J Koren Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 44(4), 475~482(2015) http://dx.doi.org/10.3746/jkfn.2015.44.4.475 리치저분자폴리페놀인 Oligonol 의 Streptozotocin 투여당뇨쥐에서산화적스트레스와관련된간손상에미치는영향 노정숙 동명대학교식품영양학과 Effect of Oligonol, Low Moleculr Weight Polyphenol Derived from Lychee on Oxidtive StressRelted Heptic Dmge in StreptozotocinInduced Dietic Rts Jeong Sook Noh Deprtment of Food Science & Nutrition, Tongmyong University ABSTRACT This study ws conducted to exmine whether or not oligonol, low moleculr weight polyphenol derived from lychee fruit, hs n meliortive effect on dietesinduced oxidtive stressrelted heptic dmge in streptozotocin (STZ)induced dietic rts. Oligonol (10 or 20 mg/kg ody weight; O10 or O20, respectively) ws orlly dministered every dy for 10 dys to STZinduced dietic rts, nd its effects were compred to vehicletreted dietic (Veh) nd nondietic rts. Administrtion of 20 mg/kg of oligonol significntly decresed liver weight compred with the Veh group (P<5). Elevted levels of heptic glucose, rective oxygen species, peroxynitrite, nd lipid peroxidtion were detected in dietic vehicle rts, wheres oligonol tretment significntly ttenuted these levels (P<5). In dietic vehicle rts, heptic ntioxidnt enzyme protein levels decresed, wheres oligonol tretment showed significnt elevted results. For inflmmtionrelted protein expression, oligonoltreted groups showed insignificnt reduction. Oligonol improved expression of propoptotic protein cspse3 in the liver of dietic rts (P<5). In conclusion, these results provide importnt evidence tht oligonol exhiits n inhiitory effect on oxidtive stress nd poptosisrelted protein expression s well s heptoprotective effect ginst the development of dietic complictions in STZinduced type 1 dietic rts. Key words: oligonol, dietic rt, heptic dmge, oxidtive stress, cspse3 서 우리사회의서구화와산업화에따른인구의고령화등으로우리나라에서도각종만성질환의발병이증가하고있다. 특히우리나라의 30세이상당뇨병유병률은 2001년 8.6% 에비해 2005년 9.1%, 2007년 9.6%, 2012년 11.0% 로같은기간의선진국에비해빠른속도로꾸준히증가하고있어서 (1) 당뇨병은국민건강을위협하는심각한요인으로지적되고있다 (2). 당뇨병은췌장의베타세포의인슐린분비량이부족하거나결핍되어발생하는대사성질환으로열량원의대사를변형시키며, 이러한대사이상은고혈압, 고지혈증, 비만및동맥경화성혈관장애를일으킨다 (35). 이러한증상외에도망막증신증, 신경장애, 감염증등이당뇨합병증으로나타날수있다. 당뇨병에서만성화된고혈당은과다한유리기 (free rdicl) 가생성되거나항산화방어기전의활 Received 28 Novemer 2014; Accepted 28 Jnury 2015 Corresponding uthor: Jeong Sook Noh, Deprtment of Food Science & Nutrition, Tongmyong University, Busn 608711, Kore Emil: jsnoh2013@tu.c.kr, Phone: +82516291716 론 성감소로산화적스트레스가증가되고지질과산화에의해각조직의염증작용증가및세포사멸진행과도관련이있다 (6,7). 따라서고혈당으로인한활성산소종의제거나염증반응또는세포사멸진행을억제하는것은주요장기에나타날수있는당뇨합병증예방의중요한예방기전이될수있을것이다. 비만과당뇨를포함한대사적장애와관련된합병증의치료제로서독성이나부작용이없는천연소재로부터효과적인물질을찾으려는노력이계속되어왔다 (8). 현재기능성식품이나식이소재들은부작용이없고자연에풍부하며, 상업적제품에용이한적용가능성으로인해많은주목을받고있다 (9). 폴리페놀이풍부한식품들, 즉포도주, 차류, 커피, 초콜릿등은건강에유익한항산화성원료로주목받고있다. 특히 ctechin류성분들, 즉 resvertrol이나 curcumin 등은항암, 항돌연변이, 항균등의효과가뛰어난것으로알려져있다 (1012). 리치 (lychee, Litchi chinensis, Spindcee) 는예로부터중국과남아시아지역에서사용돼왔다. 리치에는폴리페놀이다량함유되어있으며가식부위의폴리페놀함량은
