ISSN (print) 1226-8496 ISSN (online) 2288-3819 http://dx.doi.org/10.5933/jkapd.2015.42.1.10 Detection of Streptococcus mutans in Saliva using Monoclonal Antibodies Minjeong Lee, Daewoo Lee, Miah Kim, Kyungyeol Lee, Byeongju Baik, Yeonmi Yang, Jaegon Kim Department of Pediatric Dentistry and Institute of Oral Bioscience, School of Dentistry, Chonbuk National University Abstract The purpose of this study was to determine the usefulness of a detection method for Streptococcus mutans in saliva with monoclonal antibodies developed targeting Ag I/II and glucosyltransferases (gtf B, gtf C and gtf D) in Streptococcus mutans. In the three groups tested (adults, minors, and minors under orthodontic treatment), the results of the DMFT scores, the colony density (CFU/mL) in their saliva was measured using Dentocult -SM strip mutans, polymerase chain reaction was performed to test whether Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus were present, and Streptococcus mutans detecting tests performed in their saliva using four types of monoclonal antibody were collected. In conclusion, it was demonstrated that the Streptococcus mutants plays more important role in forming dental caries compared to Streptococcus sobrinus, and that the monoclonal antibodies against glucosyltransferases (gtf B, gtf C, gtf D) and Ag I/II of Streptococcus mutans are superior in detecting Streptococcus mutans to Dentocult -SM strip mutans or polymerase chain reaction. Key words : Monoclonal antibody, Streptococcus mutans, Glucosyltransferase B,C,D, Ag I/II Ⅰ. 서론치아우식증은구강건강과관련하여전세계적으로문제가되고있는구강질환으로서세계보건기구 (WHO) 의보고에따르면치아우식증은세계인구의약 60% 에서발병하는것으로보고되었다 1). 우리나라의경우 2012년국민구강건강실태조사자료를분석한결과, 치아우식경험지수 (DMFT ; Decayed, Missing, and Filled teeth) 가점차감소되어가는추세이나여전히치아우식증은구강건강을위협하는대표적인질환이다 2). Keyes와 Jordan 3) 은치아우식증의발생요인을세균, 당분, 숙주인자로구분하여이들이모두관여하여중복될때우식이발생한다고설명하였다. 그후우식이만성질환인점을감안하여이들에제4의인자인시간을포함시켰고, 지속적인연구를 통해치아우식증의병인으로환경적여러요인들이고려되면서우식병인론의또다른모델이제시되고있다 4). 이와같이다양한인자들이관여하는치아우식증의일차적원인은치면세균막내에존재하는세균으로알려져있으며, 실제구강에서치태를이루는세균들이존재하지않는다면우식은발생하지않는다 5). 치아우식증은치면세균막내에존재하는세균들의당질대사산물인젖산등의유기산에의해치아의법랑질이탈회되면서발생하는데, 이러한세균들로는 Streptococcus mutans (S. mutans) 와 Streptococcus sobrinus (S. sobrinus) 를포함하는 mutans streptococci가있으며, 그중 S. mutans가우식병소를유발하는가장주요한세균이라는것이밝혀졌다 6). 치아우식증의발병론은 3가지단계가제시되고있는데, 그 Corresponding author : Jaegon Kim Department of Pediatric Dentistry and Institute of Oral Bioscience, School of Dentistry, Chonbuk National University, 567, Barkje-daero, Deokjin-gu, Jeonju-si, Jeollabuk-do, 561-712, Korea Tel: +82-63-250-2223 / Fax: +82-63-250-2223 / E-mail: pedokjg@chonbuk.ac.kr Received September 2, 2014 / Revised November 24, 2014 / Accepted November 24, 2014 이논문은전북대학교병원의생명연구원의학술연구비지원에의하여연구되었음. 10
첫단계는 sucrose-독립단계로 S. mutans는 S. mutans의표면항원단백질인 Ag I/II에의해치면세균막에부착한다. 두번째단계는 sucrose-종속단계로섭취된 sucrose를이용하여 S. mutans가생성하는 glucosyltransferase (gtfs) 에의해접착성이강한 glucan이형성되어 glycocalyx가만들어지고, 세균의 glucan binding proteins (GBP) 에의해다른세균들과집락을이루어, 치아표면에붙는 S. mutans의수가점점증가한다. 세번째단계로축적된치태내세균이산을생성하고, 유리된산이치아를탈회시켜치아우식증을야기하게된다 7). 이중세균이치면에부착하는것은치아우식증이발생하는첫번째단계로이모든일련의과정이시작되는가장중요한단계라할수있다. 따라서 S. mutans의독성인자를대상항원으로한연구가많이진행중이며, 특히세균의부착에관여하는단백질인 Ag I/Ⅱ, gtfs, GBP에집중하여, 최근실제로이것을이용해우식예방에효과를거둔연구들이발표되고있다 8). 