(51) Int. Cl. C07K 14/11 (2006.01) (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 10-2006-0052804 2006 년 05 월 19 일 (21) 출원번호 10-2006-7000719 (22) 출원일자 2006년01월11일 번역문제출일자 2006년01월11일 (86) 국제출원번호 PCT/US2004/022001 (87) 국제공개번호 WO 2005/020889 국제출원일자 2004 년 07 월 09 일국제공개일자 2005 년 03 월 10 일 (30) 우선권주장 10/617,569 2003 년 07 월 11 일미국 (US) (71) 출원인노바백스, 인코포레이티드미국 21046 메릴랜드콜럼비아가일포드로드 8320 (72) 발명자로빈슨로빈에이미국메릴랜드 20842 딕커슨 20419 피치트리로드푸시코피터엠미국메릴랜드 21701 프레더릭 917 세미놀로드 (74) 대리인석혜선김용인 심사청구 : 없음 (54) 기능성인플루엔자바이러스유사입자 요약 인플루엔자캡소머, 서브바이러스입자들, 바이러스유사입자 (VLP), VLP 복합체들및 / 또는이의일부를포함하는재조합인플루엔자바이러스단백질은인플루엔자바이러스를위한백신으로제공된다. 본발명은두개의백신기술 : (1) 본래안전한재조합백신기술, 및 (2) 플라즈마막에삽입되고고유한형태에서중화항원결정부위를나타내는인플루엔자바이러스구조단백질의여러복제물로이루어진매우면역성이좋고, 자가결합되는단백질고분자의조합을기초로한다. 보다구체적으로, 본발명은인간인플루엔자바이러스타입 A/ 시드니 /5/94(H3N2) 및 / 또는조류인플루엔자바이러스타입 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 의재조합구조단백질로이루어진기능성동형및이형재조합인플루엔자바이러스유사입자 (VLPs) 의디자인과바큘로바이러스감염곤충세포에서이의생산및인플루엔자감염의예방백신과바이러스구조연구와임상적진단용실험시약으로서의용도에관한것이다. 대표도 도 1 색인어 인플루엔자바이러스유사입자, 재조합인플루엔자바이러스단백질 - 1 -
명세서 기술분야 인플루엔자바이러스는오르쏘마이코비리대 (Orthomyxoviridae) 과의요소이다 ( 머피앤웹스터, 1996 참조 ). A, B, 및 C 로지정된 3 가지아형 (subtype) 의인플루엔자바이러스가있다. 인플루엔자비리온은단편의네거티브 - 센스 RNA 게놈을포함한다. 인플루엔자비리온은헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다아제 (NA), 매트릭스 (M1), 프로톤이온 - 채널단백질 (M2), 핵단백질 (NP), 중합효소염기단백질 1(PB1), 중합효소염기단백질 2(PB2), 중합효소산성단백질 (PA) 및비구조단백질 2(NS2) 와같은단백질을포함한다. 상기 HA, NA, M1 및 M2 는막결합단백질인반면, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2 는뉴클레오캡시드결합단백질이다. 상기 NS1 은비리온입자들과결합하지않은유일한비구조단백질이나인플루엔자 - 감염세포들에특이적이다. 상기 M1 단백질은인플루엔자입자들에서가장풍부한단백질이다. 상기 HA 및 NA 단백질은바이러스부착및바이러스입자들의세포속으로의침투를담당하는외피당단백질이고, 바이러스중화및방어면역성을위한주요면역우성항원결정부위의재료이다. 상기 HA 및 NA 는예방인플루엔자백신을위한가장중요한성분들이라고생각된다. 배경기술 인플루엔자바이러스감염은비리온표면 HA 단백질이시알산 - 함유세포수용체 ( 당단백질및당지질 ) 에부착됨으로써개시된다. 상기 NA 단백질은시알산수용체의처리를매개하고, 세포속으로의바이러스침투는 HA- 의존성수용체 - 매개엔도시토시스에의존한다. 인플루엔자비리온을함유하는내재엔도좀의산성부위에서, HA 2 단백질은바이러스막과세 포막의융합및바이러스탈피각및바이러스 RNA 합성을위해세포핵으로이동하는뉴클레오캡시드 - 결합리보뉴클레오단백질 (RNPs) 의 M1 단백질의 M2- 매개배출을유도하는입체적변화를겪는다. HA 단백질에대한항체들은바이러스전염성을중화시킴으로써바이러스감염을막는반면, NA 단백질에대한항체들은바이러스복제의초기단계에서자신들의효과를전달한다. 비활성인플루엔자 A 및 B 바이러스백신은현재비경구적투여용으로허가되어있다. 상기 3 가백신들은자충포장란의요막강에서생성되고, 속도구역원심분리또는컬럼크로마토그래피로정제되고, 포르말린또는 β- 프로피오락톤으로비활성화되고, 소정의연도동안사람들사이에서유포되는인플루엔자바이러스의타입 A 및타입 B 의두균주의혼합물로제제화된다. 이용가능한상업용인플루엔자백신들은전바이러스 (WV) 또는서브비리온 (SV; 분열되거나정제된표면항원 ) 바이러스백신들이다. WV 백신은손상되지않고, 비활성화된비리온을함유한다. 트리 -n- 부틸 - 포스페이트 (Flu- Shield, Wyeth-Lederle) 와같은용매로처리한 SV 백신들은거의모든바이러스구조단백질을포함하고약간의바이러스외피를함유한다. 트리톤 X-100(Fluzone, Connaught; fluvirin, Evans) 로용해된 SV 백신들은대개 HA 모노머, NA 및 NP 의집합체를함유하고있으며, 잔여량의다른바이러스구조단백질이존재한다. 잠재성저온적응약독화생백신 (potential cold-adapted live attenuated influenza virus vaccine)(flumist, MedImmune) 은능동면역과건강한어린이및 15-17 세의청소년및 18-49 세의건강한성인에서인플루엔자 A 및 B 에의해발생된질병의예방을나타내는비강전달백신으로서상업적으로사용하기위한판매승인을최근 FDA 로부터받았다. 여러재조합제품들이재조합인플루엔자백신후보들로서개발되고있다. 이런시도들은인플루엔자타입 A HA 및 NA 단백질의발현, 생산및정제에집중되고있으며, 바큘로바이러스감염곤충세포 ( 크라우포드등, 1999; 요한슨, 1999; 트리아노어등., 1996), 바이러스벡터 ( 프시코등., 1997; 베르그런드등, 1999), 및 DNA 백신구조물 ( 올센등., 1997) 을사용하는상기단백질들의발현을포함한다. 크라우포드등.(1999) 은바큘로바이러스감염곤충세포에서발현된인플루엔자 HA 는조류 H5 및 H7 인플루엔자아형에의해발생된치명적인인플루엔자질병을예방할수있다는것을증명하였다. 동시에, 다른그룹은바큘로바이러스 - 발현인플루엔자 HA 및 NA 단백질은종래의백신 ( 요한슨등., 1999) 에의해유도된면역반응들보다뛰어난면역반응들을동물에서유도한다는것을증명하였다. 말인플루엔자바이러스의바큘로바이러스 - 발현헤마글루티닌의면역원성및유효성을동형 DNA 백신후보 ( 올슨등., 1997) 와비교하였다. 전체적으로고려했을때, 데이터가인플루엔자바이러스면역성검사에대해높은수준의방어는다양한실험방법을사용하여다른동물모델들에서재조합 HA 또는 NA 단백질을가지고유도될수있다는것을증명하였다.. 라케이등.(1996) 은바큘로바이러스 - 유도인플루엔자 HA 백신은단계 I 용량증가실험 (Phase I dose escalation safety study) 에서지원자가잘견디었고면역성이있는것을나타내었다. 그러나, HA 및 / 또는 NA 단백질로이루어진인플루엔 - 2 -
