Korean Journal of Microbiology (2019) Vol. 55, No. 3, pp pissn DOI eissn Copyright

Korean Journal of Microbiology (2019) Vol. 55, No. 3, pp. 258-267 pissn 0440-2413 DOI https://doi.org/10.7845/kjm.2019.9060 eissn 2383-9902 Copyright c 2019, The Microbiological Society of Korea 유산균의증식과항균활성에관한탈지유및두유의영향 임은서 * 동명대학교식품영양학과 Influence of soymilk and skim milk on growth and antibacterial activity of lactic acid bacteria Eun-Seo Lim* Department of Food Science & Nutrition, Tongmyong University, Busan 48520, Republic of Korea (Received June 19, 2019; Revised July 10, 2019; Accepted July 10, 2019) The purpose of this study was to investigate the effect of lactic acid bacteria (LAB) on the growth and biogenic amines (BA) formation of Enterobacter aerogenes CIH05 in skim milk and soymilk. Lactobacillus acidophilus GK20, Lactobacillus paracasei GK74, and Lactobacillus plantarum GK81 isolated from mustard kimchi did not produce BA in the decarboxylation broth. L. paracasei GK74 exhibited the highest cell viability and antimicrobial compounds producing ability in fermented skim milk and soymilk samples, while the lowest producer was L. plantarum GK81. The production yield of lactic acid, hydrogen peroxide, and bacteriocin was dependent on the species of Lactobacillus and the type of culture medium. As LAB the number of viable cells of E. aerogenes CIH05 were higher in skim milk than in soymilk. When mixed culture with L. acidophilus GK20 and L. paracasei GK74 and treated with bacteriocin solution (300 AU/ml) obtained from these strains in milk media, the cell growth and cadaverine and histamine contents of E. aerogenes CIH05 were significantly (P < 0.05) lower than the respective values in control sample. Keywords: biogenic amine, lactic acid bacteria, skim milk, soymilk 바이오제닉아민 (biogenic amines, BA) 은아미노산의탈탄산화에의해주로생성되며생물학적활성을가지는저분자의 *For correspondence. E-mail: limsm020@tu.ac.kr; Tel.: +82-51-629-1714; Fax: +82-51-629-1709 유기질소성화합물이다. 이들은식물, 동물및미생물의단백질의대사과정중에자연적으로발생되어세포성장, 유전자발현, 단백질합성등생리조절에중요한역할을하는물질이지만, BA가다량함유된식품을섭취할경우에는홍조, 두통, 부종, 구토, 설사, 복부경련및저혈압등의중독증상을초래한다 (Shalaby, 1996). BA에의한독성은유전학적결함이나특정약물의복용에의해아민분해효소 (amine oxidase) 가불활성화되면유해아민의무독화능력이저하되어심각한문제를야기한다 (Bodmer et al., 1999). BA의양은발효과정중유입균에의해증가되는경우가많으므로제조환경불량에따른오염여부및식품의변질을판단하는지표로이용되기도한다 (Linares et al., 2011). BA는생선및그가공품을비롯하여육류, 채소, 맥주및포도주와같은각종발효식품등에서다량검출된다. 이러한식품들에주로함유된히스티딘, 티로신, 오르니틴, 베타-페닐알라닌등의아미노산은미생물이생산한효소에의해카르복실기가이탈되면서각각히스타민, 티라민, 푸트레신, 카다베린및베타-페닐에틸아민등이생산된다 (Linares et al., 2011). 게다가장건강에도움을주고필수영양소공급원로잘알려진유산균발효식품인유제품뿐만아니라우유, 커드및유청에서도폴리아민, 티라민, 히스타민, 푸트레신, 카다베린, 베타-페닐에틸아민및트립타민등각종 BA가검출된다 (Linares et al., 2011). 유제품의주원료인우유에함유된단백질은다양한미생물들이생산한프로테아제, 펩티다아제혹은아미노펩티다아제등의각종효소에의해

Growth and antibacterial activity of lactic acid bacteria 259 BA 생성에필요한전구체아미노산이만들어진다 (Benkerroum, 2016). 유제품의 BA 함량은원유자체에혼재하거나제조과정중에외부로부터혼입된미생물및발효스타터인유산균의종류, 기질아미노산의이용능, ph, 온도및수분활성도등의발효조건등에의해주로결정된다 (Linares et al., 2011). Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipolytica, Pichia jadinii, Geotrichum candidum 등과같은진균류뿐만아니라 Hafnia alvei, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia sp. 및 Enterobacteriaceae 등도유제품내에서유해아민을생성하는것으로보고되고있다 (Pircher et al., 2007). 또한프로바이오틱균주로서면역기능강화, 항산화, 항암및항콜레스테롤등의활성을발휘하는유익균으로알려진유산균인 Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Leuconostoc sp. 및 Streptococcus sp. 등도아미노산탈탄산효소의작용에의해유해물질인 BA를생산하는주요원인균으로알려져있다 (Gardini et al., 2006; Quinto et al., 2014). 발효식품의주체인유산균이균주에따라아미노산탈탄산효소의작용으로 BA를생산하기도하지만일부의유산균은항균물질을생산함으로써 BA 생성균에대한항균활성을나타내기도한다. 