Ann Clin Microbiol Vol. 20, No. 4, December, 2017 https://doi.org/10.5145/acm.2017.20.4.103 pissn 2288-0585 eissn 2288-6850 Rapid Detection of Group B Streptococcus Using ChromID STRB and PCR in the Pregnant Women Dong-Hyun Lee 1, Hyoshim Shin 1, Sunjoo Kim 1,2 1 Department of Laboratory Medicine, Gyeongsang National University School of Medicine, Gyeongsang Institute of Health Sciences, Jinju, 2 Department of Laboratory Medicine, Changwon Gyeongsang National University Hospital, Changwon, Korea Background: Group B Streptococcus (GBS) can be transmitted to neonates during delivery through the birth canal. As awareness of neonatal GBS infections is increasing, more rapid and efficient screening tests are required. The aim of this study was to evaluate the performance of ChromID STRB (biomérieux, France) and PCR compared with the standard culture method. Methods: Recto-vaginal swabs were collected from 775 pregnant women from April 2016 to March 2017. Cotton swab cultures were grown in LIM broth overnight and then subcultured onto blood agar plates and ChromID STRB. PCR was carried out to detect atr genes specific for GBS. Results: The carrier rate of GBS was 5.9% (46/775). The sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were 83.8%, 99.3%, 86.1%, and 99.2%, respectively, for ChromID STRB and 89.2%, 99.6%, 91.7%, and 99.5%, respectively for PCR. Both ChromID STRB and PCR detected 6 more cases compared to the standard culture. Conclusion: Chromogenic agar, ChromID STRB, and PCR using the atr gene showed excellent performance to screen for GBS. To administer prophylactic antibiotics efficiently, either selective chromogenic agar or PCR could be used in addition to the standard culture. (Ann Clin Microbiol 2017;20:103-108) Key Words: Group B Streptococcus, Infection, Pregnancy, Streptococcus agalactiae INTRODUCTION Group B Streptococcus (GBS, Streptococcus agalactiae) 는신생아패혈증및수막염의가장주요한원인이다 [1]. GBS 감염은감염의시기에따라조발형감염 (early-onset infection) 과지발형감염 (late-onset infection) 으로나누어지며, 분만전후에산모의산도를통하여신생아에게수직전파된다 [2]. 특히, 생후일주일이내발생하는조발형감염은신생아 GBS 감염의약 80% 를차지하고, 지발형감염보다심각한후유증을일으킬수있다 [1,3]. 미국질병관리본부 (CDC) 통계자료에의하면, 산모에서 GBS 집락률은 10-30% 로추산되고, 조발형 GBS 감염의발생률은신생아 1,000명당 1.7명으로보고하고있다 [4]. GBS 선별검사의중요성이증가함에따라다양한진단법들이개발되어왔다. 