이연구에서는 S. mutans의표면에발현되어독성을나타내는 Ag I/II 단백질과 S. mutans가생성하여치태를만드는 gtfs에대하여개발된단일클론항체들을가지고, 이들을타액에적용했을때단일클론항체들이 S. mutans를검출해내는능력을확인하고자, DMFT와 Dentocult -SM strip mutans를이용한 colony density, 그리고 polymerase chain reaction (PCR) 등을조사하여비교하였다. Ⅱ. 연구재료및방법본연구는전북대학교병원의임상연구윤리위원회 (Institutional Review Board, IRB) 의지침에따라수립하였으며, 심의절차과정을통과하였다 (IRB번호 : 2011-07-025-001). 1. 조사대상이연구는 S. mutans와치아우식간의유의적연관성에대해알아보고자세군을대상으로시행되었다. 성인과미성년자의차이를평가하기위해각각을다른군으로나누어실험대상자로설정하였으며, 교정치료유무에따른차이를알아보기위해교정치료중인미성년자한군을더하여최종실험대상자를세군으로설정하였다. 미성년자인실험대상자들은실험결과의안정성과 DMFT를얻기위해만 10세이상만실험에참여하였다. 1군은전북대학교치과병원소아치과에서교정치료중인환자들중, 특별한의과적병력이없는만 10세이상의교정환자 31명 ( 만 13.5세, 남녀 16 : 15), 2군는특별한의과적및치과적병력이없는만 10세이상의전주시초등학교 5학년학생 25명 ( 만 10.2세, 남녀 11 : 14), 그리고 3군은특별한의과적병력이없는 20~30대성인 41명 ( 만 28.4세, 남녀 25 : 16) 을대상으로하였다. 이연구를위해총 97명의피실험자가참여하였다. 연구대상자들은구강검사전에식사를한후칫솔질을하지 않고실험에참여하였다. 동일한검사자에의한구강검사후, 우식경험치아수가기록되었고, 파라핀왁스를사용하여자극성타액을 10~15 ml씩채취하였으며, 채취된타액은검사시작전까지 -20 에보관하였다. 실험대상자에게실험의목적과방법을상세하게설명하고동의를얻었으며, 대상자가미성년자인경우에는보호자에게도동의를얻은후연구를진행하였다. 2. 조사방법 1) 치아우식경험지수 (DMFT) 연구대상자의구강상태를조사하기위하여동일한검사자 ( 치과의사 ) 가치경과탐침을이용하여조사하였다. 세계보건기구에서제시한지표를기준으로상하좌우제3대구치를제외한 28개의치아를대상으로우식치아, 상실치아, 충전치아를조사하여 DMFT를산정하였다. 우식치아는 international caries detection and assessment system (ICDAS) 를기준으로 grade 0에해당하는백색반점또는백묵양반점등의초기치아우식증의치아는건전치아로판정하였다 9). 2) Dentocult -SM strip mutans를이용한 colony density (CFU/mL) Dentocult -SM strip mutans (Orion Diagnostica, Espoo, Finland) 내의파라핀을수분간씹게하여타액을수집후배지판을혀에대고 screening strip 전체면에타액이충분히묻도록한다. 미리 bacitracin disc를녹인배양액에넣어마개를조금느슨하게잠근후, 37 항온배양기에서 48시간배양하여제작회사의판정표의기준에의한 S. mutans의집락수에따라, 우식활성도를 grade 0~3으로판정하였다 (Table 1). 3) PCR을이용한 S. mutans와 S. sobrinus의존재여부타액내 S. mutans와 S. sobrinus의존재여부는 PCR 실험을통해확인하였다. 실험에사용된 primer는 5-GATAACTA- CCTGACAGCTGACT-3' 과 5'-AAGCTGCCTTAAG- GTAATCACT-3' 이 S. sobrinus에대해사용되었으며, 5'- ATGCGCAATCAACAGGTT-3' 과 5-CGCAACGCGAACA- TCTTGATCAG-3' 이 S. mutans를위해사용되었다. PCR 실험을위한총양은 20 μl 로 DNA 1 μl 와 5 PCR mixture (ELPIS, Taejeon, Korea) 4 μl, 5 pm primer 1 μl, 증류수 14 μl 로이루어졌다. PCR 반응은 95 C 에서 1분간 Table 1. Caries risk and colony density of grades Dentocult -SM grade Caries Risk Colony Density (CFU/mL) 0 negative CFU/mL < 10 4 1 mild 10 4 < CFU/mL < 10 5 2 moderate 10 5 < CFU/mL < 10 6 3severe CFU/mL > 10 6 11
denaturation 후, 95 C 에서 10초간 denaturation, 58 에서 10초간 annealing, 72 C 에서 10초간 extension 과정을 30 cycle 수행하였으며, 그후 72 C 에서 5분간 extension 하였다. PCR 실험을통해나온산물은 1% 아가로즈젤에서분석되었다. 4) 4가지단일클론항체를사용한타액내의 S. mutans 검출 (1) 4가지단일클론항체의개발이실험에사용된 S. mutans의 Ag I/II 단백질과 gtfs (gtf B, gtf C, gtf D) 에대한단일클론항체는기존에제작된항체들을사용하였다. 이항체들을얻기위해서 Ag I/II 단백질과 gtfs (gtf B, gtf C, gtf D) 의 N-terminus 유전자를 PCR을통해증폭하였다. 이를 T 벡터에 ligation하여 sequencing을통해정확한 sequence를가진벡터를선택하여제한효소로잘라 plasmid에 integration하여얻어진벡터를이용해재조합단백질들 (Ag I/II-N, gtfbn, gtfcn, gtfdn) 을발현시켰고, 이를확인하였다. 이단백질들을정제하여 mice에주입하였으며, 얻어진 spleen cell을 SP2/0 cell과 fusion하여 hybridoma를생성하였다. Western blot과 Dot blot, 그리고 ELISA를통해이 hybridoma가 Ag I/II-N, gtfbn, gtfcn, gtfdn에대한단일클론항체 anti-ag I/II antibody, anti-gtfbn antibody, anti-gtfcn antibody, anti-gtfdn antibody (ckag I/II, ckbn, ckcn, ckdn) 를생성함을확인하였다. (2) 4가지단일클론항체를사용한타액내의 S. mutans 검출타액내 S. mutans를검출하기위해 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 실험방법을사용하였다. ELISA 실험을위해 20 μl 의재조합 Ag I/II 단백질과 gtfs (gtf B, gtf C, gtf D) 로코팅한 96-well 플레이트 (Nunc, Roskilde, Denmark) 에 100 μl 의타액을넣은후 4 에서하루저녁놓아두었다. 