유산균은유기산이나박테리오신등의항균물질을생산하는데이는인체에해가없으며, 유해미생물의균수감소및독성물질생성을억제하는데효과적이므로식품제조와가공중에생물학적보존제로도널리이용되고있다 (Özogul and Hamed, 2018). 항균물질을생산하는유산균을치즈발효에이용한경우 BA 생성균의증식이억제됨에따라유해물질의함량을효과적으로낮출수있다는결과도보고된바있으므로 (Joosten and Nuňez, 1996; Capozzi et al., 2012) 유해아민저감화를위해유산균의이용가치가높다고판단된다. 따라서본연구에서는 BA 함량이낮은치즈제조에이용할발효스타터를선발하기위하여탈지유와두유내에서유산균의아미노산탈탄산효소및항균물질생성능과이에따른 BA 생성균의증식과아민생성량에미치는영향을비교하였다. 재료및방법 실험균주및배양전보 (Lim et al., 2011; Lim and Lee, 2016) 에서갓김치로부터분리된유산균 (Lactobacillus acidophilus GK20, Lactobacillus brevis GK55, Lactobacillus paracasei GK74, Lactobacillus plantarum GK81) 을실험균주로사용하였고, 생선내장으로부 터분리된 BA 생성균 Enterobacter aerogenes CIH05 는항균활성측정을위한지시균주로사용하였다. 유산균은 Lactobacilli MRS agar (BD Difco), BA 생성균은 Brain Heart Infusion (BHI) agar (BD Difco) 사면배지상에서계대배양 (37 C, 24시간 ) 하여실험하였다. BA 생성능확인실험균주의효소생성을유도하기위해탈카르복시화액체배지에전구체아미노산 (L-arginine monohydrochloride, L-histidine monohydrochloride monohydrate, L-lysine monohydrochloride, L-ornithine monohydrochloride, L-phenylalanine, L-tryptophan 및 L-tyrosine hydrochloride, Sigma-Aldrich, 1 g/l) 과 1 mg/l pyridoxal 5-phosphate를첨가한다음균접종후 37 C에서 48 시간동안 5회전배양하였다 (Bover-Cid and Holzapfel, 1999). Microtiter plate의 well에전배양액 (50 μl) 과아미노산 (2%, w/v) 이첨가된탈카르복시화액체배지 (100 μl) 를각각분주한후 35 C, 48시간동안혐기적인조건 (Anoxomat system, MART Co.) 하에서배양한다음 BA 함량은 Eerola 등 (1993) 과 Mah 등 (2003) 의방법을일부변형하여측정하였다. 배양액을원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 한후상등액 (1 ml) 은여과제균 (0.22 μm membrane filter, Millipore Co.) 한다음 BA 혼합표준용액 (cadaverine, histamine, putrescine, tyramine, tryptamine, 500 ppm) 과 0.4 M perchloric acid (Merck, 9 ml) 를첨가하였다. 진탕혼합후원심분리 (3,000 g, 10분 ) 해서회수한상등액은여과 (Whatman paper No. 1) 한다음여과액 (1 ml) 에 2 N sodium hydroxide (200 μl) 와 sodium bicarbonate 포화용액 (300 μl) 을가하고 acetone에용해시킨 dansyl chloride (Sigma- Aldrich, 10 mg/ml) 2 ml을가하였다. 40 C에서약 45분간반응시킨다음잔존하는 dansyl chloride는 25% ammonium hydroxide (100 μl) 를가하여제거하고상온에서약 30분간방치한후 acetonitrile을가하여최종 5 ml로맞추고, 원심분리 (2,500 g, 5분 ) 해서얻은상등액은여과 (0.22 μm membrane filter) 하여 dansyl 유도체화시켰다. High pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu) 의 Nova-Pak C 18 column (150 3.9 mm, Waters) 을사용하였으며 UV 254 nm에서검출하였다. 컬럼온도 40 C에서이동상 (solvent A: 0.1 M ammonium acetate, solvent B: acetonitrile) 의유속은 1 ml/min으로조정하였고, 시료량은 10 μl에맞춰주입하였다. 탈지유와두유제조및배양조건 Skim milk powder (BD Difco) 를 10% (w/v) 의농도에맞춰증류수에용해시킨다음고압습열멸균하여탈지유를제조하 Korean Journal of Microbiology, Vol. 55, No. 3

260 Eun-Seo Lim 였다. 한편, 대두 (500 g) 에 10배의증류수를가하여상온에서 12시간동안수침한후대두를건져 60 C의열수 (5 L) 를가하여약 3분간분쇄하였다. 면보로압착하여얻은액체는원심분리 (5,000 g, 5분 ) 하여침전물을제거한후상등액은 65 C에서 30분간가열살균하여두유를제조하였다 (Devi et al., 2014). 유산균은 MRS broth에접종하고 37 C, 24시간동안배양하여얻은배양액으로부터원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 해서세포를회수한다음 phosphate buffer saline (PBS, ph 7.0) 으로 2 회세척하였다. 초기균수를 1.0 10 6 CFU/ml로조정한세포현탁액 1% (v/v) 를탈지유와두유에각각접종한후 37 C에서 24시간동안배양하였다. 어진침전물을동결건조시켰다. 50% (v/v) alcohol (4 ml) 에용해시켜조박테리오신용액을제조하고 microtiter plate method (Hole et al., 1991) 로항균활성을측정하였다. BA 생성균은 BHI broth 내에서 37 C, 24시간동안배양후원심분리 (7,000 g, 20분, 4 C) 하여모든세포를 PBS (ph 7.0) 로 2회세척하였다. 세포현탁액내균수는 1.0 10 5 CFU/ml로맞추고이진법으로희석한박테리오신용액을 microtiter plate well (Falcon) 에가한후 37 C에서 24시간배양하여 600 nm에서흡광도를측정하였다. 대조구는박테리오신용액대신 PBS (ph 7.0) 를가하여얻은탁도 50% 에해당하는최대희석배수의역수를박테리오신활성 (arbitrary unit, AU) 으로계산하였다. 시료내유산균수및항균물질생성능배양한시료 (1 g) 를채취한후 PBS (ph 7.0) 로십진희석한다음 MRS agar 상에서표준한천평판배양법으로유산균수를측정하였다. ph는시료 (10 g) 에증류수 5배를가하고스토마커 (3 M) 로균질화한다음원심분리 (7,000 g, 10분 ) 해서얻은상등액을시료액으로하여 ph meter (Fisher Scientific) 로측정하였다. 