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The Korean Journal of Pathology 2009; 43: 503-8 DOI: 10.4132/KoreanJPathol.2009.43.6.503 간성상세포의활성에서 sirna 를이용한 TGF-b1 의전사조절 오훈규 김경현 금윤섭 조창호박재복 박관규 대구가톨릭대학교의과대학병리학교실 접수 : 2009년 1월 30일게재승인 : 2009년 6월 24일 책임저자 : 박관규우 705-718 대구광역시남구대명4동 3056-6 대구가톨릭대학병원병리과전화 : 053-650-4151 Fax: 053-650-3050 E-mail: kkpark@cu.ac.kr 본연구는대한병리학회연구비제06-01호의지원으로이루어진것임. Transcriptional Regulation of Hepatic Stellate Cell Activation by sirna for TGF-b1 Hoon-Kyu Oh, Kyung-Hyun Kim, Yoon-Sup Keum, Chang-Ho Cho, Jae-Bok Park and Kwan-Kyu Park Department of Pathology, College of Medicine, Daegu Catholic University, Daegu, Korea Background : The cytokine-induced activation of hepatic stellate cells (HSC) plays a major role in liver fibrosis. Quiescent HSCs undergo phenotypic transformation called transdifferentiation in response to viral, chemical or immune insults to the liver. The cytokine TGF-b1 plays a key role in progressive liver fibrosis. Since small interfering RNA (sirna) is a powerful tool for silencing gene expression post-transcriptionally, the present study aimed to determine whether synthetic TGF-b1 sirna down-regulates the expression of the TGF-b1 gene in immortalized and activated rat HSCs (HSC-T6s). The study examined whether synthetic TGFb1 sirna prevents rat HSCs activation and extracellular matrix (ECM) production. Methods : TGF-b1 sirna or a control (pu6) sirna was added to HSC-T6 culture media. We then performed RT-PCR and western blot analyses for TGF-b1 and ECM components (fibronectin, type-i collagen, and TIMP-1). Results : TGF-b1 sirna significantly down-regulated expression of TGF-b1 mrna and protein and attenuated mrna and protein expressions of type-i collagen, fibronectin, and TIMP-1, as compared to the control. Conclusions : TGF-b1 sirna can effectively down-regulate the expression of TGF-b1 in rat HSC, resulting in significant inhibition of HSC activation and of ECM production. These data indicate that synthetic TGF-b1 sirna can be a useful treatment modality to prevent liver fibrosis. Key Words : Transforming growth factor-beta; Small interfering RNA; Hepatic stellate cell; Liver fibrosis 간섬유화는알코올, 바이러스, 약물, 간독성물질등많은원인에의해초래되는간세포손상에대한반응으로쿠퍼세포와염증세포에서분비되는사이토카인들과다른용해성물질에의한염증반응과섬유생성반응의결과로생긴다. 