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대한진단검사의학회지제 28 권제 2 호 2008 Korean J Lab Med 2008;28:109-17 DOI 10.3343/kjlm.2008.28.2.109 원저 임상미생물학 Rhinovirus, Human Metapneumovirus, Coronavirus 검출을위한 Seeplex TM RV Detection 키트의평가 성흥섭 박숙자 우영대 최병후 김미나 울산의대서울아산병원진단검사의학과 Evaluation of Seeplex TM RV Detection Kit for Detecting Rhinovirus, Human Metapneumovirus, and Coronavirus Heungsup Sung, M.D., Sook Ja Park, M.T., Young Dae Woo, Ph.D., Byung Hoo Choi, M.T., and Mi-Na Kim, M.D. Department of Laboratory Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, Seoul, Korea Background : Direct antigen test (DAT) and culture are primary tests to diagnose infections by respiratory viruses, but are mainly available for the traditional viral pathogens such as respiratory syncytial virus (RSV), influenza virus, parainfluenza virus (PIV), and adenovirus in clinical laboratories. The objective of this study was to evaluate a multiplex reverse transcriptase-pcr method using Seeplex TM RV Detection kit (Seegene, Korea) for the detection of rhinovirus, coronavirus, and human metapneumovirus (hmpv). Methods : From January to May 2007, nasopharyngeal aspirates (NPAs) from pediatric patients negative for culture and DAT of traditional viral pathogens were tested with Seeplex TM. All the amplicons were directly sequenced and homology of the sequences was searched in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database. Patients medical records were reviewed for clinical and demographic features. Results : Forty-seven (26.4%) of 178 NPAs were positive: 18 rhinovirus, 15 hmpv, 4 RSV A, 3 coronavirus OC43, 3 influenza virus A, 2 adenovirus, 1 coronavirus NL63, and 1 RSV B. Based on maximum identity, each of the sequences indicating rhinovirus, hmpv, and coronavirus OC43 matched to the corresponding viruses with homology of 94-98%, 96-99%, and 98-100%, respectively. Seeplex TM - positive patients were 0-11 yr old with a male:female ratio of 1.5:1. Clinical diagnoses included 9 pneumonia, 6 bronchiolitis, 2 cold, 1 asthma exacerbation for rhinovirus; 10 pneumonia, 4 bronchiolitis, and 1 clinical sepsis for hpmv; and 1 pneumonia, 2 croup, and 1 cold for coronavirus. Conclusions : Multiplex reverse transcriptase-pcr method using Seeplex TM RV Detection kit is a reliable test to detect rhinovirus, hmpv, and coronavirus. It may improve the diagnostic sensitivity for RSV, influenza virus, PIV, and adenovirus. (Korean J Lab Med 2008;28:109-17) Key Words : Culture, Direct Antigen Test, Multiplex PCR, Respiratory Virus 접 수 : 2008년 1월 2일 접수번호 : KJLM2102 수정본접수 : 2008년 2월 21일 게재승인일 : 2008년 2월 21일 교신저자 : 김미나 우 138-736 서울시송파구풍납2동 388-1 서울아산병원진단검사의학과 전화 : 02-3010-4499, Fax: 02-478-0884 E-mail: mnkim@amc.seoul.kr * 본논문은 2007년도아산생명과학연구소연구비지원 (2007-443) 에의한것임. 서론급성호흡기감염은모든연령층에서가장흔한질병이며, 특히소아가입원하게되는주요한원인중하나이다 [1, 2]. 소아에서급성하기도감염의 80% 정도는바이러스가원인이다 [3]. 바 109