이것을 3% skim milk로상온에서 30분차단시킨다음 phosphate buffered saline (PBS) 로 3번씻은후각단일항체를넣어 37 에서 1시간 incubation하였다. PBS로씻어항체제거후 alkaline phosphate가붙은 goat anti-mouse immunoglobulin G (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 를 37 에서 1시간 incubation하였다. 이 것을 PBS로 4번씻은후 alkaline phosphatase substrate를넣어, ELISA reader (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA) 기에서 405 nm로측정하였다. 5) 통계분석각연구대상자들의 DMFT와 Dentocult -SM strip mutans, PCR을이용한 S. mutans와 S. sobrinus의존재유무, 그리고 4가지의단일클론항체를사용한타액내의 S. mutans 검출실험의자료를 SPSS (Statistical Package for Social Science) Ver 19.0 통계프로그램을사용하여분석하였다. 각군들의 DMFT, Dentocult -SM strip mutans, S. mutans와 S. sobrinus의 PCR 결과, 그리고 S. mutans와 4가지의단일클론항체반응간의상관관계를살펴보기위해 Spearman 상관분석을실시하였으며, 군에따른각실험결과들의차이에대해 Chi-square 검정, One-way ANOVA를실시하였다. 비모수적인방법으로 Fisher s Exact test, Kruskal-Wallis test를실시하였다. Ⅲ. 연구성적 1. 치아우식경험지수 (DMFT) 조사대상자의표본구성과특성을살펴보기위해빈도분석을실시한결과 Table 2와같이나타났다. 연구대상자는총 97명이었으며, 1군교정환자 32.0%, 2군초등학생 25.8%, 3군성인 42.3% 이었고, 각군의 DMFT는 5.16, 5.12, 8.39로나타났으며, 전체 DMFT 평균은 6.52로조사되었다 (Table 2). 2. Dentocult -SM strip mutans를이용한 colony density (CFU/mL) 1군의 Dentocult -SM strip mutans를이용한 colony density (CFU/mL) 조사에서 grade 0이 10명 (32.3%), grade 1이 16명 (51.6%), grade 2가 4명 (12.9%), grade 3이 1명 (3.2%) 으로나타났으며, 2군는 grade 0이 11명 (44.0%), grade 1이 11명 (44.0%), grade 2가 2명 (8.0%), grade 3이 Table 2. Distribution of the DMFT index N (%) DMFT (Mean ± SD) Range p value Group 1 31 (32.0) 5.16 a ± 2.89 1.00-13.00 Group 2 25 (25.7) 5.12 a ± 4.06 0.00-13.00 0.002** Group 341 (42.3) 8.39 b ± 5.20 0.00-19.00 (p = 0.009**) Total 97 (100.0) 6.52 ± 4.60 0.00-19.00 One way ANOVA test, chi-square test (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001) Duncan post hoc test, a < b. Kruskal-Wallis test p value N = sample size, SD = standard deviatioin 12
Table 3. Distribution of colony density (CFU/mL) level of Streptococcus mutans Group 1 Group 2 Group 3Total N (%) N (%) N (%) N (%) p value Grade 0 10 (32.3) 11 (44.0) 18 (43.9) 39 (40.2) Grade 1 16 (51.6) 11 (44.0) 16 (39.0) 43 (44.3) 0.916 Grade 2 4 (12.9) 2 (8.0) 6 (14.6) 12 (12.4) (p = 0.912) Grade 3 1 (3.2) 1 (4.0) 1 (2.4) 3 (3.1) One way ANOVA test, chi-square test (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001). Fisher's Exact test p value N = sample size 1명 (4.0%) 으로나타났고, 3군은 grade 0이 18명 (43.9%), grade 1이 16명 (39.0%), grade 2가 6명 (14.6%), grade 3이 1명 (2.4%) 으로나타났다. 전체연구대상자의 Dentocult -SM strip mutans는 grade 0이 39명 (40.2%), grade 1이 43명 (44.3%), grade 2가 12명 (12.4%), grade 3이 3명 (3.1%) 으로나타났다 (Table 3). 3. PCR을이용한 S. mutans와 S. sobrinus의존재여부 1군의타액을이용한 S. mutans에대한 PCR 결과, S. mutans가검출되지않은경우가 61.29%, 검출된경우가 38.71% 로나타났으며, S. sobrinus에대한 PCR 결과는 S. sobrinus가검출되지않은경우가 58.65%, 검출된경우가 41.94% 로나타났고, S. mutans와 S. sobrinus가공통으로검출된경우는 80.65%, 둘다검출되지않은경우는 19.35% 로나타났다. 2군의타액을이용한 S. mutans에대한 PCR 결과, S. mutans가검출되지않은경우가 44%, 검출된경우가 56% 로나타났으며, S. sobrinus에대한 PCR 결과는 S. sobrinus가검출되지않은경우가 36%, 검출된경우가 64% 로나타났고, S. mutans와 S. sobrinus가공통으로검출된경우는 72%, 둘다검출되지않은경우는 28% 로나타났다. 3군의타액을이용한 S. mutans에대한 PCR 결과, S. mutans가검출되지않은경우가 41.46%, 검출된경우가 58.54% 로나타났으며, S. sobrinus에대한 PCR 결과는 S. sobrinus가검출되지않은경우가 65.85%, 검출된경우가 34.15% 로나타났고, S. mutans와 S. sobrinus가공통으로검출된경우는 73.17%, 둘다검출되지않은경우는 26.83% 로나타났다. 