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International Journal of Oral Biology, Vol. 34, No. 2, June 30 2009, p.115~121 Copyright c 2009, The Korean Academy of Oral Biology International Journal of Oral Biology Bone Morphogenetic Protein 2-induced MAPKs Activation Is Independent of the Smad1/5 Activation Ji Hae Jun, Hyun-Mo Ryoo, Kyung Mi Woo, Gwan-Shik Kim, and Jeong-Hwa Baek* Department of Cell & Developmental Biology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University (received June 8, 2009 ; revised June 10, 2009 ; accepted June 12, 2009) Bone morphogenetic protein (BMP) 2 is a potent osteogenic factor. Although both Smad1/5 and mitogenactivated protein kinases (MAPKs) are activated by BMP2, the hierarchical relationship between them is unclear. In this study, we examined if BMP2-stimulated MAPK activation is regulated by Smad1/5 or vice versa. When C2C12 cells were treated with BMP2, the activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK), p38 MAPK and c-jun-n-terminal kinase was evident within 5 min. The knockdown of both Smad1 and Smad5 by small interfering RNA did not affect the activation of these MAPKs. In addition, neither the overexpression of Smad1 nor Smad5 induced ERK activation. When ERK activation was induced by constitutively active MEK1 expression, the protein level and activation of Smad1 increased. Furthermore, the inhibition of constitutively active BMP receptor type IB-induced ERK activation significantly suppressed Smad1 activation. These results indicate that Smad1/5 activation is not necessary for BMP2-induced MAPK activation and also that ERK positively regulates Smad1 activation. Key words : Bone morphogenetic protein 2, Smad1, Smad5, Mitogen-activated protein kinase (MAPK) *Corresponding author: Jeong-Hwa Baek, Department of Cell and Developmental Biology, School of Dentistry, Seoul National University, 28 Yeongun-dong, Jongno-gu, Seoul 110-749, Korea. Tel.: +82-2-740-8688, Fax.: +82-2-741-3193, E-mail : baekjh@snu.ac.kr 서론 Bone morphogenetic protein(bmp) 은 transforming growth factor(tgf)-β superfamily의일원으로조골세포전구세포로부터조골세포로의분화를촉진하고 in vivo와 in vitro 모두에서뼈형성을증가시키는효과를나타낸다. BMP가다양한생물학적효과를나타내는데는세포막에존재하는제1형 (BMPRI) 과 2형 BMP수용체 (BMPRII) 에대한결합이필요하다. BMP가수용체에결합하면 BMPRI 의 serine/threonine kinase가활성화되어 R-Smads(Smad1, 5, 8) 의카르복실말단이인산화되며이것이 co-smad인 Smad4와결합하여핵내로이동하여다양한전사인자및 coactivator 등과의상호작용을통해여러타겟유전자의발현을조절하는것으로알려져있다 (Miyazono et al., 2005; Ryoo et al., 2006). Smad1과 Smad5가 BMP2에의한조골세포분화과정에주요한신호전달물질로알려져있으며, 이들을 C2C12세포에과발현시키면조골세포분화가유도된다 (Yamamoto et al., 1997; Fujii et al., 1999). 