Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 1, pp. 18-24 pissn 0440-2413 DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2016.6013 eissn 2383-9902 Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea 보문 한국인모유영양아의분변에서분리한 Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 의항알레르기효과 이승훈 1,2 강재훈 1 강대중 1 * 1 일동제약 ( 주 ) 중앙연구소, 2 건국대학교생물공학과 Anti-allergic effect of Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 isolated from breast milk-fed Korean infant Seung-Hun Lee 1,2, Jae-Hoon Kang 1, and Dae-Jung Kang 1 * 1 Bioprocess Engineering Team, Research Laboratories, ILDONG Pharmaceutical Co., Ltd., Hwaseong 18449, Republic of Korea 2 Department of Biotechnology and Bioengineering, Konkuk University, Seoul 05029, Republic of Korea (Received March 3, 2016; Revised March 16, 2016; Accepted March 16, 2016) ABSTRACT: We investigated 23 lactic acid bacteria isolated from Korean breast milk-fed infant in order to select strains which show superior anti-allergic effect. The candidates were cultivated and then we obtained dried powders of tyndallized cells and supernatant concentrate separately. Screening was carried out with down-regulation of interleukin (IL) 4 and up-regulation of IFN-γ in mouse splenocytes. As a result of the screening, we selected Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 (RH3201) for oral feeding to ovalbuminsensitized BALB/c mice. Oral administration of RH3201 as dead cell bodies and supernatant concentrate suppressed hyper-production of serum immunoglobulin (Ig) E levels compared to vehicle group. Such anti-allergic effects were achieved by improvement of the balance between cytokines produced from type-1 helper T (Th1) and type-2 helper T (Th2) lymphocytes. Therefore, RH3201 has potential to improve atopic symptoms by immunomodulatory effect. Key words: Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201, immunomodulation, tyndallization, immunoglobulin E 인간의장내에는약 100조이상의장내세균이서식하고있다. 장내세균총 (intestinal microflora) 에는소위유익균이라하는숙주에이로운역할을하는균이있는반면각종부작용을일으키는유해균도존재하는데, 이들균주의균형을유지하는것이건강을유지하는데중요하다 (Gail, 2007). 최근아토피유발환자의증가로인해큰사회적손실이발생하고있는데, 이에대한원인으로서널리받아들여지고있는위생가설 (hygiene hypothesis) 에따르면비위생적환경에노출될수록다양한면역반응을학습할수있는기회가생겨아토피를예방할수있다 (Yazdanbakhsh et al., 2002). 장내균총의변화는수지상세포나장상피세포에존재하는 toll-like receptor *For correspondence. E-mail: djkang@ildong.com; Tel.: +82-31-371-2881; Fax: +82-31-371-2900 등에의해인지되고면역반응을일으키게되므로, 유익균의섭취를통한장내균총의변화는아토피에서나타나는면역반응조절자로서의역할을할수있다 (Kelly et al., 2005). 유익균으로널리알려진유산균 (Lactic acid bacteria) 은유해균의생육저해및부착억제능으로장내세균총을조절하여정장작용을하는것으로알려져있다 (Chauviere et al., 1992; Styriak et al., 2003). 위장관의미생물균총은점막면역에영향을미쳐, 장내균총이존재하지않는무균실험동물에서는 Peyer`s patches와상피세포중의림프구그리고 immunoglobulin (Ig) A 가감소되어있으며 IgE 생성을제어할수있는면역조절능력도감소되어있다는내용이보고된바있다 (Retnaninggtyas et al., 2008). 유산균은세포성면역을활성화하거나항체생성을조절하는기능이있고, 최근에는과민면역반응인알레르기를개선할수있는기능성이제기되고있다 (Herich and Levkut,