또한간섬유화는만성간손상에따르는수복과정으로간성상세포의활성화와과도한세포외기질의생산을특징으로한다. 간손상이오래지속되면결국간세포는기능을상실하고섬유화에의해간의구조는변하게되며결절이형성되는비가역적변화인간경화로진행하게된다. 1 휴지기상태의간성상세포는간세포가손상될때또는배양접시와같은딱딱한표면에서배양될때세포내의지방과레티노이드성분을잃고알파민무늬근육액틴 (a-sma) 을발현하는증식성의근섬유모세포 (myofibroblast) 로바뀌게되는데이런과정을변환분화 (transdifferentiation) 라고한다. 변환분화된근섬유모세포는세포외기질뿐만아니라섬유화에관련된다양한종류의사이토카인과케모카인들을분비하게된다. 2-4 간세포의손상으로야기되는염증반응은휴지기의간성상세포를활성화하여세포외기질물질과다양한사이토카인및케모카인들을분비하게하고기질메탈로프로테인아제 (matrix metalloproteinase) 와그억제제인 tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP) 의분비도촉진하게한다. 또한간성상세포는섬유화를촉진하면서섬유융해작용 (fibrolysis) 도담당한다. 5-7 Transforming growth factor-b (TGF-b) 는많은세포들에서강력한성장억제제로작용하고실질세포에서는아포프토시스의조절에주요한역할을하며세포외기질의생성을자극하기도한다. 특히간섬유화에서간성상세포의근섬유모세포로의변환분화의시작과촉진그리고진행에주요한역할을담당하는데, 섬유화과정에서 TGF-b1이활성화되면간성상세포에서콜라겐의생성과축적이증가하여섬유화가진행되고간의기능을잃게된다. 8 따라서 TGF-b1의생성과신호전달과정을차단하여간섬유화의진행을막기위해다양한동물실험이행해지고있다. 9-12 503

504 오훈규 김경현 금윤섭외 3 인 Small interfering RNA (sirna) 는특정유전자의 mrna 와상보적으로결합하여그유전자의단백발현을억제, 전사단계에서유전자의발현을억제하는 RNA간섭 (RNAi) 의한방법이다. 13,14 또한유전자의이중가닥 RNA (double-stranded RNA, dsrna) 를세포내로주입하는 RNAi는 RNA-induced silencing complex (RISC) 나 dicer RNase III 같은세포내효소들에의해그유전자의 mrna를특이적으로분해하여유전자의발현을억제하는방법이다. 이들은 ribozyme이나 antisense ODN을이용하는유전자억제방법보다훨씬더효율적으로목적하는유전자의발현을억제시킬수있어최근들어다양한실험연구와치료방법에응용되고있다. 15-18 저자들은사염화탄소로유도된쥐의간경화모델에서 TGFb1 sirna 를이용하여 TGF-b1의발현이억제되고섬유화관련단백인제1형콜라겐과알파민무늬근육액틴의발현이낮아지는것을관찰하였으며, TGF-b1 sirna가효과적으로항섬유화작용을하는것을관찰하였다. 19 그러나동물모델에서는간손상과섬유화과정에관여하는여러유형의간내세포들중어느세포가섬유화과정에중요한작용을하는지는알수없었다. 따라서이번연구에서는간섬유화과정에핵심세포로작용하는간성상세포에서 TGF-b1 의작용을 TGF-b1 sirna를이용하여차단함으로써 sirna 를이용한유전자치료가항섬유화치료의방법으로유효한것인지알아보기위해이실험을시행하였다. 는짧은 RNA transcript를전사하는 U6 RNA 중합효소 Ⅲ 증진부위를가지고있는플라스미드벡터를사용하였는데, TGFb1 sirna 염기서열및벡터는 Vectorcorea ( 벡터코아에이, 대전, 대한민국 ) 로부터주문제작하여사용하였다. TGF-b1 sirna 간성상세포핵산전달감염 (transfection) 및확인 간성상세포에서 TGF-b1 sirna 의효과를확인해보기위해간성상세포를 60 mm의세포배양접시에 2 10 5 cells/ml씩동일하게나누어혈청을넣지않은배지로 24시간동안배양시켜성장주기를동일하게맞추어배양하였다. 핵산전달감염은 Lipofectamine Plus Reagent (Invitrogen, CA, USA) 를사용하여시행하였으며, TGF-b1 sirna를가지는플라스미드벡터와대조군 pu6 벡터는각세포배양접시에 3 mg씩사용하였다. 