110 성흥섭 박숙자 우영대외 2 인 이러스성호흡기감염은세균성감염과의감별이필요하고, 원인바이러스가다르더라도유사한증상과징후를보여임상적으로는원인바이러스를구분하기어렵기때문에검사실적진단이필요하다 [4]. 호흡기감염의원인바이러스를신속하게검출하면위급한환자에서적절한항바이러스제치료를할수있을뿐아니라불필요한항균제사용과입원기간을줄일수있으며, 감염환자를적절하게격리하여병원내전파를막을수있다 [5]. 유행기에따라분리빈도에차이가있으나 respiratory syncytial virus (RSV), influenza virus, parainfluenza virus (PIV), adenovirus 등이높은빈도로분리된다 [6-8]. 최근에는기존에감기의원인으로알려졌던바이러스가심각한호흡기감염을일으킬수있음이밝혀지거나, 호흡기감염을일으키는새로운바이러스들이알려지고있다 [9, 10]. Human metapneumovirus (hmpv) 는 2001년처음으로발견된호흡기바이러스로소아에서급성하기도감염의원인중 5-15% 를차지한다고보고되었으며 [9], 주로상기도감염의원인인 human rhinovirus (HRV) 와 coronavirus (CoV) 도천식의급성악화와급성하기도감염을일으킬수있다 [11, 12]. 따라서급성호흡기감염증상을보이는소아에서감별해야할바이러스의종류가많아졌다. 호흡기바이러스검출에는직접항원검사와배양검사가전통적인방법이다 [3, 13]. 하지만일부바이러스검출에는직접항원검사의민감도가낮을수있으며, 배양이안되거나시간이많이걸리는바이러스도있다 [13]. 핵산증폭법은바이러스를더신속하고민감하게검출할수있어전통적인방법의단점을보완할수있다 [14]. 최근에는 hmpv처럼이제까지검출하지않았던새로운바이러스를검출할때직접항원검사법이나배양검사법보다핵산증폭법을먼저적용하여신속하게바이러스감염유무를진단하고있다 [9]. 특히호흡기감염바이러스는감별진단을위해여러가지바이러스를동시에검출할필요가있기때문에다중역전사중합효소연쇄반응 (multiplex reverse transcriptase-pcr, multiplex RT-PCR) 검사법이유용하다 [6, 15, 16]. 국내에서는 dual priming oligonucleotide (DPO) 를이용하여 RSV A, RSV B, influenza virus A, influenza virus B, PIV 1, PIV 2, PIV 3, adenovirus, HRV, hmpv, CoV OC43, CoV 229E/NL43 등 13종의호흡기바이러스를동시에 multiplex RT-PCR하기위한 Seeplex TM RV Detection 키트 (Seegene, Seoul, Korea) 가개발되었다 [17]. 본연구에서는 RSV, influenza virus, PIV, adenovirus 직접항원검사와배양검사가모두음성이었던환자를대상으로 Seeplex TM RV Detection 키트의진단적유용성을평가하였다. 대상및방법 1. 대상및검체 2007년 1월부터 5월까지호흡기증상으로 RSV, influenza virus, PIV, adenovirus 직접항원검사와배양검사가동시에의뢰된환자중두검사모두음성이었던소아환자를대상으로하였으며전자의무기록을조회하여환자의임상정보를얻었다. 직접항원검사와배양검사에서사용한비인두흡인액을 4 C 에서보관하였다가 7일이내에사용하였다. 직접항원검사와배양검사에는동정용항체로 D3 DFA (Diagnostic Hybrids Inc., Athens, OH, USA) 를사용하였다. 바이러스배양을위해 2007년 1-2월에는 Madin-Darby canine kidney (MDCK), LLC-MK2, HEp-2 세포주를, 2007년 3월부터는 R-Mix Too 세포주 (Diagnostic Hybrids Inc.) 를사용하였다. 2. Multiplex RT-PCR Viral Gene-Spin, Viral DNA/RNA Extraction 키트 (Intron, Seoul, Korea) 를사용하여비인두흡인액 300 L에서 30 L의 RNA를추출하였다. 각검체에서핵산을추출하기전키트내내부대조물질 5 L를첨가하였다. 추출한 RNA 8 L를 RevertAid First Strand cdna Synthesis 키트 (Fermentas, Ontario, Canada) 로 cdna를합성하여최종부피가 20 L가되게맞추었다. Seeplex TM RV Detection 키트내의 adenovirus, hmpv, CoV 229E/NL63, PIV 1형, 2형, 3형검출을위한 A 세트와 influenza virus A형과 B형, RSV A형과 B형, HRV, CoV OC43 검출을위한 B 세트각각에대한 PCR 반응액을제조하였다. PCR 반응액은 3 L의 cdna, 4 L의 5 RV Primer, 3 L의 8- methoxypsoralen (8-MOP), 10 L의 2 Multiplex Master Mix로총 20 L가되도록하였다. PCR은 94 에서 15분반응후, 94 C30초, 60 C1.5분, 72 C 1.5분의반응을 40회반복하였고, 최종적인연장반응을 72 C 에서 10 분간실시하였다. 증폭된반응산물은 ethidium bromide 가 0.5 L/mL 포함된 2% agarose gel에서전기영동하여내부대조물질의증폭산물이있을때핵산추출과증폭과정이적절하였다고판단하였고, 각증폭산물의밴드크기는키트에포함된 marker DNA와비교하여판독하였다. 3. 염기서열분석과계통발생학적분석 PCR 산물은 GENCLEAN II 키트 (Q-BIO gene, Carlsbad,

