대한진단검사의학회지 : 제 22 권제 4 호 2002 Korean J Lab Med 2002; 22: 253-9 임상미생물학 Candida 균종의 Fluconazole 감수성검사를위한 Spectrophotometric Broth Microdilution법의평가 이지연 신종희 이경원 * 용동은 * 채명종 서순팔 양동욱 전남대학교의과대학진단검사의학교실, 연세대학교의과대학진단검사의학교실 * Evaluation of Spectrophotometric Broth Microdilution Method to Determine the Fluconazole MIC of the Candida Species Ji Yon Yi, M.D., Jong Hee Shin, M.D., Kyungwon Lee, M.D.,* Dongeun Yong, M.D.,* Myoung Jong Chae, M.D., Soon Pal Suh, M.D., and Dong Wook Ryang, M.D. Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School, Gwangju; Department of Laboratory Medicine,* Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background : Although the broth microdilution method has been recently established for antifungal susceptibility testing of the Candida species, there is still an argue in the interpretation of the trailing endpoint. We evaluated the spectrophotometric broth microdilution method (SBM) to determine the fluconazole MICs from five different Candida species. Methods : A total of 252 clinical isolates of five Candida species (144 C. albicans, 42 C. tropicalis, 32 C. glabrata, 28 C. parapsilosis, and 6 C. krusei) were tested for fluconazole susceptibility with the broth microdilution method. The MICs were spectrophotometrically determined at 80% (Spec-80%) and 50% (Spec-50%) decrease in absorbance as compared with growth control, respectively. The results were compared with the fluconazole MICs tested by the National Committee for the Clinical Laboratory Standards (NCCLS) macrodilution method. Results : When MICs were obtained by Spec-80%, the agreements of SBM and the NCCLS macro dilution method within two doubling dilutions were 92.4% (220/238) at 24 h and 78.6% (198/252) at 48 h for all Candida species. Using the Spec-50%, those were increased to 97.9% (233/238) at 24 h and 98.8% (249/252) at 48 h (P<0.01). Especially, for C. albicans and C. tropicalis, the agreement of the Spec-50% was significantly higher than those of the Spec-80% at 48 h; 97.9% vs. 75.0%, for C. albicans (P<0.01), and 100% vs. 57.1%, for C. tropicalis (P<0.01). Conclusions : These data suggest that the SBM using Spec-50% can provide a more precise and objective mean for fluconazole susceptibility testing, especially for C. albicans and C. tropicalis. (Korean J Lab Med 2002; 22: 253-9) Key words : Spectrophotometric microdilution method, Fluconazole, Candida, Antifungal susceptibility testing, Candida albicans 접수 : 2002년 7월 15일접수번호 : KJCP1593 수정본접수 : 2002년 8월 23일교신저자 : 신종희우 501-757 광주광역시동구학동 8 전남대학교병원진단검사의학과전화 : 062-220-5342, Fax: 062-224-2518 E-mail : shinjh@chonnam.ac.kr 서론항진균제감수성검사를위한 broth microdilution법은 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) M27- T법에포함되어있는데, NCCLS broth macrodilution법과높은 253
