 10 ml의배양액 (broth) 에접종하고표 2에기재된최적온도에서 18 시간동안배양하였다. 배양한세균을분광분석기 (Spetrophotometer, Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, USA) 를사용하여 650 nm 에서광밀도 (optical density) 값 0.4 (10 6 CFU/ ml ) 로흡광도를조절하고, 주가평판법 (pour-plate) 에따 라배지가분주된배양접시에균일하게섞은후실온에서굳혔다. <171> <172> <173> <174> <175> 이배지위에멸균된페이퍼디스크 (paper disc) 를시료수에맞게올리고밀착시킨후각각의시료를 2,000 ppm, 1,000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 그리고 100 ppm으로흡수시켰다. 대조구는 80 % 에탄올을실험군과동일한방법으로점적하였다. 최적온도에서 24 시간배양한후디스트주변에생성된생육저해환 (clear zone, mm) 의크기를측정하여항균활성정도를비교분석하였다. 3. 농도별미생물생육저해율측정애기달맞이가미생물에미치는생육저해율측정은 TSB 배지 10 ml 에추출물및분획물을 membrane 여과 (filter) 로제균시키고, 액체배지에각분획물을 2,000 ppm 농도별로첨가하였다. - 11 -
<176> <177> 여기에 O.D 값이 0.4가될때까지키운세균배양액 10 μl를접종하여 shaking 인큐베이터 (120 rpm) 를이용하여 37 에서 24 시간배양하여마이크로플레이트리더 (microplate reader, Bio-TEK instrumenis. USA) 를통해 650 nm에서측정하였다. 다음식으로생육저해율 (%) 을확인하였다. <178> <179> <180> <181> <182> <183> <184> <185> <186> <187> <188> 4. 항균활성실험결과본발명의애기달맞이추출물에대한항균활성실험결과, 그램양성균에서는 80 % 에탄올추출물, 에틸아세테이트, 부탄올및물분획물에서처리농도가증가할수록항균활성을나타내는억제환 (inhibition zone) 의크기도비례적으로증가하였으며, 특히에틸아세테이트분획물의경우황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 에서 2,000 ppm 농도에 18 mm의생육저해환이나타나다른추출물보다높은항균력을나타냈다 ( 도 6). 그램음성균에대한항균활성결과는표 4에서보는바와같이애기달맞이조추출물과분획물모두에서모든균주를대상으로우수한항균활성을나타냈으며, 특히에틸아세테이트분획물이살모넬라 (Salmonella typhimurium) 균주에서 2,000 ppm으로처리시 19 mm로가장우수한생육저해환 (clear zone) 을나타내었다 ( 도 7). 한편, 헥산과디클로로메탄분획물은모든균주에서항균활성을보이지않았으며, 특히에틸아세테이트분획물은그램양성, 그램음성모든균주를대상으로폭넓은항균력을보여주었다. 일반적으로식물의에틸아세테이트분획물에는사포닌성분, 유기산류, 탄닌당, 배장체및기타알칼로이드류가주로용출되는것으로알려져있다. 애기달맞이추출물과분획물들의농도를 TBS 배지 10 ml에 2,000 ppm으로처리하여미생물에대한생육저해를흡광도 (A=650 nm) 를측정하여저해율을구하였다. 그결과, 에탄올추출물은본실험에서사용된모든균주에대해약 25 ~ 53 % 정도의생육저해효과를나타내었고, 특히살모넬라엔테리티디스균 (Salmonella enteritidis) 에대해 53.8 % 로가장높은저해율을나타내었다 ( 도 8). 그리고, 분획물중에는에틸아세테이트분획물과부탄올분획물이 44 ~ 62 % 로가장높은생육억제율을보였으며, 거의모든미생물균주에대해약 50 % 이상의강력한생육저해를나타냈다. 