이때정상대조군은활성화된간성상세포를사용하였고, 실험군과대조군은 12시간동안핵산전달감염시킨후회수하였다. 또한간성상세포에서 TGF-b1 sirna의핵산전달감염을확인하기위하여 Label IT nucleic acid labeling kit (MirusBio, WI, USA) 로 TGF-b1 sirna에형광물질을표지하였다. 이때표지된 TGF-b1 sirna는 Lipofectamine plus reagent (Invitrogen) 를사용하여핵산전달감염을시행한후형광현미경으로관찰하였다. 재료와방법간성상세포 (Hepatic stellate cell) 배양표현형과생화학적특성이활성화된쥐의불멸화 (immortalization) 간성상세포 (rat HSC-T6) 를분양받아실험에사용하였다. 간성상세포는 10% 우태혈청 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 과페니실린 (100 U/mL, Gibco), streptomycin (100 mg/ ml, Gibco) 을포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium, (DMEM, Gibco) 배지를이용하여 37, 5% CO 2 를함유하는배양기에서배양하였다. 그리고배양된세포는 10 mm 접시에 2 10 5 cells/ml씩나누어 37.8, 5% CO 2 를함유하는배양기에서계대배양하여사용하였다. TGF-b1 sirna 적정부위선정및플라스미드벡터클로닝 TGF-b1 전체유전자염기서열에서 sirna 효과를만족하게해주는 21개의상보적인염기서열을선정하였다. 즉목적부위가 A ( 아데노신 ) 나 G ( 구아닌 ) 로시작하고다른유전자와상동성이없으며, 2차구조가적고 GC 비율이 30-50% 인부위를선정하였다. 그염기서열은다음과같다 : 5 -AACCAAGGAGA- CGGAATACAG-3 (TGF-b1 site; NM_021578). 또한벡터 RNA 분리및역전사중합효소연쇄반응 (reverse transcriptase polymerase chain reaction) 각실험군의배양세포배양액을제거한후 1 PBS로세척하고, TRIzol 용액 1 ml로처리하였다. 그런후 0.2 ml의클로로포름을첨가하여 3분간상온에서반응시키고 12,000 rpm에서 10분간원심분리하여생긴상층액 600 ml를새튜브로옮긴후, 450 ml의이소프로필알코올을첨가하여섞어준다음다시상온에서 10분간반응시키고 12,000 rpm에서 10분간원심분리하였다. 이렇게원심분리하여생긴침전물에 75% 의알코올 1 ml을첨가하여 7,500 g에서 5분간원심분리하였다. 그리고침전물을공기중에서말린후각각의튜브마다 50 ml의 RNase free water 를첨가하여녹인다음원액을 1/100로희석, 260 nm 파장에서정량하였다. 그리고분리한 RNA 중 500 ng의 RNA를사용하여 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA) 로역전사반응을시켜 cdna를합성하였으며, 합성된 cdna를이용하여 TGF-b1, type I collagen, fibronectin, TIMP-1의 primer를이용, PCR 을수행하였고생성된 product는 1% agarose gel로전기영동하여 ethidium bromide과결합, 가시화하여결과를확인하였다. RT-PCR을위해사용한각각의 primer 서열은 Table 1과같다.

간성상세포의활성에서 sirna 를이용한 TGF-b1 의전사조절 505 단백질의분리및 western blot 분석각실험군의배양세포배양액을제거한후 1 PBS로세척하고, 세포를 scraper로긁어모아 4, 12,000 rpm으로 5분간원심분리한후상층액은제거하고변성용액 (IPH buffer, 50 mm ph8.0 Tris, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 100 mm PMSF, 1 mg/ml leupeptin, 1 mg/ml aprotinin, 1M DTT) 으로현탁시켰다. 그런후 4 에서 30분동안용해시키고 12,000 rpm에서 20분동안원심분리한후, 세포용해물로부터단백질을분리하였다. 그리고단백질정량용시약 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) 을사용하여분광광도계 (Beckman, Peapack, USA) 로전체단백질을정량하였다. 