시료 5 g에동량의증류수를가하고 1% (w/v) 페놀프탈레인지시약을첨가한다음 0.1 N NaOH 용액으로적정하여그소비량을측정한다음계산식 [ 산도 (%) = 0.1 N NaOH 소비량 0.1 N NaOH 역가 0.9]/ 시료량 ] 에대입하여적정산도를계산하였다. 유산의함량은 Shah와 Ravula (2002) 의방법에따라시료 (1 g) 에 15.5 M nitric acid (100 μl) 와 0.01 M sulfuric acid (2 ml) 를가한후원심분리 (14,000 g, 30분 ) 해서단백질을침전시켰다. 상등액을회수하여 0.22 μm membrane filter로여과제균한후 HPLC의 ion exchange column (Aminex HPX-87H, 300 7.8 mm, Bio-Rad) 온도는 65 C, 이동상 (0.01 M H 2SO 4) 유속은 0.6 ml/min 하에서분석하였다. 과산화수소의함량은 Gilliland (1969) 의방법에따라시료 (10 g) 의 ph를 4.5로조정한후 0.1 M acetate buffer (2 ml) 를가하고멸균수를첨가하여 20 ml에맞춰서약 2분동안균질화하였다. Whatman No.2로여과시킨여액 (5 ml) 에 1% o-dianisidine (100 μl) 과 horseradish peroxidase (0.01 mg, Fisher Scientific) 를가하고상온에서약 10분간반응시킨후 4 N HCl (200 μl) 를가하여반응을종료시켰다. 400 nm에서흡광도를측정하고표준곡선으로부터과산화수소의함량 (μg/ml) 을측정하였다. 박테리오신함량은 Settanni 등 (2005) 의방법에따라시료 (10 g) 에 40% acetonitrite-0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (90 ml) 을가하여균질화한다음원심분리 (15,000 g, 10분 ) 하여얻 배양조건별 BA 생성균에대한항균활성혼합배양 : 유산균과 BA 생성균은 MRS broth와 BHI broth에각각접종하고 37 C, 24시간동안배양하여얻은배양액으로부터원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여세포를모아서 PBS (ph 7.0) 로 2회세척하였다. 각각의초기균수를 1.0 10 6 CFU/ml로조정한세포현탁액 1% (v/v) 를탈지유와두유에각각접종한후 37 C에서 24시간동안혼합배양하였다. 배양상등액처리 : 유산균은 MRS broth에접종하여 37 C에서 24시간배양한후원심분리 (7,000 g, 20분, 4 C) 하여상등액을회수한후세포를제거하기위해여과제균 (0.45 μm membrane filter) 하고탈지유와두유에각각 5.0% (v/v) 농도로첨가하였다. 여기에 BHI broth에서 overnight 배양한 BA 생성균의배양액을원심분리 (7,000 g, 10분 ) 하여세포를세척한후균수를 1.0 10 6 CFU/ml으로조정한다음시료에접종하고 37 C에서 24시간동안배양하였다. 박테리오신용액처리 : 전보 (Lim et al., 2011) 의방법에따라유산균의배양상등액내유산및과산화수소의항균력을배제하기위해 1 N NaOH를이용하여 ph 7.0으로조정한다음카탈라아제 (1 mg/ml, Sigma-Aldrich) 를처리하였다. 60% (w/v) 의황산암모늄으로염석후투석하여탈염시켜조박테리오신용액을조제하였다. 박테리오신용액 300 AU/ml을탈지유와두유에각각첨가한다음 BHI broth에서배양한 BA 생성균의배양액을원심분리 (7,000 g, 20분, 4 C) 하여세포현탁액 (1.0 10 6 CFU/ml) 을접종하고 37 C 에서 24시간동안배양하였다. 시료내 BA 생성균수및생성량측정시료 (1 g) 를채취한후 PBS (ph 7.0) 로십진희석한다음 BA 생성균은 Eosin Methylene Blue (EMB) agar (BD Difco) 상에서표준한천평판배양법으로생균수를측정하였다. 미생물학회지제 55 권제 3 호

Growth and antibacterial activity of lactic acid bacteria 261 시료내 BA 함량은 Eerola 등 (1993) 의방법을일부변형하여측정하였다. 즉, 시료 (2 ml) 에 0.4 M perchloric acid (10 ml) 을첨가하여균질화한후원심분리 (3,000 g, 10분 ) 하였다. 상등액은여과지 (Whatman No. 1) 로여과하여얻은여액에 BA 혼합표준용액 (cadaverine, histamine, 500 ppm) 과 0.4 M perchloric acid (Merck) 를가하여최종 25 ml로맞추었다. 시료추출물에 2 N sodium hydroxide (200 μl), 포화 sodium bicarbonate (300 μl) 및 10 mg/ml dansyl chloride (Sigma-Aldrich, 2 ml) 를가한후 40 C에서 45분간반응시키고 100 μl ammonia 를첨가한다음 30분간방치하였다. Acetonitrite를가해최종 5 ml에맞추어원심분리 (2,500 g, 5분 ) 하여얻은상등액을 0.22 μl syringe filter로여과제균한후 HPLC의 Nova-Pak C 18 column (150 3.9 mm, Waters) 으로 BA의함량을측정하였다. 컬럼온도 40 C에서이동상은 0.1 M ammonium acetate (A) 와 acetonitrile (B) 을이용하였으며, 유속은 1 ml/min, 시료 10 μl 주입후 254 nm에서흡광도를측정하여분석하였다. 통계처리실험항목별로 3회씩실험하여얻은측정값은평균 ± 표준편차로나타내었다. 실험결과값은 SPSS 프로그램 (Ver. 12.0, Chicago, IL, USA) 의 Student s t-test를통해 P < 0.05 유의수준에서대조구와실험구의유의성을검정하였다. 결과및고찰 탈카르복시화액체배지상에서의 BA 생성능탈카르복시화액체배지상에서실험균주의 BA 생성균을측정한결과는 Table 1과같다. 생선내장으로부터분리된 E. aerogenes CIH05는카다베린 (572.3 ± 16.2 mg/l) 과히스타민 (2,564.2 ± 20.5 mg/l) 을생성하는것으로확인되었다. 갓김치 로부터분리된 L. brevis GK55는히스타민 (852.4 ± 11.6 mg/l) 과티라민 (662.3 ± 22.7 mg/l) 을생성하였고, L. mesenteroides GK104는카다베린 (356.8 ± 9.6 mg/l) 를생성하는것으로확인되었다. 반면, L. acidophilus GK20, L. paracasei GK74 및 L. plantarum GK81은 BA를생성하지않아후속연구를위한균주로선발하였다. Alvarez 와 Moreno-Arribas (2014) 는 L. plantarum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus pentosus, Pediococcus acidilactici 등의유산균이 in vitro에서히스타민과티라민을생성하였다고보고하였다. Barbieri 등 (2019) 의유산균균종별 BA 생성에대한연구결과에따르면, L. brevis는히스타민, 티라민, 베타-페닐에틸아민, 카다베린, 푸트레신을생산하고, L. paracasei는히스타민, 티라민, 카다베린, 푸트레신을생성한다고알려져있다. 