Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 20, No. 9 pp. 306-314, 2019 https://doi.org/10.5762/kais.2019.20.9.306 ISSN 1975-4701 / eissn 2288-4688 정학재 1, 사수진 1, 백선영 1, 조은석 1, 김영신 1, 홍준기 1, 조규호 1, 김지윤 2, 박미령 2, 김경운 3* 1 농촌진흥청국립축산과학원양돈과, 2 동물바이오공학과, 3 기획조정과 Generation of a transgenic pig expressing human dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) Hak Jae Chung 1, Soo Jin Sa 1, Sun Young Baek 1, Eun Suek Cho 1, Young Shin Kim 1, Jun Ki Hong 1, Kyu Ho Cho 1, Ji Youn Kim 2, Mi Ryung Park 2, Kyung Woon Kim 3* 1 Swine Science Division, 2 Animal Biotechnology Division, 3 Planning & Coordination Division, National Institute of Animal Science, Rural Development Administration 요약 Dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) 저해제는부작용이적어제2형당뇨병의 2차용법으로널리사용되고있다. 우리는 human DPP-4 (hdpp-4) 유전자를돼지 zygote의전핵에주입한후, 1 세포단계의수정란을외과적방법으로이식하였고, 마지막으로꼬리에서 hdpp-4 유전자가발현되는형질전환돼지를생산하는데성공했다. 이식한 3두의임신돈에서 16두의자돈이생산되었고, 이들가운데 1두의수컷자돈에서형질전환개체가확인되었다. Western blot 과 RT-PCR 분석을통해 hdpp-4가형질전환돼지의막세포에서강하게발현되고, hdpp-4 유전자가다양한조직과꼬리에서각각발현되고있음을확인하였다. 이것은발현벡터가형질전환돼지에서정상적으로발현된다는것을시사한다. 이번연구결과는인슐린저항성에대한내분비기능을확인하는모델동물로, hdpp-4 형질전환돼지가인슐린저항성에대한내분비기능을확인할수있는새로운신약에대한검증의소재로서가치를높일것으로기대된다. Abstract As dipeptidyl peptidase-4(dpp-4) inhibitors are used widely as a secondary treatment for type 2 diabetes because they tend to be well tolerated with minimal side effects, the human DPP-4(hDPP-4) gene was injected into a pig zygote through micro-injection, and 1-cell stage fertilized embryos were then transplanted surgically into the oviduct. Three pigs were fertilized with hdpp-4 genes and produced sixteen piglets, in which one male piglet was identified to be transgenic. Finally, transgenic pigs showing hdpp-4 gene expression in the tail were produced. Western blot and RT-PCR analysis confirmed that the hdpp-4 is expressed strongly in the membrane cells of the transgenic pig, and that the hdpp-4 gene appears in various tissues and tails. This suggests that the expression vector is normally expressed in transgenic pigs. These results are anticipated to be a model animal to check the endocrine function for insulin resistance that occurs in a hdpp-4 