그러나이러한분화효과는 BMP 처리또는 constitutively active(ca) BMPRI 발현시보다덜효과적이어서 Smad 신호경로외에추가적신호경로가작용할것으로생각되어왔다. BMP에의한조골세포분화작용에서 non-smad 경로의중요성에대한다수의보고가이루어졌으며, BMP2에의해활성화되는것으로알려진주요 non-smad 신호전달경로는 p38 mitogen-activated protein kinase(mapk), c-jun-n-terminal kinase(jnk), extracellular signal-regulated kinase(erk) 를포함하는 MAPKs 경로이다 (Kozawa et al., 2002; Guicheux et al., 2003; Hassel et al., 2003). 발표된논문에따라서로상반된결과를보이기도했지만, 많은경우이러한 non-smad 경로를차단하면 BMP2에 115

116 Ji Hae Jun, Hyun-Mo Ryoo, Kyung Mi Woo, Gwan-Shik Kim, and Jeong-Hwa Baek 의한조골세포분화및석회화결절형성이억제되었기때문에 BMP2 의작용이효과적으로나타나기위해서는 Smad 경로활성화와더불어이러한 non-smad 경로의활성화가필수적인것으로보여진다. BMPR 을통한 MAPKs 활성화경로에대해아직잘알려져있지않지만, 일부보고에서 p38 MAPK 및 JNK 활성화경로를설명하였다. 신경전구세포에 BMP4 를처리하면 BMPRI 에 X-linked inhibitor of apoptosis protein(xiap) 이결합하고 XIAP 에 TGF-β activated kinase 1(TAK1) binding protein 1(TAB1) 이결합하며그하위로 p38 MAPK 가활성화됨이보고되었다 (Yamaguchi et al., 1999; Jordan et al., 2001). TAK1 은 MAPKK6 와 MAPKK3 를활성화하여 p38 과 JNK 를활성화시킬수있으므로 JNK 도이런경로를통해활성화될가능성이있을것으로생각된다 (Shirakabe et al., 1997). 한편또다른보고에따르면정상적으로세포막에는 BMPRI 과 BMPRII 가 homomer 복합체또는 heteromer 복합체의상태로존재하고있으며, homomer 복합체형태로존재하는경우에는 BMP2 가 BMPRI 복합체에붙은후 BMPRII 와의 heteromer 복합체를형성하여 p38 MAPK 를활성화하지만이미 BMPRI 과 BMPRII 가 heteromer 복합체상태로존재하는경우에는 BMP2 가결합하면바로 R-Smad 활성화가유도되는것으로설명하였다 (Nohe et al., 2002). 이러한보고는 BMPR 에의한 p38 MAPK 활성화가 R-Smads 활성화와는독립적으로이루어짐을제시하고있지만, ERK 와 JNK 같은다른 MAPKs 활성화와 R-Smads 활성화간의관계는아직잘알려져있지않다. 따라서본연구에서는 C2C12 세포에서 BMP2 에의한이들 MAPKs 의활성화를확인하고, 그과정에서 R-Smad 인 Smad1 과 Smad5 이관여하는지를확인하고자하였다. 실험재료및방법 세포배양 C2C12세포와 HEK293 세포를 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco Invitrogen; Grand Island, NY, USA), antibiotics(100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, Gibco Invitrogen) 가함유된 Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM; Hyclone; Logan, UT, USA) 에서계대배양하여유지하였다. Alkaline Phosphatase 염색 BMP2 에의해유도되는조골세포분화과정에서 MAPKs 의역할을알아보고자 alkaline phosphatase(alp) 염색을시행하였다. C2C12 세포를 24-well plate 에 1.3 10 5 cells/well 의밀도로세포를분주한후 90% 정도세포가 confluent 해질때까지배양하였다. 그후배양액을 5% FBS가함유된 DMEM으로교체하고 MAPKs 활성을저해하는그룹에서는각 MAPK의억제제를 1시간동안전처치하였으며, 그후 100 ng/ml BMP2(Cytolab; Rehobot, Israel) 를첨가하여 48시간동안배양하였다. 배양이끝난세포를 phosphate-buffered saline(pbs) 으로 2회세척하고 2% paraformaldehyde로고정한후 Alkaline Phosphatase Stain Kit(Sigma; St. Louis, MO, USA) 를이용하여염색을시행하였다. 