476 노정숙 딸기다음으로높다 (13). 리치폴리페놀의특징은 ctechin 단일형태 (monomer) 와소중합체 (oligomer) 인 pronthocynidin을함유하고있다는점이다. Pronthocynidin은구조적으로 ctechin의중합체 (polymer) 이며높은분자량을가진다. 그러나중합체는경구적으로섭취하였을때소화흡수율이낮으며인체내활성또한높지않다. 게다가분자량이높은 pronthocynidin은물에잘녹지않으며특징적인쓴맛 ( 수렴적인맛 ), 즉구강단백질과구강점막수용체와결합하면서느껴지는감각으로인해식품산업에서의이용도가낮아진다 (14). Tnk 등 (15) 에의해고분자 pronthocynidin을저분자화하는기술이성공적으로개발되었고그것이식품산업에이용되고있다. 리치로부터제조된 oligonol은 15.3% monomer(ctechin 포함 ) 와 16.7% 이합체 (dimer, ctechin과 procynidin 포함 ) 의폴리페놀복합체로구성되어있는데반해리치폴리페놀은 6.4% monomer와 9.8% 이합체를함유하고있어저분자량폴리페놀함유량이낮다. Oligonol의다양한생리적효능이 in vitro와 in vivo에서관찰되었다. 항암 (16), 항산화및항염증 (17), nitric oxide 생리이용성증가효과 (18) 와지질대사조절작용 (19,20) 등이보고되었다. 게다가 2형당뇨모델인 d/d 마우스의신장조직에서항염증및최종당화생성물억제효과, 간조직에서지질대사조절을통한지질합성억제효과등이보고되어 oligonol은당뇨로인한신장및간조직의기능장애에대한보호효과가있는것으로나타났다 (2123). 그러나 oligonol을 1형당뇨동물모델에서단기간투여시간조직손상에미치는직접적영향에대한결과가미흡하다. 따라서본실험에서는 oligonol을 streptozotocin으로 1형당뇨를유발한쥐에단기간투여하여간조직에서증가된산화적스트레스억제, 염증인자및세포사멸과관련된효소발현에미치는영향에대해살펴보고자한다. 재료및방법실험재료본실험에사용된 oligonol의추출및제조, 분석등은 Tnk 등 (15) 에의해수행되었다. 즉건조리치를 50% (v/v) 에탄올로추출 농축하고흡착제를충진한칼럼을통과시켜여과하였다. 여과하여얻어진리치에탄올추출물을녹차추출액, citric cid와혼합하여 60 C에서 16시간가열하고다시여과한다음, 40%(v/v) 에탄올로추출및농축한 oligonol을 Amino Up Chemicl(Spporo, Jpn) 로부터제공받아실험에사용하였다. 실험동물및시료투여실험동물은체중 100 g 내외의 SprgueDwley 수컷 rts로효창사이언스 (Degu, Kore) 에서구입하였다. 실험동물실의환경은온도 23±3 C, 습도 50±20%, 명암주기는 12시간으로유지하였다. 사료는고형사료와물을충분히공급하면서 7일간실험실환경에적응을위하여자유롭게섭취하도록하였다. Streptozotocin(STZ, SigmAldrich Co., St. Louis, MO, USA) 을 50 mm citrte 완충용액 (ph 4.5) 에녹여 STZ 50 mg/kg을복강주사하여당뇨를유발하였다. 당뇨유발확인은 STZ 투여 48시간후, 12시간절식시키고꼬리정맥에서채혈하여혈당을측정하였다. 복강주사 14일후, 공복혈당수준이 350 mg/dl 이상일때당뇨가유발된것으로간주하고당뇨대조군 (Veh, n=8), oligonol 10 mg/kg 투여군 (O10, n=5), oligonol 20 mg/kg 투여군 (O20, n=5) 으로나누어 10일동안실험에사용하였다. STZ 대신 uffer만투여한정상군 (N, n=8) 을당뇨군과비교하였다. Oligonol 투여는체중 kg당 10 mg과 20 mg을증류수에녹여존대를통해매일경구투여하였고, 정상군과당뇨대조군은실험기간동안동량의증류수를투여하였다. 실험군의체중은실험시작전과종료일에측정하였으며실험동물과정은대구한의대학교의지침에따라수행하였다 (DHU2014009). 혈액및장기적출, 샘플사이즈실험종료후 12시간동안절식시킨실험동물을에테르로마취시킨후개복하여심장에서혈액을채취하였고, 곧바로생리식염수로관류하였다. 채취한혈액은실온에서 20분간방치한후원심분리기에서 3,000 rpm, 15분동안회전시켜상층부인혈청을분리하였다. 분리한혈청은 70 C에서냉동보관한후분석에사용하였다. 간조직은적출하여 0.9% 생리식염수로세척하고여과지로물기를제거하여중량을측정한다음일정부위를채취하여각실험항목별로분리하였다. 이를액체질소로급속동결한다음냉동고에보관하면서실험에사용하였다. 실험항목별혈청및간조직샘플수는모든실험군의동물개체수로각각정상군 8개, 당뇨대조군 8개, O10군 5개, O20군 5개이다. 혈청및간조직 glucose 농도측정혈청 glucose 농도는 glucose oxidse법으로제조된포도당측정용시약 (GlucoseE kit, Youngdong Phrmceuticl Co., Seoul, Kore) 을사용하여 505 nm에서비색정량하였다. 간조직의 glucose 농도를측정하기위해먼저간조직을 0.9% NCl, 0.15 M B(OH) 2, 5% ZnSO 4 를넣어균질화한다음원심분리 (1,400 g, 15 min, 4 C) 하여상층액을분리하고, 포도당측정용시약을사용하여비색정량하였다 (24). 간조직 ROS, peroxynitrite, MDA 함량측정 ROS(rective oxygen species) 생성정도는 Ali 등 (25) 의방법을사용하였다. 먼저간조직을차가운 1 mm EDTA 50 mm sodium phosphte uffer(ph 7.4) 로마쇄하여균질화한다음원심분리하여상등액을분리하고 25 mm