Evaluation of Seeplex TM RV Detection Kit 111 CA, USA) 로정제한후 Seeplex TM RV Detection 키트에포함된해당바이러스의시발체로 BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction 키트 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를이용하여 ABI Prism 3100- Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) 에서직접염기서열분석하였다. 각염기서열은 NCBI의 Basic Local Alignment and Search Tool (BLAST, http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/) 로 GenBank에등재된바이러스유전자염기서열과비교하여상호일치도를구하였다. 바이러스유전자의염기서열일치도가높은바이러스와같은과 (family) 또는속 (genus) 에포함된바이러스유전자를 GenBank에서찾아 ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw/index. html) 에서염기서열을정렬하고, Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 3, http://www.megasoftware. net/) 프로그램에서 Neighbour-Joining 방법으로계통발생학적으로분석하였다 [18]. 이때계통발생학적나무그림은 Tree- View 프로그램 (http: //taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/ treeview.html) 에서얻었다. 계통발생학적분석에사용된바이러스염기서열의 GenBank accession number는다음과같다 : DQ473498 (HRV), EF456706 (poliovirus 1), EU262658 (coxsackievirus A16), X05690 (coxsackievirus B4), DQ- 452074 (enterovirus 71), X92886 (echovirus 9); DQ023127 (hmpv), AF187152 (avian pneumovirus (APV C), D00850 (APV A), Y14292 (APV B), D11128 (pneumonia virus of mice), NC001989 (bovine RSV), NC001781 (human RSV); AY903460 (CoV OC43), DQ415914 (CoV HKU), NC005831 (CoV NL63), NC002645 (CoV 229E), NC004718 (SARS CoV). 결과 1. 대상환자들의특성 5개월동안 323명의환자에서 477검체가의뢰되었으며, RSV, influenza virus, PIV, adenovirus 직접항원검사와배양검사결과각각 47명 (14.6%) 에서 49검체 (10.3%), 54명 (16.7%) 에서 57검체 (11.9%) 가양성이었다. 분리된바이러스는 RSV 26검체 (5.5%), influenza virus A 16검체 (3.4%), influenza virus B 7검체 (1.5%), PIV 7검체 (1.5%), adenovirus 5검체 (1.0%) 였다. 266명 (82.4%) 의 417검체 (87.4%) 는두가지검사모두음성이었으며, 추적관찰검체를제외한후검사가능한 178검체를대상으로 multiplex RT-PCR을시행하였다. 남자가 108명 (60.7 %), 여자가 70명 (39.3%) 이었으며, 나이는 0.8±3.2세, 연령분포는생후 4일부터 15세까지였다. 외래환자가 1명 (0.6%), 응급실에서치료받은후퇴원한환자가 23명 (12.9%), 호흡기증상으로입원한환자가 86명 (48.3%), 입원중호흡기증상이발생한환자가 68명 (38.2%) 이었다. 2. Multiplex RT-PCR 결과직접항원검사와배양검사에서모두음성이었던 178검체중 47검체 (26.4%) 가 multiplex RT-PCR 양성이었으며, 모두 1가지종류의바이러스만검출되었다. HRV는 18 검체 (10.1%), hmpv 는 15검체 (8.4%), CoV OC43은 3검체 (1.7%), CoV 229E/NL63 은 1검체가검출되었다 (Table 1). 직접항원검사및배양검사에서음성이었는데, multiplex RT-PCR에서양성인경우는 RSV A형 4검체 (2.2%), influenza virus A형 3검체 (1.7%), adenovirus 2검체 (1.1%), RSV B형 1검체 (0.6%) 였다 (Table 1). RSV A가검출된환자두명은각각8일과 4개월전에RSV가배양된 Table 1. Clinical diagnoses of 47 patients positive for rhinovirus, human metapneumovirus, coronavirus, and other viruses by multiplex reverse transcriptase PCR Respiratory viruses Total N of patients Pneumonia Bronchiolitis Croup Asthma exacerbation Clinical sepsis Common cold HRV 18 9 6 0 1 0 2 hmpv 15 10 4 0 0 1 0 CoV OC43 3 1 0 1 0 0 1 CoV NL63 1 0 0 1 0 0 0 Others* 10 3 5 0 0 2 0 Total 47 23 15 2 1 3 3 *Others included traditional viral pathogens such as respiratory syncytial virus, influenza virus, parainfluenza virus, and adenovirus. Abbreviations: HRV, rhinovirus; hmpv, human metapneumovirus; CoV, coronavirus.