254 이지연 산종희 이경원외 4 인 일치율을보이며사용이매우간편하다 [1-3]. 그러나이를이용한칸디다균주의 fluconazole 감수성검사는일부칸디다균주가 RPMI 배지에서잘자라지않거나끌림 (trailing) 효과를보이는등으로인해최소억제농도 (minimal inhibitory concentration, 이하 MIC) 결과에있어재현성이문제가되고있다 [3-8]. 또한 MIC를 48시간배양후육안관찰에의해성장대조 well에비해균성장이현저히감소된지점 (score 2 이하 ) 으로판정하도록하고있어 [2], 주관적오류의위험이있다 [5, 6, 8]. 최근이와같은 microdilution법에의한항진균제감수성검사를시행한후분광광도계 (spectrophotometer) 를이용하여객관적으로 MIC를판정하고자동화하려는 spectrophotometric broth microdilution (SBM) 법이시도되고있다 [5, 6, 9-12]. 저자들은임상검체에서분리된 5종의칸디다균주들의 fluconazole 감수성검사를 SBM법으로시행하였다. Fluconazole MIC는약제가들어있지않은성장대조균액에비해흡광도가 80% 또는 50% 감소한지점으로각각판정하였고, 이를 NCCLS broth macrodilution법결과와각각비교하였다. 대상및방법 1. 대상균주전남대학교병원및연세대학교세브란스병원에내원한환자에서분리된 5종의칸디다 252주 ( 전남대 195주, 연세대 57주 ) 를대상으로하였다. 균종별대상균주는 Candida albicans 144주, Candida tropicalis 42주, Candida glabrata 32주, Candida parapsilosis 28주및 Candida krusei 6주이었다. 또각검사의정도관리를위해 5주의 ATCC 표준균주 (C. albicans ATCC 90028, C. glabrata ATCC 90030, C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258 및 C. albicans ATCC 64550) 를이용하였다. 균주들은혈액한천배지나 Sabouraud dextrose agar (SDA) 에 계대배양시킨후발아관시험, API 20C (biomerieux, Marcy l'eltoile, France) 와 ATB 32C system (biomerieux) 검사성 적및 cornmeal agar와 CHROMagar Candida (BBL, Cockeysville, Maryland, USA) 에서의형태관찰등을이용하여동정하였다. 분리된균주들은 20% skim milk 배지 (Becton Dickinson, Sparks, Md, USA) 에넣어 -70 에보관하였다. 2. NCCLS broth microdilution법 NCCLS M27 방법에의하여 0.165 M MOPS (3-N-morpholinopropanesulfonic acid) 가들어있는 RPMI 1640 (RPMI- MOPS) 배지를이용하여시행하였다 [1, 2]. Fluconazole (Diflucan, 한국화이자, Korea) 은 RPMI-MOPS 배지를이용하여각각 64-0.125 g/ml가되도록배수희석하여 10개의농도.... 로만들어 96 microwell plate (Nunclon, Nalge Nunc International, Roskilde, Denmark) 에 1번에서 10번 well까지각 well당 100 L씩분주하였다. 균주는 SDA 평판배지에 35, 24시간배양후 0.85% 식염수에균을풀어잘섞은후 0.5 McFarland 탁도 (spectrophotometer, 530 nm) 로맞추어균농도가약 1-5 10 6 CFU/mL가되도록하였다. 이균액을다시 RPMI-MOPS 배지를이용하여 1:1,000으로희석하였고, 1번에서 10번 well까지각각 100 L ( 최종균농도, 0.5-2.5 10 3 CFU/mL) 씩을분주하였다. 11번 well은성장대조 well로서균액 100 L와 fluconazole이들어있지않은 RPMI-MOPS 배지 100 L를, 12 번 well은배지의대조 well로서 RPMI-MOPS 배지 200 L만을분주하였다. 균접종이끝난 microplate는 35 에서 24시간및 48시간동안배양하였다. 결과판정은 24시간및 48시간배양후 microplate를꺼내어 shaker에서 5분동안잘혼합한후, 분광광도계 (VERSAmax Tunable Microplate Reader; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, Calif., USA) 로 405 nm에서흡광도를측정하였다. MIC 판정은성장대조 well에비해흡광도가 80% 또는 50% 이상억제된최소항진균제농도 ( 각각 Spec-80% 및 Spec-50%) 를기준으로판정하였다 [2, 13]. 