Oligonol 의당뇨쥐간손상에미치는영향 477 2',7'dichlorofluorescein dicette를가하여 30분간암소에서방치한다음 excittion 468 nm, emission 530 nm 파장에서형광도를측정하였다. Peroxynitrite 소거활성은 Kooy 등 (26) 의방법에따라 dihydrorhodmine(dhr) 123 이산화되는정도로측정하였다. DHR 123(5 mm) 은 dimethylformnide로녹여서질소로 purge 한후에 80 C 에보관하였으며, 사용하기직전에암실의얼음위에서조제하여사용하였다. 실험에이용되는반응액 (200 μl) 은 90 mm sodium chloride와 5 mm potssium chloride를포함하는 50 mm sodium phosphte uffer(ph 7.4) 에 diethylentriminepent cetic cid를 100 μm로혼합하고 DHR 123 용액을 5 μm이되게혼합한후실험농도로희석한시료 10 μl와 200 μm peroxynitrite 10 μl를첨가하여사용하였다. Peroxynitrite nion 소거활성은상기의반응액을실온에서 5분간반응시킨후 excittion 파장 485 nm 와 emission 파장 530 nm로하여실온에서측정하였다. 간조직의 MDA(mlondildehyde) 농도는 MDA ELISA kit(e0597r, USCNLife, Wuhn, Huei, Chin) 을이용하여 450 nm에서 multireder기를이용하여흡광도를측정하였다. 표준용액의흡광도를통해서회귀식을산출하여간조직의 MDA 농도를계산하였다 (27). 간조직 nucler 및 postnucler frction 분리간조직의 western lotting을하기위해 rt 한마리당일정부위의간조직일부를해부직후채취하여액체질소로급속냉동하여냉동고에보관후시료로사용하였다. Nucler frction을분리하기위해먼저간조직을차가운 lysis uffer[5 mm 2mino2hydroxymethylpropne1,3 diol(tris)hcl(ph 7.5), 2 mm MgCl 2, 15 mm CCl 2, 1.5 M sucrose, 0.1 M dithiothreito(dtt), protese inhiitor cocktil] 에넣어 homogente 하였다. 원심분리 (10,500 g, 20분, 4 C) 후상등액은 postnucler frction으로, pellet 은 nucler frction을분리하기위해사용하였다. Pellet에핵추출 uffer[20 mm 2(4(2hydroxyethyl)1piperzyl) ethnesulfonic cid(ph 7.9), 1.5 mm MgCl 2, 0.42 M NCl, 0.2 mm EDTA, 25%(v/v) glycerol, 0.1 M DTT, protese inhiitor cocktil] 를첨가하여 ice에서 30 분간방치한후소거활성 (20,500 g, 5 min, 4 C) 하여상등액을 nucler frction으로사용하였다. Nucler frction은핵전사인자인 nucler fctor kppb(nfκb) 단백질발현정도를, postnucler frction은 superoxide dismutse(sod)1, ctlse, inducile nitric oxide synthse(inos), cspse3을측정하기위해사용하였다. 각 frction의단백질량은표준품으로 ovine serum lumin 을사용하고 Lowry 등 (28) 의방법을이용하여정량하였다. 간조직 western lotting 단백질이정량된샘플에 Lemmli smple uffer를혼합 하여 western lotting용샘플을조제하였다. Trget 단백질분석을위하여 10% SDSPAGE에단백질샘플을각각 20 ml 분주한후에 100 V에서전기영동하여단백질을분리하였다. 단백질분리후 100 V에서 1시간동안 polyvinylidene difluoride memrne으로전이시켰다. 전이가끝난후 5% BAS가포함된 locking uffer(tbst uffer; 50 mm TrisHCl, 150 mm NCl, 5%, Tween20) 를이용하여 locking을실시하였다. 1차항체인 SOD1, ctlse, NFκB, inos, cspse3, βctin, histone(snt Cruz Biotechnology Inc., Snt Cruz, CA, USA) 을 5% skim milk에희석한후 memrne에분주하고 4 C에서 overnight 시킨후 TBST uffer를이용하여 10분간 5회씻어내었다. 그리고 2차항체로는 got ntirit IgG (Snt Cruz Biotechnology Inc.) 를각각 1:2,000으로희석하여한시간동안반응을시킨후 TBST uffer로 10분간 5회씻어냈으며, 이에따라도출된밴드의동정은 enhnced chemiluminescence kit을이용해 memrne을발광시킨후 Xry film에현상하였다. Bnd의 density는 densitometry(biord, Hercules, CA, USA) 로정량하였다. 통계처리본실험에서얻은모든데이터는평균과표준오차로나타내었고, 각평균치간차이에대한유의성은 SPSS(Version 22.0, IBM, Armonk, NY, USA) 를이용하여 ANOVA를실시한후, Duncn's multiple rnge test로각군의평균차이에대한통계적유의성을 5% 수준에서검증하였다. 결과및고찰 STZ 당뇨유발 rt의체중, 사료섭취량, 음수량및간무게변화 STZ당뇨유발 rt의체중변화 (Tle 1) 는실험기간 10 일동안당뇨대조군이 24.5±3.0 g 감소하였고, 정상군은 18.0±2.1 g 증가하였다 (P<5). 이는 1형당뇨의전형적인증상으로당뇨가진행됨에따라사료섭취및음수량이증가하는데비해체중감소가심해진다. Oligonol 투여군은당뇨대조군과비교하여유의적으로체중감소정도가낮아졌다. 사료섭취량과음수량모두정상군에비해당뇨군에서모두유의적으로높아졌으나 oligonol 투여에따른유의적변화는나타나지않았다. 단위무게당간중량은정상군에비해당뇨대조군에서 166.7% 유의적으로증가되어 1형당뇨상태에서간의무게가증가함을알수있었다. 당뇨상태에서의간무게증가현상은인슐린저항성및결핍으로인한세포의 glucose 이용률감소와체지방의분해에따른유리지방산증가및간에서의중성지방합성이증가하기때문인것으로보고되고있다 (29). 그러나 oligonol 20 mg/kg 투여군에서당뇨대조군에비해간무게가 23% 정도유의적
