Journal of Bacteriology and Virology 2006. Vol. 36, No. 3 p.185 194 국내돼지에서분리한내인성레트로바이러스 gag 유전자의분자생물학적특성분석 건국대학교동물생명과학대학동물생명공학과, 공주대학교산업과학대학동물자원학과 1 이정은 이동희 유재영 김계웅 1 박홍양 이훈택 김영봉 * Molecular Characterization of Porcine Endogenous Retrovirus gag Genes from Pigs in Korea Jungeun Lee, Donghee Lee, Jae-Young Yoo, Gye-Woong Kim 1, Hong-Yang Park, Hoon-Taek Lee and Young Bong Kim * Department of Biotechnology, College of Animal Bioscience & Technology, Konkuk University, 1 Department of Animal Resource Science, College of Industrial Science, Kongju National University Received : May 11, 2006 Accepted : June 22, 2006 Xenotransplantation, as a potential solution to the shortage of human organs, is associated with a number of concerns including immunologic rejection and xenogenic infection. While the pigs are considered the most suitable organ source for xenotransplantation, there is a potential public health risk due to zoonosis. Among the known porcine zoonotic microbes, Porcine Endogenous Retrovirus (PERV) is the most considerable virus. PERV belongs to the Gammaretrovirus and has been divided into three groups (A, B, and C). To characterize the gag of PERVs, we isolated the genomic DNAs from three pig breeds (Birkshire, Duroc, and Yorkshire) and two types of SPF miniature pigs. About 1.5 kb fragments covering full length of gag were amplified and cloned into T-vector. A total of 38 clones were obtained and sequenced. Nucleotide sequences were analyzed and phylogenetic trees were constructed from the nucleotide and deduced amino acids. PERV-A, -B and -C were present in the proportion of 47, 19 and 34%, respectively. Regardless of origin or subgroups, gag clones showed highly homology in nucleotide and deduced amino acid sequences. Deduced amino acids sequence alignments showed typical conserve sequences, Cys-His box and processing sites. Among analyzed clones, about 28% of isolates had the correct open reading frame. To test the functional expression of Gag protein, gag was subcloned into expression vector and confirmed its expression in HeLa cell. This research provides the fundamental information about molecular characteristics of gag gene and functional Gag protein related xenotropic PERVs. Key Words: PERV, Xenotransplantation, Group specific antigen, Zoonosis 서 장기공급의부족및수요의증가에따른문제점으로인해이종간장기이식에대한필요성이요구되고있으며그에따른연구또한활발히진행되고있다. 돼지는짧은임신기간 * 교신저자 : 김영봉. 143-701, 서울특별시광진구화양동 1번지, 건국대학교동물생명과학대학동물생명공학과 Phone: 02-450-4208, Fax: 02-455-1044, e-mail: Kimera@konkuk.ac.kr 론 을가지고있으며대량사육이쉽고, 윤리적논쟁을피할수있는장점으로이종간장기이식에서가장적절한장기공여동물로연구되고있다 (21). 이종간장기이식은면역학적인거부반응, 생리적부적합성 (physiological incompatibility), 동물유래질병의인체감염등여러문제점을안고있다 (3). 이종간장기이식의실용화는이러한문제중어느하나라도배제될수없으나이중동물유래바이러스전염은새로운전염병출현과함께인류를위협할수있는가능성을지녀더욱주의를요하고있다. 185