특히, 에틸아세테이트분획물은리스테리아식중독균 (Listeria monocytogenes) 에대하여 62.4 % 로가장높은미생물생육저해율을나타내었다. < 표 4> 그램양성균에대한애기달맞이추출물의항균활성실험결과 <189> B.cereus 균주명 L.monocytogenes 농도 (ppm) 에탄올 추출물 생육저해환 (clear zone) 의직경 (mm) 헥산 분획물 디클로로메탄분획물 에틸아세테이트분획물 부탄올 분획물 물 분획물 100 - - - 9 10-250 9 - - 10 11-500 11 - - 13 11 9 1000 13 - - 16 13 11 2000 15 - - 18 13 12 100 - - - 11 9-250 9 - - 12 11-500 11 - - 12 12 9 1000 12 - - 13 12 10 2000 15 - - 14 13 10-12 -
S.aureus 100 - - - 11 10-250 9 - - 12 12-500 11 - - 13 13 9 1000 13 - - 15 14 11 2000 15-18 14 12 <190> < 표 5> 그램음성균에대한애기달맞이추출물의항균활성실험결과 <191> 균주명 E.coli S.enteritidis S.trphimurium 농도 (ppm) 에탄올 추출물 생육저해환 (clear zone) 의직경 (mm) 헥산 분획물 디클로로메탄분획물 에틸아세테이트분획물 부탄올 분획물 물 분획물 100 2 - - 9 10 -- 250 9 - - 10 11-500 11 - - 12 12 9 1000 13 - - 15 13 11 2000 16 - - 17 14 12 100 8 - - 11 9-250 9 - - 12 11-500 11 - - 13 12 9 1000 12 - - 15 14 11 2000 15 - - 15 17 13 100 - - - 11 10-250 9 - - 12 12-500 11 - - 13 13 9 1000 12 - - 16 14 11 2000 15 - - 19 14 12 발명의효과 <192> <193> 본발명에의해항산화활성, 항염활성, 항암활성및항균활성의생리활성이뛰어난애기달맞이추출물이제공된다. 또한, 본발명에의해생리활성이뛰어난애기달맞이추출물을활성성분으로포함하는질병예방및개선을위한조성물이제공된다. 도면의간단한설명 <1> <2> <3> <4> <5> <6> <7> <8> <9> <10> <11> 도 1은본발명의애기달맞이추출물에대한폴리페놀화합물함량을나타내는그래프도 2는본발명의애기달맞이추출물에대한항염활성을나타내는그래프도 3은본발명의애기달맞이추출물중에틸아세테이트분획물에대한 DNA 단편화의전기영동사진 M : DNA 마커, Lane 1 : 대조군 Lane 2 : 에틸아세테이트분획물 (100 μg / ml ) 도 4는본발명의애기달맞이추출물의세포사멸정도를나타내는유동세포분석에의한 DNA 함량그래프 A : 대조군, B : 에틸아세테이트분획물 (12 시간 ) C : 에틸아세테이트분획물 (24 시간 ) 도 5는본발명의애기달맞이추출물의세포사멸정도를나타내는핵응집현상사진 A : 대조군, B : 에틸아세테이트분획물 (12 시간 ) C : 에틸아세테이트분획물 (24 시간 ) - 13 -
<12> <13> <14> <15> <16> <17> <18> 도 6은본발명의애기달맞이추출물중에틸아세테이트분획물의스타필로코커스아우레우스균 (Straphylococcus aureus) 에대한농도별항균활성을나타내는결과사진 C : 대조군, 1 : 2,000 ppm, 2 : 1,000 ppm 3 : 500 ppm, 4 : 250 ppm 5 : 100 ppm 도 7은본발명의애기달맞이에틸아세테이트분획물의살모넬라티피뮤리움균 (Salmonella typhimurium) 에대한농도별항균활성을나타내는결과사진 C : 대조군, 1 : 2,000 ppm 2 : 1,000 ppm, 3 : 500 ppm, 4 : 250 ppm 5 : 100 ppm 도 8은본발명의애기달맞이에탄올추출물및분획물에대한항균활성을나타내는그래프 도면 도면 1-14 -
도면 2 도면 3-15 -
도면 4-16 -
도면 5-17 -
도면 6 도면 7-18 -
도면 8-19 -