또한, L. plantarum은히스타민, 티라민, 푸트레신을생산하고, L. mesenteroides는히스타민, 티라민, 베타- 페닐에틸아민, 카다베린, 푸트레신등을생산하는것으로보고되고있으나, L. acidophilus으로부터는아미노산탈탄산효소생성능이확인되지않아본연구결과와부분적으로일치하였다. Priyadarshani와 Rakshit (2014) 에의하면 Lactobacillus casei TISTR 389는강력한단백질가수분해및아미노산탈탄산효소활성에의해탈지유내에서 48시간배양후히스타민과티라민의생성량이각각 6.86 ± 0.035 mg/l와 6.08 ± 0.042 mg/l 로나타났다. Russo 등 (2012) 에따르면와인으로부터분리된 L. brevis IOEB 9809는티라민과푸트레신을생성하였으며, 원유로부터분리된 L. mesenteroides IPLA 1040은 0.5% 전구체아미노산이함유된탈카르복시화액체배지상에서 807 mg/l 의티라민과 6.90 mg/l의트립타민을생성하는것으로보고되었다 (De Llano et al., 1998). 이러한결과는동종의유산균일지라도균주에따라생성하는 BA의종류와생성량에상당한차이가있다는본연구결과와는일치하지않는다. 동종의유산균들에서 BA 생성능에차이가있는것은아미노산탈탄 Table 1. Biogenic amines (BA)-forming ability of the tested strains in decarboxylase medium supplemented with amino acid BA content (mg/l) Strain Cadaverine Histamine Putrescine Tyramine Enterobacter aerogenes CIH05 572.3 ± 16.2 2,564.2 ± 20.5 ND ND Lactobacillus acidophilus GK20 ND ND ND ND Lactobacillus brevis GK55 ND 852.4 ± 11.6 ND 662.3 ± 22.7 Lactobacillus paracasei GK74 ND ND ND ND Lactobacillus plantarum GK81 ND ND ND ND Leuconostoc mesenteroides GK104 356.8 ± 9.6 ND ND ND Data are means ± standard deviation (SD) from triplicate determinations. ND, not detected. Korean Journal of Microbiology, Vol. 55, No. 3

262 Eun-Seo Lim 산효소가이용가능한기질의종류가다르고효소의활성에도차이가있기때문으로판단된다. 유산균은성장을위한최적조건이아닌상황에서도적응력이비교적높아주요영양원인당이고갈된후에도아미노산을에너지원으로이용할수있는능력을가지고있어오랜기간생존이가능하며, 낮은 ph 하에서도저항성이강해효소활성을발휘한다 (Papadimitriou et al., 2016). 미생물의아미노산탈탄산화는산의자극 (acid stress) 에대한세포반응으로써운반단백질을통해세포내로유입된아미노산은탈탄산효소에의해 H + 를이용하여아미노산의 CO 2 가제거되어세포질내 ph가증가하게되고생성된아민은역수송체 (antiporter) 를통해세포밖으로이동하게된다 (Gardini et al., 2016). 위산의자극하에서도 H + 를소비하여 BA를생성함으로써미생물의생존율을높이게되고장내상피세포점막에대한부착력도증가하게되는것으로보고된바있다 (Russo et al., 2012). 따라서탈탄산효소는미생물세포활성과는무관하게열악한환경조건하에서세포가용해된상황에서도활성이유지되며식품내에생성된 BA는가열, 냉동및훈연처리에도분해되기어려울만큼안정하다고알려져있으므로탈탄산효소특성을고려한유해아민함량저감화방법을모색해야할것이다 (Barbieri et al., 2019). 탈지유와두유내에서의유산균증식및항균물질생성능탈지유와두유내에서선발균주의증식정도및항균물질생성능을측정한결과는 Table 2와같다. L. acidophilus GK20 과 L. paracasei GK74는탈지유내에서 10 9 CFU/g 이상검출되었으나, 두유에서는이보다다소낮은균수가검출되었다. 한편, L. plantarum GK81의균수는 GK20 및 GK74 보다는적은균수가측정되었으나, 이들은탈지유와두유내에서유의할만한차이는보이지않았다. 탈지유의 ph는 L. paracasei GK74 (4.20 ± 0.09) 에의해가장낮게나타났고그다음으로는 L. acidophilus GK20 (4.75 ± 0.12), L. plantarum GK81 (4.91 ± 0.07) 순이었고, GK74와 GK81 에의한 ph는두유보다는탈지유에서다소낮게나타났다. 탈지유의적정산도는 L. paracasei GK74 (1.37 ± 0.02%) 가 L. acidophilus GK20 (0.95 ± 0.05%) 및 L. plantarum GK81 (0.89 ± 0.01%) 에비해유의하게높았고, 두유보다는탈지유내에서비교적높은값이측정되었다. 유산의함량도적정산도와유사한경향으로두유보다탈지유에서더높았고 L. acidophilus GK20 (90.2 ± 0.9 mm) 이나 L. plantarum GK81 (76.9 ± 4.1 mm) 보다 L. paracasei GK 74 (116.9 ± 5.0 mm) 에의해높게나타났다. 과산화수소는탈지유에서배양한 L. acidophilus GK20 (6.8 ± 0.1 mm) 에의해가장많은양이검출되었고두유내에서검출된양도 L. Table 2. Cell viability and antimicrobial substances production of BA non-forming lactic acid bacteria (LAB) in skimmed milk and soy milk Characteristics Skim milk Soymilk Viable cell counts (CFU/g) ph Titratable acidity (%) Lactic acid (mm) Hydrogen peroxide (mm) Bacteriocin activity (AU/g) Data are means ± SD from triplicate determinations. ND, not detected. Lactobacillus acidophilus GK20 3.3 ± 0.5 10 9 9.6 ± 1.5 10 8 Lactobacillus paracasei GK74 4.5 ± 0.3 10 9 7.9 ± 3.0 10 8 Lactobacillus plantarum GK81 8.5 ± 0.9 10 8 6.8 ± 2.1 10 8 Lactobacillus acidophilus GK20 4.75 ± 0.12 4.66 ± 0.11 Lactobacillus paracasei GK74 4.20 ± 0.09 4.32 ± 0.10 Lactobacillus