transgenic pig and to increase its value for use as a material in newly developed medicines. Keywords : Insulin-Resistant, Dipeptidylpeptidase-4(DPP-4), Micro-Injection, Transgenic, Pig, Gene-Expression 본논문은농촌진흥청연구사업 (PJ01359301) 의지원에의해이루어진것임 Corresponding Authors : Kyung-Woon Kim(National Institute of Animal Science) email: kw72kim@korea.kr Received July 2, 2019 Revised August 7, 2019 Accepted September 6, 2019 Published September 30, 2019 306
1. 서론 당뇨병은체내에필요한인슐린이충분하게분비되지못하거나세포가인슐린에적절하게반응하지못하여혈액내혈당수치가높게유지되는대사질환이며, 당뇨환자의약 10% 는선천적이거나면역적인문제로인슐린을분비하지못하는제1형당뇨병이고나머지는체내에상대적으로부족한인슐린과인슐린저항성이복합적으로작용하여만성적인고혈당이지속되는제2형당뇨병이다 [1-2]. 예전에는주로과체중인중년층에서발병하던제2형당뇨병이최근에는소아비만과관련되어아동을비롯한청소년층에서도빈번하게발생하고있다 [3]. 또한, 흔히말하는대사증후군도인슐린저항성, 고지혈증및고혈압등과같은증상의총칭으로주요한사망원인으로대두되고있는심혈관질환의위험인자로인식되고있다 [4]. 이러한대사증후군 (metabolic syndrome) 의증가도당뇨병과밀접한관련이있는것으로추측되고있다. 인크레틴 (Incretin) 효과는동량의당분을정맥주사했을때보다당분을먹었을때더활발한인슐린분비가일어나는것을말하며, 이러한인크레틴효과는혈당의증가에따라높아지며, 건강한사람에비해당뇨병환자의경우에이러한효과가낮다 [5]. 인크레틴호르몬인 GIP(glucose-dependent insulinotropic peptide), GLP-1(glucagon like peptide-1) 및이에대한생리적분해효소인 DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4) 의발견은당뇨병의새로운치료약제인 GLP-1 agonist와 DPP-4 억제제의개발을가능케하였다 [6-7]. Dipeptidyl peptidase-4(dpp-4) 는 110-kDa 크기의단백질로써 adenosine deaminase complexing protein 2 또는 CD26(cluster of differentiation 26) 로도알려져있으며세포표면에존재하는 Type II transmembrane 당단백질이다 [8]. DPP-4 분해활성은목적단백질및펩타이드의 N-말단에서두번째아미노산이프롤린혹은알라닌인경우그말단에서 2개의아미노산을제거하는단백질분해효소이고세포형태나환경인자에따라다양한생물학적역할을나타내고있다. DPP-4 억제제의경우 GLP-1 agonist의여러장점을공유하면서도상대적으로싼가격과경구투여라는장점덕분에임상의사들이손쉽게선택하는약제가되었다. 지금까지개발된 DPP-4 억제제는총 6종으로 sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, linagliptin, alogliptin 및 gemigliptin이시판되고있다 [9-14]. 그 러나, 이러한새로운약제개발은신약들의효능및안전성그리고사람과유사한대상의충분한실험적증거를제시하지못하고있는실정이다. 따라서, 본연구에서는사람과생리 해부학적으로유사하다고알려진돼지를이용하여 hdpp-4유전자가과발현되는형질전환돼지를생산하였고, 이러한형질전환돼지는새롭게개발되는 DPP-4 억제의약품들에대한약효성검증과체내안전성과관련된대사산물에대한중요한연구결과를제시해줄수있을것으로기대된다. 2. 재료및방법 2.1 공시동물 본연구에사용된동물들은국립축산과학원에서사육중인돼지를사용하였으며, 연구에사용된동물관리및절차에관해서는국립축산과학원동물실험윤리위원회의승인 (NIAS2015-593) 을얻어그에준하여실시하였다. 