사용된 MAPK 억제제는 ERK 억제제로 40 µm U0126(Cell Signaling Technology; Beverly, MA, USA), p38 MAPK 억제제로 10 µm SB253580 (Calbiochem-Novabiochem; La Jolla, CA, USA), JNK 억제제로 10 µm SP600125(Sigma) 를사용하였다. Semiquantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction 조골세포분화관련전사인자및표지유전자의발현에미치는영향을관찰하기위해 reverse-transcription polymerase chain reaction(rt-pcr) 을시행하였다. 이를위해 C2C12세포를 5 10 5 cells/60 mm dish가되도록분주하고세포가 70~80% confluent 해진후 5% FBS가함유된 DMEM으로교체하였다. MAPKs 저해제를 1시간동안전처치하거나하지않고 100 ng/ml BMP2를첨가한후 48시간배양하였다. 배양된세포로부터 easy-blue RNA Extraction Reagent(iNtRON Biotechnology; Sungnam, Korea) 를이용하여 total RNA를준비하고 AccuPower RT Premix(Bioneer; Daejeon, Korea) 로 cdna를제작한후 i- star Taq DNA polymerase(intron Biotechnology) 를이용하여 PCR을시행하였다. 얻어진 PCR 산물은 1.2% agarose gel에서전기영동한후 ethidium bromide로염색하여확인하였다. PCR에사용한 primer는 TaKaRa Korea (Seoul, Korea) 에서제작하여사용하였으며, PCR 산물의크기및 primer 서열은아래와같다. ALP(439 bp) F: 5 -AGGCAGGATTGACCACGG-3, R: 5 -TGTAGTTC- TGCTCATGGA-3 ; Runx2 (289 bp) F:5 -CCGCACGAC- AACCGCACCAT-3, R: 5 -CGCTCCGGCCCACAAATCTC -3 ; Dlx5(491 bp) F: 5'-GGCCACCGATTCTGACTACTACA- 3, R: 5 -GCTCCGGGGGCATCTCC-3 ; Osteocalcin(300 bp) F: 5'-ATGAGGACCCTCTCTCTGCT-3, R: 5 -CCGTAGA TGCGTTTGTAGGC-3 ; glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (452 bp) F: 5 -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3, R: 5 -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3. Small Interfering RNA Transfection 및 BMP2 에의한 MAPKs 활성화관찰 R-Smad 가 BMP2 에의한 MAPKs 활성화에미치는영향을알아보기위해 Smad1 및 Smad5 에대한 small interfering(si) RNA 를이용하여 R-Smad 발현을억제하고 BMP2 의효과를관찰하였다. 이를위해 C2C12 세포를 5 10 5 cells/60 mm dish 가되도록분주하고다음날

R-Smads are not necessary for BMP2-induced MAPKs activation 117 Smad1 및 Smad5에대한 sirna 또는 random control sirna를 DharmaFECT(Dharmacon; Lafayette, CO, USA) 를이용하여 transfection하고밤새회복시킨후다음날혈청이없는배지로교환하여 6시간배양하였다. 그후 100 ng/ml BMP2를처리하고 1, 5, 30, 60분후에세포를수집하여단백질시료를준비하고 Western blot 분석을시행하였다. 실험에사용된 sirna는 Dharmacon에서구매하여사용하였고, Smad1과 Smad5의발현감소효과는단백질수준에서확인하였다. Western blot 분석과정을간단히설명하면배양된세포를 PBS로세척하고 RIPAbuffer(10 mm Tris-HCl [ph 7.5], 1 mm EDTA, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 2% SDS, 1% sodium deoxycholate, 50 mm NaF, 0.2 mm Na 3 VO 4, 1 mm PMSF, protease inhibitor cocktail) 에용해하여단백질시료를준비하였다. 