정량된단백질 50 mg은 DTT가첨가된 2 SDS loading buffer (Tris-Cl [ph6.8] 100 mm, glycerol 20%, bromophenol blue 0.2%, SDS 4%, dithiothreitol 200 mm) 와섞어 98 에서 5분간가열한후 TGF-b1은 12%, type I collagen은 6%, fibronectin은 10%, TIMP-1은 12% 로 SDS-polyacrylamide gel에서 2시간 30분간 100 V로전기영동하고, 15 V에서 12시간동안나일론막으로단백질을전달하였다. 그후나일론막은 TBS-T buffer (10 mm Tris, 150 mm NaCl, 0.1% Tween 20) 5% 탈지유로 1시간동안배양한후일차항체 anti-tgf-b1 (R&D systems, CA, USA), anti-type I collagen (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronectin (Abcam), anti-timp-1 (Santa Cruz, CA, USA) 으로 3시간반응시키고, TBS-T buffer로 10분간 3번헹구었다. 그런후 horseradish peroxide (HRP) 가결합되어있는 anti-rabbit 또는 anti-mouse IgG (IgG-HRP) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 로 1시간동안결합시키고, TBS-T buffer로 10분간네번헹군후 enhanced-chemiluminescence 용액 (Amersham, Buckinghamshire, UK) 으로가시화하였다. 량화하였고, 각실험을 3번시행하여평균값을사용하였다. 이때 Student s t-test에서 p<0.05일때통계적으로유의한차이가있다고판정하였다. 결과 TGF-b1 sirna 플라즈미드벡터의핵산전달감염확인 TGF-b1 sirna 플라스미드벡터의핵산전달감염효율과위치를확인하기위하여 TGF-b1 sirna에형광을붙여간성상세포에핵산전달감염을시켰다. 전달감염 12시간후간성상세포를형광현미경으로관찰하여본결과배양된대부분의간성상세포의세포질과핵에서형광이관찰되었다 (Fig. 1). 이를토대로간성상세포에 TGF-b1 sirna 플라스미드벡터가효과적으로전달됨을확인하였다. 활성화된간성상세포주에서 TGF-b1 mrna 발현억제활성화된간성상세포주에서 TGF-b1 sirna 플라스미드를주입하여 12시간이경과한후 mrna를추출, mrna 발현의변화정도를관찰하였다. 그결과활성화된간성상세포와 pu6 promtor를핵산전달감염시킨대조군에서 TGF-b1의 mrna 발현을확인하였고, 대조군에비하여 TGF-b1 sirna 플라스미드를핵산전달감염시킨실험군에서는 TGF-b1 mrna 발현량이현저히감소하는것을확인할수있었다 (Fig. 2). 이로써 TGF-b1 sirna 플라스미드가활성화된간성상세포내로전달되어 TGF-b1의전사단계를효과적으로차단하였음을확인하였다. 통계처리 RT-PCR과 western blot의발현치는 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 와의상대적인발현량을정 Table 1. Primers sequences of TGF-b1, type I collagen, fibronectin and TIMP-1 Target TGF-b1 Type I collagen Fibronectin TIMP-1 Primer sequence sense: 5 -TCTCTCCGACCTGCCACAGA-3 antisense: 5 -GATCGCGCCCATCTAGGTT-3 sense: 5 -TGGTGCCAAGGGTCTCACTGGC-3 antisense: 5 -AGGCCTTGTACACCACGTTCACC-3 sense: 5 -TGTGACAACTGCCGTAGACC-3 antisense: 5 -GACCAACTGTCACCATTGAGG-3 sense: 5 -CTGGCATCCTCTTGTTGCTA-3 antisense: 5 -AGGGATCTCCAGGTGCACAA-3 Fig. 1. Immunofluorescence of intracytoplasmic and intranuclear transfection of TGF-b1 sirna (arrows) in cultured HSC-T6 cells.