2.2 Human DPP-4유전자클로닝및미세주입용발현벡터구축사람 DPP-4(hDPP-4) 유전자를클로닝하기위해 GeneBank(Accession number:nm_001935) 에등록된염기서열을기초로특이적 primer를디자인하였으며, 사용한 primer 염기서열은 Table 1에나타내었다. PCR은 HEK293세포에서합성한 cdna 1uL, sense 와 anti-sense primer 각각 10 pm과 HS LA-Taq polymerase(takara, Japan) 반응액을섞은후진행하였으며, PCR 반응조건은 94 1분 (pre-incubation), 98 10초, 68 5분 (30 cycles) 조건으로반응시키고마지막증폭단계에서 10분을추가하였다. PCR 증폭산물은 1% agarose gel에전기영동으로증폭산물을확인하고 Gel extraction kit(qiagen, Germany) 를이용하여정제한후 pcr2.1-ta vector(thermofisher, USA) 에 cloning하여삽입된클론을선별하였다. 선별된클론들은전체염기서열을분석하였고, NCBI blast 프로그램을통해상동성을비교하여 GeneBank 에등록된 human DPP-4(hDPP-4) 와서열이일치한클론을선별하였다. 307
한국산학기술학회논문지제 20 권제 9 호, 2019 Table 1. The primer sequence for PCR, RT-PCR, and real-time PCR RT- PCR Vector cloning PCR Real- Time PCR Primer name Sequence(5 3 ) Size ATGAAGACACCGTGGAAGGTT hdpp4-for CTTC CTAAGGTAAAGAGAAACATTG hdpp4-rev TTTTATGAAGT GAATTCGCCGCCACCATGAAG hdpp4-f ACACCGTGGAAGGTTCTTC GGATCCCTAAGCGTAATCTGGAACA hdpp4-ha-r TCGTATGGGTAAGGTAAAGAGAAAC ATTGTTTTATGAAGT 354-hDPP4-F CAAATTGAAGCAGCCAGACA 354-hDPP4-R CAGGGCTTTGGAGATCTGAG SYBR-hDPP4-F AAAGGCACCTGGGAAGTCATCG SYBR-hDPP4-R CAGCTCACAACTGAGGCATGTC SYBR-pDPP4-F GATAATCGCTGGTCAGAGCTTCG SYBR-pDPP4-R CACCTCTGATGGAAGCAGCTTC SYBR-pACTB-F SYBR-pACTB-R 2301 2349 354 153 Under line: Restriction enzyme site, Italic: Kozak consensus sequence, Bold: First methionine, Bold-under line: HA-tagging sequence 형질전환동물생산에사용할미세주입용발현벡터는조직에서지속적인발현을위해 CMV enhancer 와 chicken beta-actin promoter 가삽입되어있는 pcagen(addgene, USA) 을기본벡터로, 앞서클로닝한 hdpp-4 유전자에발현벡터구축을위한제한효소절단부위와형질전환동물생산후내재성돼지유래 DPP-4(pDPP-4) 단백질과구별을위한 hdpp-4유전자 C-말단에 HA-tag를삽입한단편을프로모터 3 -위치에도입하여구축하였다. 최종적으로만들어진벡터구조는 Fig. 1과같다. 구축된미세주입용발현벡터는염기서열분석을통해전체염기서열을다시한번검정하였고검증된발현벡터는 HincII와 HindIII 제한효소로처리하여직선화된형태 pcag-hdpp-4를만들었으며 0.5% agrose gel에전기영동하여실험에사용할 4,638 bp 단편만을겔로부터정제하여최종농도 10 ng/ul으로희석하여수정란미세주입실험에사용하였다. 2.3 유전자미세주입및수정란이식미세주입에사용된돼지수정란은국립축산과학원에서사육되고있는 Landrace 암컷에서채취하여사용하였다. 수정란채란을위해암컷을발정동기처리한후, 자연교미를통해종부를진행하고외과적방법으로 1-세포기수정란을채취하였다. 회수된난자의전핵에형질전환동물생산용 hdpp-4 유전자를미세주입하고외래유전자가주입된수정란은외과적방법으로돼지난관에이식하였다. 수정란이식후임신 40일과 114일째임신진행상황을체크하기위해초음파진단을실시하였다. 2.4 생산된형질전환돼지의중합효소연쇄반응 (PCR) 을통한유전자검정수정란이식으로생산된자돈은 genomic DNA PCR 을통해형질전환여부를검증하였다. 생산된자돈의꼬리, 신장, 간장, 심장및귀조직에서 genomic DNA를분리하여 PCR 주형으로사용하여실험을진행하였다. PCR반응은 HS Taq(GenetBio) 을이용하여 200 ng의 genomic DNA, 10 um의 primer mixture를함유한반응액을만들어사용하였다. 