112 성흥섭 박숙자 우영대외 2 인 Table 2. Similarities between the sequences of the respiratory viral isolates in this study and the archival sequences from the GenBank Viruses Target gene Size of target gene (bp) N of isolates Sequence identity (%) based on maximum identity Compared strains (GenBank accession no.) Rhinovirus 5 untranslated region 337 18 94-98 DQ316274, -277, -297 DQ473498, -3508 EF186077 AF542443 AF108161, -173 EF077279 hmpv Fusion protein 469 15 96-99 AY304362 EF081369 DQ023127, -131 AY622381 AY530094 Coronavirus OC43 Membrane glycoprotein 231 3 99-100 AY903459, -460 Coronavirus 229E/NL63 Spike protein 375 1 98 AY567487 RSV A Fusion protein 273 4 98-100 AF512538 DQ885231 AY114149 RSV B Fusion glycoprotein 391 1 98 AY526565 Influenza A Segment 7 matrix protein 351 3 98 EF620022 Adenovirus E2B DNA polymerase 534 2 99 AY339865 Abbreviations: hmpv, human metapneumovirus; RSV, respiratory syncytial virus. 적이있었다. 핵산추출, 역전사, Seeplex TM RV Detection 키트를이용한 multiplex RT-PCR법의전체검사시간 (turnaround time) 과수기시간 (hands-on time) 은각각 8시간과 90분이었다. 3. 염기서열분석과계통발생학적분석결과 RT-PCR에양성이었던 47검체의증폭산물모두의염기서열을 GenBank에서비교검색했을때각각의증폭산물의크기로동정된바이러스종과높은일치도를보였다 (Table 2). hmpv로동정된 3명의환자검체에서얻은염기서열을제외하고는각각의바이러스분리주사이의염기서열이 100% 일치하는경우는없었다. HRV 양성검체들은표적유전자인 5 untranslated region 유전자 337 bp 부위의염기서열이 GenBank에등록된 HRV 염기서열과 94-98% 일치하였고 (Table 2), 다음으로높은일치도를보인 poliovirus의염기서열과 62% 의일치도를보였다. HRV로동정되었던환자검체에서얻은염기서열과 GeneBank 에등록된 HRV 염기서열, HRV와염기서열일치도가높은 Enterovirus의염기서열과계통발생학적분석결과 HRV와군집을이루었다 (Fig. 1A). hmpv 양성검체들은표적유전자인 fusion protein 유전자 469 bp 부위의염기서열이 GenBank에등록 된 hmpv 염기서열과 96-99% 일치하였고 (Table 2), 다음으로 APV C형의염기서열과 73% 의일치도를보였다. hmpv로동정되었던환자검체에서얻은염기서열과 GenBank에등록된 hmpv 염기서열, hmpv와염기서열일치도가높은 Pneumovirinae의염기서열과계통발생학적분석결과 hmpv와군집을이루었다 (Fig. 1B). CoV OC43 양성검체들은 membrane glycoprotein 유전자 231 bp 부위의염기서열이 GenBank에등록된 CoV OC43 염기서열과 99-100% 일치하였고 (Table 2), 다음으로 CoV HKU의염기서열과 66% 의일치도를보였다. GenBank에등록된 CoV OC43, CoV 229E, CoV NL63, CoV HKU, SARS CoV 염기서열과 RT-PCR에서 CoV OC43 양성이었던환자에서얻은염기서열을계통발생학적으로분석한결과 CoV OC43과군집을이루었다 (Fig. 1C). CoV 229E/NL63 양성인 1검체는 spike protein 유전자 375 bp 부위의염기서열이 GenBank에등록된 CoV NL63 염기서열과 98% 일치하였고 (Table 2), 다음으로 CoV 229E와 67% 의일치도를보였으며, GenBank에등록된 CoV OC43, CoV 229E, CoV NL63, CoV HKU, SARS CoV 염기서열과계통발생학적분석결과 CoV NL63과군집을이루었다 (Fig. 1D). RSV A형, RSV B형, influenza virus, adenovirus 양성이었던검체에서얻은염기서열과 GenBank에등록된염기서열

Evaluation of Seeplex TM RV Detection Kit 113 R1 HRV Poliovirus 1 Coronavirus A16 Coronavirus B4 Enterovirus 71 Echovirus 9 A 0.1 0.1 APV-B M1 hmpv APV-C APV-A PVM brsv hrsv B C1 CoV-OC43 CoV-HKU CoV-OC43 CoV-HKU SARS-CoV SARS-CoV C4 CoV-NL63 CoV-NL63 CoV-229E 0.1 C 0.1 CoV-229E D Fig. 1. Phylogenetic analysis using Neighbour-Joining method showed a close relationship between the isolates of this study (A. Human rhinovirus [HRV] R1, B. Human metapneumovirus [hmpv] M1, C. Coronavirus [CoV] OC43 C1, D. CoV NL63 C4) and archival strains of corresponding viruses. Distances are presented as a number of substitutions per site (a scale of 0.1 means 0.1 nucleotide substitution per site). Abbreviations: hrsv, human respiratory syncytial virus; brsv, bovine respiratory syncytial virus; PVM, pneumonia virus of mice; APV, avian pneumovirus; SARS, severe acute respiratory syndrome. 사이의일치도는각각 98-100%, 98%, 98%, 99% 였다 (Table 2). 4. Multiplex RT-PCR 양성환자들의임상적특성 HRV 양성 18명중남자는 8명 (44.4%), 여자는 10명 (55.6%) 이었으며나이의중앙값은 1.4세 (2개월-11세) 였다. 11명 (61.1%) 은기저질환을가지고있었으며, 9명 (50.0%) 은폐렴, 6명 (33.3 %) 은급성세기관지염, 2명 (11.1%) 은상기도감염, 1명 (5.6%) 은천식의급성악화로진단받았다. 9명의폐렴환자중 4명은원인이밝혀졌으며, 세균성폐렴이 3명, 거대세포바이러스폐렴이 1 명이었다 (Table 1). hmpv 양성환자 15명중남자는 11명 (73.3%), 여자는 4명 (22.2%) 이었으며나이의중앙값은 1.4세 (4개월-7세) 였다. 9명 (60.0%) 은기저질환을가지고있었으며, 10명 (66.7%) 은폐렴, 4명은급성세기관지염, 1명 (6.7%) 은임상적패혈증으로진단받았다 (Table 1). hmpv가검출된환자중세균성폐렴이증명된환자는없었다. CoV OC43 양성환자 3명은모두남아로나이범위는 4개월에서 6개월이었으며, 각각폐렴, 크룹, 상기도감염으로진단받 았다. CoV NL63 양성환자는 3세여아로크룹으로진단받았다 (Table 1). CoV가검출된환자중세균성폐렴이증명된환자는없었다. RSV A형또는 B형이분리된 5명은모두 2세미만이었으며, 4명은급성세기관지염, 1명은폐렴으로진단받았다. Influenza virus가분리된 3명중 2명은임상적패혈증으로, 1명은폐렴으로진단받았다. Adenovirus가분리된 2명중 1명은폐렴, 나머지 1명은급성세기관지염으로진단받았다 (Table 1). 고찰 RT-PCR에서증폭된산물을염기서열분석한결과기존에 GenBank에등록된바이러스염기서열과 94-100% 의높은일치도를보였고, 계통발생학적으로해당바이러스와뚜렷한군집을보여서 Seegene RV Detection 키트의판독결과와모두일치하였다. 이들바이러스가분리된 47명의환자들은임상적으로호흡기증상을가지고있었고, hmpv와 CoV 양성인환자들에서는세균성원인이증명된경우가없어서이들바이러스가현감염의원인일것으로추정할수있었다. RT-PCR 방법으로

114 성흥섭 박숙자 우영대외 2 인 원인바이러스가검출될경우증폭산물의교잡반응이나염기서열분석을통해교차오염의가능성을배제해야한다 [19]. hmpv 양성이었던 3검체는증폭산물의염기서열이서로 100% 일치하여교차오염에의한위양성가능성을배제할필요가있었지만, 3검체모두임상적으로하기도감염이의심되었던환자에서채취되었고 hmpv에대한직접항원검사와배양검사도양성이어서 hmpv 감염으로판단하였던증례들이다 ( 미발표자료 ). 따라서 HRV, hmpv, coronavirus 감염에대한 Seeplex TM RV Detection 검사법의진단특이도는 100% 였다. Multiplex RT- PCR의특이도는배양이가능한호흡기바이러스에대해서는직접항원검사와배양검사를기준으로평가되며, 배양이불가능한호흡기바이러스에대해서는새로운시발체로단일 RT-PCR 을시행하거나염기서열분석을통해평가된다 [16, 20]. 기존의보고에서 multiplex RT-PCR의특이도는배양검사와직접항원검사를기준으로 96-99%, 단일 RT-PCR을기준으로 96-100%, 염기서열분석을기준으로 94% 로보고되어 RT-PCR의특이도는매우우수하였다 [16, 20]. Seeplex TM RV Detection 키트가다중중합효소연쇄반응법인데도불구하고민감도와특이도를유지할수있는이유는시발체가 18-25 bp의 5 부위, 5개의 deoxyinosine으로구성된 linker 부위, 6-12 bp의 3 부위등세부분으로구성되어있어서, 상대적으로긴 5 부위는바이러스유전자와의결합을촉진하며, 짧은 3 부위는바이러스특이증폭반응이일어날수있게하는 DPO 기법을이용하여제작하였기때문이다 [17, 21]. 이제품에대한다른평가에서도검출한계값이 10 copies/ml로기존의 multiplex RT-PCR 검사법들의검출한계값인 50-250 copies/ml에비해더우수한민감도를보였다 [16, 19, 21]. HRV와 CoV 진단에는배양법이용이하지않고, hmpv 진단에는 RT-PCR이 표준법 이기때문에 [22-24] 이들바이러스를동시에민감하고특이하게검출하는 Seeplex TM RV Detection 키트는호흡기바이러스진단에믿을만한검사법이라고판단하였다. RSV, influenza virus, PIV, adenovirus 등의직접항원검사와배양검사음성인환자중 20.8% 에서 multiplex RT-PCR 법에의해 HRV, hmpv, CoV가검출되었음을미루어볼때 HRV, hmpv, CoV가소아호흡기질환의중요한원인바이러스임을알수있었다. 