전체연구대상자들의 S. mutans에대한 PCR 결과, S. mutans 가검출되지않은경우가 48.5%, 검출된경우가 51.5% 로나타났으며, S. sobrinus에대한 PCR 결과는 S. sobrinus가검출되지않은경우가 55.7%, 검출된경우가 44.3% 로나타났고, S. mutans와 S. sobrinus가공통으로검출된경우는 24.7%, 둘다검출되지않은경우는 75.3% 로나타났다 (Fig. 1-3, Table 4). Fig. 1. Representative results from the electrophoresis of polymerase chain reaction using Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in saliva samples of group 1. (A) Streptococcus mutans. (B) Streptococcus sobrinus. (M : marker, lane 1-31 : products of polymerase chain reaction of group 1). Fig. 2. Representative results from the electrophoresis of polymerase chain reaction using Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in saliva samples of group 2. (A) Streptococcus mutans. (B) Streptococcus sobrinus. (M : marker, lane 1-25 : products of polymerase chain reaction of group 1). 13
(Fig. 4-6, Table 5). 5. 변수간상관분석 Fig. 3. Representative results from the electrophoresis of polymerase chain reaction using Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in saliva samples of group 3. (A) Streptococcus mutans. (B) Streptococcus sobrinus. (M : marker, lane 1-41 : products of polymerase chain reaction of group 1). 4. 4 가지의단일클론항체를사용한타액내의 S. mutans 검출 1) 전체의변수간상관분석본연구의변수간관련성을살펴보기위하여 Spearman 상관분석을시행한결과, Dentocult -SM strip mutans (D- SM) 를이용한실험은 polymerase chain reaction- Streptococcus mutans (PCR-SM) (r = 0.295, p < 0.01), polymerase chain reaction-streptococcus sobrinus (PCR- SS) (r = 0.369, p < 0.001), PCR-Both (r = 0.467, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. PCR-SM은 PCR-Both (r = 0.585, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, PCR-SS는 PCR- Both (r =0.643, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. ckag I/II level은 ckbn (r = 0.811, p < 0.001), ckcn (r = 0.753, p < 0.001), ckdn (r = 0.834, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, ckbn은 ckcn (r = 0.823, p < 0.001), ckdn (r = 0.825, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났고, ckcn은 ckdn (r = 0.751, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. ELISA를사용하여타액과개발된 4가지단일클론항체 (ckag I/II, ckbn, ckcn, ckdn) 를반응시켜타액내 S. mutans를검출하였다. 1군에서 ckag I/II은평균 1.78, ckbn은평균 1.97, ckcn은평균 1.86, ckdn은평균 1.55 로검출되었으며, 2군에서 ckag I/II은평균 1.70, ckbn은평균 1.82, ckcn은평균 1.57, ckdn은평균 1.70로검출되었고, 3군에서 ckag I/II은평균 1.65, ckbn은평균 1.67, ckcn은평균 1.44, ckdn은평균 1.44로검출되었다. 전체연구대상자들에서는 ckag I/II은평균 1.71, ckbn은평균 1.80, ckcn은평균 1.61, ckdn은평균 1.54로검출되었다 2) 1군의변수간상관분석 1군의변수간관련성을살펴보기위하여 Spearman 상관분석을시행한결과, D-SM을이용한실험은 PCR-SM (r = 0.510, p < 0.01), PCR-Both (r = 0.492, p < 0.01) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. PCR-SM은 PCR-Both (r = 0.661, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, ckag I/II (r = - 0.554, p < 0.01), ckbn (r = - 0.534, p < 0.01), ckdn (r = - 0.434, p < 0.05) 에음 (-) 의유의한영향이있는것으로나타났고, PCR-SS는 PCR-Both (r = 0.576, p < 0.01) 에양 Table 4. Detection of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus using polymerase chain reaction Group 1 Group 2 Group 3Total N (%) N (%) N (%) N (%) p value PCR 12 (38.8) 13 (52.0) 25 (61.0) 50 (51.5) 0.022* -SM X 19 (61.3) 12 (48.0) 16 (39.0) 