자백신의수회투여량으로예방접종된지원자들의여러임상부위에서수행된단계 II 연구로부터의결과는재조합서브유닛단백질백신들은방어면역성을유발하지않는다는것을나타내었다 [ 지. 스미스, Protein Sciences; M. Perdue, USDA, Personal Communications]. 이런결과들은감염성비리온의 HA 및 NA 페플로머의표면에나타난입체적항원결정부위는항체의중화및방어면역성의유도에중요하다는것을나타내었다. 다른인플루엔자단백질의재조합인플루엔자백신후보들속으로의함유에관해서, 인플루엔자뉴클레오단백질, NP, 단독또는 M1 단백질과조합하여관여하는실험들을포함하는여러연구들이수행되었다 ( 울머등., 1993; 울머등., 1998; 조우등., 1995; 티수등., 1998). 유사 - 불변내부비리온단백질 (quasi-invariant inner virion protein) 로구성된상기백 신후보들은주로세포성 (CD4 + 및 CD8 + 메모리 T 세포 ) 인넓은스펙트럼면역성을유도하였다. 이런실험들은 DNA 또는바이러스유전벡터의사용을포함한다. DNA 의낮은투여량에의한실험으로부터얻은결과는적게방어되거나방어가되지않기때문에비교적다량으로주입된 DNA 가필요하다 ( 첸등., 1998). 이제부터, 추가의임상전및임상연구는인플루엔자 NP 및 M1 을포함하는 DAN- 기초방법이안전하고, 효과적이고지속하는지를평가하는데필요할것이다. 최근에, 인플루엔자에대한보다효과적인백신을개발하려는시도에서, 입자단백질은인플루엔자 M2 단백질항원결정부위의담체로사용되었다. M2- 계백신개발의근본이유는동물연구에서인플루엔자에대한방어면역성은 M2 단백질에의해유도된다는것이다 ( 슬렙프시킨등., 1995). 니어닉등.(1999) 은 HBcAg 캡시드유사입자들의표면에 M2 항원결정부위 ( 들 ) 을노출하기위해간염 B 바이러스코어항원 (HBcAg) 을가진아미노종결융합파트너로서 23-aa 긴 M2 막통과부위를사용하였다. 그러나, 전장 M2 단백질및 M2-HBcAg VLP 모두는쥐에서탐지가능한항체및방어를유도한다는사실에도불구하고, M2 단백질은비리온당복제수가낮으며, 약한항원성이고, 프리인플루엔자비리온을결합하는항체를유도할수없으며, 세포수용체에대한바이러스부착 ( 즉, 바이러스중화 ) 을봉쇄할수없기때문에, 장래의인플루엔자백신은전적으로 M2 단백질을기초로하지않을것이다. 종래연구가표면인플루엔자당단백질, HA 및 NA 는인플루엔자바이러스에대한방어면역성의유도를위한주요표적이며 M1 은인플루엔자에대한세포면역성을위해보존된표적을제공하기때문에, 새로운백신후보는바이러스유사입자 (VLPs) 와같은단백질고분자입자로서상기바이러스항원들을포함할수있다. 또한, 상기인플루엔자항원을가진입자들은인플루엔자바이러스의여러균주에대한중화항체를유도하는입체적항원결정부위를나타낼수있다. 여러연구들은재조합인플루엔자단백질은포유류발현플라스미드또는바큘로바이러스벡터를사용하는세포배양액에서 VLPs 속으로자가결합할수있다는것을증명하였다 ( 고메즈 - 퓨어타스등., 1999; 뉴만등., 2000; 라탐및갈라자, 2001). 고메즈 - 퓨어터스등.(1999) 은인플루엔자 VLP 의효과적인형성은바이러스단백질의발현수준에의존한다는것을증명하였다. 누만등.(2000) 은복제된 cdnas 로부터전적으로감염성인플루엔자바이러스유사입자를발생시키는포유류발현플라스미드 - 기초시스템을만들었다. 라탐및갈라자 (2001) 는 HA, NA, M1 및 M2 유전자를공동발현하는재조합바큘로바이러스로감염된곤충세포에서인플루엔자 VLPs 의형성을보고하였다. 이런연구들은인플루엔자비이론단백질은진핵세포에서공동발현에따라자가결합할것이다. 발명의상세한설명 본발명에따라, HA( 겐뱅크등록번호 AJ404626), NA( 겐뱅크등록번호 AJ404629), M1( 겐뱅크등록번호 AJ278646), M2( 겐뱅크등록번호 AF255363) 및 NP( 겐뱅크 AF255742) 단백질에대한서열들을암호화하는조류인플루엔자바이러스타입 A H9N2 를포함하고 HA( 겐뱅크등록번호 AJ311466) 및 NA( 겐뱅크등록번호 AJ291403) 에대한서열들을암호화하는인간인플루엔자바이러스타입 A H3N2 를포함하는고분자단백질구조들이제공된다. 상기인플루엔자바이러스유전자를암호화하는게놈 RNA 는인플루엔자바이러스격리체또는인플루엔자감염유기체로부터분리될수있다. 동일하거나다른균주또는타입의인플루엔자바이러스로부터의상기암호화서열의각각은발현벡터내에전사프로모터의하류에서복제되고세포에서발현된다. 따라서, 본발명은 (a) 제 1 인플루엔자바이러스 M1 단백질및제 2 이상의인플루엔자바이러스 M1 단백질 ; 제 1, 제 2 이상의인플루엔자바이러스 HA 단백질 ; 제 1, 제 2, 또는그이상의인플루엔자바이러스 NA 단백질 ; 및제 1, 제 2 이상의인플루엔자바이러스 M2 단백질을포함할수있는 (b) 부가적구조단백질을함유하는고분자단백질을제공한다. 만일부가적구조단백질이제 2 이상의인플루엔자바이러스 M1 단백질로부터얻은것이아니라면, 그룹의둘또는모든요소, 예를들어, 제 1 및제 2 인플루엔자 M2 바이러스단백질이포함된다. 그자체로, 서브바이러스입자, VLP 또는캡소머구조또는이의일부, 백신, 다가백신및본발명의발명에의해생성된인플루엔자바이러스구조단백질로필수적으 - 3 -