반응조건은 94 에서 10 분간 pre-incubation 하였으며, 94 에서 30초, 55 에서 30초, 72 에서 1분의조건으로 35 cycles을진행한후, 72 에서 5분을추가로수행하였다. PCR 증폭산물은 1.0 % agarose gel에전기영동으로확인하였다. 2.5 세포배양및형질전환돼지체세포배양형질전환돼지유래체세포배양을위한귀표면의체모를제거한후알코올로소독살균을실시하고일회용펀치를이용하여귀조직을채취하였다. 채취된귀조직은실험실에서 1X Anti-Anti(ThermoFisher) 가첨가된 Fig 1. A schematic representation of the hdpp-4 expression vector used to generate transgenic pigs 1X HBSS버퍼로 3번이상세척하여오염원을제거하고표피조직을제거한연골부분만을분리하여배양액이들어있는플레이트에서배양하여체세포 (pig Ear cell Fibroblast-DPP-4, pef-dpp-4) 를확보하였다. 세포 308
배양은 M106(ThermoFisher, USA), 10% ES FBS (ThermoFisher, USA), 1X Anti-Anti(ThermoFisher, USA), 0.5X LSGS( ThermoFisher, USA) 을포함하는배지를이용하였고계대배양은 90% confluent 할때실시하였다. 2.6 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) 에의한 hdpp-4유전자의발현유형분석실험에사용할일반돼지체세포와형질전환돼지유래체세포 (hdpp-4) 를배양한다음각각회수하여 Trizol (ThermoFisher, USA) 를사용하여 total RNA를회수하였다. 이를 random hexamer primer 와 Transcriptor First Strand cdna Synthesis kit(roche, Germany) 를사용하여 cdna를합성하였다. 합성된 cdna를주형으로세포내 hdpp-4 유전자발현을확인하기위하여 RT- PCR을수행하였다. 사용된 primer는 Table 1에나타낸것과같고 PCR반응을위한조성액은 1/50으로희석한 cdna, sense와 antisense primer 각각 10 pm 씩, 2X enzyme mixture(toyobo, Japan) 를포함한반응액을조제하고 Roter-Gene 6000 system(corbett Research, USA) 을이용하여아래와같이수행하였다. PCR 조건은 pre-denaturation단계로 95 에서 10분간반응을시킨후, 95 에서 10초간 denature, 60 에서 45초간 annealing 과 extension 을동시에진행하는조건으로 40 cycle을수행하여 hdpp-4 절편을증폭시켰다. 증폭산물은 2% agarose gel에전기영동하여분석하였다. 2.7 Western Blot Western blotting에사용한시료는적절한농도로희석하여 (V1, V2 라인 : 1/5, V3 라인 1/500) 실험에사용하였다. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 는 30 ul 의시료와 6% acrylamide gel 을사용하여진행하였고, nitrocellulose membrane(amersham Biosciences, Sweden) 에 transfer하였다. Membrane 을 1시간동안 blocking buffer(5% nonfat milk powder와 0.1% Tween-20을함유한 20 mm Tris-HCl-buffered saline) 에서교반한후, polyclonal-rabbit anti-human DPP-4/HRP를 blocking buffer와 1:500으로섞은 buffer 에서반응시켰다 (16hr, 4 ). Washing buffer(0.1% Tween-20을함유한 20 mm Tris-HCl-buffered saline) 로 10분씩 3번 washing 후 ECL(enhanced chemiluminescence) 방법으로감광하였다. 3. 