본연구에서이들바이러스가모두단독으로분리되었는데, RSV, influenza virus, PIV, adenovirus 에대한직접항원검사와배양검사음성이었던검체만을대상으로하였기때문으로판단되며, 중복감염을보고했던기존연구들 [10, 21, 25] 에비추어볼때 RSV, influenza virus, PIV, adenovirus 양성검체에서중복감염이있었을가능성을배제 할수없다. RSV와 influenza virus의상대적빈도가다른국내연구에비해낮았던것은검체수집기간이이들 2가지바이러스의최고유행기인 11월과 12월이제외된것이가장큰원인일것으로추정하였다. HRV는상기도감염의주요원인이지만, 소아특히, 신생아및면역억제환자에서심한하기도감염을일으킬수있다고알려져있다 [26, 27]. 본연구에서도 HRV 양성환자 18 명중 11 명 (61.1%) 이기저질환을가지고있어서하기도감염의빈도가높았을것이다. hmpv 양성이었던환자중 90% 이상이하기도감염이었는데, 이는병원의특성상증상이심한환자들이내원하였기때문일수있다. 하지만이전의국내보고에서하기도감염소아환자의 4.7-15.7% 에서 hmpv가분리되어 [10, 28, 29], hmpv는소아하기도감염의주요원인일것으로판단하였다. CoV 감염환자는 2.2% 를차지하여하기도감염소아의 1.6%, 급성호흡기감염소아의 1.7-5.0% 에서분리되었다는국내보고와유사하다 [10, 25, 30]. CoV의빈도가높지는않지만크룹과세기관지염을유발하므로이들감염이있는환자에서는 CoV 검출이필요하다. CoV 감염에대한기존의국내보고에서는 NL63에의한것이많은데비해본연구에서는 4명중 3명이 OC43임을규명함으로써 RT-PCR 검사가호흡기바이러스감염의역학적분석에도도움이됨을알수있었다 [10, 25, 30]. 이상의결과를볼때통상적인배양검사와직접항원검사로진단되지않고있는 HRV, hmpv, CoV 등이소아호흡기감염의중요한원인임을알수있었다. 그러므로, 이들바이러스를신속정확하게검출할수있는 multiplex RT-PCR 검사법이유용할것으로판단하였다. RSV, influenza virus, PIV, adenovirus에대한직접항원검사와배양검사에서모두음성이었던 10검체 (5.6%) 에서 RT- PCR로 RSV, influenza virus, adenovirus 등이검출되어, RT-PCR이항원검사나배양검사에비해민감도가더높을것으로추정되었다. RSV가 RT-PCR법으로검출된 5검체중 1검체는 RSV가배양된지 8일후채취한검체인데배양검사가음성이었던이유는바이러스역가가낮거나, 호흡기상피세포가충분하지못했거나, 검체운송과정중바이러스가죽었기때문일가능성이있다 [3]. 직접항원검사와배양검사는검체의종류, 검체의채취시간, 검체의질, 운송조건, 동정에사용하는시약, 이용되는세포주등에따라민감도에차이가있다 [20]. RT-PCR 의경우에도검체의종류, 검체의채취시간등에영향을받지만, 직접항원검사나배양검사보다는검체영향이덜하기때문에민감도가더높을수있다 [31]. 이전보고에서 4가지바이러스에대한직접항원검사와배양검사, multiplex RT-PCR법의양성률이각각 28.4%, 36.2%, 44.9% 로 RT-PCR의민감도가

Evaluation of Seeplex TM RV Detection Kit 115 가장높았고 [10], MultiCode-PLx법을평가했을때배양법보다 influenza virus A를더많이검출하거나전체적인민감도가높았다는보고가있다 [20, 32]. 특히 RT-PCR은바이러스배출기간이짧고배출량이적은성인이나증상이시작된후 3일이지난소아에서원인바이러스검출에도움이될수있다 [33]. 2007년국내임상검사실을대상으로한설문조사에서호흡기바이러스검사를실시하는 31개기관중호흡기바이러스직접항원검사를실시하는기관이 58.1% 로가장많았고, RT-PCR과배양검사를실시하는기관이각각 41.9% 로 RT-PCR의이용률이배양검사와비슷함을알수있다 [7]. 그러나 RT-PCR은검사소요시간이항원검사보다길고시발체부위에염기서열변이가있을때에는위음성일수있으며, 새로운호흡기바이러스를검출할수는없으므로직접항원검사나배양검사를완전히대체할수는없다 [31]. 임상검사실에서통상검사로의도입여부를결정할때검사소요시간과수기시간이중요한요소가된다. Seeplex TM RV Detection 키트는전체검사소요시간과수기시간이각각 8시간과 90분정도로 NGEN respiratory virus analyte-specific assay (Nanogen, San Diego, CA, USA), ResPlex II assay (Genaco Biomedical Products, Inc., Huntsville, AL, USA), MultiCode-PLx respiratory virus panel (EraGen Biosciences, Madison, WI, USA), ID-Tag respiratory viral panel (Tm Bioscience Corp., Toronto, Canada) 등다른상품화된 multiplex RT-PCR 검사법들이전체검사소요시간은 4-9 시간, 수기시간은 50-70분정도인것에비해긴편이다 [4, 16, 20, 32]. 이는 PCR 증폭산물을검출하는데전통적인전기영동법을사용하기때문으로검사실로서는전기영동장치외의별도의검출장비가필요하지않다는점이장점이될수있지만, 다중시발체수가증폭산물밴드를육안으로감별할수있을정도로제한된다는점과전체검사소요시간과수기시간이길어지고전기영동밴드를주관적으로해석할위험이있다는점들은단점이될수있다. 따라서향후증폭산물을검출하는방법의개선이필요할것이다. 현재까지개발된호흡기바이러스검출을위한상품화된 RT-PCR 검사법중체외진단시약으로미국식품의약국의승인을받은제품은없고, 국내에서는 multiplex RT-PCR법을진단검사에적용하기위한기준을검토하는단계이므로향후진단시약의개발또는개선과함께이검사법들의진단적유효성과장단점비교가체계적으로이루어질필요가있다. 