이때검사자에의한오차를방지하기위하여두사람의관찰자가맹검으로판정하였다 [3]. 3. NCCLS broth macrodilution법 NCCLS broth macrodilution법은 NCCLS M27 방법에따라최종균농도는 0.5-2.5 10 3 CFU/mL로서시험관내검사량이 1 ml가되도록하여 35 에48시간동안배양하여실시하였다. MIC 판정은 48시간배양후성장대조시험관을 1:5로희석하여 1 번부터 10번시험관까지비교하며 80% 억제된희석배수까지로판정하였다 [1, 2]. 4. 통계처리각군간의통계적유의성은 Student t test 및 2 test를이용하여검정하였고, P<0.05 인경우유의한것으로간주하였다. 결과 1. 칸디다 ATCC 표준균주의 fluconazole MIC 결과정도관리범위가알려진칸디다 4종의표준균주를대상으로 fluconazole 감수성검사를 SBM법에의해 Spec-80% 혹은 Spec-50% 의기준으로 MIC를판정한결과, 48시간배양후의 MIC는모두정도관리허용범위에속하였다. 그러나 24시간배양후의 MIC는 Spec-80% 를기준으로했을때는한가지표준균
Spectrophotometric Microdilution 법을이용한 Fluconazole 감수성검사 255 Table 1. Fluconazole MICs of Candida control ATCC strains ATCC strain Incubation time (h) *Spectrophotometric reading. Abbreviation: NA, not available. Fluconazole MICs ( g/ml) Microdilution* Q.C. range Macrodilution Spec- Spec- 80% 50% C. albicans 24 0.5 0.5 ATCC 90028 48 0.25-1 0.5 0.5 0.5 C. glabrata 24 4 4 ATCC 90030 48 8.0-32 8.0 16 8 C. parapsilosis 24 2 1 ATCC 22019 48 2.0-8 4.0 2 2 C. krusei 24 16 8 ATCC 6258 48 16-64 32 32 32 C. albicans 24 16 16 ATCC 64550 48 NA 32 32 32 주 (C. glabrata ATCC 90030) 가, 그리고 Spec-50% 를기준으로했을때는 3가지표준균주 (C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei) 가각각정도관리허용범위에서한단계씩낮은 MIC를보였다. 한편 fluconazole 내성균주인 C. albicans ATCC 64550의경우현재정도관리용허용범위는알려진바없으나, 본실험에서 Spec-80% 혹은 Spec-50% 로판정한 24시간및 48시간배양방법모두에서 MIC가 16-32 g/ml 사이로 NCCLS macrodilution법과 유사한결과를보였다 (Table 1). 2. Broth macrodilution법과 microdilution법의일치율 Microdilution법에의한 fluconazole MIC를 Spec-80% 및 Spec-50% 를기준으로판정하여이를각각 NCCLS macrodilution법의결과와비교하여일치율을분석하였다 (Table 2). 48시간배양후에는전체 252주모두가성장을보여판독이가능하였으나, 24시간배양후에는 14주 (5.6%) 가자라지않아 24시간배양후의결과는 238주에서만알수있었다. 24시간배양후까지자라지않은균주를균종별로보면 C. albicans 5주, C. tropicalis 2주, C. glabrata 5주및 C. parapsilosis 2주가이에속하였다. 전체 252주를대상으로 microdilution법에의한 fluconazole 감수성검사를 Spec-80% 를기준으로판정하였을때, NCCLS macrodilution법과의 2배희석배수내일치율은 24시간과 48시간배양후각각 92.4% (220/238) 와 78.6% (198/252) 이었고, Spec-50% 를기준으로판정한결과는 24시간과 48시간배양후각각 97.9% (233/238) 와 98.8% (249/252) 로서 macrodilution 법과의일치율은 Spec-80% 기준인경우보다의의있게더증가하였다 (P<0.01). 