단백질정량은 BCA reagent(pierce, Rockford, IL, USA) 를이용하였으며, 50 µg 단백질을 5X Laemmli sample buffer에섞은후 10% gel을이용하여 SDS-PAGE를시행하고 PVDF 막에옮긴후적절한일차및이차항체로반응시키고, WEST-ZOL plus(intron Biotechnology) 를이용하여해당단백질밴드를관찰하였다. Anti-phospho-ERK, anti-erk, anti-phospho-p38 MAPK, anti-p38 MAPK, anti-phospho-jnk, anti-jnk, anti- Smad1 및 anti-smad5 항체는 Cell Signaling Technology 제품을사용하였고, anti-actin, immunopure goat anti-mouse IgG horseradish peroxidase(hrp)-conjugated, goat anti-rabbit IgG HRP-conjugated, bovine anti-goat IgG HRP-conjugated antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 에서구매하여사용하였다. R-Smad 활성화가 ERK 활성화에미치는영향관찰 R-Smad 활성화만으로 ERK 활성화를유도할수있는지알아보기위해 Smad1 또는 Smad5를과발현하고 ERK 인산화정도를확인하였다. 이를위해 HEK293 세포에 Flag-tagged Smad1, Flag-tagged Smad5 발현벡터를 WelFect-Ex PLUS(WelGene, Seoul, Korea) 를이용하여 transient transfection하고 24시간동안회복시켰다. 그후혈청이없는배지또는혈청이포함된배지에서 24시간더배양한후세포를수집하여 Western blot 분석을시행하였다. ERK 활성화를유도하기위해일부세포에는 camek1 발현벡터 (Stratagen; La Jolla, CA, USA) 를같이 transfection하였다. 과발현시킨 Smad 단백질은 mouse anti-flag M2-HRP-conjugated antibody(sigma) 로관찰하였고, Smad1/5 활성화를확인하기위해서는 R-Smad 카르복실말단의 SXS 모티프가인산화된부분에결합하는 anti-phospho Smad1/5/8 antibody(cell Signaling Technology) 를일차항체로사용하였다. BMP 신호에의한 R-Smad 활성화에대해 ERK의조절작용이있는지알아보기위해 cabmprib를과발현시 키고 ERK 억제제를처리한후 Smad 활성화정도를관찰하였다. 이를위해 HEK293 세포에 cabmprib 및 Flagtagged Smad1, Flag-tagged Smad5 의 transient transfection 을시행하고 24 시간동안회복시킨후, 하루동안혈청이없는배지에서배양하고단백질시료를준비하여 Western blot 분석을시행하였다. ERK 활성을저해하는그룹에서는단백질시료준비전 3 시간동안 40 µm U0126 을처리하였다. 실험결과 조골세포분화유도기전을연구하기위해흔히사용되는모델시스템중하나는 C2C12 세포주같은근육전구세포 (premyoblast) 가조골세포로분화가유도되는지를확인하는것으로조골세포분화표지인자로는 ALP, osteocalcin 의발현을주로관찰한다 (Lee et al., 2000). 따라서본연구에서도 BMP2 에의한조골세포분화유도과정에서 MAPKs 활성화의역할을알아보기위해 C2C12 세포를이용하였다. C2C12 세포에 ERK, p38, JNK 의억제제를 1 시간동안전처치한후이들억제제존재하에 100 ng/ml BMP2 를 48 시간동안처리하고조골세포초기분화표지인 ALP 활성을관찰한결과 ERK 와 p38 억제제는 BMP2 에의해유도되는 ALP 활성을감소시켰지만 JNK 억제제는별다른억제효과를나타내지못하였다 (Fig. 1A). 동일한농도의 SP600125 는 BMP2 에의해유도되는 Dlx5 mrna 의발현을저해하는효과를나타냈으므로 JNK 억제제의농도가낮아서 ALP 에영향을나타내지못한것은아닌것으로생각된다 ( 결과보이지않음 ). ERK 와 p38 경로의효과를좀더살펴보기위해 ALP 와더불어조골세포분화초기에중요한전사인자로작용하는 Runx2 와 Dlx5, 조골세포분화후기표지인자인 osteocalcin 의 mrna 발현에미치는영향을 RT-PCR 로확인하였다. C2C12 세포에 100 ng/ml BMP2 를처리하고 48 시간후 ALP, Dlx5 mrna 의발현이강력히유도되었으며 Runx2 와 osteocalcin mrna 의발현은약간증가하는경향을보였다 (Fig. 1B, C). 여기에 ERK 억제제를처리한경우 Runx2 를제외한모든유전자의발현이억제되었고특히 Dlx5 는거의완전히발현이차단되는양상을보였다 (Fig. 1B). 그러나 p38 MAPK 억제제를처리한경우에는 ALP mrna 발현은감소시켰지만 Runx2, Dlx5 에는별다른영향을미치지못했으며 osteocalcin 의경우에는오히려발현을더욱촉진하는결과를나타내었다 (Fig. 1C). BMP2 에의한 MAPKs 활성화과정에서 R-Smads 를필요로하는지알아보기위해 BMP2 신호의대표적 R-Smad 인 Smad1 과 Smad5 에대한 sirna 를처리한후이들 MAPKs 의활성화양상을관찰하였다. Smad sirna 의