L. rhamnosus IDCC 3201 의항알레르기효과 19 2002; Ishida et al., 2005; Yu et al., 2010). 그람양성세균인유산균세포벽의 muramyl dipeptide와 lipoteichoic acid (Claes et al., 2012) 등이세포표면의수용체와반응하여 interleukin (IL)-12 등의싸이토카인 (cytokines) 생성을변화시키는것으로보고되었다 (Schwandner et al., 1999). 알레르기는체내에침입한항원에대해면역체계가과민반응을보이는것으로항원은 macrophage를통해 T 세포에전달되고, T 세포는항원종류나반응하는수용체에따라 type-1 T helper (Th1) 세포또는 type-2 T helper (Th2) 세포로분화한다. Th2 세포의싸이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13은체액성면역인 B cell을활성화시킴으로써결과적으로가려움증을유발하는 IgE 생성량이증가하여알레르기가유발되는반면, Th1 세포인 IL-12, interferon γ (IFN-γ) 는세포성면역을활성화시키고 IgE 생성을억제하는작용을한다 (Kato et al., 1999). 따라서 Th1과 Th2 세포의균형이잘유지되도록하면알레르기반응을억제할수있다 (Fujiwara et al., 2004). Kanamycin을투여하여장내세균총을교란시킨마우스에서 Th2 세포의활성과관련이있는 IL-4와 IgE 등이증가하였으며이마우스에유산균을투여하면저해되었다는것이보고된바있다 (Cross et al., 2001). Lactobacillus rhamnosus GG 의경우알레르기증상이있는유아들에게투여하여장내염증과아토피피부염 (atopic dermatitis) 증상이완화된바있다 (Majamaa and Isolauri, 1997). 본연구에서는아토피피부염을포함하는알레르기증상예방및완화능을갖는기능성프로바이오틱스균주를개발하기위하여, 한국인의유아분변에서분리된유산균에서 in vitro 실험을통해 Th1/Th2 싸이토카인의균형을동시에유지시킬수있는유산균을선별하고동물실험을통해그면역조절기능을확인하였다. 재료및방법 균주분리및배양물제조서울 경기소재의산후조리원에서사전동의후신생아분변에서분리한유산균을사용하였다. 각균주를효모추출분말기반배지에 10% (v/v) 접종하고 18시간동안배양한후 8,000 g로 10분간원심분리하여균체와상등액을각각얻었다. 균체는 70 C에서 2시간열처리 (tyndallization) 하여사균화하였고, 상등액은감압농축기 (N-1100, EYELA) 를사용하여 10배농축한다음각각동결건조하여분쇄하였다. 균체와상등액시료는멸균증류수를사용해희석하여사용하였으며, 사균체개수는 Neubauer counting chamber (Superior) 를사용 하여직접계수법 (direct count method) 을통해계측하였다. 실험동물이실험에서는생후 5주령암컷 BALB/c 마우스를사용하였다. 실험과정은 National Institutes of Health Animal Research and Care에따라진행되었고, 일동제약의 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 승인을받아진행하였다 ( 승인번호 A1303-6, A1305-4). 항알레르기균주의 in vitro 선별처리시료는 23종의유산균사균체및상등액농축물을증류수에현탁하였고, 양성대조군으로는 L. rhamnosus GG를사용하였다. BALB/c 마우스에 Al(OH) 3 2 mg과 ovalbumin (OVA) 1 mg을복강주사로부스팅시키고 6일경과후동일하게 2차부스팅하였다. 13일째마우스에서비장을무균적으로적출하고 10% FBS과 OVA가 1 mg/ml 함유된 DMEM 배지에 5 10 6 cells/ml의농도로현탁하여비장세포를준비하였다. 96 well plate의각 well에비장세포현탁액 (5 10 6 cells/ml) 200 μl를분주하고, 시료를최종 1 μg/ml 되도록첨가한후 5% CO 2 배양기에서 7일간배양하였다. 배양종료후배양액중의 IL-4, IL-12, IFN-γ를 cytoset kit (Biosource International) 를이용하여측정하였다. 세포독성측정균주선별실험을통해선정된 L. rhamnosus IDCC 3201 (RH3201, GenBank AY094065) 의사균체와상등액농축물의농도별세포독성은 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay (Promega, USA) 로측정하였다. RAW 264.7 세포를 2 10 5 cell/well의농도로 96 well plate에분주하고 2시간동안배양한다음배지를제거하고시료와대조군을농도별로처리하여 24시간배양하였다. 96 well plate의상등액을제거한후 0.5 mg/ml MTT 용액을 200 μl 씩첨가하여 1시간동안배양하여 formazan을형성시켰다. 이후상등액을제거하고용해액을첨가하여 formazan을녹인후 ELISA 판독기 (Bio-Tek) 를사용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. RH3201 의 in vivo 항알레르기효과각균주들의면역조절작용을확인하기위해 Xu 등 (2013) 의방법을변형하여실험법을확립하였다. 적응기간을거친실험동물을난괴법으로시험군당 6마리씩나누고 7일마다각 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 1
