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대한내분비외과학회지 : 제12권제2호 Vol. 12, No. 2, June 2012 원저 세포흡인검사에서 Peptide Nucleic Acid-Mediated PCR Clamping 법을이용한 BRAF V600E 유전자변이검사 동아대학교의과대학 1 이비인후-두경부외과학교실, 5 외과학교실, 6 병리학교실 2 영상의학과학교실, 3 내분비내과학교실, 4 핵의학교실, 홍종철 1 박헌수 1 강명구 1 이준형 2 김덕규 3 박미경 3 강도영 4 김성흔 5 홍숙희 6 김대철 6 Detection of BRAF V600E Mutation using Peptide Nucleic Acid-Mediated PCR Clamping Method in Fine Needle Aspiration Cytology Jong-Chul Hong, M.D. 1, Heon-Soo Park, M.D. 1, Myung- Koo Kang, M.D. 1, Joon-Hyung Lee, M.D. 2, Deok-Kyu Kim, M.D. 3, Mi-Kyung Park, M.D. 3, Do-Young Kang, M.D. 4, Sung-Heun Kim, M.D. 5, Sook-Hee Hong, M.D. 6 and Dae-Cheol Kim, M.D. 6 Purpose: The aim of this study was to evaluate the diagnostic value of a peptide nucleic acid (PNA)-mediated PCR clamping method for the detection of BRAF V600E mutations in fine needle aspiration cytology (FNAC). Methods: One hundred sixty four patients underwent FNAC to evaluate BRAF V600E mutations between April 2011 and November 2011. Among them, forty-two patients were diagnosed with papillary thyroid carcinoma in a permanent pathologic specimen. A PNA-mediated PCR clamping method and a Dual-Priming Oligonucleotide (DPO)-based Real-time PCR method were used to detect the BRAF V600E mutation. We compared the result of mutation between the two methods. Results: A BRAF mutation was found in 31 samples created by the PNA-mediated PCR clamping method, and in 28 samples in the DPO-based Real-time PCR method. The rate of BRAF mutation was 73.8% in association with the PNA-mediated PCR clamping method, and 66.7% in association with the DPO-based Real-time PCR method. There was no statistical differences between the two methods (P>0.05). Conclusion: The PNA-mediated PCR clamping method may be an alternative to the DPO-based Real-Time PCR method 책임저자 : 김대철, 부산시서구동대신동 3 가 -1 602-715, 동아대학교의과대학병리학교실 Tel: 051-240-2878, Fax: 051-243-7396 E-mail: freehand@dau.ac.kr 접수일 :2012 년 4 월 3 일, 수정일 :2012 년 5 월 11 일, 게재승인일 :2012 년 5 월 14 일 This study was supported by research funds from Dong-A University. for detection of BRAF mutations in thyroid nodules. (Korean J Endocrine Surg 2012;12:87-91) Key Words: Thyroid cancer, BRAF mutation 중심단어 : 갑상선암, BRAF 변이 Departments of 1 Otolaryngology-Head and Neck Surgery, 2 Radiology, 3 Endocrinology, 4 Nuclear Medicine, 5 Surgery, 6 Pathology, Dong-A University College of Medicine, Busan, Korea 서 갑상선결절은성인에서촉진으로 4 8%, 초음파로는 10 41% 까지발견되고있다. 그리고부검결과 50% 의환자에서결절이발견된다.(1) 최근에는건강검진시갑상선초음파검사의대중화로인해갑상선결절의발견율이점점높아지고있으며, 그중약 5% 에서갑상선암이발견된다. 갑상선암은국내에서매년증가하고있으며, 2009년한국국가암등록사업보고서에따르면전체암중에서위암다음으로가장많은수를차지한다. 갑상선암중유두상암이국내에서는가장흔한조직형으로전체갑상선암중약 95% 를차지한다.