118 Ji Hae Jun, Hyun-Mo Ryoo, Kyung Mi Woo, Gwan-Shik Kim, and Jeong-Hwa Baek Fig. 1. MAPKs activation is involved in BMP2-stimulated osteoblast differentiation. (A) C2C12 cells were treated with BMP2 in the absence or presence of MAPKs inhibitors for 2 days and alkaline phosphatase histochemical staining was performed. U, 40 µm U0126; SB, 10 µm SB203580; SP, 10 µm SP600125. (B, C) C2C12 cells were treated with BMP2 (100 ng/ml) and/or MAPKs inhibitor (40 µm U0126 or 10 µm SB203580) for 2 days and semi-quantitative RT-PCR was performed. ALP, alkaline phosphatase; OCN, osteocalcin; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. 효과를확인하기위해 Smad1 과 Smad5 의단백질양을확인한결과 random control sirna 를처리한경우에비해두단백질모두발현수준이현저하게감소된것을확인할수있었다 (Fig. 2). Control sirna 를 transfection 하고 100 ng/ml BMP2 를처리한후 ERK, p38, JNK 의활성화를관찰한결과 ERK 와 JNK 는 5 분후에일시적으로활성화가관찰된후다시불활성화되는양상을보였다 (Fig. 2). 반면 p38 의경우 1 시간후까지지속적으로활성화되는양상을보였다. Smad1/5 의발현을감소시킨세포에서도 BMP2 를처리한후이들 MAPK 의활성화가관 Fig. 2. Smad1/5 knock-down does not inhibit BMP2-induced MAPKs activation. C2C12 cells were transfected with random control sirna or sirnas for Smad1 and Smad5, serum-starved for 6 hours, and treated with BMP2 for the times indicated. Then, the whole cell lysates were subjected to Western blot analysis with the antibodies indicated. Knock-down of Smad1 and Smad5 was confirmed in the protein level by Western blot analysis. 찰되었으나, p38 MAPK 의경우활성화속도가지연되는양상을보였다 (Fig. 2). 특이하게 ERK 의경우대조군세포에서는 30 분이후에는 basal level 의 ERK 활성화도억제된것으로나타난반면, Smad1/5 발현이감소된세포에서는 BMP2 처리 30 분후에도여전히어느정도활성화상태가유지되는것으로나타났다. 이는 Smad1/5 가 ERK 활성에대해억제적조절효과를나타낼가능성이있음을시사하였다. ERK 활성화와 Smad 와의관계를좀더살펴보기위해 HEK293 세포에 Smad1 또는 Smad5 를과발현시키고 ERK 활성화에미치는영향을살펴보았다. 또한 ERK 활성화를유도하기위해 camek1 을동시에과발현시키기도하였다. 혈청이없는상태에서세포를배양한경우 Smad1 또는 Smad5 의과발현에의한 Smad 활성화효과는미약하였고, 이상태에서 ERK 활성화는관찰되지않았다 (Fig. 3A). Smad 와 camek1 을동시에과발현시킨세포에서는예상대로 ERK 활성화가관찰되었다. 특이하게 Smad1 과 camek1 을동시에과발현시킨경우 Smad1 단백질의발현양이크게증가되었으며그상태에서는 Smad1 의활성화가관찰되었다. 혈청이있는상태에서세포를배양한경우에는 Smad1 또는 Smad5 의과발현에의해 Smad 활성화가관찰되었다 (Fig. 3B). 그러나 Smad 가활성화된상태에서도 ERK 활성화는관찰되지않았으며, camek1 을발현시킨세포에서만 ERK 활성화가유도되었다. 혈청이없는상태에서와마찬가지로 camek1 이과발현된경우 Smad1 단백질양이크게증가되었고활성화된 Smad1 도증가하였다. ERK 활성화에의한 Smad1 단백질증가효과는반복실험에서일정하게관찰된반면 Smad5 의경우에는그결과가일정하게나오지않았다 ( 결과보이지않음 ). ERK 활성화가 Smad1 단백질양및활성화를증가시키는것으로관찰되었기때문에 BMPR 에의해유도된 ERK 활성화가 R-Smad 활성화에미치는영향을관찰하였다.