각균종별로살펴보면, Spec-80% 를기준으로판정하였을때 C. albicans의경우 24시간과 48시간배양후 NCCLS macrodilution법과의일치율은각각 91.4% (127/139) 와 75.0% (108/ Table 2. Distribution of difference and agreement of the MICs determined by the NCCLS macrodilution reference method and microdilution method for five Candida species isolates Species (No. of isolates) Method of endpoint determination Reading time (h) No. of isolates with MICs* of >-2-2 -1 0 +1 +2 >+2 C. albicans (144) Spec-80% 24 2 4 30 69 17 7 10 91.4 48 1 2 12 66 22 6 35 75.0 Spec-50% 24 0 16 56 63 4 0 0 100 48 0 13 45 75 8 0 3 97.9 C. tropicalis (42) Spec-80% 24 1 2 13 12 4 3 5 85.0 48 0 0 3 7 10 4 18 57.1 Spec-50% 24 2 10 17 11 0 0 0 95.0 48 0 0 7 31 4 0 0 100 C. glabrata (32) Spec-80% 24 0 3 15 9 0 0 0 100 48 0 0 5 21 5 1 0 100 Spec-50% 24 2 4 19 2 0 0 0 92.6 48 0 3 15 14 0 0 0 100 C. parapsilosis (28) Spec-80% 24 0 3 11 11 1 0 0 100 48 0 0 3 23 2 0 0 100 Spec-50% 24 1 8 5 6 6 0 0 96.2 48 0 2 10 16 0 0 0 100 C. krusei (6) Spec-80% 24 0 4 1 1 0 0 0 100 48 0 0 1 0 0 0 100 Spec-50% 24 0 4 2 0 0 0 0 100 48 0 0 4 2 0 0 0 100 *Spectrophotometric MICs different from macrodilution method MICs by number of log dilutions; EA of MIC results of the two methods is defined as exact agreement or agreement within two fold dilutions; Five C. albicans, two C. tropicalis, five C. glabrata and two C. parapsilosis isolates were not grown after 24 h-incubation; P<0.01, Spec-80% versus Spec-50% at each incubation time within a given Candida species. EA (%)
256 이지연 산종희 이경원외 4 인 Table 3. Comparison of fluconazole MICs determined by spectrophotometric microdilution method with those obtained by NCCLS macrodilution method for five different Candida species Candida species (No. of isolates) MIC method Reading time (h) No. of isolates with MICs ( g/ml) <4 4-8 16-32 64 C. albicans (144) Macrodilution 48 143 0 1 0 Microdilution Spec-80% 24* 131 0 2 6 48 121 1 3 19 Spec-50% 24* 138 1 0 0 48 141 0 2 1 C. tropicalis (42) Macrodilution 48 42 0 0 0 Microdilution Spec-80% 24* 36 0 1 3 48 26 1 2 13 Spec-50% 24* 40 0 0 0 48 42 0 0 0 C. glabrata (32) Marodilution 48 1 24 7 0 Microdilution Spec-80% 24* 2 20 5 0 48 1 22 9 0 Spec-50% 24* 2 20 5 0 48 1 26 5 0 C. parapsilosis (28) Macrodilution 48 28 0 0 0 Microdilution Spec-80% 24* 26 0 0 0 48 28 0 0 0 Spec-50% 24* 26 0 0 0 48 28 0 0 0 C. krusei (6) Macrodilution 48 0 0 2 4 Microdilution Spec-80% 24 0 0 4 2 48 0 0 0 6 Spec-50% 24 0 0 5 1 48 0 0 3 3 *Five C. albicans, two C. tropicalis, five C. glabrata, and two C. parapsilosis isolates were not grown after 24 h-incubation. 144) 이었는데, Spec-50% 를기준으로판정한결과각각 100% (139/139) 와 97.9% (141/144) 로서 Spec-80% 기준인경우보다일치율이더증가하였다 (P<0.01). C. tropicalis의경우는 Spec- 80% 를기준으로판정하였을때 24시간과 48시간배양후 NCCLS macrodilution법과의일치율이각각 85.0% (34/40) 및 57.1% (24/42) 이었는데, Spec-50% 를기준으로판정하였을때는각각 95.0% (38/40) 및 100% (42/42) 로서 C. albicans 균주와마찬가지로 Spec-50% 를기준으로할때일치율이더높았다 (P<0.01). 