47 (48.5) (p = 0.013*) PCR 13 (41.9) 15 (60.0) 15 (36.6) 43 (44.3) 0.169 -SS X 18 (58.1) 10 (40.0) 26 (63.4) 54 (55.7) (p = 0.177) PCR 6 (19.4) 7 (28.0) 11 (26.8) 24 (24.7) 0.697 -Both X 25 (80.6) 18 (72.0) 30 (73.2) 73 (75.3) (p = 0.726) One way ANOVA test, chi-square test (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001). Fisher's Exact test p value PCR = polymerase chain reaction, SM = Streptococcus mutans, SS = Streptococcus sobrinus, O = detection of the bacteria, X = non-detection of the bacteria, N = sample size 14
Fig. 4. Level of antibodies (A) ckag I/II, (B) ckbn, (C) ckcn, (D) ckdn identified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in saliva samples of group 1. Fig. 5. Level of antibodies (A) ckag I/II, (B) ckbn, (C) ckcn, (D) ckdn identified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in saliva samples of group 2. 15
Fig. 6. Level of antibodies (A) ckag I/II, (B) ckbn, (C) ckcn, (D) ckdn identified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in saliva samples of group 3. Table 5. level of monoclonal antibodies reacted with Streptococcus mutans in saliva samples Group 1 Group 2 Group 3Total p value ckag I/II 1.78 ± 0.59 1.70 ± 0.41 1.65 ± 0.531.71 ± 0.52 0.595 (p = 0.693) ckbn 1.97 ± 0.61 1.82 ± 0.55 1.67 ± 0.61 1.80 ± 0.60 ckcn 1.86 b ± 0.47 1.57 a ± 0.48 1.44 a ± 0.631.61 ± 0.57 ckdn 1.55 ± 0.59 1.70 ± 0.55 1.44 ± 0.631.54 ± 0.60 One way ANOVA test, chi-square test (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p< 0.001) Duncan post hoc test, a < b. Kruskal-Wallis test p value 0.107 (p = 0.117) 0.005** (p = 0.003**) 0.225 (p = 0.180) (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. ckag I/II는 ckbn (r = 0.841, p < 0.001), ckcn (r = 0.629, p < 0.001), ckdn (r = 0.853, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, ckbn은 ckcn (r = 0.662, p < 0.001), ckdn (r = 0.822, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났고, ckcn은 ckdn (r = 0.614, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. 3) 2군의변수간상관분석 2군의변수간관련성을살펴보기위하여 Spearman 상관분석을시행한결과, DMFT는 D-SM (r = 0.416, p < 0.05) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, D-SM은 PCR-SS (r = 0.460, p < 0.05), PCR-Both (r = 0.576, p < 0.01), ckag I/II (r = 0.488, p < 0.05) 에양 (+) 의유의 16
한영향이있는것으로나타났다. PCR-SM은 PCR-Both (r = 0.599, p < 0.01), ckbn (r = 0.433, p < 0.05) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, PCR-SS는 PCR- Both (r = 0.509, p < 0.01) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났고, PCR-Both는 ckbn (r = 0.494, p < 0.05) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. ckag I/II는 ckbn (r = 0.686, p < 0.001), ckcn (r = 0.723, p < 0.001), ckdn (r = 0.688, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, ckbn은 ckcn (r = 0.781, p < 0.001), ckdn (r = 0.801, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났고, ckcn은 ckdn (r = 0.676, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. 