(2) 최근갑상선암의발생원인과연관하여다양한유전자연구가발표되고있다. 갑상선양성및악성종양에서 ras 암유전자돌연변이가약 30% 정도로발견되고있으며, 이는갑상선종양발생의초기단계에관여하는것으로보고되고있다.(3) RET/PTC 돌연변이는갑상선유두암에서약 11 40% 에서관찰되고있다.(4) 그리고 p53 종양억제유전자점돌연변이도발견되는데, 이는분화암보다는미분화암에서높은빈도로발견된다.(5) Raf kinase는세포의성장과분화그리고악성화에관여하는 Ras, mitogen-activated protein kinase kinase (MEK), mitogen activated protein kinase (MAPK)/ extracellular signal-related kinase (ERK) 신호경로의중요인자이다. Raf kinase 중 B type RAF (BRAF) 는이신호경로의가장강력한활성화체이며이유전자는염색체 7번에위치한다. BRAF V600E 은전체 BRAF 돌연변이의약 90% 정도를 론 87

88 대한내분비외과학회지 : 제 12 권제 2 호 2012 차지하는가장흔한유형이다. 이유형은 BRAF 유전자의 exon 15의 1799 nucleotide가 thymine에서 adenine으로치환되는것으로알려졌다.(6) 국내연구결과갑상선유두암에서 BRAF 유전자의돌연변이가유병률은 80 90% 정도로매우흔히발견되고, 특이도는 100% 에가까워술전진단에세침흡인검사와함께진단율을높이기위해검사의시행이점점늘어나고있다.(7,8) BRAF 검사방법도여러가지가보고되고있는데그중 Multiplex PCR법이흔하게사용되고있다. 이에저자들은최근국내에서개발된 peptide nucleic acid (PNA)-mediated PCR clamping법을이용한 BRAF 검사를이용하여 Multiplex PCR법과의결과차이와유용성에대해서알아보고자하였다. 방법 1) 대상 2011년 4월부터 2011년 11월까지갑상선결절을주소로본원외래를내원한환자중수술전초음파유도하세침흡인검사와 BRAF 유전자변이검사를했던환자 164명중본원에서수술후최종병리조직검사상유두상암으로진단받았던 42명의검체를대상으로하였다. BRAF 유전자변이검사방법은 Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법과 PNA-mediated real time PCR Clamping법을사용하여 PNA-mediated real time PCR Clamping법이 Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법의결과와차이가있는지알아보고자하였다. 이연구는본원의임상실험심사위원회의심의를통과하였으며, 모든환자에게서유전자검사동의를받았다. 2) 조직검체수집세침흡인방법을통해세포검체를얻은후 DNA를추출하였다. 3) DNA 추출방법 BRAF 돌연변이검출을위한 DNA 추출은 High Pure PCR Template Preparation Kit를사용하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) 을사용하여정량하였고, 실험전까지 -20 o C에보관하였다. 4) BRAF 유전자변이검사방법 (1) PNA-mediated real time PCR Clamping method: 갑상선결절에서채취한세침흡인검체로부터 DNA를추출한다. Real-time PCR Mixture를준비한다. PCR mixture 1, 2 각각을고루섞어준비한다. 0.2 ml PCR 튜브에검체의이름을적는다. 이때한검체당 2개의튜브가필요하다. 하나의검체를 PCR mixture 1, 2에각각넣어반응한다. 준비된 PCR mixture 1, 2를각각의튜브에 13μl 씩첨가한다. 준비된검체를 10 25 ng으로적정한후 DNase/RNase Free Water로 final volume이 7μl 가되도록준비한다. Mix된용액을부드럽게섞어준후 spin down하여각각의기기에맞는 PCR tube 혹은 PCR plate로옮긴다. 준비된 PCR tube 혹은 PCR plate를 Real-time PCR 기기에넣어증폭한다 (Fig. 1). Non PNA mix #1 반응에서검체의 Threshold Cycle (Ct) 값이 22 35 사이에서확인되면증폭반응이제대로일어난것으로확인한다. 검체의 Ct값으로부터다음과같은판정기준값을계산한다. 1) ΔCt-1 값 : Standard Ct값 (35, wild type 샘플에대한평균 Ct값 )-PNA mix #2 반응에서검체의 Ct값, 2) ΔCt-2 값 : PNA probe 유무에따른 Ct값차이 ( 돌연변이샘플인경우 PNA probe의유무에따른증폭효율의차이가없으므로 Ct값의차이가적음 ). 판정기준값을바탕으로다음과같은돌연변이판정기준에따라돌연변이유무를확인한다. 1) ΔCt-1 값 2.0 이상이면돌연변이로판정한다. 2) ΔCt-1 값이 0 2 사이인경우 ΔCt-2 값이 3 이하이면돌연변이로판정한다 (Fig. 2). (2) Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR method: 갑상선결절에서채취한세침흡인검체로부터 DNA를추출한다. BRAF V600E 돌연변이를검출하는데 Anyplex TM BRAF V600E Real time detection system (Seegene Inc., Seoul, Korea) 을사용하였다. PCR 반응액은다음과같 Fig. 1. Schematic representation of peptide nucleic acid (PNA)-mediated PCR clamping method.