로이루어진이의혼합물을포함하는기능성인플루엔자단백질구조가제공된다. 특히바람직한실시예에서, 인플루엔자고분자단백질구조는야생형바이러스의합성절편으로서복제된인플루엔자바이러스유전자의발현생성물인인플루엔자바이러스 HA, NA 및 M1 단백질을포함한다. 상기고분자단백질구조는, 예를들어, 핵단백질 (NP), 조류또는포유류출처로부터유도된비인플루엔자바이러스이외의종들로부터의막단백질및비인플루엔자출처의막단백질과아형 A 및 B 인플루엔자바이러스를포함하는다른아형의인플루엔자바이러스의막단백질과같은부가적구조단백질을포함할수있다. 본발명은인플루엔자바이러스에의해생성되지않는모이어티를가진적어도하나의단백질의일부를포함하는키메라고분자단백질구조를포함할수있다. 인플루엔자의방어는재조합구조물로부터의숙주세포에서자가결합될수있는고분자단백질을제공함으로써완성될수있다. 본발명의상기고분자단백질구조는방어적인중화항체를유발하는 HA 및 NA 단백질에대해입체적항원결정부위를나타내는동형또는이형바이러스유사입자 (VLPs) 속에자가결합하는능력을가진다. 조성물은담체또는희석제및 / 또는보조제를함유하는백신조성물일수있다. 기능성인플루엔자 VLPs 는기능성인플루엔자 VLPs 가하나이상의바이러스균주또는타입의 HA 및 / 또는 NA 단백질을함유하는지에따라인플루엔자바이러스의하나이상의균주또는타입에대한중화항체를유발한다. 백신은야생형인플루엔자바이러스단백질인인플루엔자바이러스단백질을포함할수있다. 바람직하게는, 인플루엔자 VLP 또는이의일부를함유하는구조단백질은야생형인플루엔자바이러스의다양한균주로부터유도될수있다. 인플루엔자바이러스는인플루엔자바이러스의하나이상의균주또는타입에대해방어면역성을유발시키기위해인간또는동물에투여될수있다. 본발명의고분자단백질구조는적혈구응집성 ((hemagglutination activity) 및 / 또는해리능 (neuraminidase activity) 을나타낼수있다. 본발명은 M1, HA 를포함하는인플루엔자구조유전자및인플루엔자바이러스로부터유도된적어도하나의구조단백질을암호화하는재조합구조물을구조화함으로써인플루엔자로부터유도된 VLP 를생산하기위한방법을제공한다. 재조합구조물은적절한숙주세포를재조합바큘로바이러스로이입 (transfect), 감염또는형질전환시키기위해사용된다. 숙주세포는 M1, HA 및인플루엔자바이러스로부터유도된적어도하나의구조단백질의발현을허용하는조건하에서배양되고 VLP 는숙주세포에서형성된다. 기능성인플루엔자 VLP 를함유하는오염된세포는채취되고 VLP 는정제된다. 또한본발명은숙주세포를제 2 인플루엔자단백질을암호화하는제 2 재조합구조물로공동 - 이입, 공동 - 감염, 또는공동 - 형질전환하는추가단계를특징으로하며, 이를통해 VLP 내에제 2 인플루엔자단백질을혼합시킨다. 이런구조단백질은 NA, M2 및 NP 를포함하는인플루엔자바이러스로부터유도될수있고, 적어도하나의단백질은조류또는포유류출처로부터유도된다. 본발명에따라, 숙주세포는진핵세포일것이다. 또한, VLP 는키메라 VLP 일것이다. 또한본발명은인플루엔자바이러스유전자를암호화하는재조합구조물을숙죽세포에도입하고재조합인플루엔자바이러스단백질을세포내의기능성동형또는이형 VLP 속에자가결합하게함으로써인플루엔자 VLP 를함유하는약물을제제화하는방법을특징으로한다. 상기인플루엔자 VLP 는분리되어정제되고약물은인플루엔자 VLP 를함유하도록제제화된다. 약물은보조제를추가로포함할수있다. 또한, 본발명은인플루엔자 VLP 를함유하는약물과지질소포, 즉, 비이온성지질소포와혼합함으로써약품을제제화하는방법을제공한다. 따라서, 기능성동형또는이형 VLPs 는감염된세포로부터의외피입자들로성장할수있다. 성장된인플루엔자 VLPs 는분리되고약물물질로서초원심분리또는컬럼크로마토그래피에의해정제되고단독으로제제화되거나백신과같은약품으로노바박스사의제품인 Novasomes 와같은보조제로제제화된다. 향상된면역효과를제공하는 Novasomes 는본명세서에참조로포함된미국특허제 4,911,928 호에추가로개시되어있다. 본발명은인플루엔자바이러스고분자구조의적어도하나의입체적항원결정부위를가진인플루엔자바이러스단백질의유효항체 - 검출량을포함하는검사시약을제공함으로써척추동물에서인플루엔자감염에대해체액성면역을탐지하는방법을제공한다. 상기검사시약은인플루엔자바이러스감염을위해실험될척추동물의체액샘플과접촉된다. 샘플에함유된인플루엔자바이러스특이적항체들은인플루엔자바이러스고분자구조의입체적항원결정부위와결합하여항원 - 항체복합체들을형성한다. 상기복합체들은결합하지않은복합체들로부터분리되고탐지가능하게표지된면역글로블린 - 결합제와접촉된다. 복합체들과결합한탐지가능하게표지된면역글로블린 - 결합제의양을결정한다. 인플루엔자바이러스는표지를생성하는탐지가능한신호를갖거나인플루엔자바이러스의입자의적어도하나의입체적항원결정부위에대해특이성을갖는탐지가능하게표지된시약과결합된항체들을제공함으로써바이러스에감염될위험이있는동물또는인간의표본에서탐지될수있다. 상기표본은항체들과접촉되고항체들은인플루엔자바이러스와결합된다. 표본에인플루엔자바이러스가존재하는지는탐지가능한표지에의해확인된다. - 4 -
본발명은척추동물에본발명의조성물의유효량을투여함으로써치료, 예방및방어적면역반응을일으키는방법을제공한다. 선택적으로, 인플루엔자 VLP 약물물질은인플루엔자바이러스구조연구및임상적진단법에사용되는실험용시약으로제제화될수있다. 또한본발명은본발명의조성물의유효량을투여함으로써인플루엔자바이러스를치료하는키트와사용지침을제공한다. 본명세서에사용된용어 " 바큘로바이러스 "( 바큘로비리대로도알려짐 ) 는절지동물의외피 DNA 바이러스의과를의미하고, 이에속하는것들은삽입세포배양액에서재조합단백질을생성하기위한발현벡터로사용될수있다. 비리온은이중 나선형 DNA(M r 54 x 10 6-154 x 10 6 ) 의분자를함유하는하나이상의막대모양의뉴클레오캡시드를함유한다. 벡터로 사용된바이러스는일반적으로 Autographa californica 핵다면체바이러스 (NVP) 이다. 유도된유전자의발현은바이러스들이감염된세포들에포함되는대형핵봉입체 (large nuclear inclusion) 의다면체단백질성분의발현을정상적으로조절하는강한프로모터가지배한다. 본명세서에사용된용어 " 로부터유도된 " 은기원또는출처를의미하고, 자연적으로발행하고, 재조합, 미정제또는정제분자들을포함할수있다. 본발명의단백질들과분자들은인플루엔자또는비인플루엔자분자들로부터유도될수있다. 본명세서에사용된용어 " 제 1" 인플루엔자바이러스단백질, 즉, 제 1 인플루엔자바이러스 M1 단백질은인플루엔자바이러스의특정균주로부터유도된 M1, HA, NA 및 M2 와같은단백질을의미한다. 제 1 인플루엔자바이러스의균주또는타입은제 2 인플루엔자바이러스단백질의균주또는타입과다르다. 따라서, " 제 2 " 인플루엔자바이러스단백질, 즉, 제 2 인플루엔자바이러스 M1 단백질은제 1 인플루엔자바이러스단백질과다른균주또는타입인인플루엔자바이러스의제 2 균주로부터유도된 M1, HA, NA 및 M2 와같은단백질을의미한다. 본명세서에사용된용어 " 적혈구응집성 " 은적혈구들 (erythrocytes) 을결합하고결집하는 HA- 함유단백질, VLPs 또는이의일부의능력을의미한다. 본명세서에사용된용어 " 해리능 " 은페투인과같은단백질들을포함하는기질들의시알산잔류물을분해하는 NA 함유단백질, VLPs 또는이의일부의효소작용을의미한다. 본명세서에사용된용어 " 이형 " 은하나이상의다른타입또는균주의바이러스를의미한다. 본명세서에사용된용어 " 동형 " 은한타입또는균주의바이러스를의미한다. 