478 노정숙 Tle 1. Body weight, food intke, wter intke, nd liver weight Group 1) N Dietic rt Veh O10 O20 Body weight gin (g/10 d) 18.0±2.1 2)3) 24.5±3.0 c 16.3±1.7 15.0±6.6 Food intke (g/d) 23.3±0.3 38.4±0.7 37.0±0.6 39.7±0.5 Wter intke (ml/d) 27.6±0.8 215.8±3.1 208.7±4.3 220.6±3.6 Liver weight (g) 13.0±0.7 12.6±0.6 12.5±0.6 9.5±0.3 Liver weight (g/100 mg B.W) 3.1±0.1 c 5.2±0.3 5.3±0.5 4.0±0.2 1) N: nondietic rt (n=8), Veh: vehicletreted dietic rt (n=8), O10: oligonol 10 mg/kg ody weighttreted dietic rt (n=5), O20: oligonol 20 mg/kg ody weighttreted dietic rt (n=8). 2) Results re expressed s mens±se. 3) Mens with different letters (c) within column re significntly different t P<5 y Duncn's multiple rnge test. 으로감소하였다. 이는당뇨대조군에비해체중감소가적었음에도간무게증가가낮아진것은당뇨쥐의간조직에서 oligonol의지질합성저해효과때문인것으로사료된다 (22). Tle 2. Chnges of serum nd liver glucose level Group 1) N Dietic rt Veh O10 O20 Serum glucose (mg/dl) 128.7±0.5 413.4±1.1 415.1±16.5 389.6±12.8 Heptic glucose (mg/mg protein) 103.6±6.2 c 255.5±23.5 219.2±16.0 173.8±14.9 1) Groups re the sme s Tle 1. 2) Results re expressed s mens±se. 3) Mens with different letters (c) within column re significntly different t P<5 y Duncn's multiple rnge test. Oligonol 의혈청및간조직 glucose 농도에미치는영향 Tle 2에서보는바와같이 STZ를투여한당뇨그룹이 STZ를투여하지않은정상군보다혈당치가매우높았다 (P<5). 당뇨군에 oligonol을투여한결과유의적인변화는없었으며, 선행연구와동일하게본연구에서도 oligonol 투여는혈당조절에는직접적인영향을미치지못하는것으로나타났다 (21). 그러나간조직의 glucose 농도를측정한결과정상군에비해당뇨대조군에서유의적으로크게증가한간조직내 glucose 농도는 20 mg/kg oligonol 투여시 32.0% 감소하였다 (P<5). 당뇨병상태에서는간에서 glucose uptke와 incorportion이증가하여간조직내 glucose가축적되는것으로알려져있으며 (30), 본실험에서의결과와일치하였다. 그리고 oligonol은이러한간조직내 glucose 농도를낮추었으며, 이는간조직내지나친 glucose 유입및축적에기인하는활성산소생성및당화최종생성물합성의촉진반응을억제하는작용으로사료된다. Oligonol 의 ROS, peroxynitrite, 지질과산화생성에미치는영향간조직중의 ROS 및 peroxynitrite, 지질과산화함량은 Fig. 1에서와같이당뇨대조군인 Veh군에서정상군에비해각각 12%, 160.5%, 141.4% 증가되었다. 그러나 oligonol 10 또는 20 mg/kg 투여군에서 ROS 및지질과산화생성수준은 Veh군에비해현저하게감소되어정상군수준과유사하였다 (P<5). 또한 peroxynitrite 생성또한 oligonol 20 mg/kg 투여군에서유의적으로감소하였다 (P<5). 당뇨병상태에서산화적스트레스증가는비효소적당화 (nonenzymtic glycosyltion) 와자동산화적당화 (utooxidtive glycosyltion) 의증가, 항산화방어계 (ntioxidtive defense system) 의변화등으로인하여일어난다고알려져있다 (31,32). 이러한산화스트레스로인하여생체대사과정중에 free rdicl이나지질과산화물이끊임없이생성되는데생체에는이들의축적을방지하기위해가동되는 SOD, ctlse와같은산화적방어체계가있어서이들을제거하지만질병상태에서와같이과도의산화적스트레스상태에서는방어체계가깨뜨려지므로 free rdicl A ROS. (flurescence/min/mg protein). 10000 8000 6000 4000 2000 B ONOO(μM). (fluorescence/mg protein). 200 150 100 50 c C MDA. (nmol/mg protein). 0.10 8 6 4 2 0 0 0 Dietic rts Dietic rts Dietic rts Fig. 1. ROS, ONOO, nd MDA production in the liver. Groups re the sme s Tle 1. Results re expressed s mens±se. Mens with different letters (c) ove the rs re significntly different t P<5 y Duncn's multiple rnge test.