이상적인 GBS 선별검사는낮은수의 GBS 균을보균하더라도민감하게검출할수있어야하고, 검사시간이짧아야한다. 표준배양은 LIM 액체배지 (Todd-Hewitt broth with colistin and nalidixic acid) 에하룻밤증균한후, 혈액한천배지에접종하고, 완전용혈을보이는집락을대상으로동정하기때문에검사시간이최대 72시간정도소요되고 GBS 검출률이 54-87% 밖에되지않는다 [5,6]. 표준배양과비교하여빠르고효율적인결과를얻기위하여새로운진단법들이연구되고있다. 이러한방법들중현재검사실에서많이쓰이는방법으로는라텍스응집법, 선택적발색배지 (selective chromogenic media), 핵산증폭법 (nucleic acid amplification tests) 등이있다. 2010년에개정된미국질병관리본부 (CDC) 가이드라인에서는조발형 GBS 감염의예방을위하여모든산모에서임신 35주에서 37주사이에질-직장에서채취한검체에대하여민감도와신속성의증대를위하여증균배지에 18-24시간배양후선택적발색배지검사, 연쇄중합효소반응 (PCR) 과같은핵산증폭법을표준배양검사와병행하여시행하도록권장하고있다 [4]. 선택적발색배지는질-직장에상재하는정상상재균의증식을억제하고, GBS 존재시집락의색깔이특정색으로변하게하여다 Received 27 September, 2017, Revised 2 November, 2017, Accepted 8 November, 2017 Correspondence: Sunjoo Kim, Department of Laboratory Medicine, Changwon Gyeongsang National University Hospital, 11 Samjungja-ro, Seongsan-gu, Changwon 51472, Korea. (Tel) 82-55-214-3072, (Fax) 82-55-214-3087, (E-mail) sjkim8239@hanmail.net c The Korean Society of Clinical Microbiology. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 103
104 Ann Clin Microbiol 2017;20(4):103-108 른균들과쉽게구별할수있게해준다. 하지만 GBS와유사한집락이자란경우반드시라텍스응집법또는 CAMP 검사법같은추가적인검사로확인하여위양성을배제해야한다. 선택적발색배지의유용성은이미여러연구를통해밝혀져있다. Verhoeven 등 [7] 은 GBS 선택적발색배지인 Granada medium (biomérieux, Marcy l Etoile, France), Billiance GBS (Thermo Fisher Scientific, Dardilly, France), ChromID Strepto B agar (ChromID STRB, biomérieux) 등의성능을비교한연구에서이들의민감도는각각 94.3%, 100%, 100%, 특이도는각각 100%, 90.3%, 98.8% 라고하였다. 핵산증폭법을이용한연구역시지금까지활발히진행되어왔고, 일부연구에서 GBS의피막형 (capsular type) 을알아내기위하여사용되었다 [8,9]. GBS 검출에대하여다양한유전자표적이존재하는데, 이중 atr 유전자는 GBS에특이적인유전자로알려져있다. atr 유전자는모든 GBS에존재하고발현되는필수유전자이다. 또한이유전자는살림유전자 (housekeeping gene) 이므로돌연변이확률이매우낮다 [10]. 국외에서는 GBS 보균율과 GBS 검출을위한다양한진단방법들에대하여비교평가한문헌들이많지만, 국내에서는그러하지못하다. 그리고아직까지국내에서표준배양과 GBS 발색배지, 중합효소연쇄반응을비교한연구는발표된바없다. 이연구의목적은최근국내산모의 GBS 보균율을알아보고, GBS 검출을위하여표준배양을참고검사로하여발색배지인 ChromID STRB의성능과 atr 유전자를이용한중합효소연쇄반응의유용성을평가하고자하였다. MATERIALS AND METHODS 1. 대상및검체수집 2016년 4월부터 2017년 3월까지진주경상대학교병원과창원경상대학교병원에내원한산모중 GBS 선별검사가의뢰된검체를대상으로시행하였다. 임신 35주이후에내원한산모를대상으로하였고, 질-직장부위에서검체를면봉으로채취하였다. 검체채취후수송배지 (Asan Pharmaceuticals Co. Ltd., Hwasung, Korea) 에넣고즉시검사실로운송하였다. 본연구는경상대학교병원연구윤리위원회 (IRB) 심의를거친후시행하였다 (2016-06-008). 