4) 3군의변수간상관분석 3군의변수간관련성을살펴보기위하여 Spearman 상관분석을시행한결과, D-SM은 PCR-SM (r = 0.453, p < 0.01), PCR-SS (r = 0.417, p < 0.01), PCR-Both (r = 0.514, p < 0.01) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. PCR-SM은 PCR-Both (r = 0.528, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, PCR-SS는 PCR-Both (r = 0.797, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. ckag I/II는 ckbn (r = 0.856, p < 0.001), ckcn (r = 0.902, p < 0.001), ckdn (r = 0.885, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났으며, ckbn은 ckcn (r = 0.933, p < 0.001), ckdn (r = 0.868, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났고, ckcn은 ckdn (r = 0.922, p < 0.001) 에양 (+) 의유의한영향이있는것으로나타났다. 6. 군에따른변수의차이비교군에따른변수들의차이를살펴보기위해 Chi-square 검정, One-way ANOVA를실시한결과, 군에따라 DMFT, PCR- SM, ckcn에서통계적으로유의한차이가있는것으로나타났으며 (p < 0.05), 비모수적방법인 Fisher s Exact test, Kruskal-Wallis test를시행한결과 DMFT, PCR-SM, ckcn에서통계적으로유의한차이가있는것으로나타났다 (p < 0.05). DMFT에서 3군 (Mean = 8.39) 이 1군 (Mean = 5.16), 2군 (Mean = 5.12) 보다높은것으로나타났다. PCR- SM는 1군에서불검출 61.3%, 2군에서검출 52.0%, 3군에서검출 48.8% 로높게나타났다. ckcn에서 1군 (Mean = 1.86) 이 2군 (Mean = 1.57), 3군 (Mean = 1.44) 보다높은것으로나타났다. Ⅳ. 총괄및고찰치아우식의해결과예방을위하여그동안많은연구들이이루어졌다. 우식형성요인들중, 미생물은가장중요한인자로 여겨진다. 사람에서많이발견되는치아우식균으로는 S. mutans와 S. sorbinus가있으며, 이두세균이동시에출현할경우, 타액내 mutans streptococci의수가높게나타나고 10) 치아우식증이더심하게나타나는경향이있다 11). 그중 S. mutans가 S. sorbinus에비해, 세균이치아에처음부착할때요구되는특별한세포표면단백질이풍부하기때문에우식형성능이더크다고밝혀졌다 12). S. mutans의초기부착은세포표면의부착단백질 (AgⅠ/ Ⅱ) 에의해이루어진다. 이단백질은세균이치아표면에부착하는것을돕고, 더많은부착이이루어지도록부착부위를제공하기도한다 13). 최근의연구에서, 이단백질을억제시키자 S. mutans의독성이감소되었다 14). 치면에초기부착후, S. mutans는 sucrose를이용하여수용성과불수용성의 glucan을합성하는데, 이러한과정은 gtfs 효소 (gtf-b, gtf-c, gtf-d) 에의해이루어진다. 이효소들은 glucan 합성의마지막에글루코실기일부를전이시켜덧붙이는과정을촉진하고, 이렇게만들어진글루칸의점착성은치아에세균의부착을용이하게한다. 그리고 S. mutans는글루칸과결합하는단백질들 (GBPs) 을만드는데, 이것은 sucrose-dependent 단계에서세균의부착을돕는다 15). 또한 S. mutans는 fructosyltransferase (FTF) 를이용하여 fructan을합성하는데, fructan은세포외저장고로서의역할을하는것으로여겨지며, 치태생성에관여하는것으로알려져있다 16). 세포외 glucose와 sucrose가있을때 S. mutans는 glycogen과비슷한세포내다당류 (innerpolysaccharides, IPSs) 를만드는데, 이것은외부에탄수화물이없을때대사되어산의생성을유도한다 15). S. mutans의세포막에있는 ATPase는세균으로부터 H + 이온의 pumping을도와세포내산성화를감소시켜주위의낮은 ph환경에서도세균이기능할수있도록한다 17). S. mutans의항세균물질인 mutacin은다른종류의 mutans streptococci와 mutans streptococci가아닌그람양성세균들의성장을방해한다. 이런과정을통해결국 mutacin은구강내에서 S. mutans가효과적으로정착하여집락을이루도록돕는다 16). 이러한단계적인치아우식증의병인과정을막는것이, 치아우식증을예방하거나치료하는연구의주요한과제가될것이다. 또한구강내세균의집락형성에는환경적인상호작용이중요하다. 자연면역반응이일어나더라도과다한탄수화물에노출되거나면역학적으로이상이있으면, mutans streptococci 가우세해질것이다 18). 따라서치아우식증을예방하기위해서는 IgG를통한면역반응이나 S-IgA를이용하여세균집락형성을조절하는것이중요하다. 그중우식을야기하는 mutans streptococci에대한면역방어는주로타액에서분비되는 IgA 항체에의해이루어지는데이항체는세균의외독소나질병을일으키는효소및바이러스등을중화시키고, 산생성을방해하며, 치아나구강점막표면에세균이부착하는것을방해한다 19). 타액내항생물질 (lysozyme, lactoferrin, lactoperoxidase 등 ) 의효과를더욱증가시키는 S-IgA의효과때문에, S. mutans에대한 S-IgA의 17
반응을증가시키는방향으로백신개발이이루어지고있다 20). S. mutans의 AgⅠ/Ⅱ와 gtfs를조합한캡슐로능동면역화한실험에서 S-IgA 항체의증가가성공적으로나타났다 21). 그러나능동면역에서야기될수있는위험성때문에, 치아우식증에대해수동면역으로구강에적용가능한항체개발이대안으로제시되고있다 22). S. mutans의항원에대해개발된항체와유전적으로가공된인간화 S-IgA 항체를이용한연구에서, 개발된단일클론항체를적용했을때, S. mutans의재출현이일정기간억제되었으나더많은실험참가자들을대상으로한실험에서는동일한결과가나타나지않았다 23). 하지만이러한연구들은항체의 mutans streptococci 집락형성을방해하는능력을증명한것에큰의의가있으며, 향후이를바탕으로단일클론항체를이용하여 S. mutans에의한치태형성억제에대한연구가요구된다. 우식위험도가높은환자를식별하고예방하기위해단일클론항체를이용하여타액내 S. mutans의양을1분이내에나타내는연구가발표되었고, 최근에는 Saliva-check TM mutans (GC, Tokyo, Japan) 라는제품도상용화되었다 24). 이는 S. mutans의존재유무판정만이이루어진다는점과고비용이한계점으로지적되기는하나, 세균의배양기간이필요하지않기때문에결과를신속하게알수있으며사용법이간단하다는장점이있다 25,26). 그밖에도단일클론항체와타액내 S. mutans 를활용하여치아우식증을예측하고예방하기위한여러연구들이지속되고있으나아직획기적인상품의개발이이루어지지않고있는것이현실이다 27). 