186 이정은, 이동희, 유재영, 김계웅, 박홍양, 이훈택, 김영봉 무균사육환경 (Specific Pathogen Free) 은거의모든바이러스및세균의감염을제거함으로써무균상태의장기공여돼지사육을가능케하지만, 돼지내인성레트로바이러스 (PERV) 와같이 germ line을통해전파되는바이러스는근본적으로제거가불가능하기에이종간장기이식연구의가장큰걸림돌로남아있다. PERVs 는돼지지놈내에존재하여모든세포로부터생성되며, 1970년대에돼지세포에서 C형입자로서처음분리되었다. 이 C형입자에서 Reverse Transcriptase 활성및 C형에특이적인항원기를확인하여레트로바이러스임이밝혀졌다 (4,26). 보고된 PERV 중에서는 γ1 family 내 subgroup A, B, C 3가지그룹이바이러스를만들며감염능이있는것으로알려져있다 (1,20). 현재까지보고된 PERV 감염성에관해서는 A, B형이 in virtro 상에서인간세포에, in vivo 상에서는면역능이결핍된쥐와사람의 PERV receptor gene이형질도입된쥐에감염된사례가보고된바있다 (13,22,24). 또한사람에게 PERV 가감염될경우, PERV 바이러스가돌연변이를일으키거나사람에존재하는내인성레트로바이러스 (human endogenous retrovirus, HERV) 와의재조합을일으켜새로운전염성바이러스가될위험성을지니고있다. 이는장기이식시환자에게 PERV 가감염되어병원성을일으킬수있는요인임을내포하고있다. 따라서돼지의장기, 조직및세포를이용한이종간장기이식의경우 PERV 의제거가반드시선행되어야한다. 본연구는 gag 유전자를이용하여이종간장기이식시 PERV 제어를위한연구의기초자료로제시하고자, 국내돼지및무균돼지로부터분리한 genomic DNA를이용하여 gag 유전자를증폭, 클로닝하여이에대한분자생물학적특성을연구하고자한다. 2. PERV gag 유전자의증폭및클로닝 gag 유전자전체를증폭하기위해 Genbank에등록된 PERV 염기서열정보를수집프라이머를제작하였다 (F;.5'- TTTTTTCATATGGGACAGACAGTGACTACC-3', R;;5'-TTG- CCCCT CGAGCTTCAAAGTAGTTACCCTG-3). 50 ng genomic DNA를 PCR 반응에이용하였으며, 사용된반응액은 PCR buffer 내 1.5 mm MgCl 2, 2.5 mm dntps, primer 는각각 10 pmole, Taq polymerase 2.5 unit (SuperBio) 을이용하였다. PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700 (Perkin-Elmer Cetus) 를이용하여, 초기 DNA 변성과정을 94 에서 5분동안 1회수행하였고, 94 에서 denaturation 반응 30초, 57 에서 annealing 반응 1분, 그리고 72 에서 1분 30초간 extension 반응을 35 cycle 실시하였다. 이후 72 에서 30분간반응시켜 PCR 반응을종결시켰다. 증폭된약 1.5 kb의 PCR 증폭산물은 Gel extraction kit (Qiagen) 을사용하여아가로즈겔로부터분리하였으며, 정제된 PCR 산물은 pcr2.1-topo vector (Invitrogen) 및 pgem-t easy vector (Promega) 에 ligation 반응을수 재료및방법 1. 공시재료및 genomic DNA 의추출 본실험에사용된공시재료는국내종돈농장에서사육되고있는 Birkshire종, Duroc종, Yorkshire종, PWG Genetics Korea로부터제공받은무균돼지 (M149, T1111) 를공시동물로사용하였다. 선정된공시동물의모근및혈액의 PBMC 로부터 Genomic DNA purification Kit (Qiagen) 를이용하여 genomic DNA를분리하였다. 추출된 genomic DNA는 0.7% 아가로즈겔에서확인한뒤, 분광계 (spectrophotometer, Beckman) 를이용, 농도를측정하였다. Genomic DNA는 -20 에서보관후 Polymerase Chain Reaction (PCR) 을위한주형으로사용되었다. Figure 1. Construction of vaccinia virus recombinant. HeLa cells transfeted with a PERV gag plasmid are infeceted with wild type vaccinia virus (WR). Homologous recombinantion occurs between flanking sequences beside gag gene and virus genomic DNA. In a consequence of PERV gag gene insertion into viral DNA, recombinant virus was produced.