한편 C. glabrata, C. parapsilosis, 그리고 C. krusei 의경우는 Spec-80% 를기준으로판정하였을때의일치율은 24 시간과 48시간배양후모두 100% 이었고, Spec-50% 의경우는 C. glabrata와 C. parapsilosis의 24시간배양 ( 각각 92.9% 및 96.2%) 을제외하고는모두 100% 이었다 (Table 2). 3. Spec-80% 및 Spec-50% 를기준으로한 MIC 성적비교 NCCLS macrodilution법에의한칸디다 252주의 fluconazole MIC 분포는균종간에차이를보였다. C. albicans (144주), C. tropicalis (42주) 및 C. parapsilosis (28주) 의경우연세대의 C. albicans 1주 (16 g/ml) 를제외하고는모두 MIC가 4 g/ml 이하이었다. 한편 C. glabrata는 1주를제외하고는 31주가 MIC 4 g/ml 이상이었고, C. krusei는 6주모두가 MIC 16-64 g/ ml이었다 (Table 3). C. albicans의경우 NCCLS macrodilution법으로검사했을때 MIC가 16 g/ml 이상인균주는 144주중 1주뿐이었는데, microdilution법의결과를 Spec-80% 로판정했을때는 24시간과 48시간배양후각각 5.8% (8/139) 및 15.3% (22/144) 이었다. 그러나 Spec-50% 로판정했을때 MIC가 16 g/ml 이상인 C. albicans 균주는 24시간과 48시간배양후각각 0% (0/139) 및 2.1% (3/144) 로서 Spec-80% 로판정한경우보다감소하였다. C. tropicalis 42주를 24시간과 48시간배양후 Spec-80% 로판정했을때 MIC가 16 g/ml 이상인균주는각각 4주및 15주이었는데, 이를 Spec-50% 로판정했을때는 24시간과 48시간배양후 MIC가 16 g/ml 이상인균주는 1주도없었으며이는 NCCLS macrodilution법의결과와일치하였다. C. glabrata 32주중 31주의 fluconazole MIC는 NCCLS macrodilution법에의해 4-32 g/ml 사이이었는데, 48시간배양후 Spec-80% 및 Spec-50% 로판정한결과도 31주의 MIC가 4-32 g/ml이었다. 24시간배양후에는 C. glabrata 중5주는잘자라지않았고, Spec-80% 및 Spec-50% 로판정한결과는서로동일하여 2주를제외한 25주의 MIC가 4-32 g/ml이었다.
Spectrophotometric Microdilution 법을이용한 Fluconazole 감수성검사 257 C. parapsilosis의경우 Spec-80% 와 Spec-50% 로판정한 MIC 는 28주모두가 24시간과 48시간배양후 4 g/ml 이하로서 NCCLS macrodilution 법에의한결과와일치하였다. C. krusei 의경우 Spec-80% 와 Spec-50% 로판정한 MIC는 6주모두가 16 g/ml 이상이었고, 이는 NCCLS macrodilution법의결과와동일하였다. 고찰 SBM법을이용한 fluconazole 감수성검사는시행과판독이용이하며재현성이높은방법으로평가되고있다 [10]. 그러나칸디다는균종별로배지내성장력이나성장속도에차이가있을수있어서모든칸디다균종에동일한 MIC 판정기준을적용할수있는지에대해서는연구가필요하다. 저자들은임상검체에서분리된 5종의칸디다균주를대상으로 SBM법을이용한 fluconazole 감수성검사를시행한후 MIC를각각흡광도가 80% 및 50% 감소된지점 ( 각각 Spec-80% 및 Spec-50%) 으로판정하고, 이를 NCCLS broth macrodilution법결과와비교해보았다. 본연구에서는칸디다 ATCC 표준균주들을대상으로 SBM법으로 fluconazole 감수성검사를시행하였는데, 그결과 48시간배양성적은모두정도관리허용범위에속하였다. 그러나일부균종 (C. glabrata, C. parapsilosis 및 C. krusei) 에서 24시간배양후의성적은정도관리허용범위보다더낮은 MIC를나타내었다. Pfaller 등 [10] 도본성적과유사하게칸디다 ATCC 표준균주 5주를대상으로 SBM법으로 fluconazole 감수성시험을한결과, 24시간배양후의성적은정도관리허용범위보다더낮은 MIC를나타내었고, 48시간배양성적은모두정도관리허용범위에속하였다고보고하였다. 한편본연구결과중 C. albicans ATCC 90058 균주는 24시간과 48시간배양후의 MIC는 Spec- 80% 와 Spec-50% 판정모두에서정도관리허용범위에속하였고, C. albicans ATCC 64550 균주는정도관리허용범위는알려진바없으나 Spec-80% 혹은 Spec-50% 로판정했을때 MIC는 16-32 g/ml 사이로서 NCCLS macrodilution법과유사한결과를보였다. Polanco 등 [16] 은 C. albicans ATCC 표준균주 4 주에대해 SBM법으로 fluconazole 감수성검사를시행하고그결과를 Spec-50% 를기준으로판정했을때모든균주에서 NCCLS macrodilution법과 2배희석배수내에서일치하였다고보고한바있다. 