따라서치아우식증에영향을줄수있는여러요소들의조절과더많은연구를통해, 경제적이고빠르고간편하며정량적인대량검출법과치아우식백신의상용화가이루어진다면치아우식증을예방하는데있어서상당한도움이될수있을것으로생각된다. 이에본연구에서는 S. mutans의초기병인론에중요한역할을하는 Ag I/II 단백질과 gtfs에대해개발된단일클론항체들을사용하여, 타액내 S. mutans를검출하고그들의정략적분석을통해단일클론항체들의효용성을평가하며, S. mutans의존재여부를확인하기위한측정제품으로서의개발연구가능성을보았다. 연구대상인세군에서 DMFT, Dentocult -SM strip mutans를이용한 colony density (CFU/mL), 그리고 PCR을이용한 S. mutans와 S. sobrinus 존재여부의상관관계를조사한결과, 전체 97개체중우식경험치아수가 0인대상은 8명이었으며그중 1명에서 S. mutans가검출되었고 (18%), 4명에서 S. sobrinus가검출되었으며 (50%) 나머지 3명에서는둘다검출되지않았다 (32%). 이것은기본적으로 S. sobrinus가치아우식형성에큰영향을주지않는요인임을입증하는것이라할수있다. 세군은각실험들간의상관성조사에서일부유의한값을보였으나뚜렷한상관관계는확인할수없었는데그원인을고려해보자면, DMFT의경우치의학연구분야에서다방면으로이용되고있으나우식치아 (decayed teeth, DT), 상실치아 (missed teeth, MT), 충전치아 (filled teeth, FT) 를합산하는방식이기때문 에, 현재의 S. mutans 활동성을측정하기에는적합하지않을수있으리라생각된다. DMFS가높거나 DT, MT, FT를따로관찰한연구에서 DT가높을수록세균활성이높았다는연구결과를미루어보았을때, DMFT가여전히많은연구에서사용되고있으나정확도를높이기위해서는식이조절이나양치질횟수조절등의좀더엄격한조건에서의관찰이필요하다 28). 단일클론항체를사용한타액내 S. mutans 검출값과 DMFT, Dentocult -SM strip mutans, PCR 결과간의상관관계를조사하였을때실험대상의 DMFT 평균값은 3군이 1, 2군에비해높았으며 1군과 2군은비슷하였다. 이에반해단일클론항체에의해측정된 1, 2, 3군의 S. mutans는오히려 DMFT가높은 3군에서전체적으로단일항체에의해측정된양이적게나타났다. 이것은항체를측정하는방법으로채택된 ELISA는단일클론항체를사용해정확도는높으나특정단백질에대한항체의역가만을측정해전체적인 S. mutans의양을측정하기에는적합하지못하다는것을보여준다. 즉, 측정된항체는세균의특정항원에대한항체의양이지 S. mutans 전체에대한항체의양이라고할수없다는것이다 29). 따라서본연구에서 S. mutans와단일클론항체반응시켜얻어진 S. mutans의정량적양과 Dentocult -SM strip mutans나 PCR 결과간의유의적연관성을유추하기가어려웠다. 그러므로 S. mutans의전체적인양측정을위해서보다많은 S. mutans에대한항체개발연구가필요하며그에따라단일항체모두를이용한 S. mutans의측정실험도수행되어져야할것으로보인다. 또한타액채취시구강의환경요인을생각해볼수있다. 만일치아우식증의발생에단지치면세균막을형성할수있는미생물요인만이그원인이된다면한가지검사만으로충분히개개인의우식발생을예견하고예방할수가있겠으나, 미생물요인이외에도다른수많은요인들이복합적으로상호작용을일으키는구강환경들로인해, 본실험에서는앞서언급한것이외에는군을나누어조사한것에대하여큰의미있는결과를도출하지못했다. 연구대상자들의타액채취전, 구내조건을동일하게설정하기위해칫솔질을제한하였으나, 그이외의조건들은통제하거나조절하지못했다. 또한 3군의경우더유의한상관성이관찰되지않은것은성인은일차우식보다는이차우식이더많아우식발병기전이아이들보다더복잡하고, 담배나복용약품, 그리고타액흐름등이성인의구강환경에더영향을주었기때문이라여겨진다 30). 채취시간에따라 S. mutans의수가달랐다는연구도있어이또한제한되어야하는요인으로사료된다. 여러연구들에서치아우식증의발생을위해서는미생물, 식이, 시간뿐만아니라, 사회, 행동요인같은환경및구강검사결과등의다양한요인이고려되어야한다고주장하였다 31). 치아우식증을예측하는데있어미생물요인이가장영향력있는인자이기는하나, 다른요인들에의해치아우식증의정도가가감될수있는것이기에차후단일클론항체를이용한 S. mutans의측정량과 DMFT와의유의적연관성을찾기위한실험에서는연구대상자들의환경적조건을세밀한조 18
건으로제한하거나, 설문지등으로다른요인들을조사한연구를수행하여야할것이다. 그러나본실험에서는이러한다양한조건들을조절하지않았음에도불구하고 PCR을통한 S. mutans의측정에서그측정능력이 Dentocult -SM strip mutans를이용한것보다 11% 더높은것으로나타났으며단일클론항체를이용하여측정한경우, log2로그값을나타냈을때가장낮은값은 0.43이었고가장높은값은 3.10으로값의차이는있었으나 S. mutans를 100% 검출하였다. 따라서본연구에서얻어진결과를토대로하여, 더통제된조건하에실험이진행된다면보다나은실험결과를얻을수있을것이라여겨지며차후보강실험을통해단일항체를이용한치아우식예방연구와현제품보다더활용도높은 S. mutans 측정제품개발을위한연구를수행할수있을것이다. Ⅴ. 결론연구대상인세군모두에서단일클론항체를사용한타액내 S. mutans의검출값과연구대상들의 DMFT, Dentocult - SM strip mutans를이용한 colony density (CFU/mL), 그리고 PCR을이용한 S. mutans와 S. sobrinus 존재여부실험을수행한결과, 총 97명의피실험자중 DMFT가 0인대상은 8명으로이중 18% 에서 S. mutans가검출되었고 50% 에서 S. sobrinus가검출되었으며 32% 에서는둘다검출되지않음으로서, S. sobrinus가치아우식형성에큰영향을주지않는요인임이관찰되었다. 또한 S. mutans의단백질인 gtf B, C, D와 Ag I/II에대한단일클론항체들을이용하여 S. mutans를검출하였을때그검출능력이 Dentocult -SM strip mutans 나 PCR보다뛰어남을보였다. 이러한결과들을토대로본실험은, S. mutans는치아우식형성에주요원인균으로 S. mutans를예측하는것이치아우식예방을위한전제조건이될수있으며이를위해이균에대한검출능력이뛰어난 S. mutans 의 Ag I/II와 gtf B, C, D에대한단일클론항체를이용할수있다는것을보여주었다. 또한이단일클론항체들을이용하여 S. mutans 검출제품에대한개발연구가능성을제시할수있을것으로생각된다. References 1. Petersen PE : Challenges to improvement of oral health in the 21st century the approach of the WHO Global Oral Health Programme. Int Dent J, 54:329-343, 2004. 