본명세서에사용된용어 " 고분자단백질구조 " 는하나이상의단백질들의구조또는배열을의미한다. 본명세서에사용된용어 " 다가 " 백신은여러타입또는균주의인플루엔자바이러스에대한백신을의미한다. 본명세서에사용된용어 " 비인플루엔자 " 는인플루엔자바이러스로부터유도되지않은단백질또는분자를의미한다. 본명세서에사용된용어 " 백신 " 은항체들의형성을유도하거나병원균에대한면역성을유도하는데사용되는죽거나약화된병원균또는유도된항원결정인자의조합제를의미한다. 백신은, 예를들어, 인플루엔자바이러스들에의해유발된독감과같은질병에면역성을제공하기위해주어진다. 본발명은면역반응을일으키고방어를제공하는백신조성물들을제공한다. 인플루엔자는최적의상태에서 60-80% 효과를나타내는특이적비활성화바이러스백신들을이용할수있음에도불구하고만연된공중보건문제를남겨둔다. 상기백신들이효과적일때, 질병은바이러스감염을예방함으로써대개피할수있다. 백신약화는축적된항원차이 ( 항원대변이및항원소변이 ) 에의해발생한다. 예를들어, 조류인플루엔자바이러스타입 A H9N2 는인간인플루엔자바이러스타입 A 시드니 /97 H3N2 와돼지에서공동순환하고유행성을가진인간인플루엔자바이러스의새로운균주의유전적재분류및출현을유도하였다 ( 페리스등., 2001). 이런항원대변이의경우에, 현재사용되는백신들은적절한방어를제공할것같지않다. - 5 -
인플루엔자백신프로그램의부족에대한다른이유는현재의백신들에의해유발되는면역성이비교적짧다는것이다. 인플루엔자제어수단들의다른부적절함은현재백신들의제한된용도를반영하는데이는상업적으로허가된비활성화바이러스인플루엔자백신들의제조에사용되는달걀성분에알레르기를가진젊은이, 노인및사람들에서의백신부반응및부가반응때문이다. 또한, 비활성화인플루엔자바이러스백신들은종종부족하거나중화항체들을유발하고질병에대한방어에중요한역할을하는변형된 HA 및 NA 입체적항원결정부위를함유한다. 따라서, 비활성바이러스백신들뿐만아니라일부재조합모노머인플루엔자서브유닛단백질백신들은부적절한방어를제공한다. 반면에, 캡소머, 서브바이러스입자및 / 또는 VLPs 와같은고분자단백질구조들은최적의백신면역원성을위해바람직한입체적항원결정부위를나타내는고유단백질의여러복제물을포함한다. 본발명은조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 의 HA, NA 및 M1 유전자들을단독의또는세로로연결된단일바큘로바이러스발현벡터속으로복제하고바큘로바이러스감염곤충세포들에서서브바이러스인플루엔자입자들과인플루엔자 VLP 를포함하는기능성및면역원성동형고분자단백질구조속에자가결합하는재조합인플루엔자구조단백질들로이루어진인플루엔자백신후보들또는시약들을생산하는것을개시한다. 본발명은인간인플루엔자 A/ 시드니 /5/94(H3N2) 바이러스 HA, NA, M1, M2 및 NP 유전자를바큘로바이러스발현벡터속으로복제하고바큘로바이러스감염곤충세포들에서서브바이러스인플루엔자입자들과인플루엔자 VLP 를포함하는기능성및면역원성동형고분자단백질구조속에자가결합하는인플루엔자구조단백질로이루어진인플루엔자백신후보들또는시약들을생산하는것을특징으로한다. 또한, 본발명은인간인플루엔자 A/ 시드니 /5/94(H3N2) 바이러스의 HA 유전자및조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99 (H9N2) 의 HA, NA, 및 M1 유전자들을세로로연결된단일바큘로바이러스발현벡터속으로복제하고바큘로바이러스감염곤충세포들에서서브바이러스인플루엔자입자들과인플루엔자 VLP 를포함하는기능성및면역원성동형고분자단백질구조속에자가결합하는재조합인플루엔자구조단백질들로이루어진인플루엔자백신후보들또는시약들을생산하는것을개시한다. 본발명은본발명을제한하려는것이아닌다음실시예들에의해더설명된다. 본출원에서인용된모든참고문헌, 특허및발행된특허출원뿐만아니라도면및염기서열의내용은본명세서에참조로포함된다. 도면의간단한설명 도 1 은조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스뉴라미니다아제 (NA) 유전자 (SEQ ID NO:1) 의뉴클레오티드서열을도시한다. 도 2 는조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스헤마글루티닌 (HA) 유전자 (SEQ ID NO:2) 의뉴클레오티드서열을도시한다. 도 3 은조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스매트릭스단백질 M1(M1) 유전자 (SEQ ID NO:3) 의뉴클레오티드서열을도시한다. 도 4 는조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) HA, NA 및 M1 단백질의발현을위한재조합바큘로바이러스의구축을위한전달벡터를도시한다. 도 4a 는개별유전자들의발현을위한전달벡터를도시하고도 4b 는유전자들의다중 - 발현을위한전달벡터를도시한다. 도 5 는 Sf-9S 세포내의조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 단백질의발현을도시한다. 도 6 은수크로오스밀도기울기법에의한조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) VLPs 의정제를도시한다. 도 7 은겔여과크로마토그래피에의한인플루엔자바이러스단백질의탐지를도시한다. 웨스턴블럿분석에사용된항체들은다음과같다 : (A) 토끼항 -H9N2; (b) 설치류항 -M1 mab; 및 (C) 설치류항 -BAC gp64. - 6 -
도 8 은서브바이러스입자, VLP 및 VLP 복합체를포함하는조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 단백질의전자현미경에의한탐지를도시한다. 도 9 는정제된조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) VLPs 의적혈구응집성을도시한다. 도 10 은정제된조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) VLPs 의해리능을도시한다. 도 11 은쥐에서정제된조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) VLPs 를가진재조합인플루엔자의면역성연구를위한예방접종및블리드 (bleed) 스케줄을도시한다. 도 12 는재조합인플루엔자 H9N2 VLPs 로면역화된쥐에서면역성연구결과를도시한다. 도 12a 는조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99 의 HA, NA 및 M1 단백질로구성된재조합 VLPs 로면역화된 BALB/c 쥐의혈청을도시한다. 