국내돼지에서분리한내인성레트로바이러스 gag 유전자의분자생물학적특성분석 187 행한뒤, E. coli Top10F' 에형질전환을실시하여클로닝하였다. 3. gag 유전자의염기서열분석클로닝된 PERV gag 유전자는 M13 forward와 M13 reverse sequencing 프라이머와 PCR 반응에사용된프라이머쌍을이용하여염기서열을확인하였다. 염기서열분석결과를이용하여약 1.5 kb의각클론들을 contig 하였으며, Genbank에등록된 PERV gag 분리주들을기준으로 DNAstar 및 Clustal X (ver 1.8) 을이용하여 alignment를실시하였다 (5,14). 4. 계통발생학적분석클론들의계통분석학적관계를비교하기위하여, 염기서열분석이완료된 38개의클론을 Treecon (ver.1.3b.) 을사용하여계통분석도를작성하였다 (28). 계통분석도는 Kimura method, Clustering (UPGMA; Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) 을이용하여작성하였으며, 계통수의 topology는 100회반복 sampling하여 bootstrap 값을구하 였다. 5. 재조합백시니아바이러스생산 gag 유전자를포함하는재조합백시니아바이러스를만들기위하여 PERV A형인 Y5 clone을주형으로하여 gag 유전자를증폭하였다 (F;.5'-TTTTTTCATATGGGACAGACAGTG- ACTACC-3', R;;5'-TTTTTCTCGAGTTAATGGTGATGGTGAT- GGTG-3). 증폭된 gag 유전자와 T7 promotor를가지는 ptm DH gp140 벡터를 NdeI, XhoI으로제한효소처리한다음클로닝하였다. 발현벡터에클로닝된 gag 유전자 (ptm-y5) 를 HeLa (10% FBS, DMEM) 세포에 transfection한뒤, 야생형 (wild type) 백시니아바이러스를감염시켰다. 그결과 gag 유전자를포함하는재조합백시니아바이러스 (recombinant vaccinia) 를생산하였다 (Fig. 1). 6. Gag 단백질의정제 gag 유전자를가지는재조합백시니아바이러스를 T7 polymerase를생성하는 vtf7-3 바이러스와 HeLa 세포에각 Percent identity of amino acids (%) Table 1. PERV gag clones from domestic pigs and miniature pigs Strain Berkshire Duroc YK-1 M149 T1111 Total Subtype A A B A B A A B C Clones 3 8 4 4(3) a 3(2) 1(1) 1 1(1) 13(2) 38 ( ) a : number of clones have correct open reading frame Table 2. Comparison of PERV gag nucleotide and amino acids sequences a Percent identity of nucleic acids b (%) M1 Y4 Y5 Y7 T22 Y2 Y3 T2 T24 AJ279056 AJ1338186 AF038600 M1 96.3 98.1 96.3 96.3 94.8 95.2 94.8 97.1 97.7 94.6 96.9 M1 Y4 96.9 97.1 99.4 96.6 97.9 97.9 93.5 96.4 97.1 98.3 95.8 Y4 Y5 98.6 97.7 97.1 97.7 95.6 96.0 94.9 97.3 99.0 95.6 97.1 Y5 Y7 96.9 99.7 97.8 96.2 97.5 97.9 93.1 96.4 97.1 97.9 95.4 Y7 T22 96.1 96.4 97.3 96.4 97.7 97.7 94.3 96.0 97.5 97.5 96.4 T22 Y2 94.7 97.6 95.6 97.5 98.1 99.4 92.4 94.9 95.6 99.4 94.7 Y2 Y3 95.0 97.7 96.0 97.8 98.2 99.6 92.4 95.2 96.0 99.4 94.7 Y3 T2 97.0 95.4 96.9 95.2 95.2 93.7 93.7 95.2 94.8 92.6 96.6 T2 T24 97.4 96.7 97.5 96.7 95.5 94.7 94.9 97.6 97.3 94.8 97.5 T24 AJ279056 98.7 97.6 99.1 97.6 97.0 95.4 95.7 97.1 97.5 95.4 96.9 AJ279056 AJ133816 94.3 97.5 95.4 97.5 97.9 99.4 99.4 93.6 94.4 95.2 94.5 AJ133816 AF038600 97.4 95.7 97.3 95.6 95.5 94.0 94.0 99.0 97.9 97.5 93.9 AF038600 M1 Y4 Y5 Y7 T22 Y2 Y3 T2 T24 AJ279056 AJ1338186 AF038600 a The calculation was based on 1575 nucleotide and 525 amino acids each (AJ279056 was used for a reference strain of PERV-A, AJ133816 was used for a reference strain of PERV-B, AF038600 was used for a reference strain of PERV-C). b Percentage of nucleotide and amino acids sequence identities are presented in th upper and lower triangle respectively
188 이정은, 이동희, 유재영, 김계웅, 박홍양, 이훈택, 김영봉 Figure 2. Alignment of deduced amino acids sequences of PERV Gag. Full length nucleotide sequences of gag clones were identified. Deduced amino acids sequences of cloned gag gene clones were aligned with the reference strains (PERV-A; AJ279056, PERV-B; AJ133816, PERV-C; AF038600). Each type of clones had homology in the nucleotide sequences between 241 and 440. The sequences in shadowed boxes indicate the cleavage sites of Gag, in the closed box indicate Cys-His box.