본연구결과 SBM법에의한 fluonazole 감수성검사의 NCCLS macrodilution법과의일치율은 MIC 판정방법에따라달라짐을알수있었다. 전체균주에대한 fluconazole 검사를 Spec-80% 를기준으로판정하였을때 macrodilution법과의일치율은 24시간과 48시간배양후각각 92.4% 와 78.6% 이었고, Spec-50% 를기준으로판정한결과는 24시간과 48시간배양후각각 97.9% 와 98.8% 로서일치율이의의있게증가하였다. 이는 fluconazole을비롯한 azole계약제의경우대부분 Spec-50% 룰기준으로할때 MIC 판정결과가더정확하였고, NCCLS 표준법과의일치율도높다고하였던다른연구자들의보고 [10-12, 15] 와일치하였다. Spec-80% 결과가 NCCLS macrodilution법과의일치율이높지못한이유에대해 Rodriguez-Tudela와 Martinez-Suarez[5] 는일부칸디다균주들이 RPMI 배지내에서잘성장하지못해서성장대조 well에서의균증식이충분하지못하고, 또일부균주에서는끌림효과를보일수있기때문으로해석하였다. 본연구에서는칸디다의균종에따라 microdilution법과 NCCLS macrodilution법의일치율이차이가있음이관찰되었다. 즉, C. parapsilosis, C. glabrata와 C. krusei 균주의경우 Spec- 80% 혹은 Spec-50% 를기준으로 MIC를판정했을때, microdilution법과 macrodilution법의일치율은 48시간배양모두에서 100% 이었다. 그러나 C. albicans와 C. tropicalis의경우는 48시간배양후 Spec-80% 기준으로 MIC를판정했을때 macrodilution법과의일치율은각각 75.0% 및 57.1% 로매우낮았지만, Spec-50% 를기준으로판정했을때는일치율이 97.9% 및 100% 로서 Spec-80% 에비해증가함을알수있었다. 따라서 NCCLS 법의권장대로 fluconazole 감수성검사를 microdilution법으로실시하고 48시간배양후 MIC를판정할경우 C. parapsilosis, C. glabrata와 C. krusei 균주는 Spec-80% 혹은 Spec-50% 기준간에큰차이를나타내지않는반면, C. albicans와 C. tropicalis의경우는 Spec-80% 보다는 Spec-50% 로판정하는것이더적합하리라생각되었다. C. albicans와 C. tropicalis 균종의경우 Spec-80% 로판정한 MIC가 64 g/ml 이상인균주는 24시간배양후각각 6주및 3주이었는데, 48시간배양후에는 19주와 13주로각각증가하였고이는끌림효과에의한것으로생각되었다. 끌림효과는 fluconazole 등 azole계약제의 fungistatic activity로인해시험관내약제농도가계속증가해도균의증식이부분적으로계속관찰되는현상으로서 [3, 4], 이효과를보이는균주들은대개 fluconazole 감수성검사상 24시간배양후감수성을보이나 48시간후엔 MIC가 64 g/ml 이상으로증가되므로 NCCLS의권장대로 48시간후판정하게되면 fluconazole 내성으로잘못판정될수있다 [4, 7]. Torantore 등 [17] 은끌림효과를줄이기위해서는 24시간배양후판독하는것이좋다고하였으나, 일부균주는 24시간동안배양했을때충분히증식되지않을수있으므로이것만으로는끌림효과문제를해결할수는없다 [18]. 본연구에서도 RPMI 배지에서 24시간배양후증식하지못한균주가 14 주 (5.5%) 있었다. Revankar 등 [4] 은끌림효과를보이는균주들을대상으로 8 g/ml 및 16 g/ml의 fluconazole이포함된한천희석법으로검사하였는데, 그결과 MIC가모두 8 g/ ml 미만인감수성균주임을확인하였다. 본연구에서도 Spec- 80% 로판정했을때 MIC가 8 g/ml 이상으로끌림효과를보였던 C. albicans와 C. tropicalis 균주는 NCCLS macrodilution
258 이지연 산종희 이경원외 4 인 법을이용하여감수성균주로판정될수있었고, 이결과가 Spec- 50% 의결과와 2주를제외하고는거의일치함을확인하였다. 결론적으로 SBM법을이용하여 fluconazole 감수성검사를했을때특히C. albicans와 C. tropicalis 균주들은 Spec-80% 보다는 Spec-50% 를기준으로판정하는것이합당하리라생각되며, 높은 fluconazole MIC를보이는균주들은 macrodilution법등의다른방법으로확인검사가필요하리라사료되었다. 요약배경 : Broth microdilution법에의한 fluconazole 감수성검사는사용이간편하나, 일부칸디다균주에서최소억제농도 (MIC) 판정에있어재현성이문제되고있다. 저자들은 5가지칸디다균종을대상으로 fluconazole 감수성검사를 spectrophotometric broth microdilution (SBM) 법으로실시한후두가지기준으로 MIC를판정하고비교하여보았다. 