1 ml를 Eppendorf Tube에옮겨담아 70ºC 냉동고에보관하였다. 혈액한천배지의경우집락의성상과용혈성을관찰한후, VITEK-2 시스템 (biomérieux) 을이용하여동정하였다. ChromID STRB 발색배지는집락의색깔을관찰하여판독하였다. ChromID STRB에서 GBS가증식될경우분홍색또는적색의집락이나타나고, GBS 외다른균이존재하는경우억제되거나, 청색또는무색의집락이나타나집락의색깔로구별이용이하였다. 첫판독시음성인경우, 추가로 24시간더배양하여최종결과를판단하였다. 표준배양이음성이면서 ChromID STRB에서붉은색으로자란집락역시 VITEK-2 시스템을이용해동정하여확인하였다. 2) 중합효소연쇄반응 (PCR): GBS를확인하기위하여중합효소연쇄반응을통하여 atr 유전자를검출하였다. 시발체로는이미보고된바있는 atr 유전자로명명된염기서열을이용하였다 (Table 1) [11]. 핵산추출을위하여 AccuPower DNA Extraction Kit (Bioneer, Chungwon, Korea) 를사용하였다. PCR 전처리를위해 DNA 추출액 5 μl, 시발체각 10 pmol과증류수를 AccuPower PCR PreMix Kit (Bioneer) 에혼합하여총 20 μl의반응용액을만들었다. 중합효소연쇄반응은 Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Singapore) 를이용하여, 94 o C에서 1분간반응시킨후, 94 o C에서 1분, 55 o C에서 45초, 72 o C에서 1 분씩 30회증폭반응시키고, 72 o C에서 10분간연장반응시켰다. 증폭된 PCR 반응물은 2.0% Safe shine Agarose gel (Biosesang, Seongnam, Korea) 에서 30분간전기영동하여최종산물을확인하였다. PCR의정도관리를위하여 GBS 표준균주 (ATCC 27591) 를양성대조군으로, 증류수를음성대조군으로이용하였다. 3. 통계분석두병원간의양성률에유의한차이가있는지를확인하기위하여 Pearson's chi-square test를이용하였고, 각진단검사법의민감도, 특이도, 양성예측률, 음성예측률을계산하였다. 두가지진단방법간의유의한차이가있는지확인하기위하여 McNemar test를이용하였다. 통계분석은 MedCalc Statistical Software 버전 17.8.6 (MedCalc Software, Ostend, Belgium) 와 SPSS 버전.18.0 (SPSS Statistics, Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을사용하였다. 2. 검사방법 1) 표준배양및선택적발색배지배양 : 도착한면봉검체는 LIM 액체배지 (Asan Pharmaceuticals Co. Ltd.) 에접종하여 36ºC 배양기에 18-24시간동안배양하였다. 이후배양된 LIM 액체배지용액 10 μl를혈액한천배지와선택적발색배지인 ChromID STRB에접종하여 36ºC 배양기에 18-24시간동안배양하였다. 추후유전자증폭검사를위하여 LIM 액체배지용액 Table 1. Primer sequences that were used in PCR for GBS detection Amplified gene Primer sequence (5-3 ) Size (bp) atr Forward CAA CGA TTC TCT CAG CTT TGT TAA 780 Reverse TAA GAA ATC TCT TGT GCG GAT TTC
Dong-Hyun Lee, et al. : Rapid Detection of GBS 105 RESULTS 연구기간동안총 777개의검체가수집되었고, 이중중복을제외한 775개의검체가포함되었다. 표준배양시양성검체는 37건, 음성검체는 738건이었고, 양성률은 4.8% (37/775) 였다. 지역별로는진주는양성 11건, 음성 132건으로 GBS 양성률은 7.7% (11/143) 였고, 창원은양성 26건, 음성 606건으로 GBS 양성률은 4.1% (26/632) 로차이가있었다. 하지만두지역간양성률의차이는통계적으로유의하지않았다 (P=0.07). 양성의기준을세가지검사법중한가지이상양성인경우로정의한다면, GBS 양성률은 5.9% (46/775) 였다. ChromID STRB 검사에서 GBS 양성은 37건, 음성은 738건이었다. 표준배양에서 GBS 양성으로나온 37건중, ChromID STRB 검사에서양성인경우는 31건이었다. 표준배양에서는양성이고, ChromID STRB에서음성인경우는 6건이었고, 표준배양에서는음성이고, ChromID STRB에서양성인경우가 6건이었다 (Table 2). 