국내돼지에서분리한내인성레트로바이러스 gag 유전자의분자생물학적특성분석 189 Figure 3. Comparison of deduced amino acid sequence of PERV gag clones. PERVs (PERV-A: AJ279056, PERV-B: AJ133816, PERV-C: AF038600), GaLV (Gibbon ape leukemia virus, NC001885), BaEV (Baboon endogenous virus, AF142988), FeLV (Feline leukemia virus, K01803), MoMLV (Moloney murine leukemia virus, AF033811), and MuLV (Murine leukemia virus, AB213652) were used as references for alignment of cloned Gag deduced amino acids sequences. Cys-His motif in shadow region, pivotal in virus packaging, was conserved in alignment all gamma-retroviruses. 각 5 moi로동시감염시켜 Gag 단백질을발현하였다. Gag 단백질이발현된세포를 8 M Urea가첨가된 Lysis buffer (100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris.Cl, 8 M Urea, 10 mm imidazole, ph 8.0) 를첨가하여세포벽을용해시켰다. 원심분리후 Gag 단백질이존재하는상층액을취하여 Ni-NTA Agarose beads (Qiagen) 와 binding 시킨다음 Poly-Prep Chromatography Column (Biorad) 에통과시켰다. Column 을 washing buffer (100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris.Cl, 8 M Urea, ph 6.3) 로 2회세척후, elution buffer (100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris.Cl, 8 M Urea, ph 4.5) 를이용하여단백질을분리하였다. 결과 1. PERV gag 유전자클로닝및분포개시코돈 ATG를포함하여전체약 1.5 kb의 gag 유전자전체를 PCR로증폭하여클로닝하였으며, gag 전체유전자를지닌 38개의바이러스주를확보하였다 (Table 1). Berkshire 3개, Duroc 12개, Yorkshire (YK-1) 으로부터는 7개의 gag를분리하였으며 miniature pig의 M type (M149) 에서는 1개, T type (T1111) 에서는 15개의 PERV gag 클론을얻을수있었다. 확보된클론은 M13 forward, M13 reverse sequencing 프라이머와클로닝에사용한프라이머를이용하여, 4회이상의
190 이정은, 이동희, 유재영, 김계웅, 박홍양, 이훈택, 김영봉 분석을수행하여각클론의염기서열을결정하였다. DNAstar 프로그램을이용하여염기서열을 contig 하였으며 alignment 한결과국내돼지및무균돼지에정상적으로 gag 유전자가존재하며 A, B 그리고 C 세가지의형으로나누어짐을확인하였다. 2. PERV gag 유전자염기서열분석및아미노산서열분석총 38개의클론중에서 A형은 47%, B형은 19%, C형은 34% 로각각존재하며그중 A형으로분류된 4개의클론과 B형으로분류된 3개클론, 그리고 C형으로분류된 2개의클 론이유전자염기서열분석결과올바른 ORF을가지고있어 functional한 gag를만들수있는클론들이었다. ORF가맞는 9개의분리주와종래에보고된대표적인 reference 주와의그룹간, 그룹내의유전자및아미노산서열의상동성을분석하였다 (Table 2). Subgroup 내의염기서열은 96.9~99.7% (A), 98.1~99.6% (B), 97.6% (C) 를보여매우높은상동성을확인하였다. A와 B형간에는 94.7~97.8%, B와 C형은 93.7~95.5% 그리고 A와 C형간에는 95.2~97.5% 의상동성을보이며, A 형이 B형보다 C형에유전적으로더높은상동성을가짐을알수있었다. 아미노산에있어서도높은상동성으로유사한결과를보였다. Figure 4. UPGMA clustering tree based on 1.5 kb nucleotide sequences of PERV gag. The tree was generated by the method of Kimura (1980) on the basis of gag sequences using the Treecon (ver 1.3b.). Numbers at nodes indicate the bootstrap value of 100 resampled datasets. PERV-A (AJ279056 and AJ293656), PERV-B (AJ133816, AJ133818 and AJ279057), PERV-C (AF038599 and AF038600) and PERV-E (AF356698) were used reference strain. Upper scale bar means distances.