방법 : 임상검체에서분리된 252주 (Candida albicans 144주, C. tropicalis 42주, C. glabrata 32주, C. parapsilosis 28주및 C. krusei 6주 ) 의 5가지 Candida 균종을대상으로하였다. 각균주는 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) broth macrodilution법및 SBM법으로동시에 fluconazole 감수성검사를실시하였다. SBM법의 fluconazole MIC 판정은분광광도계 (spectrophotometer) 로흡광도를측정하여성장대조에비해 80% 및 50% 이상억제된항진균제의최소농도 (Spec-80% 및 Spec-50%) 로각각판정하였다. 결과 : SBM법에의한 fluconazole 감수성검사를 Spec-80% 를기준으로판정하였을때, 전체균주의 NCCLS macrodilution 법과의 2배희석배수내일치율은 24시간과 48시간배양후각각 92.4% (220/238) 와 78.6% (198/252) 이었고, Spec-50% 를기준으로판정했을때는각각 97.9% (233/238) 와 98.8% (249/ 252) 로서일치율이더증가하였다 (P<0.01). 특히 C. albicans의경우다른칸디다균종에비해 48시간배양후 NCCLS macrodilution법과의일치율은 Spec-50% (97.9%) 를기준으로판정했을때 Spec 80% (75.0%) 에비해증가하였고 (P<0.01), C. tropicalis 의경우도 57.1% 에서 100% 로증가하였다 (P<0.01). 결론 : SBM법을이용하여칸디다의 fluconazole 감수성검사를시행함에있어특히 C. albicans와 C. tropicalis 경우 Spec- 50% 를기준으로 MIC를판정하는것이 Spec-80% 에비해더정확한방법으로생각되었다. 참고문헌 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Proposed standard M27-T. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 1995. 2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard M27-A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 1997. 3. Rex JH, Pfaller MA, Rinaldi MG, Polak A, Galgiani JN. Antifungal susceptibility testing. Clin Microbiol Rev 1993; 6: 367-81. 4. Revankar SG, Kirkpatrick WR, McAtee RK, Fothergill AW, Redding SW, Rinaldi MG, et al. Interpretation of trailing endpoints in antifungal susceptibility testing by the National Committee for Clinical Laboratory Standards method. J Clin Microbiol 1998; 36: 153-6. 5. Rodriguez-Tudela JL and Martinez-Suarez JV. Defining conditions for microbroth antifungal susceptibility tests: influence of RPMI and RPMI-2% glucose on the selection of endpoint criteria. J Antimicrob Chemother 1995; 35: 739-49. 6. Rodriguez-Tudela JL, Berenguer J, Martinez-Suarez JV, Sanchez R. Comparison of a spectrophotometric microdilution method with RPMI- 2% glucose with the National Committee for Clinical Laboratory Standards reference macrodilution method M27-P for in vitro susceptibility testing of amphotericin B, flucytosine, and fluconazole against Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 1998-2003. 7. Tortorano AM, Viviani MA, Barchiesi F, Arzeni D, Rigoni AL, Cogliati M, et al. Comparison of three methods for testing azole susceptibilities of Candida albicans strains isolated sequentially from oral cavities of AIDS patients. J Clin Microbiol 1998; 36: 1578-83. 