도 12b 는비활성화된조류인플루엔자바이러스타입 A H9N2( 레인 1 및 3) 또는저온적응성조류인플루엔자바이러스타입 A H9N2( 레인 2 및 4) 를함유하는웨스턴블럿과반응한비활성화된조류인플루엔자바이러스타입 A H9N2 로면역화된뉴질랜드흰토끼의혈청을도시한다. 실시예 실시예 1 재료및방법 바큘로바이러스재조합벡터 (bacmid) 발현시스템을사용하여 Spodoptera frugiperda 세포 (Sf-9S 세포라인 ; ATCC PTA-4047) 에서조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 유전자들을발현하였다. 조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스로부터분리된 RNA 를사용하여역전사및중합효소연쇄반응 (PCR) 에의해 HA, NA 및 M1 유전자들을합성하였다 ( 도 1, 2 및 3). 역전사및 PCR 를위해서, 조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99 (H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 유전자들에특이적인올리고뉴클레오티드프라이머를사용하였다 ( 표 1). [ 표 1] 분액 #* 역가 1 <1:500 3 <1:500 5 1:500 7 1:1000 9 1:2000 11 1:2000 12 1:4000 14 1:500 16 <1:500 PBS** <1:500 A/ 상동 /9/93*** 1:1000 * 20-60% 수크로오스구배의분액 ** 음성대조군 *** 양성대조군 - 7 -
이런유전자들의 cdna 복제물을박테리아서브클로닝벡터, pcr2.1topo 속에최초로복제하였다. 최종으로얻은 3 개의 pcr2.1topo- 계플라스미드로부터, HA, NA 및 M1 유전자들은바큘로바이러스전달벡터, pfastbac1( 인비트로젠 ) 내의 AcMNPV 다면체프로모터의하류에삽입하였고, 각각이런인플루엔자바이러스유전자를발현하는 pha, pna 및 pm1 인 3 개의 pfastbac1- 계플라스미드를얻었다. 그런후에, 단일 pfastbac1- 계플라스미드 pham 을분리된다면체프로모터로부터각하류, HA 및 M1 유전자들을암호화하도록제조하였다 ( 도 4). pna 플라스미드내의인접 5'- 및 3'- 영역을가진 NA 유전자의뉴클레오티드서열을결정하였다 (SEQ ID NO:1)( 도 1). 동시에, 인접한영역을가진 HA 및 M1 유전자의뉴클레오티드서열을 pham 플라스미드 (SEQ ID NOS:2 및 3) 를사용하여결정하였다 ( 도 2 및 3). 마지막으로, HA 및 M1 발현카세트모두를암호화하는 pham 플라스미드의제한 DNA 절편을 pna 플라스미드속에복제하였다. 이를통해조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 유전자 ( 도 4) 를암호화하는플라스미드 pnaham 를얻었다 ( 도 4). 플라스미드 pnaham 을게놈속에통합된각각개별바큘로바이러스다면체프로모터의하류인인플루엔자바이러스 NA, HA 및 M1 유전자를함유하는재조합바큘로바이러스를제조하는데사용하였다. 얻어진재조합바큘로바이러스에의한허용된 Sf-9S 곤충세포의감염은이런재조합바큘로바이러스로감염된각각의 Sf-9S 세포에서 3 개의인플루엔자유전자들의공동발현을일으켰다. 결과 감염된 Sf-9S 세포에서의발현생성물은 SDS-PAGE 분석, 쿠마시블루단백질염색및 HA- 및 M1- 특이적항체들을사용하는웨스턴면역블롯분석에의해 72 시간후감염 (p.i.) 을특징으로하였다 ( 도 5). 인플루엔자바이러스타입 A/ 홍콩 / 1073/99(H9N2)(CDC, 미국, 조지아, 아틀란타 ) 에대해키워진토끼항체또는인플루엔자 M1 단백질에대한쥐단클론항체 ( 영국, 세로테크 ) 를사용하여웨스턴면역블롯분석을수행하였다. 예상분자량 ( 각각 64kd, 60kd 및 31kd) 의상기 HA, NA 및 M1 를웨스턴면역블롯분석법으로탐지하였다. 이분석법에서탐지한 HA 단백질의양과비교했을때, NA 단백질은인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스에대한토끼혈청과낮은반응성을보여주었다. 탐지가능한 NA 단백질의양에대한설명은 HA 단백질과비교하여재조합바큘로바이러스로감염된 Sf-9S 세포의 NA 단백질의더낮은발현수준, 웨스턴블롯분석법에서변성조건하에서이혈청과 NA 의더낮은반응성 ( 막결합의겔전기영동하는동안중요한 NA 항원결정부위의제거때문 ), HA- 항체와비교하여더낮은 NA- 항체결합력또는혈청에서 NA- 항체들의낮은풍부함을포함하였다. A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) HA, NA 및 M1 단백질들을발현하는재조합바큘로바이러스 Sf-9S 세포의배지에대해인플루엔자단백질을조사하였다. 서브바이러스입자들, VLP, VLP 의복합체및가능하면, 인플루엔자 HA, NA 및 M1 단백질로이루어진다른자가결합입자들과같은인플루엔자바이러스의고분자단백질복합체를농축하기위해맑은배양상청액을 27,000 rpm 에서초원심분리하였다. 뭉쳐진단백질생성물을인산염 - 완충식염수 (PBS, ph 7.2) 에재현탁하였고불연속적인 20-60% 수크로오스단계기울기로초원심분리하여더정제하였다. 수크로오스구배의분액을수집하고 SDS- PAGE 분석법, 웨스턴면역블롯분석법및전자현미경으로분석하였다. 쿠마시블루염색및웨스턴블롯분석법에의해예상된분자량의인플루엔자 HA 및 M1 단백질을여러수크로오스밀도구배분액 (sucrose density gradient fractions) 에서탐지하였다 ( 도 6). 이것이감염된 Sf-9S 세포들의인플루엔자바이러스단백질은캡소머, 서브바이러스입자들, VLP 및 / 또는 VLP 복합체와같은고분자량의복합체에결합된다. 비록쿠마시블루염색및웨스턴면역블롯분석법에의해불일치되게탐지되지만, 토끼항 - 인플루엔자혈청의비활성때문에웨스턴면역블롯분석법에서인식될수있는변성 NA 단백질은뉴라미니다아제효소활성분석법에서일관되게탐지되었다 ( 도 10). 고분자 VLPs 의존재는겔여과크로마토그래피에의해확인되었다. 인플루엔자바이러스단백질을함유하는수크로오스밀도구배분액의분취량을중량을기초로한분획법을위해세파로오스 CL-4B 컬럼속에채웠다. 컬럼을각각 2,000,000; 20,000; 및 1,357 달턴의겉보기분자량을가진덱스트란블루 2000, 덱스트란옐로우및비타민 B12( 아머샴파마시아 ) 로측정하였고컬럼의틈새부피를결정하였다. 예상대로, 바이러스입자들과같은고분자단백질의특징을나타내는고분자인플루엔자바이러스단백질은컬럼의틈새부피로이동하였다. 인플루엔자와바큘로바이러스단백질을탐지하기위해서웨스턴면역블롯분석법에의해분액을분석하였다. 예를들어, 바큘로바이러스단백질을함유하는 M1 단백질을틈새부피분율에서탐지하였다 ( 도 7). - 8 -