결론적으로 Seeplex TM RV Detection 키트는 HRV, hmpv, CoV 검출을위한신뢰할만한검사법이었고, RSV, influenza virus, adenovirus 검출의민감도도높일수있었다. 소아환자에서 HRV, hmpv, CoV 등이호흡기감염의중요한원인균으로기존의호흡기바이러스와함께이들바이러스까지검출할수있는 Seeplex TM RV Detection 키트가호흡기감염진단에유용할것으로판단하였다. 요약배경 : 임상검사실에서호흡기바이러스검사에직접항원검사와배양검사를일차적으로이용하지만, respiratory syncytial virus (RSV), influenza virus, parainfluenza virus (PIV), adenovirus 등에만국한되어있다. 본연구에서는위의전통적인호흡기바이러스뿐만아니라 rhinovirus, coronavirus, human metapneumovirus (hmpv) 의검출을위해 Seeplex TM RV Detection 키트 (Seegene, Seoul, Korea) 를사용한다중역전사중합효소연쇄반응 (multiplex reverse transcriptase-pcr, multiplex RT-PCR) 검사법의진단적유용성을평가하였다. 방법 : 2007년 1월부터 5월까지 RSV, influenza virus, PIV, adenovirus에대한직접항원검사와배양검사가음성이었던 178개의비인두흡인액을 Seeplex TM RV Detection 키트로검사하였다. Seeplex TM RV Detection 키트에서양성인증폭산물을직접염기서열분석하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI) 데이터베이스에서가장유사한염기서열을검색하였다. 환자의임상정보는전자의무기록에서조회하였다. 결과 : 47검체 (26.4%) 가양성이었으며, rhinovirus 18검체, hmpv 15검체, RSV A형 4검체, coronavirus OC43 3검체, influenza virus A형 3검체, adenovirus 2검체, coronavirus NL63 1검체, RSV B형 1검체순이었다. Rhinovirus, hmpv, coronavirus OC43의염기서열은기존보고된바이러스주와각각 94-98%, 96-99%, 98-100% 일치하였다. Seeplex TM RV Detection 키트를사용하여 multiplex RT-PCR법으로양성이었던환자들의나이는 0-11세였으며, 남녀비는 1.5:1이었다. Rhinovirus 양성이었던환자는폐렴 9명, 세기관지염 6명, 상기도염 2명, 천식의급성악화 1명이었으며, hmpv 양성이었던환자는폐렴 10명, 세기관지염 4명, 임상적패혈증 1명이었고, coronavirus 양성이었던환자는폐렴 1명, 크룹 2명, 상기도염 1명이었다. 결론 : Seeplex TM RV Detection 키트를사용한 multiplex RT-PCR법은 rhinovirus, hmpv, coronavirus 검출을위한신뢰할만한검사법이었으며, RSV, influenza virus, PIV,

116 성흥섭 박숙자 우영대외 2 인 adenovirus 등에의한호흡기감염의진단에있어서배양검사, 직접항원검사보다민감도를높일수있을것으로판단하였다. 감사의글이연구를위해 Seeplex TM RV Detection 키트를제공해주고, 염기서열분석을지원해준 ( 주 ) 씨젠에감사드립니다. 참고문헌 1. Chretien J, Holland W, Macklem P, Murray J, Woolcock A. Acute respiratory infections in children. A global public-health problem. N Engl J Med 1984;310:982-4. 2. Monto AS. Epidemiology of viral respiratory infections. Am J Med 2002;112(S):S4-12. 3. Forbes BA, Sahm DF, et al. eds. Bailey and Scott s diagnostic microbiology. 12th ed. St. Louis: Mosby Elsevier, 2007:798-813. 4. Li H, McCormac MA, Estes RW, Sefers SE, Dare RK, Chappell JD, et al. Simultaneous detection and high-throughput identification of a panel of RNA viruses causing respiratory tract infections. J Clin Microbiol 2007;45:2105-9. 5. Henrickson KJ. Cost-effective use of rapid diagnostic techniques in the treatment and prevention of viral respiratory infections. Pediatr Ann 2005;34:24-31. 6. Denny FW and Clyde WA Jr. Acute lower respiratory tract infections in nonhospitalized children. J Pediatr 1986;108:635-46. 7. Kang JO, Kim EC, Lee KM, Lee NY, Lee CK. Surveillance for respiratory virus testing situation in Korea and epidemiology for the respiratory viruses detected in 5 university hospitals. Korean J Clin Microbiol 2007;10:102-8. ( 강정옥, 김의종, 이규만, 이남용, 이창규. 