Oligonol 의당뇨쥐간손상에미치는영향 479 생성이증가된다. 생성된 superoxide rdicl(o 2 ), peroxynitrite(onoo ), hydroxyrdicl( OH) 등은세포에상해를주며, 특히세포막의다불포화지방산에작용하여지질과산화물을생성하고이로인해세포의기능을손상시키는것은이미알려져있다 (33). 활성산소외에산화적스트레스를증가시키는또다른활성물질인산화질소역시염증반응의매개자로작용하는데염증반응이활성화되면여러종류의세포에서 inos의발현이촉진되고그로인하여산화질소의생성량이증가된다. NO는 nitric oxide synthse에의하여 Lrginine으로부터생성되는물질로체내방어기능, 신호전달기능, 혈관확장등다양한생리기능을나타낸다. 그러나 nitric oxide의생성량이정상이상으로지속적으로상승하게되면염증성질환이발생할수있으며산소와결합하여생성된 ONOO 는세포와조직에산화적손상을주고유전자변이, 패혈성쇼크및신경손상등을일으키고생성된 ONOO 의제거능력이현저히떨어지기때문에활성산소의생성을억제하든지병리적 nitric oxide 생성효소발현을낮추는것이매우중요하다 (34,35). 1형당뇨에있어간조직의과산화물생성정도를알아보기위해 MDA 농도를측정하였다. Fig. 1에서정상군에비해당뇨대조군에서 MDA 농도가유의적으로높았으며, 이렇게증가된 MDA의농도는 oligonol을투여한 O10군과 O20군모두에서유의하게낮아졌다 (P<5). 생체내지질과산화물은 DNA를손상하며발암, 돌연변이, 유전자의손실및노화의기전으로알려져있다. 이는당뇨발생시산화적스트레스의증가로인하여조직내의과산화물이증가하였고이는간조직에서 MDA 함량이증가했다는다른보고 (36,37) 와같으며, STZ로당뇨를유도한쥐에서간의지질과산화함량의증가는조직의손상을더욱가속화할것으로사료된다. 그러나 oligonol을투여한결과 O10과 O20군모두에서지질과산화물함량이낮아졌으며이는 ROS 및 ONOO 와같은 free rdicl 제거능과함께간조직의산화적스트레스를완화시키는요인으로작용한것으로생각된다. Oligonol 의간조직 SOD 및 ctlse 단백질발현에미치는영향 SOD는 superoxide rdicl을환원시켜 H 2O 2 로전환시키며이때생성된 H 2O 2 등은 GSHperoxidse, ctlse 등의작용에의해 H 2O로무독화됨으로써산소독으로부터생체를보호하게되는것이다 (38). Microsome의 cytochrome P450 및 mitochondri의 respirtory generting system에의해생성되는 ROS는여러종류의질병유발에관여한다 (39). 고혈당성당뇨상태에서는 ROS 생성계가활성화되는반면 ROS 소거활성은감소한다 (40). 본실험결과 STZ로유발한당뇨쥐에서간조직의 SOD 및 ctlse 발현정도는정상군에비해당뇨유발군에서현저히감소하였으나 oligonol 투여군에서는 SOD 및 ctlse 단백질발현이유의적으로증가하였다 (Fig. 2). 이것은 oligonol의활성산소생성억제및지질과산화억제효과는직접적인라디칼소거효과에기인하는것으로사료된다. Oligonol에는 ctechin 기본구성 monomer와 oligomer가다량함유되어있고이러한물질들의활성산소종소거능은매우효과적인것으로보고되고있다 (41). Oligonol의간조직 NFκB 및 inos 단백질발현에미치는영향 Fig. 3에서보는바와같이 STZ유발당뇨쥐의간조직에서염증조절전사인자인 NFκB와그타깃단백질인 inos 의발현정도를측정하였다. 정상군에비해당뇨대조군의 NFκB 및 inos 단백질발현이유의적으로증가하였다 (P< 5). 그러나 oligonol 투여군에서는높아진염증성인자의발현이낮아지는경향은보였으나유의적이지않았다. 활성산소는 NFκB를활성화시켜염증촉진 cytokine과 chemokine, 성장인자들의발현을촉진하고저밀도지단백의과산화 (oxidizedldl) 를증가시켜여러조직에서 tumor necrosis fctor(tnf)α와 interleukin(il)6 등의염증촉진물질들을증가하게한다 (42). 염증반응은광범위한외부자극에대하여신체를보호하기위한가장중요한면역작용 A SOD1 βctin B Ctlse βctin SOD1 (fold of N). 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Ctlse (fold of N). 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Dietic rts Dietic rts Fig. 2. Heptic SOD1 nd ctlse expressions. Groups re the sme s Tle 1. Results re expressed s mens±se. Mens with different letters (,) ove the rs re significntly different t P<5 y Duncn's multiple rnge test.