국내돼지에서분리한내인성레트로바이러스 gag 유전자의분자생물학적특성분석 191 바이러스의 core를구성하는 gag 유전자는변이정도가 env 유전자보다덜하며잘보존되어있어진단및백신연구에많이활용되고있다 (3). 본실험에서분리한 gag 클론들의염기서열및아미노산서열도 subgroup 간또는 subgroup 내 90% 이상의상동성을가지는것을확인하였다. ORF가맞는클론을포함하여분석되어진 38개의분리주모두정확한 cleavage site를가지고있었으며, 전체 23% 가정확한 ORF를지니고있어이는바이러스생성시정상적인 PERV 바이러스합성가능성을보여주었다. PERV gag 유전자는발현되면약 60 kda의 polyprotein을형성하고이는번역후과정을거쳐바이러스단백분해효소 (Protease; PR) 에의해 NC (Nucleocapsid) 단백질과 CA (Capsid) 단백질, 그리고 MA (Matrix) 단백질로크게나뉘어진다 (16,19). 본실험에서분리한 PERV gag 클론들의아미노산서열의분석결과 MA/CA 단백질의 cleavage site가아미노산서열 190에서 198까지로존재, A와 B형에서는 Glu- Ile-Ala-Ile-Leu-Pro-Leu-Arg-Thr로 C형에서는 Glu-Ile-Ala-Thr- Leu-Pro-Leu-Arg-Thr로존재하였다. CA/NC 단백질의 cleavage site는아미노산서열 449에서 459까지부분으로 A, B, C형모두공통임을확인하였다 (Fig. 2). Gammaretrovirus에속하는다른레트로바이러스와 Gag 영역아미노산서열비교에서는종류별변이가있음에도특이적으로 packaging에관여하는 Cys-His box (18) 가동일하게존재함을알수있었다 (Fig. 3). 3. PERV gag 유전자염기서열을이용한계통학적분석 PERV gag 클론 38개의염기서열과 Genbank에등록된 PERV-A (AJ279056, AJ293656), PERV-B (AJ133816, AJ133818, AJ279057), PERV-C (AF038599, AF038600) 그리고 outgroup 으로는 PERV-E (AF356698) 를 reference 주로선정하여 clustering 방법을이용하여계통분석학적관계를나타내었다 (Fig. 4). B형은 93% 의 bootstrap 값으로하나의 clade를이루며, A와 C가포함된하나의 clade와 B형은 100% 의 bootstrap 값을가지며나누어짐을확인할수있었다. A와 C형은 54% 의 bootstrap 값을가지며나뉘어졌다. Table 1에서보인염기서열분석결과와동일하게계통분석도상에서도세가지타입으로나뉘어짐을확인하였다. gag 클론들사이의유전학적또는계통학적거리가상당히가깝다는것을알수있었다. 4. 재조합 vaccinia system 을이용한 gag 유전자의발현 Gag 단백질을발현시키기위해서백시니아 (vaccinia) 바이러스를이용하였다. gag 유전자및 T7 프로모터를포함한 ptm-y5 플라스미드와야생형백시니아바이러스 (WR) 의 Figure 5. Immunoblot analysis of expressed PERV Gag protein. Recombinant vaccinia virus harboring PERV gag gene was amplified in HeLa cell. Amplified recombinant vaccinia virus was coinfected with vtf7-3, vaccinia virus producing T7 polymerase, to HeLa cell (lane 1, lane 2). HeLa cell was harvested after 36 hrs later. Detection of expressed PERV Gag protein was performed by anti-his Ab. HeLa cell was used as a control (lane C). The sizes of the molecular weight markers are indicated on the left of panels. 상동재조합 (homologous recombination) 을통해재조합백시니아바이러스를구축하였다. 제작된재조합백시니아바이러스와 T7 polymerase를발현하는 vtf7-3 백시니아바이러스를함께감염시켜 Gag 단백질을발현하였다. 발현된 Gag 단백질의 C-말단에위치하는 hexahistidine-tag을이용하여, western blot을실시한결과배양액으로단백질이분비되지않고세포내에서만약 60 kda의 Gag 단백질이검출되었다 (Fig. 5). 이는다른레트로바이러스와같이세포질에서 Gag polyprotein 합성이이루어지며 (8) 이와마찬가지로 PERV 의 Gag 단백질이세포막외부로분비 (secretion) 되지않고세포내부, 세포질에존재함을확인할수있었다. 고 본연구는국내식육용종돈돼지 3종류와무균돼지 2 종류를이용하여, 그로부터 PERV gag 유전자를분리하였으며그에대한분자생물학적특징및계통학적분석을수행하였으며, Gag 단백질의발현을확인하였다. PERV 는전형적인레트로바이러스의구조를지닌 gag, pol, env 유전자를지니며이중 gag 유전자에의해서바이러스의 core 단백질이만들어진다. 