R-Smads are not necessary for BMP2-induced MAPKs activation 119 Fig. 3. Activation of Smad1 or Smad5 does not induce ERK activation. HEK293 cells were transiently transfected with Flag-tagged Smad1, Flag-tagged Smad5 and/or camek1 expression vectors. After recovery, cells were incubated in the serum-free medium (A) or 10% FBS containing medium (B) for 24 hours. Then cell lysates were prepared and Western blot analysis was performed. P-Smad; Phosphorylated Smad1/ 5/8 at carboxyl terminal SXS motif. C2C12 세포에 cabmprib 를과발현시킨경우 MEK1/ERK 경로가활성화됨이확인되었으므로 (Fig. 4A), HEK293 세포에 Smad1/5 와 cabmprib 를같이발현하고 U0126 으로처리하여 ERK 활성화를억제한후 Smad1/5 활성화에미치는영향을관찰하였다. Fig. 3A 의결과와마찬가지로혈청이없는배지에서세포를배양했기때문에 Smad1 또는 Smad5 과발현만으로 Smad 활성화정도는미미했지만 cabmprib 를같이발현시키면 Smad 활성화가뚜렷하게관찰되었고 ERK 활성화도같이관찰되었다 (Fig. 4B). 한편 ERK 억제제를처리한경우 cabmprib 에의한 ERK 활성화저해효과뿐아니라 Smad1 의활성화감소도뚜렷하게나타났다. Smad5 의경우에도정도는적지만유사한현상이관찰되었다. 이러한결과는 BMP 에의해활성화된 ERK 가 R-Smad 특히 Smad1 의활성화를촉진하는작용을가지고있음을시사하였다. 고 찰 조골세포의분화를유도하는데있어 BMP 뿐아니라다른성장인자나세포외기질도중요한역할을담당하는것으로알려져있으며이들은 MAPKs 를포함한여러신호전달경로를활성화시켜그효과를나타낸다. BMP 의경우에도 R-Smad 의활성화를통한신호전달이주요신호전달경로로작용하기는하지만동시에 MAPKs, protein kinase C 및 D, phosphatidyl inositol 3 kinase 등여러 non-smad 신호전달경로를활성화시키며이들은 Smad 경로작용을촉진, 보완, 또는억제하는다양한효과를나타내는것으로생각되고있다. 따라서본연구에서는 BMP2 에의해활성화되는 non-smad 신호전달물질중특히 MAPKs 와 R-Smads 활성화간의상관관계를살펴보았으며그결과 R-Smads 활성화가 BMP2 에의한 ERK, Fig. 4. Inhibition of ERK activity reduces BMPR-induced R-Smads activation. C2C12 (A) or HEK293 cells (B) were transiently transfected with camek1, Flag-tagged Smad1, Flag-tagged Smad5 and/or cabmprib expression vectors and incubated in the serum-free medium for 24 hours. Then, cell lysates were prepared and Western blot analysis was performed. When indicated, cells were treated with 40 µm U0126 for the last 3 hours.