480 노정숙 A NFκBp65 B inos Histone βctin NFκBp65 (fold of N). 1.6 1.2 0.8 0.4 inos (fold of N). 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Dietic rts Dietic rts Fig. 3. Heptic NFκBp65 nd inos expressions. Groups re the sme s Tle 1. Results re expressed s mens±se. Mens with different letters (c) ove the rs re significntly different t P<5 y Duncn's multiple rnge test. 중의하나이지만그정도가과도하거나장기화되면여러가지질환을유발하게되는데염증상태에서는대식세포가활성화되어과도한산화질소와 prostglndin(pg) E 2, TNFα, 염증촉진성사이토카인, 부착성물질등의분비를증가시키는것이특징이다 (43). 증가된 TNFα는당뇨병성지방간초기단계에서간의직접적인손상을유도하며, IL1β는간조직의섬유화에관여하는 fironectin의발현을증가시킨다. 선행연구에서제2형당뇨동물모델에 8주간 oligonol을투여한후염증인자발현을억제한결과를살펴보았을때본연구에서 oligonol 투여군의결과는실험기간이단기간인것을감안하면당뇨쥐의간조직에서유전자적조절기전이진행중인것으로사료된다. Oligonol 의간조직 cspse3 단백질발현에미치는영향세포사멸과밀접한관련이있는간조직 cspse3 단백질발현정도를측정하였다 (Fig. 4). 간조직 cspse3 발현은정상군에비해 STZ 투여당뇨대조군에서크게증가하였다 (P<5). 그러나당뇨대조군에비해 oligonol 투여군에서증가된 cspse3 발현이유의적으로억제되었다 (P<5). 이러한결과는 STZ 투여로인해간조직의세포사멸과관련된 cspse3 활성이증가되어간손상이유발되었으며, oligonol 투여는효과적으로효소발현정도를낮추어세포사멸과관련된간조직손상을억제할것으로사료된다. 특히 oligonol에다량함유되어있는 pronthocynidin과 polyphenol은지질산화억제와활성산소생성억제를통해산화적스트레스와관련한세포사멸을효과적으로억제한다고보고되었다 (44). 고혈당에의해유발되는산화적스트레스는각조직에많은세포적반응을일으킨다. 세포수준에서고농도글루코오스에의한세포사멸은지속적인산화적스트레스에기인한다. 과도한활성산소의생성뿐만아니라불충분한항산화력은세포구성성분에 dmge를준다. 고혈당으로유도된 free rdicl의공격은지질, 단백질과 DNA 손상에의한세포사멸을증가시킨다. 적어도프로그램된세포사멸 (poptosis) 은고농도의포도당에의한독성과관련있는것으로 Cspse 3 βctin 2.5 Cspse 3 (fold of N). 2.0 1.5 1.0 0.5 c Dietic rts Fig. 4. Heptic cspse3 expressions. Groups re the sme s Tle 1. Results re expressed s mens±se. Mens with different letters (c) ove the rs re significntly different t P< 5 y Duncn's multiple rnge test. Fig. 5. Predicted mechnism in heptic tissue on dministering oligonol ginst oxidtive stress in STZinduced dietic rts.
Oligonol 의당뇨쥐간손상에미치는영향 481 여겨진다 (45,46). Apoptosis는다양한전사인자와유전자에의해유도된다. Bx 발현이증가하고 Bcl2 발현이조절되며, 미토콘드리아에서 cytochrome c의방출이증가하면그에따라 cspse3, 9, 8이차례로활성화되어세포사멸이진행된다 (47). 또한세포사멸이진행됨에따라염증성인자인 NFκB와 inos 발현이 STZ유도당뇨시험동물모델에서증가하는것으로보고되었다 (48). 리치의폴리페놀을저분자화한 oligonol이 1형당뇨유발 rt에서의효과를 Fig. 5에도식화하였다. Oligonol 투여는고혈당과지질대사이상으로인한간의비대화를억제하였으며간조직의산화적스트레스를유발하는 ROS 및 ONOO, 지질과산화물생성을효과적으로억제하였다. 이러한 free rdicl 생성억제는간조직의항산화효소발현을유의적으로증가시켰다. 그러나염증유발인자인 NFκ B 및 inos의발현억제로나타날것으로예상하였지만 oligonol의단기간투여로간조직보효효과에대한경향은보였으나유의적이지않았다. 특히세포사멸과관련있는효소인 cspse3의단백질발현은산화적스트레스로인해증가된활성이 oligonol 투여군에서유의적인감소효과가나타났다. 요 본연구에서는 STZ 유발당뇨쥐에서고혈당및산화적스트레스관련간손상기전에 oligonol의영향에대해살펴보고자하였다. 10일동안 oligonol을투여한결과 20 mg/kg oligonol 투여군에서당뇨대조군에비해간무게및간조직의 glucose, ROS, peroxynitrite, 지질과산화물농도가유의적으로감소하였다. 간조직의항산화효소단백질발현을측정한결과정상군에비해당뇨대조군에서발현정도가낮아졌지만 oligonol 투여군에서는유의적으로증가하였다. 또한 cspse3 효소의단백질발현은당뇨대조군에서증가하였으나 oligonol 투여군에서그발현이억제되었다. 따라서 oligonol의투여는 STZ유발당뇨모델에서 ROS 및지질과산화물생성억제와항산화효소작용의증가및세포사멸작용이있는 cspse3 발현억제를통해고혈당및산화적스트레스에의해유발되는간손상에대한보호효과가있는것으로사료된다. 약 감사의글 이논문은 2013학년도동명대학교교내학술연구비지원 (2013A037) 에의하여수행되었으며, 연구비지원에감사드립니다. REFERENCES 1. Ministry for Helth, Welfre nd Fmily Affirs. The Forth Kore Ntionl Helth nd Nutrition Exmintion Survey (KNHANES IV). http://www.mw.go.kr/front_new/l/sl0301 vw.jsp?par_menu_id=04&menu_id=0403&cont_s EQ= 305115&pge=1 (ccessed Oct 2014). 2. Ahn KJ. 2010. Westerniztion of Koren dietes. Koren Clin Dietes J 11: 9194. 3. Skuri T, Tsuchiy S. 2006. Superoxide production from nonenzymticlly glycted protein. FEBS Lett 236: 406410. 4. Lyons TJ. 1991. Oxidized low density lipoproteins: role in the pthogenesis of therosclerosis in dietes? Diet Med 8: 411419. 5. Ti ES, Lim SC, Tn BY, Chew SK, Heng D, Tn CE. 2000. Screening for dietes mellitus: twostep pproch in individuls with impired fsting glucose improves detection of those t risk of complictions. Diet Med 17: 771775. 