plantarum GK81 4.91 ± 0.07 5.02 ± 0.06 Lactobacillus acidophilus GK20 0.95 ± 0.05 0.97 ± 0.02 Lactobacillus paracasei GK74 1.37 ± 0.02 1.14 ± 0.03 Lactobacillus plantarum GK81 0.89 ± 0.01 0.77 ± 0.06 Lactobacillus acidophilus GK20 90.2 ± 0.9 88.6 ± 3.8 Lactobacillus paracasei GK74 116.9 ± 5.0 105.2 ± 1.7 Lactobacillus plantarum GK81 76.9 ± 4.1 60.2 ± 2.5 Lactobacillus acidophilus GK20 6.8 ± 0.1 5.9 ± 0.4 Lactobacillus paracasei GK74 4.2 ± 0.1 3.6 ± 0.2 Lactobacillus plantarum GK81 1.9 ± 0.4 1.5 ± 0.5 Lactobacillus acidophilus GK20 640 160 Lactobacillus paracasei GK74 1,280 640 Lactobacillus plantarum GK81 ND ND 미생물학회지제 55 권제 3 호

Growth and antibacterial activity of lactic acid bacteria 263 paracasei GK74 (3.6 ± 0.2 mm) 나 L. plantarum GK81 (1.5 ± 0.5 mm) 에비해높았다. 탈지유내에서 L. paracasei GK74 (1280 AU/g) 의박테리오신활성은 L. acidophilus GK20 (640 AU/g) 보다 2배높게나타났으나, 이들의활성은탈지유보다두유에서유의하게낮게검출되었다. 반면탈지유및두유내에서 L. plantarum GK81의박테리오신활성은나타나지않았다. 유산균의증식및항균물질의생성량은원료유의물리화학적특성과고형분의함량, 미생물의산소및영양성분의이용능, 발효온도등다양한인자들에의해영향을받는것으로알려져있다. 유산균은단백질가수분해효소를통해얻은유기질소원인펩타이드나아미노산등을주로이용하므로탈지유나두유는증식이나대사산물생산을위해적합한영양원이라고보고된바있는데 (Priyadarshani and Rakshit, 2014), 본연구결과유산균의증식과항균물질생산에는두유보다탈지유에함유된영양성분이더유용한것으로판단된다. Hati 등 (2018) 에의하면, Streptococcus thermophiles MD2와 Lactobacillus helveticus V3의발효액은다른균주들에비해유의하게높은항균활성을나타내었으며유산균의균종에따라두유및발효유내에서나타난활성에는유의한차이가있었고이들활성은두유보다는탈지유에서더높게나타났다고하였는데본연구결과도이와유사한것으로확인되었다. 전보 (Lim et al., 2011) 에따르면, MRS broth 상에서 24시간만에 GK20과 GK74의박테리오신활성은각각 640 AU/ml과 2,560 AU/ml으로측정되었으나, 두유나탈지유에서는이보다적은양의활성이측정되어탈지유보다도배지내영양성분이박테리오신생산에유리한것으로확인하였다. 이상의 결과, 유산균의균종및균주에따라증식과항균물질생산을위해선특정영양분을요구하는것으로보인다. 배양조건에따른탈지유및두유내 BA 생성균수변화 BA 생성균과선발된유산균의혼합배양및유산균의항균물질처리시탈지유와두유내 BA 생성균의균수를측정한결과는 Table 3과같다. 탈지유내에서 E. aerogenes CIH05 단독배양에의한균수는 5.8 ± 1.0 10 8 CFU/ml이었으나, 두유에서는이보다낮은 8.2 ± 0.4 10 7 CFU/ml으로나타났다. 탈지유에서 E. aerogenes CIH05의균수는 L. acidophilus GK20 및 L. paracasei GK74와의혼합배양에의해유의하게낮았으나 L. plantarum GK81과의혼합배양에의해선유의할만한균수감소가나타나지않았다. 두유내에서는 L. paracasei GK74와의혼합배양에의해유의한균수감소가나타났으나, GK20 및 GK81에의해서는대조구와비슷한수준의균수가검출되었다. 3종의유산균이생산한유기산을탈지유와두유에처리한경우 E. aerogenes CIH05에대한항균효과는나타나지않았다. 하지만 L. acidophilus GK20과 L. paracasei GK74가생산한박테리오신 (300 AU/ml) 을처리한경우에는탈지유와두유내에서 2 log cycle 내외의균수감소효과가확인되었다. 탈지유및두유내에서배양된 BA 생성균의균수는유산균과의혼합배양이나배양상등액의처리에의해서는유의할만한정도로감소되지는않았으나, 유산균이생산한박테리오신은이들의균수를효과적으로감소시켰다. 전통발효된장으로부터분리된 L. plantarum DLA205, L. brevis DLA501, Lactobacillus fermentum DLA509, L. acidophilus Table 3. Effects of antimicrobial substances-producing LAB on viable cell counts of Enterobacter aerogenes CIH05 in skimmed milk and soy milk Viable cell counts (CFU/ml) Incubation condition LAB Skim milk Soymilk Control 5.8 ± 1.0 10 8 8.2 ± 0.4 10 7 Mixed culture Treatment of CFCS (10%) Treatment of bacteriocin (300 AU/ml) Data are means ± SD from triplicate determinations. *Significantly differ (P < 0.05) from the control group by Student s t-test. CFCS, cell-free culture supernatant. NT, not tested. Lactobacillus acidophilus GK20 1.1 ± 0.2 10 8 * 6.5 ± 1.6 10 7 Lactobacillus paracasei GK74 8.0 ± 3.1 10 7 * 4.6 ± 0.5 10 6 * Lactobacillus plantarum GK81 6.3 ± 2.4 10 8 9.1 ± 2.4 10 7 Lactobacillus acidophilus GK20 7.0 ± 2.8 10 8 6.9 ± 3.5 10 7 Lactobacillus paracasei GK74 3.6 ± 0.2 10 8 8.0 ± 2.1 10 7 Lactobacillus plantarum GK81 9.1 ± 0.6 10 8 1.9 ± 1.0 10 8 Lactobacillus acidophilus GK20 9.5 ± 2.7 10 6 * 7.4 ± 1.8 10 6 * Lactobacillus paracasei GK74 2.8 ± 0.9 10 6 * 9.8 ± 3.6 10 5 * Lactobacillus plantarum GK81 NT NT Korean Journal of Microbiology, Vol. 55, No. 3