홍종철외 :Peptide Nucleic Acid-Mediated PCR Clamping 법을이용한 BRAF V600E 유전자변이검사 89 Fig. 2. (A) Wild type. ΔCt-1: -2.0. (B) Mutant type. ΔCt-1: 5.77. 이준비한다. 한반응당 Amplification과 detection 시약인 10 BRAF Oligo Mix (OM) 는 2μl, 오염방지시약인 8-methoxypsoralen (8-Mop) 은 3μl, deoxynucleoside triphosphate (dntps) 가포함된 buffer와 DNA polymerase를포함하고있는시약인 2 anyplex PCR Master Mix는 10μl 씩넣는다. PCR 반응액이준비되면 5회정도고루섞어준후 0.2 ml PCR tube에 15μl 씩분주해준다. 샘플의 DNA 5μl 를각각의반응액에넣어전체부피가 20μl 가되도록준비한다. Real time PCR은 CFX96 TM Real-time PCR System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장비를사용하였으며 95 o C에서 15분간유지한후에 95 o C에서 15초, 60 o C에서 30초를 15회반복한다음다시 95 o C에서 30초, 60 o C에서 32초를 35회반복하였다. Real time PCR에서 cycle threshold (Ct) 란형광증폭이시작되는지점을뜻한다. 검체의적합성을판단하는 Ct값은항상 40 이하이며, 검체의 Ct값이 40 이하일때양성으로판정한다. 각각의반응은모두양성대조군과음성대조군을포함하고있다. 5) 통계학적분석 SPSS 15.0 프로그램 (Chicago, USA) 의 student t-test를이용하여 2가지검사의일치율을비교하였으며, P값이 0.05 이하인경우를통계학적으로유의한것으로판정하였다. 결 세침흡인세포결과를 5개의분류로구분하였다. 5개의분류법은 unsatisfactory, benign, atypia of undetermined significance (AUS), suspicious for malignancy (SFM), papillary carcinoma (PC) 이다. 총 42 검체중 unsatisfactory 검체는 1개였으며이중 1개의검체에서 PNA-mediated real time PCR Clamping법과 Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based 과 Table 1. The results of BRAF V600E mutation in PNA-mediated real time PCR clamping method and Multiplex PCR method according to fine needle aspiration cytology FNAC (N) PNA-mediated real time PCR clamping method BRAF (+) BRAF (-) Multiplex PCR method BRAF (+) BRAF (-) Unsatisfactory (1) 0 1 0 1 Benign (1) 0 1 0 1 AUS (4) 4 0 4 0 SFM (11) 6 5 4 7 PC (25) 21 4 20 5 Total (42) 31 (73.8%) 11 (26.2%) 28 (66.7%) 14 (33.3%) FNAC = fine needle aspiration cytology; AUS = atypia of undetermined significance; SFM = suspicious for malignancy; PC = papillary carcinoma. Real-Time PCR법에서모두 BRAF 돌연변이음성소견이있었다. Benign 검체는모두 1개였으며모든검체에서 BRAF 돌연변이음성소견을나타내었다. AUS 검체는 4였는데모든검체에서 PNA-mediated real time PCR Clamping법과 Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법에서양성소견을보였다. SFM 검체는 11개였다. 11개의검체중 BRAF 돌연변이양성소견을보인검체는 PNA-mediated real time PCR Clamping법에서 6개, Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법에서 4개였다. Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법에서양성을보인 4개의검체에서모두 PNA-mediated real time PCR Clamping법에서양성을나타내었지만, PNA-mediated real time PCR Clamping법에서양성을보인나머지 2개의검체에서는 Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법에서음성을나타내었다. PC 검체는 25개