결과및고찰 3.1 구축된 pcag-hdpp-4 벡터 COS7 세포내발현 F0 형질전환돼지생산에사용하기위해구축한 pcag-hdpp-4 벡터가세포내에서정상적으로발현되는지확인하고자공벡터인 pcagen과구축된 pcag-hdpp-4 절편을 COS7세포에 transfection 시키고각각의 COS7세포들을회수하여 western blot을수행하였다. Fig. 2. Identification of transgenic piglet by genomic PCR. The PCR products resolved on a 1 % agarose gel. M: 1kb Marker, P: hdpp-4 microinjected vector transiently transfected PK-15 cell as positive control, N: wild type pig ear cell as negative control, No. 1~13: piglet ear cells 그결과 pcag-hdpp-4 벡터가 transfection된세포에서 hdpp-4 단백질발현을확인할수있었으며 (Fig. 2), 이는본연구에서구축한 pcag-hdpp-4 벡터가생산하려는형질전환개체에서도정상적으로발현이이루어질것으로생각된다. 3.2 미세주입및형질전환돼지 (F0) 생산 형질전환개체생산을위해돼지수정란에 pcag-hdpp-4 유전자미세주입을실시하였다. 수정란은국립축산과학원에서사육되고있는공란돈 27두에서배란된 684개수정란을채란하여 1-세포기수정란을선별하였고 pcag-hdpp-4 벡터는수정란전핵에미세주입을실시하였다. 먼저 hdpp-4 유전자가수정란발달에미치는영향을조사하기위하여 pcag-hdpp-4 벡터를주입한 4개의배반포 (Blastocyst:BL) 를분석한결과, 3 309
한국산학기술학회논문지제 20 권제 9 호, 2019 개에서 pcag-hdpp-4 유전자가삽입되어있음을확인할수있었고 (3/4 BL : 75%) 대조군인단위발생배반포에서는 hdpp-4 유전자는확인되지않았다 (Fig. 3). 이를통해미세주입한 hdpp-4 유전자는수정란발달에는영향을미치지않는다는것을확인할수있었다. Table 2. Analyses of transgenic gene transfer in piglets Class No.of recipen ts/sows No. piglets Male Fema le Trnasgenic pigs Fema Male le Transfer rate of transgene (%) F0 16 9 7 1 0 6.25 3.3 형질전환돼지유래세포에서의 hdpp-4 유전자발현생산된형질전환개체에서 hdpp-4 의발현위치를확인하기위하여 western blot와미세주입후외래유전자 hdpp-4 발현을전사수준에서확인하기위하여 RT-PCR 을수행하였다. 먼저실험에사용할체세포를확보하기위해생산된자돈귀조직으로부터체세포를분리배양하여형질전환개체유래체세포 (pef-hdpp4) 를확보하였 Fig. 3. Identification of hdpp-4 gene in blastocysts pcag-hdpp-4가미세주입된수정란 478개는외과적수술로대리모난관상층부에이식하였고, 그결과대리모 15두가운데 4두가임신하였으나 1두는임신중반에유산되었다. 임신상황은수정란이식후 40일째와 114일째초음파로진행여부를확인하였으며 (Fig. 4) 최종적으로 3두가분만하여수정란이식자돈 16두 (F0) 를생산하였다. 다. hddp-4 antibody 를이용한귀세포로부터분리배양된계대배양세포에서세포막부분과세포질부분으로나누어발현양상을확인한결과세포막에서 hdpp-4의강한발현이나타나고있는반면, 세포질에서는발현양상을확인할수없었다 (Fig. 5). Fig. 5. Western blot analysis of hdpp-4 expression in ear cells of transgenic piglet Fig. 4. Identification of pregnancy by ultrasound 생산된자돈들에대한형질전환여부는귀조직에서 genomic DNA를분리하여 PCR로분석하여확인하였고, 분석결과수컷 1두에서 hdpp-4 유전자가삽입된것을확인하였다 (Fig. 3). 본연구의외래유전자미세주입전이율은 6.25% (Table 2) 이었으며 Lee et.al.[15] 등에의한보고 (1.96%) 보다는높았으나 Lee et. al.[16] 등의보고 (19.2%) 보다는낮은결과를보였다. 이러한결과는사용된수란돈과생산된자돈의수와도관계가있을수있으나형질전환동물생산을위해서는수정란생산부터최종착상단계까지동물생산에대한효율성을높이는개선이필요할것으로생각된다. 한편, 형질전환복제돼지재생산을위한 donor 세포주확보를위해 hdpp-4 형질전환개체로부터체세포를분리하여계대배양을실시하였고계대배양동안가지고있는세포핵형에이상이발생하였는지확인하기위해핵형분석 (karyotype) 을실시하였다. 20개의 metaphase 를판독한결과, 구축된 pef-hdpp4 체세포는정상적인 38개상염색체 (XY) 를가지고있었고결실, 역위등염색체구조상에발생하는이상현상은발견되지않았다 (Fig. 6). 또한, pef와 pef-hdpp4 세포에서유전자발현정도를분석한결과, hdpp-4유전자는대조군인 pef세포에는발현이확인되지않았고형질전환세포인 pef-dpp4 에서만발현이확인되었다. 이러한결과로본연구에서생산된형질전환돼지에서는외래유전자인 310