120 Ji Hae Jun, Hyun-Mo Ryoo, Kyung Mi Woo, Gwan-Shik Kim, and Jeong-Hwa Baek p38 MAPK, JNK 활성화유도에필요하지않고 ERK는 Smad1 활성화를촉진함을확인하였다. 조골세포에서 BMP2에의한 MAPKs 활성화의역할에대해보고된주요내용을정리해보면, 생쥐조골세포전구세포 (MC3T3-E1) 또는 C2C12 세포에서 i) p38 MAPK 활성화가 BMP2에의한조골세포분화에관여하며 (Gallea et al., 2001; Guicheux et al., 2003), ii) ERK 활성화는조골세포분화를촉진하거나 (Gallea et al., 2001) 억제하고 (Kozawa et al., 2002; Higuchi et al., 2002), iii) JNK 활성화는 osteocalcin 발현을촉진한다고하였다 (Guicheux et al., 2003). 또한사람의골수간엽세포또는조골세포를이용한연구에서는 ERK 활성을억제하면 BMP2에의한 ALP 발현이촉진되며 (Osyczka et al., 2005), p38 MAPK의활성화가 BMP2에의한조골세포분화에관여한다는보고가있었다 (Noth et al., 2003). 본연구에서 C2C12 세포에 BMP2를처리하면수분이내에세가지 MAPK가모두활성화됨이관찰되었고, 각 MAPK의억제제를사용하여조골세포분화관련전사인자인 Runx2, Dlx5, 조골세포분화표지유전자인 ALP, osteocalcin의발현에미치는영향을관찰한결과 MAPK의종류에따라조절효과가서로다르게나타났지만전체적인반응양상은기존의보고들과유사하였다. ERK 억제제는 Dlx5, ALP, osteocalcin 발현을감소시켰고특히 BMP2에의해유도되는 Dlx5 발현을완전히차단한반면, p38 MAPK 억제제는 ALP 발현만을감소시켰다. JNK 억제제는 Dlx5 의발현을감소시켰으나 ALP에는별다른영향을미치지않았다. 이러한결과는이들 MAPKs가각기그하위신호전달물질활성조절을통해 BMP2 생리활성에서로다른방식으로기여함을시사하였다. 현재까지보고된 non-smad 경로의역할에대해 BMP 보다는 TGF-β 시스템에서좀더많이알려져있다. Moustakas et al.(2005) 은 TGF-β 시스템에서 Smad와 non-smad간의관계에대해 i) TGF-β가 non-smad를활성화시키고그들이 Smad를타겟으로조절작용을나타내거나, ii) Smad가 non-smad의활성을직접조절하거나, iii) TGF-β 수용체가 Smad와 non-smad 경로를독립적으로동시에활성화시키고 non-smad 신호전달물질이 Smad 활성에상협작용을나타낼수있다고설명하였다. BMP 시스템에서 Smad 와 non-smad 간관계가아직잘밝혀져있지않지만세포막에존재하는 BMPR의조합에따라 Smad와 p38 MAPK 를활성화시키는수용체풀이따로존재한다는 Nohe et al. (2002) 의보고는 BMP 수용체가 Smad와 non-smad 경로를독립적으로동시에활성화시켜 non-smad 신호전달물질이 Smad 활성에상협작용을나타낼가능성을시사한다. 그러나 TGF-β의경우 Smad 활성의존적으로 p38 MAPK 활성화가이루어진다는보고들이있어 (Takekawa et al., 2002; Ungefroren et al., 2003), 조골세포에서 BMP 수용체를통한 MAPK 활성화와 R-Smad 활성화간의상 관관계를살펴볼필요가있다. 앞서언급된연구들에서조골세포에 BMP2 처리후 MAPKs 의활성화시기가다양하게나타나며수분이내에활성화가일시적으로된다는보고와 1 시간이후에활성화가시작되어수시간동안활성화상태가유지된다는보고가있었다. 본연구에서 MAPKs 가 BMP2 에의해주로활성화되는시간을보면 5 분이내에활성화가시작되었고, p38 MAPK 는 1 시간넘어서까지활성화상태가유지되었지만 ERK 와 JNK 는곧바로불활성화가진행되는것으로나타났다. 이러한 MAPK 활성화유도시간은, R-Smad 가활성화되기시작하는시간으로알려진 5~15 분과유사하므로 (Noth et al., 2003; Guicheux et al., 2003) 이들 MAPK 활성화가 Smad 의활성화에이차적으로수반되는현상은아닌것으로생각된다. 