264 Eun-Seo Lim DLA703 및 E. faecalis DLA804 등이생산한박테리오신은 BA 생성균인 Bacillus licheniformis DB102, Bacillus subtilis DB203, Bacillus amyloliquefaciens DB714에대한항균활성을나타내었고박테리오신의활성은유산균의종류에따라큰차이가있었다 (Lim, 2018). Nugrahani 등 (2016) 도 L. casei가생산한박테리오신은히스타민생성균인 Pseudomonas sp. 과 Micrococcus sp. 에대한항균활성을나타내었다고하였으므로유산균의항균물질이유해아민제어에효과적이라고보고하였다. 배양조건에따른탈지유및두유내 BA 생성량변화 BA 생성균과선발된유산균의혼합배양및유산균의항균물질처리시탈지유와두유내 BA 생성균에의한카다베린과히스타민의함량을측정한결과는 Table 4와같다. 탈지유와두유내 E. aerogenes CIH05 단독배양한경우카다베린생성량은각각 501.7 ± 7.9 mg/l와 452.2 ± 20.5 mg/l로탈지유내에서다소높게나타났고, 히스타민의생성량은카다베린에비해 4배이상검출되었으며두유보다는탈지유내영양성분이 CIH05의 BA 생성에도유리한것으로나타났다. 탈지유내에서는 L. acidophilus GK20 및 L. paracasei GK74 와의혼합배양에의해선카다베린과히스타민생성량이대조구에비해유의하게감소되었으나, 두유내에서는 L. paracasei GK74와의혼합배양에의해서만감소효과가나타났다. 한편, 실험유산균 3종의배양상등액을처리한경우탈지유및두유내에카다베린의함량은대조구와비슷한수준으로검출되었고, 히스타민의함량에도유의할만한변화를주지는못했다. 이는배양상등액내에함유된유산에의해 ph가낮아지면탈탄산효소활성이증가되어 BA의생성량이많아진다는기존문헌 (Kimura et al., 2001; Gardini et al., 2016) 의보고에따라본연구결과에서도유산균의배양상등액을처리한경우탈지유및두유내 BA 함량감소효과는나타나지않은것으로추정된다. 반면 L. acidophilus GK20과 L. paracasei GK74가생산한박테리오신 (300 AU/ml) 은탈지유와두유내에카다베린과히스타민의함량을효과적으로감소시켰다. 이상의결과, 유산균이생산한박테리오신용액을조제하여처리한경우도이들의항균활성에의해균이사멸됨으로써 BA 생성량이유의하게낮게검출된것으로사료된다. 타이전통발효어육소시지인 som-fug 내 BA 축적에관한유산균 (L. sakei KM5474, L. plantarum KM1450) 의영향을측정한결과, 유산균을접종하지않은대조구에서는카다베린, 푸트레신, 히스타민, 트립타민, 페닐에틸아민및티라민등의 BA가유의하게높게나타났으나, 이들균주로발효시킨경우에는 BA양이월등히감소되었다. 시료내유리아미노산양은 BA의생성량과상관관계가있었으며, 유리아미노산의이용을제한한경우 BA의양도감소되었다. 또한 L. sakei 보다는 L. plantarum에의한 BA 함량감소효과가더크게나타났고혼합균주가단독균주로발효시킨경우보다감소량이더많은것으로나타나수산발효식품의유해아민함량감소를위해유산균을이용한바있다 (Kongkiattikajorn, 2015). 한편으로 E. faecalis, E. faecium 및 Enterococcus durans 의티라민생성은낮은 ph 하에서높은활성을유지하였고, Lactococcus lactis와 L. brevis의히스티딘탈탄산효소의활성 Table 4. Effects of antimicrobial substances-producing LAB on cadaverine and histamine formation of E. aerogenes CIH05 in skimmed milk and soy milk Cadaverine (mg/l) Histamine (mg/l) Incubation condition LAB Skim milk Soymilk Skim milk Soymilk Control 501.7 ± 7.9 452.2 ± 20.5 2,214.7 ± 8.2 1,726.3 ± 22.5 Mixed culture Treatment of CFCS (10%) Treatment of bacteriocin (300 AU/ml) Data are means ± SD from triplicate determinations. *Significantly differ (P < 0.05) from the control group by Student s t-test. CFCS, cell-free culture supernatant. NT, not tested. Lactobacillus acidophilus GK20 425.9 ± 20.7* 440.7 ± 23.0 1,752.3 ± 4.9* 1,417.8 ± 40.8 Lactobacillus paracasei GK74 381.2 ± 14.7* 399.2 ± 9.4* 1,562.7 ± 27.0* 1,296.1 ± 17.0* Lactobacillus plantarum GK81 493.5 ± 5.5 466.5 ± 19.9 2,096.3 ± 31.4 1,526.7 ± 13.5 Lactobacillus acidophilus GK20 503.3 ± 15.8 470.8 ± 22.3 2,164.5 ± 5.5 1,801.2 ± 12.3 Lactobacillus paracasei GK74 479.2 ± 30.9 447.9 ± 9.9 2,043.1 ± 14.1 1,623.5 ± 5.9 Lactobacillus plantarum GK81 496.0 ± 23.8 438.2 ± 5.2 2,355.7 ± 6.3 1,599.5 ± 32.4 Lactobacillus acidophilus GK20 441.5 ± 11.8* 403.6 ± 11.5* 1,788.2 ± 7.1* 1,219.2 ± 20.6* Lactobacillus paracasei GK74 391.2 ± 7.8* 372.4 ± 12.9* 1,428.3 ± 16.9* 1,163.0 ± 19.9* Lactobacillus plantarum GK81 NT NT NT NT 미생물학회지제 55 권제 3 호