506 김미숙 정상우 활성화된간성상세포주에서세포외기질관련유전자의 mrna 발현억제 활성화된간성상세포주에서 TGF-b1 sirna 플라스미드를주입한후세포외기질관련유전자의 mrna발현을관찰하였다. 이때활성화된간성상세포와 pu6 promoter를핵산전달감염시킨대조군에서는세포외기질관련유전자인 type I collagen, fibronectin, TIMP-1의발현을확인하였고, TGF-b1 sirna 플라스미드를핵산전달감염시킨실험군에서는 type I collagen, fibronectin, TIMP-1의발현이감소하는것을확인하였다 (Fig. 2). 따라서활성화된간성상세포에서 TGF-b1 sirna 플 라스미드처리는 TGF-b1 자체의발현을억제시킬뿐만아니라세포외기질관련단백의 mrna 발현도억제시킴을확인할수있었다. 활성화된간성상세포에서 TGF-b1 sirna 플라스미드로인한 TGF-b1 과세포외기질단백의발현감소 본연구에서는활성화되어있는간성상세포를사용하여간경화상태에서의간성상세포활성과동일하게세포의활성을유지하였으며, 세포배양을통해획득한단백질로 western blotting 을이용, TGF-b1 단백과세포외기질단백의발현을확인하였 120 Collagen 100 Fibronectin TIMP-1 Relative abundance (%) 80 60 40 TGF-b1 20 GAPDH A 0 Collagen Fibronectin TIMP-1 TGF-b1 B Fig. 2. RT-PCR analysis shows inhibitory effects of TGF-b1, collagen type 1, fibronectin and TIMP mrna expression in cultured HSC-T6 cells by TGF-b1 sirna (A). (B) Decreased expression of TGF-b1, collagen type 1, fibronectin and TIMP-1 mrna in TGF-b1 sirna treated cultured HSC-T6 cells (TGF-b1 sirna) than normal control (NC) and pu6 treated control group (pu6). The values are means with standard deviations from three independent experiments. p<0.05. 140 Collagen 120 Fibronectin TIMP-1 Relative abundance (%) 100 80 60 40 TGF-b1 20 GAPDH A 0 Collagen Fibronectin TIMP-1 TGF-b1 B Fig. 3. Western blot analysis shows inhibitory effects on the expression of TGF-b1, collagen type 1, fibronectin and TIMP-1 protein in cultured HSC-T6 by TGF-b1 sirna (A and B). p<0.05.

간성상세포의활성에서 sirna 를이용한 TGF-b1 의전사조절 507 다. 그결과, 활성화된간성상세포와 pu6 promoter 플라스미드를처리한경우 TGF-b1, type I collagen, fibronectin, TIMP-1 단백의발현을확인할수있었다. 또한 TGF-b1 sirna 플라스미드를처리한실험군에서는 TGF-b1, type I collagen, fibronectin, TIMP-1단백의발현이 TGF-b1 sirna 플라스미드에의해감소하는것을확인하였다 (Fig. 3). 고찰간섬유화를방지하기위해 TGF-b1의발현을억제하기위한많은연구가행해지고있다. 9-12,19 이에따라본연구에서도간섬유화의핵심역할을담당하는간성상세포에서 sirna를이용, TGF-b1 발현을차단함으로써간섬유화를억제해보고자하였다. 이때작은 dsrna 조각을직접감염시킬경우세포안에서오랜시간동안유전자의발현억제가어려운점을고려하여 sirna가안정적으로세포내에서합성될수있도록고안된플라스미드벡터를사용하였다. 21 플라스미드벡터는자가복제가가능하고면역반응을유발하지않으며, 독성이없고제조및대량생산이용이한장점이있다. 22,23 TGF-b1 sirna 가간성상세포에핵산전달되는것을확인하기위해실험군과대조군에서 TGF-b1 mrna의발현을전달감염시키고 12시간후관찰한결과, 실험군의간성상세포에서유의하게감소하는것을발견할수있었으며, 이를통해본실험에사용한플라스미드벡터가 sirna를간성상세포내에서효과적으로전달하는것을확인하였다. TGF-b1은간손상에서아주중요한전섬유생성인자 (profibrogenic factor) 로작용하며, 24-26 일반적으로모든간손상에서 TGF-b1의생성이증가한다. TGF-b1은간세포및간의기질세포들뿐만아니라림프구, 단핵구, 탐식구와같은염증세포와활성화된간성상세포에서도생성되는데 27,28 간손상을일으키는많은원인들은결국간섬유화를유발한다. 