수크로오스구배분액에서인플루엔자 VLP 및단백질의형태는전자현미경으로해명되었다. 음성 - 염색전자현미경의경우, 두개의수크로오스밀도구배분액의인플루엔자단백질을 ph 7.2, PBS 에서 2% 글루타르알데하이드로고정하였다. 음성 - 염색샘플들의전자현미경검사를통해두분액에서고분자단백질복합체또는 VLPs 의존재가나타났다. 상기 VLPs 는대략 60 및 80nm 의지름을포함하는다른크기와형태 ( 구형 ) 를나타내었다. 양타입의입자들의더큰복합체들뿐만아니라막대 - 형태입자들도탐지되었다 ( 도 8). 모든관찰된고분자구조들은그표면에인플루엔자바이러스의특징을가진스파이크 ( 페플로머 ) 를가진다. 80nm 입자들의크기와외형이야생형인플루엔자바이러스의입자들과유사하기때문에, 이런구조들은유사한입자배열, 구조, 삼각측정수, 대칭및다른특징들을포함하는야생형인플루엔자비리온과분명한유사점들을가진 VLPs 를나타내었다. 대략 60nm 의작은입자들은형태적및구조적으로 VLPs 와다른서브바이러스입자들을나타낼수있다. 다른크기와형태의재조합고분자단백질들의유사한현상은다른바이러스들에도보고되었다. 예를들어, 헤파티스 B 바이러스의재조합코어항원 (HBcAg) 은다른구조와삼각측정수 T=4 및 T=3 을가진다른크기의입자들을형성한다 ( 크로우써등., 1994). 정제된인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) VLPs 의기능성특성들의특징을나타내기위해, 적혈구응집반응측정법 ( 도 9) 및뉴라미니다아제효소측정법 ( 도 10) 으로샘플을측정하였다. 적혈구응집반응측정법의경우, 정제된인플루엔자 VLPs 의 2- 배희석액을 0.6% 기니피그적혈구와혼합하였고 1 시간또는 16 시간동안 4 에서배양하였다. 적혈구응집반응의정도를눈으로관찰하였고적혈구를응집할수있는재조합인플루엔자단백질들의최고희석화를결정하고기록하였다 ( 도 9). 다시, 수크로오스밀도구배의많은분액은적혈구응집성을나타내어서, 인플루엔자단백질들의다중고분자형태와모노머형태가존재한다는것을나타내었다. 탐지된최고의역가는 1:4000 이었다. 대조실험에서, 야생형인플루엔자 A/ 상동바이러스는 1:2000 의역가를나타내었다. 적혈구응집반응측정법은인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스 HA, NA 및 M1 단백질로이루어진재조합 VLPs 는기능적으로능동적이었다. 이것은 VLPs 내의 HA 서브유닛단백질의결합, 배열및접힘은야생형인플루엔자바이러스와유사하거나동일하다는것을나타내었다. 또한, 정제된 H9N2 VLPs 의샘플에대해뉴라미니다아제효소측정법을수행하였다. 기질로서페투인을사용하여수크로오스밀도구배분액에서해리능의양을결정하였다. 뉴라미니다아제측정법에서, 뉴라미니다아제는기질분자로부터시알산을절단하여측정을위한시알산을배출한다. 효소의작용을막기위해아비산염을첨가하였다. 배출된시알산의양은자유시알산의양에비례하는핑크색을생산하는티오바르비투린산으로화학적으로결정하였다. 색 ( 발색단 ) 의양을 549nm 파장에서분광분석적으로측정하였다. 이방법을사용하여, 인플루엔자 VLPs 를함유하는수크로오스구배분액에서해리능이증명되었다. 예상대로, 두개의피크분액을가지고, 여러분액에서작용이관찰되었다. 양성대조군으로서, 야생형인플루엔자바이러스를사용하였다. 야생형인플루엔자바이러스는정제된인플루엔자 VLPs 의뉴라미니다아제효소작용과필적한만한효소작용을나타내었다. 이런발견들은단백질형태에관한 HA 결과를확증하였고인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스의정제된 VLPs 는야생형인플루엔자바이러스와기능적으로유사하다는것을나타내었다. 상기분석법및측정법의결과는인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) HA, NA 및 M1 단백질의발현은바큘로바이러스감염곤충세포의기능성 VLPs 의자가결합및수송에충분하다는것을나타내었다. 상기인플루엔자 VLPs 가자가결합인플루엔자구조단백질을나타내고야생형인플루엔자바이러스의기능적특성및생화학적특성들과유사한특성을나타내기때문에, 상기인플루엔자 VLPs 는효과적인인플루엔자백신에필수적인표면항원결정부위를포함하는중요한구조적형태로생각된다. 실시예 2: 조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99 바이러스유전자의 RT-PCR 복제 본발명의목적은재조합인플루엔자바이러스단백질의생산을지시할수있는합성핵산서열을제공하는것이다. 이러한합성핵산서열은상기바이러스로부터분리된인플루엔자바이러스의본래게놈 RNA 를사용하여역전사및중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 법으로얻었다. 이러한용도를위해, 핵산서열은 RNA, DNA, cdna 또는상기단백질을암호화하는임의의합성변이형 (variant) 을의미한다. 케이. 수빠라오 (K. Subbarao) 박사 ( 미국, 조지아, 아틀란타, 질병관리센터 ) 가조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스를제공하였다. 트리졸 (Trizol) LS 시약 ( 미국캘리포니아칼스배드 (Carlsbad) 인비트로젠 (Invitrogen) 사 ( 社 )) 을사용하여 CDC 에서생물안전수준 3(Biosafety Level3, BSL3) 하의산페놀 RNA 추출법 (acid phenol RNA extraction method) 으로바이러스게놈 RNA 를분리하였다. MuLV 역전사효소 ( 인비트로젠 ) 를사용한역전사및 HA, NA 및 M1 단백질에특이한올리고뉴클레오티드프라이머와 Taq Ⅰ DNA 중합효소 ( 인비트로젠 )( 표 1) 를사용한 PCR 에의해바이러스 - 9 -