중합효소연쇄반응검사에서 GBS 양성은 39건, 음성은 736 건이었다. 표준배양과중합효소연쇄반응모두양성으로나온경우는 33건이었다. 표준배양에서양성이고, 중합효소연쇄반응에서음성으로나온경우는 4건이었고, 표준배양에서음성이고, 중합효소연쇄반응에서양성으로나온경우는 6건이었다 (Table 2). 표준배양을기준으로 ChromID STRB와중합효소연쇄반응을평가하였을때, ChromID STRB의민감도는 83.8%, 특이도는 99.3%, 양성예측률은 86.1%, 음성예측률은 99.2% 였다 (Table 3). 중합효소연쇄반응의경우민감도는 89.2%, 특이도는 99.6%, 양성예측률은 91.7%, 음성예측률은 99.5% 로나타났다. 두검사의민감도와특이도를비교하였을때유의한차이는없었다 (P=0.80). 결과보고까지의검사시간은 LIM 액체배지에공통적으로배양한시간을제외하면, 중합효소연쇄반응은 6-8시간, ChromID STRB는 18-24시간정도소요되었다. 하지만 ChromID STRB Table 2. Combination of the results of each screening test of GBS Standard culture PCR ChromID STRB N Positive Positive Positive 27 Positive Positive Negative 6 Positive Negative Positive 4 Negative Positive Positive 3 Positive Negative Negative 0 Negative Positive Negative 3 Negative Negative Positive 3 Negative Negative Negative 729 Total 775 에서 4 개의검체는 24-48 시간사이에양성판독이가능하였다. DISCUSSION GBS는그람양성의피막화된세균으로서화농성사슬알균에속한다. 대부분의 GBS는건강한성인의소화관과요로, 여성의질등에임상적인증상없이집락을형성하고있지만신생아와면역기능이저하된환자에서심각한침습성감염을일으킬수있다 [12,13]. 지금까지알려진각국의보고에따르면, 산모에서 GBS 보균율은유럽은 10-30% [14,15], 미국은 25-37% [16,17] 로높지만, 우리나라의경우 3.4-5.9% 로낮게보고되었다 [18,19]. 하지만최근국내연구에서 GBS 보균율은 7.9-8.3% 로이전보다높게보고된바있다 [20,21]. 본연구에서는산모에서 GBS 보균율이약 5.9% 로최근의연구에비하여낮았지만, 진주의경우보균율이 7.7% 로서최근자료와유사하게관찰되었다. 이는국내에서신생아에서 GBS 감염기회가증가하는것을시사한다. GBS 검출을위해산모의질-직장으로부터검체를채취한후수송배지를이용하였고, 만약검사를즉시할수없는경우냉장보관을하였다 [22]. 산모의질-직장을통해얻어진검체는해당부위의정상세균총이함께존재하기때문에, 직접배양을시도할경우 GBS 분리가어려워질수있다. 따라서직장의정상세균총을억제할수있는 Baker 액체배지 [23] 또는 LIM 액체배지에우선배양할것을권장하고있다 [4]. 실제로한연구에서혈액한천배지, colistin-nalidixic acid agar (CNA) 발색배지인 strep B select (SBS) 에질분비물검체를직접배양시분리율은각각 51.6%, 64.5%, 77.4% 였지만, LIM 액체배지에우선배양한후다시계대배양한경우분리율은각각 90.3%, 93.1%, 96.8% 로증가하였다 [24]. 본연구에서는질-직장도말검체에대하여먼저 LIM 액체배지를사용하였다. 표준법인혈액한천배지에계대배양한경우, 일부검체에서장내세균이함께자라판독이어려웠다. Table 3. Performance of ChromID STRB and PCR test compared to standard culture (95% confidence interval) Parameters ChromID STRB PCR Sensitivity (%) 83.9 (68.0-93.8) 89.2 (74.6-97.0) Specificity (%) 99.3 (98.4-99.8) 99.6 (98.8-99.9) Positive predictive value 86.1 (71.9-93.8) 91.7 (78.0-97.2) (%) Negative predictive value 99.2 (98.3-99.6) 99.5 (98.7-99.8) (%) P value* 1.00 0.75 Turn-around time (hours) 18-48 6-8 *Compared with standard culture method; TAT does not include primary culture in the LIM broth.