간성상세포는간손상초기에손상된간세포와간의조직탐식구인쿠퍼세포에서방출된 TGF-b1에의해휴지기동안활성화된다. 이때활성화된간성상세포는증식능과섬유생성이가능한수축력이있는근섬유모세포 (myofibroblast) 의형태로변환분화 (transdifferentiation) 되어간섬유화를일으키게된다. 24 불멸화 HSC-T6세포는정상쥐의간성상세포에 Rous sarcoma virus promoter (SV40) 를전달감염시켜만들어지는데, 4 HSC-T6 세포는계대배양을거듭하면세포내의지방과레티노이드성분을잃고 a-sma, desmin, vimentin 등과같은세포골격단백을발현하며섬유모세포와같은모양과높은증식능을보이는활성화된근섬유모세포의특성을보인다. 4 TGF-b1에의한간성상세포의활성은쿠퍼세포등으로부터주변분비 (paracrine) 자극과간성상세포자체의자기분비 (autocrine) 자극에의해이루어진다. 2,24,25 본실험에서 TGF-b1 sirna는활성화 된간성상세포에서 TGF-b1의 mrna와단백의발현을억제하여간성상세포에서 TGF-b1의자기분비기능을억제하는것으로생각하였다. 간성상세포는 TGF-b1과혈소판성장인자-b (PDGF-b) 등과같은성장인자와사이토카인에의해활성화된다. 특히 TGFb1은간성상세포의근섬유모세포로의변환에아주중요한역할을하는데, 2,3 TGF-b는세포막표면에존재하는두개의 TGFb 수용체에결합하여이형접합체를형성, 세포내신호전달물질인 smad를인산화하여콜라겐등의세포외기질의생성을촉진한다. 29 Liu 등 30 은휴지기의간성상세포에서는 smad2가그리고활성화된간성상세포에서는 smad3이섬유화를유발하는세포내신호전달물질로작용한다고하였다. TGF-b1은세포외기질의분해효소인기질메탈로프로테인아제 (matrix metalloproteinase) 의발현을감소시키고, 그저해제인 TIMP-1 의발현을증가시켜섬유화를더욱가속시키는것으로알려져있다. 5-7 본실험결과활성화된간성상세포에서 TGF-b1 단백과간섬유화의주요한세포외기질인 collagen typeⅠ, fibronectin 그리고 TIMP-1 단백과 mrna의발현이대조군에비하여현저하게감소됨으로써 TGF-b1 sirna가간성상세포에서 TGFb1의발현뿐만아니라세포외기질의발현도효과적으로차단하는것을알수있었다. 이상의연구결과를요약하면 TGF-b1 sirna는활성화간성상세포에서 TGF-b1의자기분비자극을효과적으로억제함으로써간성상세포의활성화와세포외기질의생성을감소시키는데, 이는만성간섬유화에서활성화간성상세포의 TGF-b1 활성을조절할수있는유효한방법이라고생각한다. 향후추가적으로간섬유화동물모델에서 TGF-b1 sirna 의발현과활성화정도를장기간관찰하여그효과를입증한다면만성간질환의새로운치료법으로사용할수있을것으로생각한다. 참고문헌 1. Friedman SL. Liver fibrosis-from bench to bedside. J Hepatol 2003; 38 (Suppl 1): S38-53. 2. Reeves HL, Friedman SL. Activation of hepatic stellate cells-a key issue in liver fibrosis. Front Biosci 2002; 7: d808-26. 3. Gressner AM, Weiskirchen R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-b as major players and therapeutic targets. J Cell Biol Med 2006; 10: 76-99. 4. Vogel S, Piantedosi R, Frank J, et al. An immortalized rat liver stellate cell line (HSC-T6): a new cell model for the study of retinoid metabolism in vitro. J Lipid Res 2000; 41: 882-93. 5. Aterman K. The parasinusoidal cells of the liver: a historical account. Histochem J 1986; 18: 279-305. 6. Bataller R, Brenner DA. Liver fibrosis. J Clin Invest 2005; 115: 209-18. 7. Gressner AM. Perisinusoidal lipocytes and fibrogenesis. Gut 1994;

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