90 대한내분비외과학회지 : 제 12 권제 2 호 2012 였으며, 이중 BRAF 돌연변이양성소견을보인검체는 PNA-mediated real time PCR Clamping법에서 21개, Dual- Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법에서 20개였다. Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real- Time PCR법에서양성을보인 20개의검체모두에서 PNAmediated real time PCR Clamping법에서도양성소견을보였지만, 1개의검체결과가일치하지않았다. 이실험결과 PNA-mediated real time PCR Clamping법에의한유두상암의 BRAF 유전자변이율은 73.8%, Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법에의한 BRAF 유전자변이율은 66.7% 를나타내었으며, 검사법사이의변이율차이나검사법사이의일치율은대상환자수가적어통계학적으로는유의하지않았다 (Table 1) (P>0.05). 고찰갑상선결절은성인인구에서초음파검사로약 40% 정도에서발견되는흔한질환이며, 연령이증가할수록발견율이증가한다. 결절이발견되면세포흡인검사를통해양성과악성을구분하는것이중요하며, 악성인경우에는수술로갑상선절제술을해야하지만, 양성으로판정될경우에는치료가불필요한경우가많다. 최근초음파기술의발달과함께세포흡인검사는외래에서간편하게시행할수있는검사이기때문에많이활용되고있다. 하지만초음파소견에서악성이의심되더라도세포흡인검사에서 unsatisfactory 또는 benign 또는 atypia of undetermined significance 로나오는경우임상의사에게는쉽게수술결정을못하고망설일때가많다. 우리나라의경우갑상선암이가장흔한내분비계암이며이중 95% 이상이유두상암이기때문에 (2) 최근에는갑상선암의진단율을높이기위해수술전에 BRAF 유전자돌연변이를검사하는경우가증가하고있다. BRAF 유전자돌연변이검사법은여러방법이보고되고있다. Direct DNA sequencing, PCR-RFLP, Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR, PCR-single strand conformation polymorphism 그리고 pyrosequencing법등이보고되고있다.(9) 전통적인검사법은 direct DNA sequencing 법이다. 하지만이방법은비용도비싸고결과가나오는데약 10시간정도걸린다는단점이있다. Kwak 등 (9) 은 BRAF 유전자변이검사에 direct DNA sequencing법을이용하여결과차이를비교하였는데, Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR 검사법은간단하고결과가볼수있는데 5시간도걸리지않을뿐아니라민감도와정확도에서는더좋은결과를보여주었다. 이에저자들은최근국내에서개발된 PNA-mediated real time PCR Clamping법을세포흡인검체를통해 multiplex PCR법과의차이를알아보고자하였다. 모든검체가수술후유두상암으로확진된환자였기때문에두가지방법의 specificty는 100% 가될수밖 에없었다. 하지만총 42개의검체중 PNA-mediated real time PCR Clamping법에서 31개의검체가 BRAF 유전자변이를보였고, Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법에서는 28개의검체만변이를보였다. 3개의검체에서결과차이를보였는데이는검사법간의민감도차이보다는 DNA 추출하는과정에서종양세포보다는조직구나염증세포같은정상세포가더많이포함되어 BRAF 유전자변이결과에영향을주었을경우로생각된다. 이 3개의검체를다시검사하지는않았지만종양세포가많이포함된검체에서다시 DNA를추출하여검사한다면다른결과를보일수도있을것이다. 유전자변이검출율의차이는대상검체수가적어어떤방법이더좋다고결론을내기힘들지만, PNA-mediated real time PCR Clamping법으로 BRAF 유전자변이를검사하는것도좋은방법이라고생각한다. 이방법은야생형염기서열과상보적인 PNA probe를이용한 Real time PCR 기반의기술이다. PNA는일종의인공 DNA로상보적인핵산에대한강한결합력, 높은특이성을가지고있다. PNA-mediated PCR clamping법은 PNA의이러한장점과 DNA polymerase 에대한 primer로사용될수없는점을이용하여개발되었으며, 야생형 DNA는 PNA probe에의해 PCR 증폭이억제되고, 돌연변이 DNA만선택적으로증폭됨으로써극소량의돌연변이를검출하는기술이다. 또다른장점은검사후결과를보는데 3시간 30분정도면충분하다는것이다. 