RNA 의 cdna 분자를얻었다. HA, NA 및 M1 cdna 클론을포함하는 3 개의재조합플라스미드에서발생된 Eco RI 자리 (site) 들사이의박테리아서브클로닝벡터 (subcloning vector), pcr2.1topo( 인비트로젠 ) 에상기 PCR 절편을복제하였다. 실시예 3: 인간인플루엔자 A/ 시드니 /5/94(H3N2) 바이러스유전자의 RT-PCR 복제 엠. 매새어 (M. Massare) 박사 ( 매릴랜드, 록빌 (RockVille), 노바백스사 (Novavax, Inc.) 로부터인플루엔자 A/ 시드니 /5/94 (H3N2) 바이러스를얻었다. 트리졸 LS 시약 ( 인비트로젠 ) 을사용하여노바백스사에서 BSL2 오염조건하에 RNA 산페놀추출법으로바이러스게놈 RNA 를분리하였다. 역전사와 HA, NA, M1, M2, 및 NP 단백질 ( 표 2) 에특이적인올리고뉴클레오티드프라이머를사용한 PCR 에의해바이러스 RNA 의 cdna 분자를얻었다. HA, NA, M1, M2, 및 NP cdna 클론을포함하는 5 개의재조합플라스미드에서발생된 Eco RI 자리들사이의박테리아서브클로닝벡터, pcr2.1topo 에 PCR 절편을복제하였다. [ 표 2] 실시예 4: 바큘로바이러스 (baculovirus) 전달벡터에조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99 바이러스의복제 pcr2.1topo 계열의플라스미드로부터, 다면체좌 (polyhedron locus) 와 Tn7 att 자리내에있고, 바큘로바이러스다면체프로모터의하류와아데닐중합체형성 (polyadenylation) 신호서열의상류에있는 pfastbac1 바큘로바이러스전달벡터 ( 인비트로젠 ) 에 HA, NA 또는 M1 유전자를서브클로닝하였다. 바이러스유전자를 T4 DNA 리가아제 (ligase) 로연결시켰다. HA 유전자에대해, Bam HI-Kpn I 소화 pfastbac1 플라스미드 DNA 에 pcr2.1topo-ha 로부터의 Bam HI-Kpn I DNA 절편을삽입하였다. NA 유전자에대해, Eco RI 소화 pfastbac1 플라스미드 DNA 에 pcr2.1topo-na 로부터의 Eco RI DNA 절편을삽입하였다. M1 유전자에대해, Eco RI 소화 pfastbac1 플라스미드 DNA 에 pcr2.1topo-m1 으로부터의 Eco RI DNA 절편을삽입하였다. 이들 DNA 연결반응, 발생된변형클론및분리된박테리아클론으로, Competent E. coli DH5 α 박테리아 ( 인비트로젠 ) 를변형시켰다. 결과적으로발생한 pfastbac1 계열의플라스미드, pfastbac1-ha, pfastbac1-na, 및 pfastbac1-m1 은아가로즈젤상의제한효소매핑을특징으로한다 ( 도 4a). 자동화된 DNA 서열화에의해, 클론유전자의도 1-3 에도시된바와같이, 뉴클레오티드서열결정하였다. DNA 서열분석은복제된인플루엔자 HA, NA, 및 M1 유전자가이전에공개된이들유전자 [ 인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 의 NA, HA 및 M1, 각유전자은행등록번호 AJ404629, AJ404626, 및 AJ278646] 에대한뉴클레이티드서열과동일함을보였다. 실시예 5: 바큘로바이러스전달벡터에인간인플루엔자 A/ 시드니 /5/94 바이러스 cdna 의복제 pcr2.1topo 계열의플라스미드로부터, 다면체좌 (polyhedron locus) 와 Tn7 att 자리내에있고, 바큘로바이러스다면체프로모터의하류와아데닐중합체형성신호서열의상류에있는 pfastbac1 바큘로바이러스전달벡터에 HA, NA, M1, - 10 -
M2 또는 NP 유전자를서브클로닝하였다. 바이러스유전자를 T4 DNA 리가아제로연결시켰다. HA 유전자에대해, Bam HI-Kpn I 소화 pfastbac1 플라스미드 DNA 에 pcr2.1topo-hha3 로부터의 Bam HI-Kpn I DNA 절편을삽입하였다. NA 유전자에대해, Eco RI 소화 pfastbac1 플라스미드 DNA 에 pcr2.1topo-hna 로부터의 Eco RI DNA 절편을삽입하였다. M1 유전자에대해, Eco RI 소화 pfastbac1 플라스미드 DNA 에 pcr2.1topo-hm1 으로부터의 Eco RI DNA 절편을삽입하였다. M2 유전자에대해, Eco RI 소화 pfastbac1 플라스미드 DNA 에 pcr2.1topo-hm2 로부터의 Eco RI DNA 절편을삽입하였다. NP 유전자에대해, Eco RI 소화 pfastbac1 플라스미드 DNA 에 pcr2.1topo-hnp 로부터의 Eco RI DNA 절편을삽입하였다. 이들 DNA 연결반응, 발생된변형클론및분리된박테리아클론으로, Competent E. coli DH5 α 박테리아 ( 인비트로젠 ) 를변형시켰다. 결과적으로발생한 pfastbac1 계열의플라스미드, pfastbac1-hha3, pfastbac1-hna2, 및 pfastbac1-hm1, pfastbac1-hm2 및 pfastbac1-hnp 는아가로즈젤상의제한효소매핑을특징으로한다. 자동화된 DNA 서열화에의해클론유전자의뉴클레오티드서열을결정하였다. DNA 서열분석은복제된인플루엔자 HA, NA, M1, M2 및 NP 유전자가이전에공개된이들유전자에대한뉴클레오티드서열과동일함을보였다. 실시예 6: 다수의조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99 바이러스유전자들을암호화하는다유전자 (multigenic) 바큘로바이러스전달벡터의복제 다수의인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 바이러스유전자들을발현시키는 pfastbac1 계열의백미드 (bacmid) 전달벡터를구성하기위해, 초기에 pfastbac1-ha 의 Hpa I 자리에 M1 유전자를포함하는 pfastbac1-m1 플라스미드로부터의 Sna BI-Hpa I DNA 절편을클로닝하였다. 이는각각의발현카세트내에있는 HA 및 M1 유전자모두를암호화하는 pfastbac1-ham 플라스미드에서발생하였고각각의다면체프로모터의조절하에서발현되었다. 최종적으로, HA 및 M1 발현카세트를포함하는 pfastbac1-ham 으로부터의 Sna BI-Avr Ⅱ DNA 절편을 Hpa I-Avr Ⅱ 소화 pfastbac1-na 플라스미드 DNA 에전달하였다. 이는 HA, NA 및 M1 유전자의발현을위한 3 개의별개의발현카세트를암호화하는플라스미드 pfastbac1-naham 에서발생되었고각각의다면체프로모터의조절하에서발현되었다 ( 도 4b). 또다른실시예에서는, 이형타입의인플루엔자 VLPs 의발현과생산을위한 4 번째인플루엔자바이러스유전자로서 pfastbac1-naham 에 pfastbac1-hha3( 실시예 5 참조 ) 로부터 H3 유전자를복제하였다. 