106 Ann Clin Microbiol 2017;20(4):103-108 이상적인선별검사지표의조건은우수한민감도와높은음성예측률, 그리고신속한결과보고이다. 이전에발표된연구들에서중합효소연쇄반응의민감도는 87-91%, 음성예측률은 97-98% 로보고되었다 [6,25]. 본연구에서 ChromID STRB의민감도는 83.9% 로약간낮았지만, 중합효소연쇄반응의민감도는 89.2% 로서이전연구와유사한수준으로관찰되었다. 두검사모두음성예측률은 99% 이상높게관찰되었다. 두검사모두표준배양만시행했을때에비하여, 6건에서추가적으로양성으로판정할수있었다. 이중표준배양에서음성이고 ChromID STRB와 PCR에서모두양성을보인 6건과표준배양과 PCR에서음성이고, ChromID STRB 에서만양성인경우 3건에대해서는 VITEK-2 시스템 (biomérieux) 을이용하여확인하여 S. agalactiae 균을확인하였다. 하지만, 잔여검체가부족하여표준배양과 ChromID STRB에서음성이고, PCR에서만양성으로나온검체 3건에대하여염기서열분석법등의방법으로추가적인동정검사를시행하지는못하였다. 중합효소연쇄반응의검사시간은 6-8시간정도로 ChromID STRB와비교하였을때최대 18시간가량짧았고, 민감도와양성예측률의측면에서더좋은성능을보였다. ChromID STRB 검사는검사과정이매우간편하지만판독까지의시간이오래소요된다. ChromID STRB에서양성으로나타난검체는대부분 24시간이내에관찰할수있었다. 하지만 4건의검체에서 24 시간이후에집락을나타내는경우가있었고, 이것은 ChromID STRB로 GBS를검출하는데있어판독시간이연장되는요인으로작용할수있다. 반면중합효소연쇄반응은검체전처리과정에많은시간이소요되고, 고가의장비와검사자의숙련도가요구된다. 최근에는일부검사실에서실시간중합효소연쇄반응을이용한자동화장비까지사용하고있고, 표준배양과의성능비교에서도월등히우수한결과를보였다 [6]. 여성생식기의주된세균총은매우느리게자라는균들로구성되어있고, 반면에직장의세균총은양적으로도많고증식속도도빠르다. 따라서양쪽부위에서검체를채취하는경우, LIM 액체배지같은선택적증균배지를사용하여직장의정상세균총의증식을억제하여도일부에서는 GBS균이매우낮은농도로존재하므로, 표준배양에서적은수의집락을형성한다고알려져있다 [26]. 한연구에서표준배양이양성이면서선택적발색배지에서음성을보이는경우를분석한결과모두표준배양에서 5개미만의집락을보였다고하였다 [27]. 본연구에서는 ChromID STRB 검사에서 6건의위음성이관찰되었다. 6건중 3건의검체에서는표준배양에서집락수가 5개미만으로적었다. 분만중효율적인항생제의예방적투여를위하여중요한전제조건은분만전에질-직장에집락화되어있는 GBS를신뢰할수있는방법으로빠르게검출하는것이다 [4,12]. 드물지만산모가분만전 GBS 보균검사를실시하지않은경우, 표준배양에비하여빠른검사법이필요할수있다. 본연구에서 ChromID STRB 와중합효소연쇄반응을이용한 GBS 검출법모두현재 gold standard 로알려진표준배양검사법을참고검사로비교하였을때우수한특이도와음성예측도를가지며, GBS 검출시간을단축할수있었으며, 상호보완적이었다. 결론적으로표준배양만을사용하여 GBS 선별검사하는경우일부에서는위음성의결과를보일수있다. 위양성으로인하여항생제의오용이증가하는것도문제이지만, 위음성으로인하여신생아 GBS 감염이발생하는것또한큰문제이다. 따라서미국질병관리본부에서권고하는것처럼표준배양외에도본연구에서이용한선택적발색배지나중합효소연쇄반응과같은추가적인검사방법을병행하여 GBS를검출하는것이바람직하겠다. 현재우리나라에서산모의 GBS 보균율은여러국내문헌을통하여볼때점차적으로증가하는추세이며, 정확한보균율및신생아감염실태를파악하기위하여국가적단위의조사가필요할것으로생각된다. ACKNOWLEDGMENTS 본연구는대한임상미생물학회의지원 (2016년) 을받아수행되었음. REFERENCES 1. Bergeron MG, Ke D, Ménard C, Picard FJ, Gagnon M, Bernier M, et al. Rapid detection of group B streptococci in pregnant women at delivery. N Engl J Med 2000;343:175-9. 2. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Early-onset and late-onset neonatal group B streptococcal disease--united States, 1996-2004. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005;54: 1205-8. 3. Stoll BJ, Hansen NI, Sánchez PJ, Faix RG, Poindexter BB, Van Meurs KP, et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics 2011;127: 817-26. 4. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep 2010;59:1-36. 5. Davies HD, Miller MA, Faro S, Gregson D, Kehl SC, Jordan JA. Multicenter study of a rapid molecular-based assay for the diagnosis of group B Streptococcus colonization in pregnant women. Clin Infect Dis 2004;39:1129-35. 6. Park JS, Cho DH, Yang JH, Kim MY, Shin SM, Kim EC, et al. Usefulness of a rapid real-time PCR assay in prenatal screening for group B streptococcus colonization. Ann Lab Med 2013;33: 39-44. 7. Verhoeven PO, Noyel P, Bonneau J, Carricajo A, Fonsale N, Ros A, et al. Evaluation of the new brilliance GBS chromogenic medium for screening of Streptococcus agalactiae vaginal colonization in pregnant women. J Clin Microbiol 2014;52:991-3. 8. Yao K, Poulsen K, Maione D, Rinaudo CD, Baldassarri L, Telford JL, et al. Capsular gene typing of Streptococcus agalactiae compared to serotyping by latex agglutination. J Clin Microbiol 2013;51:503-7.
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108 Ann Clin Microbiol 2017;20(4):103-108 = 국문초록 = 산모에서발색배지와중합효소연쇄반응을이용한 B 군사슬알균의신속한검출 1 경상대학교의과대학진단검사의학교실, 건강과학연구원, 2 창원경상대학교병원진단검사의학과이동현 1, 신효심 1, 김선주 1,2 배경 : Group B Streptococcus (GBS) 신생아감염은분만중산모의질을통해수직전파된다. 산모에서 GBS 선별검사의중요성이증가함에따라빠르고효율적인검사의필요성이증가했다. 본연구에서는발색배지인 ChromID STRB (biomérieux, France) 와중합효소연쇄반응의성능을표준배양법과비교하였다. 방법 : 2016년 4월부터 2017년 3월까지임신 35주가지난산모 775명에대해질-직장부위에서도말검체를채취하였다. 채취된면봉검체는 LIM 액체배지에서하룻밤배양한후혈액한천배지와 ChromID STRB에접종을하였고, atr 유전자를이용한중합효소연쇄반응을시행하였다. 결과 : 산모에서 GBS 보균율은 5.9% (46/775) 였다. 표준배양법과비교했을때, ChromID STRB의민감도는 83.8%, 특이도는 99.3%, 양성예측률은 86.1%, 음성예측률은 99.2% 였다. 중합효소연쇄반응의민감도는 89.2%, 특이도는 99.6%, 양성예측률은 91.7%, 음성예측률은 99.5% 였다. 두검사모두표준배양법만사용했을때에비하여, 추가적으로 6건을양성으로검출할수있었다. 결론 : 발색배지인 ChromID STRB와 atr 유전자를이용한중합효소연쇄반응모두 GBS 선별검사에적용하기에충분한성능을보였다. 산모에서항생제의효율적인예방적투여를위하여 GBS 선별검사시행시표준배양외에선택적발색배지나중합효소연쇄반응과같은신속한검사법의사용이필요하다고판단하였다. [Ann Clin Microbiol 2017;20: 103-108] 교신저자 : 김선주, 51472, 경남창원시성산구삼정자로 11 창원경상대학교병원진단검사의학과 Tel: 055-214-3072, Fax: 055-214-3087 E-mail: sjkim8239@hanmail.net