수술전 BRAF 유전자돌연변이검사의장점은앞서언급이되었지만, 수술전세포흡인검사의결과가애매한경우수술을결정하는데도움을줄수있을뿐만아니라수술중동결절편검사의횟수를줄일수있어수술시간을 20 30분정도단축시킬수있을뿐만아니라환자에게도전신마취의시간을줄일수있어유용하다. 그리고고령이나전신질환으로수술을받을수없는경우표적치료제의연구및개발에도움을줄수있다. 최근흑색종에서도 BRAF 유전자변이와연관한다양한표적치료제들을개발하고있고대표적인약제군중하나가 BRAF 억제제 (BRAF Inhibitors) 이다. Sorafenib, RAF-625, XL-281 등이이에속하는데, 최근에는선택적인 BRAF 억제제들이개발되었고, 임상연구에서가장앞선약제중하나가 PXL4032이다.(10,11) PLX4032를이용한 Phase I 임상시험에서 16명의 BRAF 유전자변이흑색종환자중 14명의환자에서종양의크기가완전관해를보였고 56% 의환자에서는부분관해를보였다고한다.(12) 아직이연구는진행중이지만, 6개월간의결과만보면상당히의미있는결론을얻을것으로평가할수있겠다. 최근에는 Vemurafenib (Zelboraf) 라는약제가미국 FDA에서 BRAF 유전자변이전이성악성흑색종에서치료제로승인받아본원에서임상시험이진행중이다. 치료시작후 Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography 검사에서도상당히긍정적인결과를

홍종철외 :Peptide Nucleic Acid-Mediated PCR Clamping 법을이용한 BRAF V600E 유전자변이검사 91 얻었다고한다. 흑색종에도이러한연구가진행되어조금씩좋은결과를보여주듯이갑상선암이나특히유두상변이역형성암에서도 BRAF 유전자변이가발견되기때문에환자의무병생존율향상에도움을줄것으로기대된다. 유두상암에서 BRAF 유전자변이는임상병리학적특징이나예후인자와의관계에서관계가있다는보고도있고그렇지않다는보고도있다. Frasca 등 (13) 의연구에서는갑상선외침윤, 크기그리고림프절전이였고, Kebebew 등 (14) 의연구에서관련이있는인자는나이, 병기, 림프절전이, 국소재발, 원격전이였다. Xing 등 (15) 과 Lee 등 (16) 은변이가있는군에서없는군보다수술후재발률이유의하게차이가나는것을보고하였다. 그러나 Puxeddu 등 (17) 의연구에서는갑상선유두암에서나이, 성별, 암종의크기, 갑상선외침윤, 림프절전이그리고병기와유전자변이사이에는관련이없는것으로나타났다. 본연구에서는수술후임상병리학적특징및예후인자에대해서는조사하지않아 BRAF 유전자변이와의상관관계는알수없었지만대상환자수가더늘어나고추적관찰기간이길게되면예후와유전자변이와의관계도조사를할계획이다. 결 비록제한된환자수이지만 PNA-mediated real time PCR Clamping법은 Dual-Priming Oligonucleotide (DPO) based Real-Time PCR법과의 BRAF 유전자변이결과에서그에못지않은결과를보여주었으며, 검사법도간단하기때문에임상에서그사용이증가될것으로생각된다. 특히세포흡인검사결과가애매할경우수술여부를결정하는데중요한정보를제공해줄수있다. 하지만유전자변이와예후관계에대해서는더많은환자수를대상으로추적관찰이이루어져야할것이다. 론 REFERENCES 1) Weiss RE, Lado-Abeal J. Thyroid nodules: diagnosis and therapy. Curr Opin Oncol 2002;14:46-52. 2)Ministry for Health, Welfare and Family Affairs. Annual report of cancer incidence (2007), cancer prevalence (2007) and survival (1993-2007) in Korea. Seoul: Ministry for Health, Welfare and Family Affairs; 2009. 3) Hamacher C, Studer H, Zbaeren J, Schatz H, Derwahl M. Expression of functional stimulatory guanine nucleotide binding protein in nonfunctioning thyroid adenomas is not correlated to adenylate cyclase activity and growth of these tumors. J Clin Endocrinol Metab 1995;80:1724-32. 4) Fusco A, Grieco M, Santoro M, Berlingieri MT, Pilotti S, Pierotti MA, et al. A new oncogene in human thyroid papillary carcinomas and their lymph-nodal metastases. Nature 1987; 328:170-2. 5) Feinstein E, Gale RP, Reed J, Canaani E. Expression of the normal p53 gene induces differentiation of K562 cells. Oncogene 1992;7:1853-7. 