6. Schttenerg JM, Schuchmnn M. 2009. Dietes nd poptosis: liver. Apoptosis 14: 14591471. 7. Nkgmi H, Morishit R, Ymmoto K, Yoshimur SI, Tniym Y, Aoki M, Mtsur H, Kim S, Kned Y, Ogihr T. 2001. Phosphoryltion of p38 mitogenctivted protein kinse downstrem of xcspse3 pthwy leds to cell deth induced y high Dglucose in humn endothelil cells. Dietes 50: 14721481. 8. Winslow LC, Kroll DJ. 1998. Hers s medicines. Arch Intern Med 158: 21922199. 9. Jones PJ, Vrdy KA. 2008. Are functionl foods redefining nutritionl requirements? Appl Physiol Nutr Met 33: 118 123. 10. Nkym M, Suzuki K, Tod M, Okuo S, Hr Y, Shimmur T. 1993. Inhiition of the infectivity of influenz virus y te polyphenols. Antivirl Res 21: 289299. 11. Hsieh TC, Wu JM. 1999. Differentil effects on growth, cell cycle rrest, nd induction of poptosis y resvertrol in humn prostte cncer cell lines. Exp Cell Res 249: 109115. 12. Pl S, Choudhuri T, Chttopdhyy S, Bhttchry A, Dtt GK, Ds T, S G. 2001. Mechnisms of curcumininduced poptosis of Ehrlich's scites crcinom cells. Biochem Biophys Res Commun 288: 658665. 13. Brt P, Georgé S, Bellmy A, Du Chffut L, Sclert A, Mennen L, Arnult N, Amiot MJ. 2006. Dily polyphenol intke in Frnce from fruit nd vegetles. J Nutr 136: 2368 2373. 14. Hslm E. 1998. Prcticl polyphenolics, from structure to moleculr recognition nd physiologicl ction. 16th ed. Cmridge University Press, Cmridge, UK. p 192194. 15. Tnk T, Yoshitke N, Zho P, Mtsuo Y, Kouno I, Nonk G. 2007. Production of oligomeric pronthocynidins y frgmenttion of polymers. Jpn J Food Chem 14: 134139. 16. Jo EH, Lee SJ, Ahn NS, Prk JS, Hwng JW, Kim SH, Aruom OI, Lee YS, Kng KS. 2007. Induction of poptosis in MCF7 nd MDAMB231 rest cncer cells y oligonol is medited y Bcl2 fmily regultion nd MEK/ERK signling. Eur J Cncer Prev 16: 342347. 17. Kundu JK, Chng EJ, Fujii H, Sun B, Surh YJ. 2008. Oligonol inhiits UVBinduced COX2 expression in HR1 hirless mouse skinap1 nd C/EBP s potentil upstrem trgets. Photochem Photoiol 84: 399406. 18. Zhng XH, Yokoo H, Nishiok H, Fujii H, Mtsud N, Hyshi T, Httori Y. 2010. Beneficil effect of the oligomerized polyphenol oligonol on high glucoseinduced chnges in enos phosphoryltion nd dephosphoryltion in endothelil cells. Br J Phrmcol 159: 928938. 19. Ogswr J, Kitdte K, Nishiok H, Fujii H, Skuri T, Kizki T, Izw T, Ishid H, Ohno H. 2009. Oligonol, new lychee fruitderived lowmoleculr form of polyphenol,
482 노정숙 enhnces lipolysis in primry rt dipocytes through ctivtion of the ERK1/2 pthwy. Phytother Res 23: 16261633. 20. Mittl A, Elmets CA, Ktiyr SK. 2003. Dietry feeding of pronthocynidins from grpe seeds prevents photocrcinogenesis in SKH1 hirless mice: reltionship to decresed ft nd lipid peroxidtion. Crcinogenesis 24: 13791388. 21. Noh JS, Kim HY, Prk CH, Fujii H, Yokozw T. 2010. Hypolipidemic nd ntioxidtive effects of oligonol, lowmoleculrweight polyphenol derived from lychee fruit, on renl dmge in type 2 dietic mice. Br J Nutr 104: 1120 1128. 22. Noh JS, Prk CH, Yokozw T. 2011. Tretment with oligonol, lowmoleculr polyphenol derived from lychee fruit, ttenutes dietesinduced heptic dmge through regultion of oxidtive stress nd lipid metolism. Br J Nutr 106: 10131022. 23. Prk CH, Yokozw T, Noh JS. 2014. Oligonol, lowmoleculrweight polyphenol derived from lychee fruit, ttenutes dietesinduced renl dmge through the dvnced glyction end productrelted pthwy in d/d mice. J Nutr 144: 11501157. 24. Momose T, Yno Y, Ohshi K. 1963. Orgnic nlysis. XL Ⅳ. A new deproteinizing gent for determintion of lood sugr. Chem Phrm Bull (Tokyo) 11: 968972. 