20 Lee et al. 각의마우스에 OVA 100 μg과 Al(OH) 3 2 mg을복강주사하여부스팅하였다. 시험군은 RH3201의사균체 (10 8, 10 9 cells) 섭취군, 상등액농축물 (10, 100 mg) 섭취군, 증류수만섭취한군으로분류하였으며, 시험물질은음용수의형태로마우스당 1 mg/day 경구투여하였다. 각실험군마우스의혈중 IgE의농도를 7일간격으로 sandwich ELISA kit (Shibayagi) 를사용하여측정하였다. 마지막 28일째에는마우스의비장을적출하여 10% FBS과 OVA가 100 μg/ml 함유된 DMEM배지에 5 10 6 cells/ml의농도로현탁하여 96 well plate에분주하였다. 5% CO 2 배양기에서 2일간배양한다음 IL-4와 IL-12, IFN-γ의생성량을 cytoset kit를이용하여측정하였다. 통계분석결과는평균 (mean) 과표준편차 (standard deviation, SD) 로표시하였다. 균주선별실험결과는 3회반복실험하여 student t-test로분석하였고, 혈중 IgE 농도와싸이토카인수치는 Mann- Whitney U test로처리하였다. 모든데이터분석은 SPSS Statics 19.0 (SPSS Inc.) 를사용하여수행하였다. 결과및고찰 분리균주의사균체선별신생아유아분변에서분리한 23종유산균의사균체에의 한비장세포의 in vitro 싸이토카인생성능을확인하였다. Fig. 1은유아분변에서분리한 23종의유산균사균체를이용하여비장세포의싸이토카인생성능을측정한결과이다. Th2 싸이토카인인 IL-4는 B 세포로부터 IgE의생성을유도하는것으로알려져있다 (Vercelli, 1995). 대부분의후보균주에서증류수섭취군과비교했을때유의적으로낮은수치를보였으며 (Fig. 1A), 반대로 Th1 싸이토카인인 IL-12과 IFN-γ의수치는상승하였다 (Fig. 1B and C). Th1/Th2 균형을확인하기위해균주별로 IFN-γ/IL-4의수치로나타내었다 (Fig. 1D). 이결과를토대로 IL-4과 IFN-γ의수치가양성대조군인 L. rhamnosus GG에비해유의적인차이가있는후보군을선별하고, 특히 IFN-γ/IL-4의수치가압도적으로높았던 RH3201을사용하여동물실험을진행하였다. 선별균주의상등액에의한싸이토카인변화양성대조군인 L. rhamnosus GG에비해 Th1/Th2 균형이유의성있게높은균주 6개에대한상등액농축물에의한비장세포의싸이토카인변화를나타내었다 (Table 1). 사균체에서와마찬가지로 RH3201의상등액농축물도다른균주의상등액농축물에비해모든싸이토카인에서유의성있는차이를보여주었다. 따라서 RH3201의사균체와상등액성분은 Th2 세포가우세한면역반응상태를 Th1이우세하게변화시키므로 B 세포생성을억제하고, 그결과로 IgE 억제능을가질것으로생각된다. Fig. 1. IL-4 (A), IL-12 (B), and IFN-γ (C) cytokines production by splenocyte isolated from ovalbumin (OVA)-sensitized BALB/c mice. IFN-γ/IL-4 ratios (D) were represented by relative values to vehicle group. A difference between lactobacilli groups and control group was considered statistically significant when *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001. 미생물학회지제 52 권제 1 호
L. rhamnosus IDCC 3201 의항알레르기효과 21 Fig. 1. Continued. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 1
22 Lee et al. Table 1. Cytokines production by splenocytes from ovalbumin (OVA)-sensitized mice stimulated by OVA in the absence (control) or presence of lactobacilli supernatants. Data are shown as mean ± SD. A difference between lactobacilli groups and control group was considered statistically significant when *P < 0.05 and **P < 0.01 Strains IL-4 (pg/ml) IL-12 (pg/ml) IFN-γ (ng/ml) Control 372 ± 60 130 ± 51 5.9 ± 1.4 Lactobacillus rhamnosus GG 252 ± 48 238 ± 31* 10.3 ± 1.2* Lactobacillus acidophilus IDCC 3301 322 ± 63 182 ± 47 7.9 ± 1.8 Lactobacillus rhamnosus IDCC 2779 262 ± 34 241 ± 76 12.1 ± 1.6** Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 215 ± 43* 323 ± 63* 15.6 ± 2.3** Lactobacillus paracasei IDCC 2611 261 ± 51 270 ± 97 9.4 ± 0.9* Lactobacillus reuteri IDCC 2445 194 ± 40* 299 ± 89* 9.8 ± 2.9 Lactobacillus reuteri IDCC 2505 275 ± 68 210 ± 84 10.1 ± 2.2* Fig. 2. Cell cytotoxicity of RH3201 cells and supernatant concentrate on RAW 264.7 macrophage. Data are shown as mean ± SD of three separate experiments. N.S, not significant. Abbreviations: C-7, 10 7 cells; C-8, 10 8 cells; C-9, 10 9 cells; C-10, 10 10 cells; S-1, 1 μg of supernatant concentrate; S-10, 10 μg of supernatant concentrate; S-100, 100 μg of supernatant concentrate; S-1000, 1000 μg of supernatant concentrate. 