또한본연구에서 Smad1 과 Smad5 의 sirna 를이용하여이들의발현을감소시킨상태에서세가지 MAPKs 활성화가모두관찰되었고, Smad1 과 Smad5 의과발현을통해 Smad 활성화를유도한경우에는 ERK 활성에별다른변화를유도하지않았으므로, 이러한결과는 R-Smad 와 MAPKs 의독립적활성화가능성을지지하는결과로생각된다. BMP2 에의해활성화된 MAPKs 가 Smad 경로에미치는조절작용에대한보고들을살펴보면, Guicheux et al.(2003) 은 p38 MAPK 또는 JNK 의억제제를처리해도 BMP2 에의한 R-Smad 인산화에아무런영향을미치지않는다고보고한반면, Noth et al.(2003) 은 BMP2 에의한 p38 MAPK 활성을억제하면 Smad1 의인산화및핵내이동이저하된다고보고하여 MAPK 가 Smad 경로에조절작용을보일수있음을제시하였다. 한편 epidermal growth factor 나 fibroblast growth factor 가각각의수용체에결합하여 ERK 를활성화시키면 Smad1 의 linker 도메인에인산화를유도하고그결과 Smad1 의핵내이동을억제하며, E3 ligase 인 Smurf1 과 Smad1 의결합을증진시켜 Smad1 의파괴를증진시키고이를통해 BMP 의활성을저해한다는보고가있었다 (Kretzschmar et al., 1997; Sapkota et al., 2007). 그러나본연구에서는 camek1 을과발현시켜 ERK 활성화를유도한경우 Smad1 단백질양및활성화가증가되었고, cabmprib 에의한 ERK 활성화를 U1026 으로저해한경우 Smad1 의활성화가감소됨이관찰되어 ERK 가 Smad1 의활성화를촉진하는효과를보이는것으로나타났다. 이는 MC3T3-E1 세포에서 ERK 활성화가 BMP2 에의한 R-Smad 전사활성을증가시킨다는보고와유사한결과로생각된다 (Suzawa et al., 2002). 본연구결과가 Sapkota et al.(2007) 의결과와다른이유는명확하지않지만, 조골세포에서 BMP2 에의해활성화되는 MAPK 의역할에대한기존의보고들에서 p38 MAPK 와 JNK 는 BMP2 에의한조골세포분화촉진효과에관여하는것이일관적으로나타났지만 ERK 의경우에는조골세포분화촉진작용을나타내기도하고오히려억제작용을나타내기도하는것으로보고된바있는데, 이

R-Smads are not necessary for BMP2-induced MAPKs activation 121 는사용한세포시스템에따라 ERK 에의한 R-Smad 조절효과가서로상반되게나타난것과관계가있을가능성을시사하는것으로보이며이에대한추가적연구가필요할것으로생각된다. 감사의글 이논문은 2006 년도정부재원 ( 교육인적자원부학술연구조성사업비 ) 으로한국학술진흥재단의지원을받아연구되었음 (KRF-2006-000-E00093) 참고문헌 Fujii M, Takeda K, Imamura T, Aoki H, Sampath TK, Enomoto S, Kawabata M, Kato M, Ichijo H, Miyazono K. Roles of bone morphogenetic protein type I receptors and Smad proteins in osteoblast and chondroblast differentiation. Mol Biol Cell. 1999;10:3801-13. Gallea S, Lallemand F, Atfi A, Rawadi G, Ramez V, Spinella- Jaegle S, Kawai S, Faucheu C, Huet L, Baron R, Roman- Roman S. Activation of mitogen-activated protein kinase cascades is involved in regulation of bone morphogenetic protein-2-induced osteoblast differentiation in pluripotent C2C12 cells. Bone. 2001;28:491-8. Guicheux J, Lemonnier J, Ghayor C, Suzuki A, Palmer G, Caverzasio J. 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