25. Ali SF, LeBel CP, Bondy SC. 1992. Rective oxygen species formtion s iomrker of methylmercury nd trimethyltin neurotoxicity. Neurotoxicology 12: 637648. 26. Kooy NW, Royll JA, Ischiropoulos H, Beckmn JS. 1994. Peroxynitritemedited oxidtion of dihydrorhodmine 123. Free Rdic Biol Med 16: 149156. 27. Ohkw H, Ohishi N, Ygi K. 1979. Assy for lipid peroxides in niml tissue y thiorituric cid rection. Anl Biochem 95: 351358. 28. Lowry OH, Roserough NH, Frr AL, Rndll RJ. 1951. Protein mesurement with the folin phenol regent. J Biol Chem 193: 265275. 29. Golderg RB. 1981. Lipid disorders in dietes. Dietes Cre 4: 561572. 30. Kotni K, Peroni OD, Minokoshi Y, Boss O, Khn BB. 2004. GLUT4 glucose trnsporter deficiency increses heptic lipid production nd peripherl lipid utiliztion. J Clin Invest 114: 16661675. 31. Ceriello A. 2000. Oxidtive stress nd glycemic regultion. Metolism 49: 2729. 32. Shrpe PC, Liu WH, Yue KK, McMster D, Ctherwood MA, McGinty AM, Trimle ER. 1998. Glucoseinduced oxidtive stress in vsculr contrctile cells: comprison of ortic smooth muscle cells nd retinl pericytes. Dietes 147: 801809. 33. Edi M, Shrm SK. 2003. Peroxynitrite nd mitochondril dysfunction in the pthogenesis of Prkinson's disese. Antioxid Redox Signl 5: 319335. 34. Epe B, Bllmier D, Roussyn I, Brivi K, Sies H. 1996. DNA dmge y peroxynitrite chrcterized with DNA repir enzymes. Nucleic Acids Res 24: 41054110. 35. Bordn C. 2001. Nitric oxide nd the immune response. Nt Immunol 2: 907916. 36. Ruiz C, Alegrí A, Brerá R, Frré R, Lgrd MJ. 1999. Lipid peroxidtion nd ntioxidnt enzyme ctivities in ptients with type 1 dietes mellitus. Scnd J Clin L Invest 59: 99105. 37. Kesvulu MM, Giri R, Kmeswr Ro B, Appro C. 2000. Lipid peroxidtion nd ntioxidnt enzyme levels in type 2 dietics with microvsculr complictions. Dietes Met 26: 387392. 38. Hyes JD, Ellis EM, Nel GE, Hrrison DJ, Mnson MM. 1999. Cellulr response to cncer chemopreventive gents: contriution of the ntioxidnt responsive element to the dptive response to oxidtive nd chemicl stress. Biochem Soc Symp 64: 141168. 39. Nohl H, Jordn W. 1980. The metolic fte of mitochondril hydrogen peroxide. Eur J Biochem 111: 203210. 40. Aliciguzel Y, Ozen I, Asln M, Krylcin U. 2003. Activities of xnthine oxidoreductse nd ntioxidnt enzymes in different tissues of dietic rts. J L Clin Med 142: 172177. 41. Henning SM, FjrdoLir C, Lee HW, Youssefin AA, Go VL, Heer D. 2003. Ctechin content of 18 tes nd green te extrct supplement correltes with the ntioxidnt cpcity. Nutr Cncer 45: 226235. 42. Boden G. 2011. Oesity, insulin resistnce nd free ftty cids. Curr Opin Endocrinol Dietes Oes 18: 139143. 43. Kumr MV, Shimokw T, Ngy TR, Lne MD. 2002. Differentil effects of centrlly cting ftty cid synthse inhiitor in len nd oese mice. Proc Ntl Acd Sci USA 99: 19211925. 44. Boghddy NA. 2013. Antioxidnt nd ntipoptotic effects of pronthocynidin nd ginkgo ilo extrct ginst doxoruicininduced crdic injury in rts. Cell Biochem Funct 31: 344351. 45. Montne J, Cdvez L, Novils A. 2014. Stress nd the inflmmtory process: mjor cuse of pncretic cell deth in type 2 dietes. Dietes Met Syndr Oes 7: 2534. 46. Aksh MS, Rehmn K, Chen S. 2013. Role of inflmmtory mechnisms in pthogenesis of type 2 dietes mellitus. J Cell Biochem 114: 525531. 47. Roertson JD, Orrenius S. 2000. Moleculr mechnisms of poptosis induced y cytotoxic chemicls. Crit Rev Toxicol 30: 609627. 48. Bu PV, Liu D, Gilert ER. 2013. Recent dvnces in understnding the ntidietic ctions of dietry flvonoids. J Nutr Biochem 24: 17771789.