8. Cuenca-Estrella M and Rodriguez-Tudela JL. Present status of the detection of antifungal resistance: the perspective from both sides of the ocean. Clin Microbiol Infect 2001; 7(Suppl 2): 46-53. 9. Odds FC, Vranckx L, Woestenborghs F. Antifungal susceptibility testing of yeasts: evaluation of technical variables for test automation. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2051-60. 10. Pfaller MA, Messer SA, Coffmann S. Comparison of visual and spectrophotometric methods of MIC endpoint determinations by using broth microdilution methods to test five antifungal agents, including the new triazole D0870. J Clin Microbiol 1995; 33: 1094-7. 11. Nguyen MH and Yu CY. Influence of incubation time, inoculum size, and glucose concentrations on spectrophotometric endpoint determinations for amphotericin B, fluconazole, and itraconazole. J Clin Microbiol 1999; 37: 141-5. 12. Espinel-Ingroff A, Rodriguez-Tudela JL, Martinez-Suarez JV. Comparison of two alternative microdilution procedures with the National Committee for Clinical Laboratory Standards reference macrodilution method M27-P for in vitro testing of fluconazole-resistant and -susceptible isolates of Candida albicans. J Clin Microbiol 1995; 33: 3154-8. 13. Ruhnke M, Schmidt-Westhausen A, Engelmann E, Trautmann M.
Spectrophotometric Microdilution 법을이용한 Fluconazole 감수성검사 259 Comparative evaluation of three antifungal susceptibility test methods for Candida albicans isolates and correlation with response to fluconazole therapy. J Clin Microbiol 1996; 34: 3208-11. 14. 신종희, 김민, 김종필, 서순팔, 양동욱. 한천희석법을이용한 Candida Species의 Fluconazole 내성선별. 대한화학요법학회지 1999; 17: 199-210. 15. Espinel-Ingroff A, Kish CW Jr, Kerkering TM, Fromtling RA, Bartizal K, Galgiani JN, et al. Collaborative comparison of broth macrodilution and microdilution antifungal susceptibility tests. J Clin Microbiol 1992; 30: 3138-45. 16. Polanco AM, Rodriguez-Tudela JL, Baquero F, Sanchez-Sousa A, Martinez-Suarez JV. Improved method of determining the susceptibility of Candida albicans to fluconazole. J Antimicrob Chemother 1995; 35: 155-9. 17. Tornatore MA. Noskin GA, Hacek DM, Obias AA, Peterson LR. Effects of incubation time and buffer concentration on in vitro activities of antifungal agents against Candida albicans. J Clin Microbiol 1997; 35: 1473-6. 18. Rodriguez-Tudela JL and Martinez-Suarez JV. Improved medium for fluconazole susceptibility testing of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 45-8.