6) Frasca F, Nucera C, Pellegriti G, Gangemi P, Attard M, Stella M, et al. BRAF(V600E) mutation and the biology of papillary thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 2008;15:191-205. 7) Kim SK, Kim DL, Han HS, Kim WS, Kim SJ, Moon WJ, et al. Pyrosequencing analysis for detection of a BRAFV600E mutation in an FNAB specimen of thyroid nodules. Diagn Mol Pathol 2008;17:118-25. 8) Lee HJ, Choi J, Hwang TS, Shong YK, Hong SJ, Gong G. Detection of BRAF mutations in thyroid nodules by allelespecific PCR using a dual priming oligonucleotide system. Am J Clin Pathol 2010;133:802-8. 9) Kwak JY, Kim EK, Kim JK, Han JH, Hong SW, Park TS, et al. Dual priming oligonucleotide-based multiplex PCR analysis for detection of BRAFV600E mutation in FNAB samples of thyroid nodules in BRAFV600E mutation-prevalent area. Head Neck 2010;32:490-8. 10) Wilhelm SM, Carter C, Tang L, Wilkie D, McNabola A, Rong H, et al. BAY 43-9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis. Cancer Res 2004;64:7099-109. 11) Sala E, Mologni L, Truffa S, Gaetano C, Bollag GE, Gambacorti-Passerini C. BRAF silencing by short hairpin RNA or chemical blockade by PLX4032 leads to different responses in melanoma and thyroid carcinoma cells. Mol Cancer Res 2008;6:751-9. 12) Flaherty KT, Hodi FS, Bastian BC. Mutation-driven drug development in melanoma. Curr Opin Oncol 2010;22:178-83. 13) Frasca F, Nucera C, Pellegriti G, Gangemi P, Attard M, Stella M, et al. BRAF(V600E) mutation and the biology of papillary thyroid cancer. Endocr Relat Cancer 2008;15:191-205. 14) Kebebew E, Weng J, Bauer J, Ranvier G, Clark OH, Duh QY, et al. The prevalence and prognostic value of BRAF mutation in thyroid cancer. Ann Surg 2007;246:466-70. 15) Xing M, Westra WH, Tufano RP, Cohen Y, Rosenbaum E, Rhoden KJ, et al. BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab 2005;90:6373-9. 16) Lee X, Gao M, Ji Y, Yu Y, Feng Y, Li Y, et al. Analysis of differential BRAF(V600E) mutational status in high aggressive papillary thyroid microcarcinoma. Ann Surg Oncol 2009;16:240-5. 17) Puxeddu E, Moretti S, Elisei R, Romei C, Pascucci R, Martinelli M, et al. BRAF(V599E) mutation is the leading genetic event in adult sporadic papillary thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab 2004;89:2414-20.