국내의료기관의호흡기바이러스검사현황및 5개대학병원에서검출된호흡기바이러스역학. 대한임상미생물학회지 2007;10:102-8.) 8. Kim SH, Huh JH, Bae SY, Kim JS, Yoon SY, Lim CS, et al. Epidemiology of respiratory viral infection in 2004-2006. Korean J Lab Med 2006;26:351-7. ( 김선형, 허지훈, 배숙영, 김장수, 윤수영, 임채승등. 2004-2006년의호흡기바이러스감염의역학. 대한진단검사의학회지 2006; 26:351-7.) 9. Williams JV, Harris PA, Tollefson SJ, Halburnt-Rush LL, Pingsterhaus JM, Edwards KM, et al. Human metapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infants and children. N Engl J Med 2004;350:443-50. 10. Choi EH, Lee HJ, Kim SJ, Eun BW, Kim NH, Lee JA, et al. The association of newly identified respiratory viruses with lower respiratory tract infections in Korean children, 2000-2005. Clin Infect Dis 2006;43:585-92. 11. Papadopoulos NG, Moustaki M, Tsolia M, Bossios A, Astra E, Prezerakou A, et al. Association of rhinovirus infection with increased disease severity in acute bronchiolitis. Am J Respir Crit Care Med 2002;165:1285-9. 12. van der Hoek L, Pyrc K, Jebbink MF, Vermeulen-Oost W, Berkhout RJ, Wolthers KC, et al. Identification of a new human coronavirus. Nat Med 2004;10:368-73. 13. Forbes BA, Sahm DF, et al. eds. Bailey and Scott s diagnostic microbiology. 12th ed. St. Louis: Mosby Elsevier, 2007:718-76. 14. Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol Rev 2006;19:165-256. 15. Lam WY, Yeung AC, Tang JW, Ip M, Chan EW, Hui M, et al. Rapid multiplex nested PCR for detection of respiratory viruses. J Clin Microbiol 2007;45:3631-40. 16. Mahony J, Chong S, Merante F, Yaghoubian S, Sinha T, Lisle C, et al. Development of a respiratory virus panel test for detection of twenty human respiratory viruses by use of multiplex PCR and a fluid microbead-based assay. J Clin Microbiol 2007;45:2965-70. 17. Chun JY, Kim KJ, Hwang IT, Kim YJ, Lee DH, Lee IK, et al. Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene. Nucleic Acids Res 2007;35:e40. 18. Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3: integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief Bioinform 2004;5:150-63. 19. Tang YW and Crowe JE Jr. Respiratory syncytial virus and human metapneumovirus. In: Murray PR, Baron EJ, et al. eds. Manual of clinical microbiology. 9th ed. Washington DC: ASM Press, 2007: 1361-77. 20. Lee WM, Grindle K, Pappas T, Marshall DJ, Moser MJ, Beaty EL, et al. High-throughput, sensitive, and accurate multiplex PCR-microsphere flow cytometry system for large-scale comprehensive detection of respiratory viruses. J Clin Microbiol 2007;45:2626-34. 21. Kim SR, Ki CS, Lee NY. Rapid identification of 12 respiratory viruses with a multiplex PCR assay. Korean J Lab Med 2007;27(S):S526-7. 22. Landry ML. Rhinoviruses. In: Murray PR, Baron EJ, et al. eds. Manu-

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