hdpp-4 유전자가정상적으로발현되고있다고판단된다. Fig. 6. Karyotype in somatic cells of transgenic piglet 4. 결론 지금까지질병에대한기전연구나약물효과를확인하기위해주로설치류등소형동물을중심으로다양한연구가시도되었고 [17-18], 발병인자로가능성이있는여러유전자들에대한형질전환동물을개발하여일부발병요인등을확인하였지만설치류에서나타나는질환의특징이인간발병기작과차이가있고번식 수명및행동양상등의차이로인해임상실험에적용하기에도많은어려움을느끼고있다. 이러한이유로보다인간과가까운동물을이용한질환모델개발에대한필요성이제기되고있으나인간과가장가까운영장류는그희소성과사육관리에투입되는비용및전문성이필요하기때문에극히제한적인분야에서만질환연구가진행되고있는실정이다. 한편, 돼지는기존설치류모델과비교하여생존기간이길고생리 해부학적으로인간과유사성이높아기존의한계성을극복할수있는질환모델동물로활용하고자하는욕구가높아지고있다. 또한돼지는산업적인동물로다른중 대동물을질환모델로사용하는것보다윤리적인측면에서도문제점을피해갈수있는장점이있고안정적인사육시스템이확립되어비교적저렴한비용과시설에서질환연구를수행하기위한동물로활용하고자하는연구가증가되고있다. 최근국내연구진이아밀로이드와관련된유전자를가진알츠하이머치매형형질전환돼지를생산하여 MRI로분석한결과, 대조군과비교하여형질전환돼지의뇌가위축되어있고 PET/CT 분석결과도뇌의전반적인부위에서대사활동의감소가관찰되었다고보고하였다. 이러한돼지를이용한알츠하이머질환모델은인간과유사한긴수명, 질병패턴및유전적유사성때문에알츠하이머유발유전자에대한체계적인형질전환돼지개발은치매에대한조기진단및치료법개발에매우효과적인연구 재료가될것으로생각된다 [19]. 비록본연구에서는 hdpp-4유전자가삽입된형질전환돼지를생산하기는했지만삽입된 hdpp-4 유전자가세포내에서어떠한역할을하는지에대한결과는제시하지못하였다. 향후체계적인계대번식을통해생산된형질전환돼지에대한이화학적분석및생리적인다양한측면에서분석을진행한다면삽입된 hdpp-4 유전자가돼지체내에미치는영향을확인할수있을것이다. 이를통해본연구를진행한최종목적인현재개발되고있는 DPP-4 억제의약품에대한체내반응성에대한추가적인실험을통해의약품에대한대사및안전성에대한생리 해부학적인결과를제시할가능성이있을것으로사료된다. References [1] S. E. Kahn, R. L. Hull, K. M. Utzschneider. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes, Nature, vol. 444, pp. 840-846. 2006. DOI: http://dx.doi.org/10.1038/nature05482 [2] G. Kloppel, M. Lohr, K. Habich, M. Oberholzer, P. U. Heitz. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited, Survey and Synthesis of Pathology Resesrch, vol.4, pp. 110-125. 1985. [3] Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Report of the expert committee on the diagnosis and classification of diabetes mellitus, Diabetes Care, vol. 26, pp. S5-S20. 2003. [4] J. P. Despres, I. Lemieux. Abdominal obesity and metabolic syndrome, Nature, vol. 444, pp. 881-887. 2006. DOI: http://dx.doi.org/10.1038/nature05488 [5] M. A. Nauck, E. Homberger, E. G. Siegel, R. C. Allen, R. P. Eaton, R. Ebert, W. Creutzfeldt. Incretin effects of increasing glucose loads in man calculated from venous insulin and C-peptide responses, The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 63, pp. 492-498. 