돼지의유전자안에존재하는많은종류의내인성바이러스유전자들은대부분이결실, 삽입, 혹은점돌연변이등에의해서바이러스입자를생성을하지못하는상태로존재하지만이중바이러스를생산하고감염성을지닌 PERV subgroup A, B와 C형이알려져있다. 본연구를통해얻어진 PERV gag 유전자는전체 Gag 단백질을코딩하는 1.5 kb 유전자로분리된 38개클론중미니돼지 M type에서 A형 1개, T type에서 B형 1개, C형 2개그리고식육돼지종인 Yorkshire 에서 A형 3개, B형 2개의 gag 클론이바이러스 core 단백질을만들수있는올바른 ORF를가지고있었 찰
192 이정은, 이동희, 유재영, 김계웅, 박홍양, 이훈택, 김영봉 다. 이는전체분리된클론중 23% 로상당히높은비율을차지하는결과 gag 클론들은실제로감염성을가지는 PERV 를생성해낼수있는염기서열을지녔으며, 이는실제장기이식시간과해서는안될분포임을보여주었다. 본연구에선행한 PERV env 유전자의상동성비교에서는 A형과 B형간에 64~68% 로약 35% 변이가큰반면 gag 클론들의그룹간유전자상동성은최소 93% 이상, 그룹내의상동성은 96% 이상으로상당히높은수치를보이고있었다. 또한백혈병, 악성종양혹은암을일으키는병원성을지닌레트로바이러스의 gag 유전자와높은상동성을보였다 (12, 27). 이를통해돼지의장기나세포의이식시사람에게존재하는 retroviral sequence인 HERV 및기타악성종양바이러스와 PERV 와의재조합을통해병원성을유발하는바이러스가만들어질수있는우려가제기되고있다. 본연구에서분리한클론과 GaLV, BaEV, FeLV, MuLV 바이러스의아미노산서열비교에서도 RNA binding site인 Cys-His box 영역이동일한서열상을보이며이는서로다른종의바이러스유전체가 cross packaging 될수있음을시사하고있으며이에대한연구가요구되고있다 (Fig. 3). gag 유전자에의해서발현된 Gag 단백질은크게 RNA 지놈에결합하고있는 NC 단백질과핵산과 DNA 삽입효소 (Integarse; IN), PR을함께둘러싸고있는 CA 부분, 그리고 Env 단백질의 TM 영역과결합되어있는 MA 부분으로구성되어있다 (2,7). Fig. 2에서 ORF가정확한클론들과 reference 주를비교한결과, 크게 2곳의 cleavage 부위가존재하였다. 190~198을경계로 MA와 CA 단백질이, 449~459를경계로 CA와 NC 단백질이나뉘어지며, 발현된 Gag 단백질이 cleavage 되어활성을가질수있음을나타내고있다. 그러나본발현연구에서는아직 gag에대한항체를확보하지못하여 anti-his 항체를이용하였으며 polyprotein으로서 Gag에대한 processing을알수없었다. 240~440 사이의서열은각 type 내에서는매우유사하였으며, type 간에는차이가있으나 CA 단백질생성에관여하는것이외에는특이할만한사항이없었다. 레트로바이러스는 RNA 지놈을가지고있는데바이러스가만들어질경우실제로바이러스합성및유지에이용되는바이러스 RNA 이외에도 mrna나숙주세포에서유래하는세포성 RNA 등이존재하고있다. 이들을제외하고선택적으로바이러스의 RNA만을둘러싸야하는데이때 Gag 단백질의 NC 부분이기능을하게된다 (11,23). 실제로 PERV와유사한 MuLV의 NC 부분을제거시키거나돌연변이화한결과, 바이러스의조립및 viral RNA packaging을제어한다는것이밝혀졌다 (17,25,30). 본연구에서분석한 Gag의 NC 지역에도 MuLV와동일하게 RNA packaging에직접적으로 관련하는 Cys-His box가존재하였다. CA 단백질또한바이러스의조립에관여하며, 비리온의성숙및 viral cdna를핵내로이동시키는 (nuclear transport) 기능을하는것으로보고되어있다 (7,29). MA 단백질은 Gag polyprotein을바이러스가조립되는세포질로운반하는역할을하며, 조립후바이러스의감염능력에도영향을준다고알려져있다 (10,15). 본연구에서분리된 gag 클론들은매우높은상동성을지니며잘보존되어있는 Gag 영역을확인할수있어실질적으로기능상결함이없이 PERV 바이러스를만들어낼수있음을짐작하게한다. 따라서 Gag 영역의변형이나인위적인변이를통해 PERV 바이러스의제어및제거에대한접근을제시할수있을것이다. 또한 Gag 발현시스템은제조합백시니아를통하여포유동물세포주에서발현시켰기에단백질 processing 연구가가능하나이를위해선단클론항체확보가요구되어지고있다. 