2. Korea National Oral Health Survey, 2012. Assessment service. Available from URL: http://www.google.co.kr/url?url=http://www.dibrar y.net/jsp/download.jsp%3ffile_id%3dfile- 00008155087&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U &ei=zgzyvkotlmsvmwxkyig4cq&ved=0cbmq FjAA&usg=AFQjCNHlhFCUrl38tP gbb0uawqvw UUNw (Accessed on November 23, 2014) 3. Keyes PH, Jordan HV : Factors influencing the initiation transmission and inhibition of dental caries. In: Mechanisms of Hard Tissue Destruction. Academy Press, NY, 261-283, 1963. 4. Selwitz RH, Ismail AI, Pitts NB : Dental caries. Lancet, 369:51-59, 2007. 5. Marsh PD : Microbiological aspects of the chemical control of plaque and gingivitis. J Dent Res, 71: 1431-1438, 1992. 6. Ajdic D, McShan WM, McLaughlin RE, et al. : Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a cariogenic dental pathogen. Proc Natl Acad Sci USA, 99:14434-14439, 2002. 7. Jenkinson HF, Demuth DR : Structure, function and immunogenicity of streptococcal antigen I/II polypeptides. Mol Microbiol, 23:183-190, 1997. 8. Taubman MA, Nash DA : The scientific and publichealth imperative for a vaccine against dental caries. Nat Rev Immunol, 6:555-63, 2006. 9. Rationale and Evidence for the International Caries Detection and Assessment System (ICDAS II). Assessment service. Available from URL:https:// www.icdas.org/uploads/rationale%20and%20eviden ce%20icdas%20ii%20september%2011-1.pdf (Accessed on November 23, 2014) 10. Köhler B, Andréen I, Jonsson B : The earlier the colonization by mutans streptococci, the higher the caries prevalence at 4 years of age. Oral Microbiol Immunol, 3:14-17, 1988. 11. Okada M, Soda Y, Hayashi F, et al. : PCR detection of Streptococcus mutans and S. sobrinus in dental plaque samples from Japanese pre-school children. J Med Microbiol, 51:443-447, 2002. 12. Okada M, Soda Y, Hayashi F, et al. : Longitudinal studies on dental caries incidence associated with Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in pre-schoolchildren. J Med Microbiol, 54:661-665, 2005. 13. Jenkinson HF, Demuth DR : Structure, function and immunogenicity of streptococcal antigen I/II polypeptides. Mol Microbiol, 23:183-190, 1997. 14. Nakano K, Tsuji M, Nishimura K, et al. : Contribution of cell-surface protein antigen PAc of Streptococcus mutans to bacteremia. Microbes Infect, 8:114-121, 2006. 19
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국문초록 단일클론항체를사용한타액내 Streptococcus mutans 검출 이민정 이대우 김미아 이경열 백병주 양연미 김재곤 전북대학교치의학전문대학원소아치과학교실및구강생체과학연구소 본연구의목적은 Streptococcus mutans의 Ag I/II와 glucosyltransferase에대해개발된단일클론항체를사용한타액내 Streptococcus mutans 검출의효용성을평가하기위함이다. 세군 ( 성인, 미성년자, 그리고교정치료중인미성년자 ) 을대상으로 DMFT, Dentocult -SM strip mutans를이용한타액내의 colony density (CFU/mL), polymerase chain reaction을이용한 Sreptococcus mutans와 Sreptococcus sobrinus의존재여부, 그리고 4가지단일클론항체를사용한타액내 Streptococcus mutans 검출실험을시행하였다. 그결과 Streptococcus mutans가 Streptococcus sobrinus보다치아우식형성에더주요하게작용한다는것을입증하였으며, glucosyltransferases (gtf B, gtf C, gtf D) 와 Ag I/II에대한단일클론항체들의 Streptococcus mutans를검출해내는능력이 Dentocult -SM strip mutans나 polymerase chain reaction을사용한검출법보다뛰어남을보였다. 주요어 : 단일클론항체, Streptococcus mutans, Glucosyltransferase B,C,D, Ag I/II 21