1986. DOI: http://dx.doi.org/10.1210/jcem-63-2-492 [6] D. J. Drucker. The biology of incretin hormones, Cell Metabolism, vol. 3, pp. 153-165. 2006. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cmet.2006.01.004 [7] J. R. Ussher, D. J. Drucker. Cardiovascular biology of the incretin system, Endocrine Reviews, vol. 33, pp. 187-215. 2012. DOI: http://dx.doi.org/10.1210/er.2011-1052 [8] R. Yazbeck, G. S. Howarth, C. A. Abbott. Dipeptidyl peptidase inhibitors, an emerging drug class for inflammatory disease?, Trends in Pharmacological Sciences, vol. 30, pp. 600-607. 2009. 311
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백선영 (Sun-Young Baek) [ 정회원 ] 2000년 2월 : 건국대학교동물생명공학과 ( 농학사 ) 2006년 3월 ~ 현재 : 농촌진흥청국립축산과학원농업연구사 홍준기 (Jun-Ki Hong) [ 정회원 ] 2012년 2월 : 충남대학교농과대학축산학과 ( 농학석사 ) 2017년 2월 : 한경대학교미래기술대학원동물자원과 ( 이학박사 ) 2007년 8월 ~ 현재 : 농촌진층청국립축산과학원농업연구사 생명공학, 동물발생 가축육종, 유전체학 조은석 (Eun-Suek Cho) [ 정회원 ] 조규호 (Kyu-Ho Cho) [ 정회원 ] 2007년 3월 : 경남과학기술대학교동물소재공학과 ( 농학석사 ) 2011년 8월 : 경상대학교응용생명공학 ( 이학박사 ) 2012년 1월 ~ 2015년 6월 : 농촌진흥청국립축산과학원박사후연구원 2015년 7월 ~ 현재 : 농촌진흥청국립축산과학원농업연구사 가축육종, 유전체학 가축육종, 통계육종 2000년 2월 : 한경대학교농과대학축산학과 ( 농학석사 ) 2007년 2월 : 한경대학교농과대학축산학과 ( 농학박사 ) 1996년 8월 ~ 현재 : 농촌진흥청국립축산과학원농업연구관 김지윤 (Ji-Youn Kim) [ 정회원 ] 김영신 (Young-Shin Kim) [ 정회원 ] 2009년 2월 : 전남대학교동물공학과 ( 농학석사 ) 2012년 8월 : 전남대학교동물공학과 ( 농학박사 ) 2012년 8월 ~ 2015년 2월 : 농촌진층청국립축산과학원박사후연구원 2018년 2월 ~ 현재 : 농촌진층청국립축산과학원농업연구사 가축육종, 유전체학 2003년 2월 : 동아대학교생명자원과학대학생명자원과학과 ( 이학석사 ) 2009년 3월 : 일본 University of Tokyo 농학생명과학연구과응용생명공학전공 ( 농학박사수료 ) 2009년 4월 ~ 2012년 3월 : 일본 University of Tokyo 연구생 2012년 6월 ~ 현재 : 농촌진흥청국립축산과학원연구원 생명공학, 미생물학, 분자생물학, 생화학 313
한국산학기술학회논문지제 20 권제 9 호, 2019 박미령 (Mi-Ryung Park) [ 정회원 ] 2000년 2월 : 경상대학교낙농학과 ( 농학석사 ) 2005년 2월 : 경상대학교응용생명과학부 ( 이학박사 ) 2010년 1월 ~ 2012년 12월 : 건국대동물자원전임연구원 2013년 1월 ~ 현재 : 농촌진흥청국립축산과학원농업연구사 동물발생, 생명공학 김경운 (Kyung-Woon Kim) [ 정회원 ] 1995년 2월 : 원광대학교분자생물학과 ( 이학사 ) 2000년 2월 : 동아대학교일반대학원농화학과 ( 농학석사 ) 2005년 9월 : 일본 University of Tokyo 이학계연구과생물화학 ( 이학박사 ) 2008년 11월 ~ 현재 : 농촌진흥청국립축산과학원농업연구사 분자생물학, 생명공학 314