계통분석학적인관계를알아보기위하여, 염기서열이분석된 38개클론의염기서열과 Genbank에등록된 PERV-A (AJ279056 and AJ293656), PERV-B (AJ133816, AJ133818 and AJ279057), PERV-C (AF038599 and AF038600) 그리고 outgroup으로 PERV-E (AF356698) 를 reference 주로사용하여, Clustering 방법으로분석한결과식육종돈돼지 (Berkshire, Duroc, Yorkshire) 와무균돼지 (M type, T type) 개체간의계통분석학적특징은존재하지않았다. B형은 93% 의 bootstrap 값을가지며하나의 clade 이루고, A와 C형은 54% 의 bootstrap 값을가지며나뉘어, 이를통해돼지내에존재하는 PERV 의 gag 유전자가 A, B 그리고 C형으로존재함을확인하였다. gag 클론중 A형그룹에속하며올바른 ORF를지닌 Y5 클론으로백시니아바이러스발현시스템을이용하여 Gag 단백질을발현시켰으며, 약 60 kda의 Gag 단백질을확인하였다. 1개의비리온당차지하는 Gag 단백질의비율은 Env 단백질보다훨씬높으며, 바이러스가숙주세포에감염된후세포질에서 Env 단백질은소실되는반면 Gag 단백질은바이러스의 core 단백질로잘보존되어있다 (9). 따라서발현된 Gag 단백질을항원으로사용하여 ELISA를이용한 PERV 검출에사용하는등 PERV 연구에적용할수있을것이라사료된다. 본연구는이종간장기이식에이용되는무균미니돼지및국내식육종돈돼지종에존재하는 PERV gag 유전자의분포및특성에대한분석, Gag 단백질의발현을보고하였다. 현재까지의 PERV 의 gag 유전자및 Gag 단백질의기능및특징에대한연구는상당히부족한실정이며이에따라본연구결과를이종간장기이식시 PERV 에대한기초자료로제공하고자한다. 최근까지 PERV 가특이적으로병원성을일
국내돼지에서분리한내인성레트로바이러스 gag 유전자의분자생물학적특성분석 193 으킨다른사례는없지만잠재적인감염성을고려해볼때, 장기이식시 PERV는상당히위험한요인이기에 PERV 에대한꾸준한연구가요구되며, 안정성확보를위해 PERV 제어에대한접근을시도하여야할것이라고본다. 사사본연구는농림부바이오장기연구 (No. 200508030701) 와학술진흥재단젊은과학자연구 (KRF-2005-F00008-100015) 지원으로수행되었으며제 1 저자인이정은학생은서울과학장학생 (Seoul Science Fellowship) 지원을받았습니다. 참고문헌 1) Akiyoshi DE, Denaro M, Zhu H, Greenstein JL, Banerjee P, Fishman JA: Identification of a full-length cdna for an endogenous retrovirus of miniature swine. J Virol 72: 4503- -4507, 1998. 2) Alin K, Goff SP: Amino acid substitutions in the CA protein of Moloney murine leukemia virus that block early events in infection. Virology 222: 339-351, 1996. 3) Blusch JH, Patience C, Martin U: Pig endogenous retroviruses and xenotransplantation. Xenotransplantation 9: 242-251, 2002. 4) Breese SS, Jr: Virus-like particles occurring in cultures of stable pig kidney cell lines. Brief Report Arch Gesamte Virusforsch 30: 401-404, 1970. 5) Burland TG: DNASTAR's Lasergene sequence analysis software. Methods Mol Biol 131: 71-91, 2000. 6) Cairns TM, Craven RC: Viral DNA synthesis defects in assembly-competent Rous sarcoma virus CA mutants. J Virol 75: 242-250, 2001. 7) Cannon PM, Matthews S, Clark N, Byles ED, Iourin O, Hockley DJ, Kingsman SM, Kingsman AJ: Structurefunction studies of the human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, p17. J Virol 71: 3474-3483, 1997. 8) Choi G, Park S, Choi B, Hong S, Lee J, Hunter E, Rhee SS: Identification of a cytoplasmic targeting/retention signal in a retroviral Gag polyprotein. J Virol 73: 5431-5437, 1999. 9) Craven RC, Leure-du Pree AE, Weldon RA, Jr, Wills JW: Genetic analysis of the major homology region of the Rous sarcoma virus Gag protein. J Virol 69: 4213-4227, 1995. 