Growth and antibacterial activity of lactic acid bacteria 265 도 ph 약산성에서더높게나타났다고알려진바있다 (Gardini et al., 2016). Bargossi 등 (2015) 도티로신탈탄산효소의최대활성은 ph 5.0~6.0에서나타났고 ph 4.0 이하에서는활성이약해졌음을확인하였다. 탈지유에서배양한 L. casei TISTR 389는배양시간이경과될수록 ph는감소된반면 BA 생성량은오히려증가되었으므로치즈와같이숙성시간이오래걸리면유해아민의함량은더욱더높아질것이라고고찰하였다 (Priyadarshani and Rakshit, 2014). L. brevis의티라민생성능도 ph 5.0에서가장높게나타났으며 ph 7.4에서도배양 7 일동안 92% 정도의높은활성을유지하였다고보고 (Zhang and Ni, 2014) 된바있는데본연구에서유산균이생산한배양상등액에함유된유기산으로는 BA 생성량을낮추기어렵다는사실을확인하였다. 그러나다량의유기산을생성하여배양액의 ph를급속히낮출수있는유산균을발효스타터로사용하면아미노산탈탄산효소생성미생물의증식을억제하여결국 BA 함량을줄일수있다고알려진바있는데 (Zhang et al., 2013), 본연구에서도다른유산균들보다유기산생성량이많은 L. acidophilus GK74의배양상등액이 BA 생성량을감소시킨것으로판단된다. L. mesenteroides subsp. cremoris와 L. lactis subsp. lactis는 L. monocytogenes의티라민생성량을약 160% 증가시켰는데이는유산균도아미노산탈탄산효소를생성하여오히려 BA 함량에대한상승작용을하기도한다. 하지만 Pediococcus acidophilus가 Salmonella paratyphi의티라민 98% 를감소시켰는데이는유산균의박테리오신이 BA 및암모니아와같은부패산물의생성량을감소시킨것이라고보고 (Özogul and Hamed, 2018) 된바있어본연구에서도박테리오신의활성이높은균주에의해 BA 생성량이감소된것으로판단된다. 항균물질이미생물의탈탄산효소활성에직접적인영향을미치기보다는세균수를감소시킴에따라 BA의생성량이낮아지는것으로보고된바있다 (Gardini et al., 2016). 우유나두유는단백질이풍부한식품이므로미생물오염시단시간내에균수급증과유해물질생산으로인하여식중독이유발되어경제적손실및공중보건에심각한위협이되고있다 (Benkerroum, 2016). 발효과정중특정미생물에의해생성된 BA의함량감소를위해주로이용되는물리화학적방법은물성이나관능학적품질악화를초래함으로써사용에한계가있으므로아민함량을효과적으로감소시키고식품의조직감이나영양학적가치에악영향을주지않는실용적이고경제적인제조공정도입과작업환경개선이이루어져야한다. 본연구결과에서보듯이유산균중일부는아미노산탈탄산 효소를생산하는것으로밝혀졌으며, 특히 Lactobacillus 및 Enterococcus sp. 등은원유내에다수존재하여살균공정중에도생존하고발효나숙성기간동안 2차오염으로도유입되어발효유제품내 BA 축적에관여하는대표적인유산균으로알려져있다 (Benkerroum, 2016). 그러므로치즈나요구르트와같은발효식품제조용스타터인유산균은반드시전구체아미노산의이용을제한하도록단백질가수분해활성이약하고아미노산의탈탄산효소생성능이없거나아민산화효소생성능을가진균주이용을권장한다. 또한미생물의단백질가수분해력, 원료내전구체아미노산의종류와함량및혼재하는미생물의항균물질생산에따른길항작용등에영향을받을수있으므로 BA 생산에관여하는인자들을고려한최적의발효조건설정이필요하다. 발효유제품의안전성확보및강화와생리활성으로인하여건강에도유익한프로바이오틱유산균을활용함으로써 BA 의독성위험을최소화할수있을것이다. 프로바이오틱유산균은발효식품제조스타터나배양보조제로서발효과정중유기산, 디아세틸, 아세토인, 과산화수소및박테리오신등다양한항균물질을생산하여부패균이나병원성미생물에대해광범위한항균스펙트럼을나타내며식품에적용시품질과풍미개선등유익한작용을하고오랜기간사용되어도인체에유해한독성인자가확인되지않았기에이들은 QPS (Qualified Presumption of Safety) 및 GRAS (Generally Regarded as Safe) 등에도등재되어있다 (Özogul and Hamed, 2018). 본연구결과유산균의항균물질생산량은두유보다는탈지유내에서더많았으므로발효에이용할원료별항균물질생산량을조사하여유해아민함량을낮출수있도록유산균의증식과항균물질생산을위한최적의원료선정도선행되어야할것이다. 항균물질생산량을증가시킬수있는배양조건하에서발효및숙성시키고유기산생산량을최대한으로높이기위한혼합균주사용및박테리오신생산유산균을물리화학적처리방법 ( 보존제, 방사선조사, 정수압및가스치환등 ) 과병용한허들테크놀러지등에적용함으로써발효식품의안전성확보와부패산물생성억제에따른식품의저장성도향상시킬수있을것이다. 아울러발효및숙성과정중 BA 생성의주된요인인미생물의오염을방지하기위해선 GMP (good manufacturing practice guide) 나 HACCP (hazard analysis critical control point) 시스템을도입하여위생적인제조공정이이루어져만 BA의독성위험을감소시킬수있을것이다. Korean Journal of Microbiology, Vol. 55, No. 3

266 Eun-Seo Lim 적요 본연구의목적은탈지유와두유내에서 Enterobacter aerogenes CIH05의증식과바이오제닉아민 (biogenic amines, BA) 생성량에대한유산균의영향을조사하는것이다. 갓김치로부터분리된 Lactobacillus acidophilus GK20, Lactobacillus paracasei GK74 및 Lactobacillus planatrum GK81은탈카르복시화배지상에서 BA를생성하지않았다. 탈지유와두유내에서 L. paracasei GK74에의해가장많은생균수와항균물질생성량이측정되었고, 반면 L. plantarum GK81은다른균주들에비해유의하게낮은균수와항균물질을생산하였다. 유산, 과산화수소및박테리오신의생산량은 Lactobacillus의균종과배지종류에의존하였다. 유산균과유사하게 E. aerogenes CIH05 도단독배양시두유보다탈지유에서더많은균수가측정되었다. 탈지유와두유내에서 L. acidophilus GK20이나 L. paracasei GK74와혼합배양하거나박테리오신용액 (300 AU/ml) 을처리했을때 E. aerogenes CIH05의균수가유의하게감소되었고히스타민과카다베린의생성도효과적으로억제되었다. References Alvarez MA and Moreno-Arribas MV. 2014. The problem of biogenic amines in fermented foods and the use of potential biogenic amine-degrading microorganisms as a solution. Trend Food Sci. Technol. 39, 146 155. Barbieri F, Montanari C, Gardini F, and Tabanelli G. 2019. Biogenic amine production by lactic acid bacteria: a review. Foods 8, 17 43. Bargossi E, Gardini F, Gatto V, Montanari C, Torriani S, and Tabanelli G. 2015. The capability of tyramine production and correlation between phenotypic and genetic characteristics of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis trains. Front. Microbiol. 6, 1371 1377. Benkerroum N. 2016. Biogenic amines in dairy products: origin, incidence, and control means. Comp. Rev. Food Sci. Food Safety 15, 801 826. Bodmer S, Imark C, and Kneubühl M. 1999. Biogenic amines in foods: Histamine and food processing. Inflam. Res. 48, 296 300. Bover-Cid S and Holzapfel WH. 1999. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 53, 33 41. Capozzi V, Russo P, Ladero V, Fernández M, Fiocco D, Alvarez MA, Grieco F, and Spano G. 2012. Biogenic amines degradation by Lactobacillus plantarum: toward a potential application in wine. Front. Microbiol. 3, 1 6. De Llano DG, Cuesta P, and Rodriguez A. 1998. Biogenic amine production by wild lactococcal and leuconostoc strains. Lett. Appl. Microbiol. 26, 270 274. Devi SM, Ramaswamy AM, and Halami PM. 2014. In situ production on pediocin PA-1 like bacteriocin by different genera of lactic acid bacteria in soymilk fermentation and evaluation of sensory properties of the fermented soy curd. J. Food Sci. Technol. 51, 3325 3332. Eerola S, Hinkkanen R, Lindfors E, and Hirvi T. 1993. Liquid chromatographic determination of biogenic amines in dry sausages. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int. 75, 575 577. Gardini F, Özogul Y, Suzzi G, Tabanelli G, and Özogul F. 2016. Technological factors affecting biogenic amine content in foods: a review. Front. Microbiol. 7, 1 18. Gardini F, Tofalo R, Belletti N, Iucci L, Suzi G, Torriani S, Guerzoni ME, and Lanciotti R. 2006. Characterization of yeasts involved in the ripening of Pecorino Crotonese cheese. Food Microbiol. 23, 641 648. Gilliland SE. 1969. Enzymatic determination of residual hydrogen peroxide in milk. J. Dairy Sci. 52, 321 324. Hati S, Patel N, and Mandal S. 2018. Comparative growth behavior and biofunctionality of lactic acid bacteria during fermentation of soy milk and bovine milk. Probiotics Antimicrob. Proteins 10, 277 283. Hole H, Nilssen O, and Nes IF. 1991. Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris: Isolationnn and characterization of the protein and its gene. J. Bacteriol. 173, 3879 3887. Joosten H and Nuňez M. 1996. Prevention of histamine formation in cheese by bacteriocin-producing lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1178 1181. Kimura B, Konagaya Y, and Fujii T. 2001. Histamine formation by Tetragenococcus muriaticus, a halophilic lactic acid bacterium isolated form fish sauce. Int. J. Food Microbiol. 70, 71 77. Kongkiattikajorn J. 2015. Potential of starter culture to reduce biogenic amines accumulation in som-fug, a Thai traditional fermented fish sausage. J. Ethn. Food 2, 186 194. Lim ES. 2018. Antibacterial activity of lactic acid bacteria against biogenic amine-producing Bacillus spp. isolated from traditional fermented soybean paste. Korean J. Microbiol. 54, 398 409. Lim SM, Jeong KS, Lee NG, Park SM, and Ahn DH. 2011. Synergy effects by combination with lactic acid bacteria and frutooligosaccharides on the cell growth and antimicrobial activity. Food Sci. Biotechnol. 20, 1389 1397. Lim ES and Lee NG. 2016. Control of histamine-forming bacteria by probiotic lactic acid bacteria isolated from fish intestine. Korean J. Microbiol. 52, 352 364. Linares DM, Martin MC, Ladero V, AlvarezMA, and Fernandez M. 2011. Biogenic amines in dairy products. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 51, 629 703. Mah JH, Ahn JB, Park JH, Sung HC, and Hwang HJ. 2003. Characterization of biogenic amine-producing microorganisms isolated from Myeolchi-Jeot, Korean salted and fermented anchovy. J. Microbiol. Biotechnol. 13, 692 699. 미생물학회지제 55 권제 3 호

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