세포생존율확인 RH3201가마우스대식세포 (macrophage) 에독성을가지는지확인하기위하여사균체와상등액농축물을 RAW 264.7 세포에처리한후세포의생존율을 MTT assay로측정하였다 (Fig. 2). 대식세포에 24시간처리한후에도전농도에서컨트롤대비유의적인세포사멸이발견되지않았다. 또한농도간에도서로유의적인차이를보이지않았기때문에 RH3201의균체와대사물은대식세포에대한세포독성이없음을확인할수있었다. RH3201 의 IgE 저하능 RH3201 의사균체와상등액농축액을 10 8, 10 9 cells/day 의 Fig. 3. Total serum IgE levels in OVA-sensitized BALB/c mice with oral feeding of RH3201 cells and supernatant concentrate on day 0, 7, 14, 21, and 28. A difference between samples and control group was considered statistically significant when *P < 0.05 and **P < 0.01. Abbreviations: C-7, 10 7 cells; C-8, 10 8 cells; SC-10, 10 mg of supernatant concentrate; SC-100, 100 mg of supernatant concentrate. 양으로매일섭취한마우스의혈중 IgE 농도를 7일간격으로측정하였다 (Fig. 3). 사균체를섭취한군은 14일차에유발군에비해상대적으로낮은 IgE 수치를유의성있게나타냈다. 특히 10 9 cells의농도로섭취한실험군에서는 28일차에매우유의적인차이를나타냈다 (P < 0.01). 이는 RH3201의사균체섭취가농도의존적으로 IgE를억제할수있다는것을확인한결과이다. 하지만상등액농축액의경우높은농도로섭취한군에서만 28일째에서야유의적으로낮아진수치를나타내었다. 앞서확인한독성실험과 IgE 억제능을생각하면균체와상등액농축물모두아토피를억제하는원료로서의가능성을가지고있다고할수있다. 미생물학회지제 52 권제 1 호
L. rhamnosus IDCC 3201 의항알레르기효과 23 Fig. 4. Influence of oral feeding with RH3201 cells and supernatant concentrate on IL-4 (A), IL-12 (B), and IFN-γ (C) cytokines production in the splenocytes from OVA-sensitized mice. IFN-γ/IL-4 ratios (D) were represented by relative values to vehicle group. A difference between samples and control group was considered statistically significant when *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001. Abbreviations were the same as Fig. 3. RH3201 투여에의한 Th1/Th2 균형변화 RH3201의사균체와상등액농축물을농도별로투여한마우스군에서의싸이토카인변화를확인하였다 (Fig. 4). 사균체를 10 8, 10 9 cells/day의양으로섭취시킨결과, IgE의비정상적인증가를일으키는 Th2 싸이토카인인 IL-4의수치를농도의존적으로감소시켰다. 또한 Th1 싸이토카인인 IL-12와 IFN-γ 는 IgE 합성을저해하여알레르기진행을억제하는것으로알려져있는데 (Borish, 1998), 이두싸이토카인모두사균체구강투여에의해농도의존적으로증가하는것을확인하였다. 상등액농축물의경우 10 mg 섭취군에서는유발군과차이를보이지않았지만, 100 mg 섭취한마우스군에서는유의적으로 IL-4는감소하고 IFN-γ는증가하는모습을볼수있었다. Th1 과 Th2 간의비율인 IFN-γ/IL-4 수치는증류수만투여한유발군에비해크게향상된모습을보였다 (Fig. 4D). 이러한 Th1/ Th2 비율의변화는농도의존적이었으며, 시험군농도별차이는앞선 IgE의양상과유사하다. 따라서 OVA 유발군에서사균체와상등액농축물이마우스의혈중 IgE 농도를감소시키는것은 Th2 싸이토카인의억제와 Th1 싸이토카인의증가를통한 Th1/Th2 균형을조절함으로써나타난결과로생각할수있다. 적요 본연구에서는우수한아토피완화능을가진유산균을선별하기위해한국인유아분변으로부터 23종의유산균을분리하였다. 후보균주들을배양하여열처리된세포와상등액농축물을각각얻었다. 우수균주선별은마우스비장세포를이용하여 IL-4의억제및 IFN-γ의증가정도를확인하는실험을 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 1
24 Lee et al. 통해진행되었다. 선별실험결과로 Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 (RH3201) 을 OVA로면역반응을유발시킨 BALB/c 마우스에투여할유산균으로선정하였다. RH3201의균체와대사물을경구투여한군에서는유발군에비해혈중 IgE의과다생성이억제된것을확인하였다. 그러한알레르기억제능은 type-1 T helper (Th1) 세포와 type-2 T helper (Th2) 세포의싸이토카인간의균형을향상시킴으로써유도되었다. 따라서 RH3201의균체와배양물은면역조절을통해아토피증상을완화시킬수있음을확인하였다. References Borish, L. 1998. Updates on cell and cytokine. J. Allergy Clin. Immun. 