10) Crawford S, Goff SP: Mutations in gag proteins P12 and P15 of Moloney murine leukemia virus block early stages of infection. J Virol 49: 909-917, 1984. 11) D'Souza V, Summers MF: How retroviruses select their genomes. Nat Rev Microbiol 3: 643-655, 2005. 12) Hanger JJ, Bromham LD, McKee JJ, O'Brien TM, Robinson WF: The nucleotide sequence of koala (Phascolarctos cinereus) retrovirus: a novel type C endogenous virus related to Gibbon ape leukemia virus. J Virol 74: 4264-4272, 2000. 13) Heneine W, Tibell A, Switzer WM, Sandstrom P, Rosales GV, Mathews A, Korsgren O, Chapman E, Folks TM, Groth CG: No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus in recipients of porcine islet-cell xenografts. Lancet 352: 695-699, 1998. 14) Hall BG: Comparison of the accuracies of several phylogenetic methods using protein and DNA sequences. Mol Biol Evol 22: 792-802, 2005. 15) Jorgensen EC, Pedersen FS, Jorgensen P: Matrix protein of Akv murine leukemia virus: genetic mapping of regions essential for particle formation. J Virol 66: 4479-4487, 1992. 16) Jürgen H. Blusch, Sigrid Seelmeir, Klaus von der Helm: Molecular and Enzymatic haracterization of the Porcine Endogenous Retrovirus Protease. J Virol 76: 7913-7917, 2002. 17) Kelly R. Young, Ted M. Ross: Elicitation of Immunity to HIV Type 1 Gag Is Determined by Gag Structure. AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES 22: 99-108, 2006. 18) Lee EG, Alidina A, May C, Linial ML: Importance of basic residues in binding of rous sarcoma virus nucleocapsid to the RNA packaging signal. J Virol 77: 2010-2020, 2003. 19) Lee SK, Nagashima K, Hu WS: Cooperative effect of gag proteins p12 and capsid during early events of murine leukemia virus replication. J Virol 79: 4159-4169, 2005. 20) Le Tissier, P, Stoye JP, Takeuchi Y, Patience C, Weiss RA: Two sets of human-tropic pig retrovirus. Nature 389: 681-682, 1997. 21) Magre S, Takeuchi Y, Bartosch B: Xenotransplantation and pig endogenous retroviruses. Rev Med Virol 13: 311-329, 2003. 22) Martina Y, Marcucci KT, Cherqui S, Szabo A, Drysdale T, Srinivisan U, Wilson CA, Patience C, Salomon DR: Mice transgenic for a human porcine endogenous retrovirus receptor are susceptible to productive viral infection. J Virol 80: 3135-3146, 2006. 23) Meric C, Goff SP: Characterization of Moloney murine leukemia virus mutants with single-amino-acid substitutions in the Cys-His box of the nucleocapsid protein. J Viro 63: 1558
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