101, 293 297. Chauviere, G., Coconnier, M.H., Kerneis, S., Arlette, D.M., Joly, B., and Alain, L.S. 1992. Competitive exclusion of diarrheagenic Escherichia coli (ETEC) from human enterocyte-like Caco-2 cells by heat-killed Lactobacillus. FEMS Microbiol. Lett. 91, 213 217. Claes, I., Segers, M., Verhoeven, T., Dusselier, M., Sels, B., Keersmaecker, S., Vanderleyden, J., and Lebeer, S. 2012. Lipoteichoic acid is an important microbe-associated molecular pattern of Lactobacillus rhamnosus GG. Microb. Cell Fact. 11, 161. Cross, M.L., Stevenson, L.M., and Gill, H.S. 2001. Anti-allergy properties of fermented foods : an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria. Int. Immunopharmacol. 1, 891 901. Fujiwara, D., Inoue, S., Wakabayashi, H., and Fujii, T. 2004. The anti-allergic effects of lactic acid bacteria are strain dependent and mediated by effects on both Th1/Th2 cytokine expression and balance. Int. Arch. Allergy Immunol. 135, 205 215. Gail, C.M. 2007. Use of probiotics: Benefits of a balanced microbiome in the intestinal tract. National Parent Club Canine Health Conference pp. 19 21. Herich, R. and Levkut, M. 2002. Lactic acid bacteria, probiotics and immune system. Vet. Med. Czech. 47, 169 180. Ishida, Y., Nakamura, F., Kanzato, H., Sawada, D., Hirata, H., Nishimura, A., Kajimoto, O., and Fujiwara, S. 2005. Clinical effects of Lactobacillus acidophilus strain L-92 on perennial allergic rhinitis : A double-blind, placebo-controlled study. J. Dairy Sci. 88, 527 533. Kato, I., Tanaka, K., and Yokokura, T. 1999. Lactic acid bacterium potently induces the production of interleukin-12 and interferonγ by mouse splenocytes. Int. J. Immunopharmacol. 21, 121 131. Kelly, D., Conway, S., Aminov, R. 2005. Commensal gut bacteria: mechanisms of immune modulation. Trends Immunol. 26, 326 333. Majamaa, H. and Isolauri, E. 1997. Probiotics : A novel approach in the management of food allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 179 185. Retnaninggtyas, L.P., Sudarmo, S.M., Harsono, A., and Damanik, S.M. 2008. Effect of probiotic on the fecal siga level in preterm infants. Paediatr. Indones 48, 246 252. Schwandner, R., Dziarski, R., Wesche, H., Rothe, M., and Kirsehning, C.J. 1999. Peptidoglycan and lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. J. Biol. Chem. 274, 1746 1749. Styriak, I., Nemcova, R., Chang, Y.H., and Ljungh, A. 2003. Binding of extracellular matrix molecules by probiotic bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 37, 329 333. Vercelli, D. 1995. Immunoglobulin E regulation in humans, 1989-1994. Allergy, 50, 5 8. Xu, M., Zhao, M., Yang, R., Zhang, Z., Li, Y., and Wang, J. 2013. Effect of dietary nucleotides on immune function in Balb/C mice. Int. Immunopharmacol. 17, 50 56. Yazdanbakhsh, M., Kremsner, P.G., and van Ree, R. 2002. Allergy, parasites, and the hygiene hypothesis. Science 296, 490 494. Yu, J.H., Jang, S.O., Kim, B.J., Song, Y.H., Kwon, J.W., Kang, M.J., Choi, W.A., Jung, H.D., and Hong, S.J. 2010. The effects of Lactobacillus rhamnosus on the prevention of asthma in a murine model. Allergy Asthma Immunol. Res. 2, 199 205. 미생물학회지제 52 권제 1 호