실시예 7: 곤충세포에조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99 바이러스의 NA, HA, 및 M1 유전자를암호화하는다유전자재조합바큘로바이러스의발생 곤충세포에서의발현을위한조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) HA, NA, 및 M1 유전자를암호화하는다유전자재조합바큘로바이러스를만들기위해결과적으로발생한다유전자백미드전달벡터 pfastbac1-naham 을사용하였다. component E.coli DH10BAC 세포 ( 인비트로젠 ) 에잠복해있는 pfastbac1-naham DNA 및 AcMNPC 바큘로바이러스게놈사이의다면체및 Tn7 att DNA 서열에서자리특이적재조합 (site-specific recombination) 에의해재조합백미드 DNA 를제조하였다 ( 도 4b). 미니프렙 (mini-prep) 플라스미드 DNA 법으로재조합백미드 DNA 가분리되었고, 양이온지질 CELLFECTIN( 인비트로젠 ) 을사용하여 Sf-9s 세포에이입되었다. 트렌스펙션 (tranfection) 후에, 재조합바큘로바이러스가분리되고, 플라그 (plaque) 정제되어, Sf-9s 곤충세포에서증폭되었다. 바이러스스톡 (virus stocks) 이 Sf-9s 곤충세포에준비되었고, 조류인플루엔자 HA, NA 및 M1 유전자생성의발현에대한특징을나타내었다. 결과적으로발생한재조합바큘로바이러스를 bnaham-h9n2 라고명명하였다. 실시예 8: 곤충세포에서재조합조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99 단백질의발현 혈청이없는배지 (HyQ SFM, HyClone, Ogden, UT) 에서 28 의쉐이커플라스크 (shaker flask) 에현탁배지로서유지된 Sf-9S 곤충세포를 3 pfu/cell 의감염배수 (multiplicity of infection, MOI0) 로재조합바큘로바이러스, bnaham-h9n2 를사용하여 2 10 6 세포 / ml의세포밀도로감염시켰다. 바이러스감염은인플루엔자단백질이발현하기위해 72 시간동안진행되었다. 감염된곤충세포에서의조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) HA 및 M1 단백질의발현은 SDS-PAGE 및웨스턴면역블럿 (immunoblot) 분석에의해확인되었다. 환원및변성조건하에서 4-12% 의선형그래디언트 NuPAGE 젤 ( 인비트론 ) 상에서 SDS-PAGE 분석을수행하였다. 웨스턴면역블럿분석의 1 차항체들은 CDC 로부터얻은조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 에대하여초래된다클론의토끼항혈청 (antiserum) 과인플루엔자 M1 단백질 ( 영국, 세로텍 (Serotec) 사 ) 에대한단클론의뮤린항혈청이었다. 웨스턴면역블럿분석의 2 차항체들은토끼또는쥐 IgG(H+L)( 미국, - 11 -
매릴랜드, 캐츠버그, Kirkegaard and Perry Laboratories) 에대하여초래된알카리성포스파타아제 (alkaline phosphatase) 가결합된염소 IgG 항혈청이다. 이들분석의결과 ( 도 5) 는 HA 및 M1 단백질이바큘로바이러스감염된곤충세포에서발현되었음을나타내었다. 실시예 9: 재조합조류인플루엔자 H9N2 바이러스성입자및고분자단백질복합체의정제 조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) HA, NA, 및 M1 유전자산물을발현시킨재조합바큘로바이러스 bnaham- H9N2 로감염된 Sf-9S 곤충세포로부터저속원심분리에의해배양상층액 (200 ml ) 이거두어졌다. GS-3 로터를사용하여 10,000 g 및 4 에서 1 시간동안 RC-5B 초고속원심분리기의원심분리에의해배양상층액을분리하였다. Sorval TH- 641 스윙버켓로터 (swinging bucket rotor) 를사용하여 27,000rpm 및 4 에서 3 시간동안 Sorval OTD-65 초고속원심분리기의원심분리에의해맑아진배양상층액으로부터바이러스와 VLP 가분리되었다. 1 ml의 PBS(pH 7.2) 에바이러스펠렛 (virus pellet) 이재현탁되고, 20-60%(W/v) 의불연속슈크로스스텝그래디언트 (discontiunous sucrose step gradient) 상에올려져, Sorval TH-641 로터를사용하여 27,000rpm 및 4 에서 16 시간동안 Sorval OTD-65 초고속원심분리기의원심분리에의해용해되었다. 수크로오스구배분액의인플루엔자단백질을실시예 6 에서상술한바와같이 SDS-PAGE 와웨스턴면역블럿분석에의해분석하였다. 웨스턴블럿분석에의해나타나고, HA 및 M1 단백질이고분자단백질복합체로서결합된것으로제안된바와같이동일한수크로오스구배분액에서 HA 와 M1 단백질을찾았다 ( 도 6). 또한 HA 및 M1 단백질은이들재조합바이러스단백질이다른밀도및조성물의고분자단백질복합체와결합되는것을가정하여슈크로스그래디언트를통해부분적으로발견되었다. 실시예 10: 젤여과크로마토그래피에의한재조합조류인플루엔자 H9N2 VLP 및단백질의분석 VLP 및모노머단백질과같은단백질고분자는그들의집단크기및형태를기초로한젤여과또는크기배제크로마토그래피컬럼상에서다르게이동한다. 수크로오스구배분액으로부터의재조합인플루엔자단백질은 VLP 와같은모노머단백질인지또는고분자단백질복합체인지를판단하기위해, 14 ml의 Sepharose CL-4B( 아머샴 ) 의수지판부피 (resin bed volume) 를갖는크로마토그래피컬럼 (7 mm 140 mm ) 을마련하였다. 크기배제컬럼은 PBS 로평등해지고, 컬럼공극량 (column void volume) 을확인하기위해각각 2,000,000; 20,000; 및 1,357 의명백한분자량을갖는 Dextran Blue 2000, Dextran Yellow, 및비타민 B12( 아머샴파마시아 ) 로측정되었다. Dextran Blue 2000 은공극부피 (6 ml분액 ) 의컬럼으로부터용출되었다. 예상된바와같이, 재조합인플루엔자단백질복합체도또한공극부피 (6 ml분액 ) 의컬럼으로부터용출되었다. 이결과는 VLP 와같은고분자량고분자단백질의특징이었다. 상기실시예 6 에서설명된바와같이웨스턴면역블럿분석에의해컬럼분액에서바이러스단백질을검출하였다. 공극분액에서 M1 단백질을검출하였다 ( 도 7). 예상된바와같이, 바큘로바이러스단백질도또한공극부피에있었다. 실시예 11: 재조합인플루엔자 VLP 의전자현미경검사 슈크로스그래디언트상에서분리되고재조합조류인플루엔자단백질을포함하는고분자단백질복합체가인플루엔자비리온 (virion) 과유사한형태를갖는지여부를판단하기위해, 음성으로염색된샘플들의전자현미경검사를수행하였다. 재조합조류인플루엔자 A/ 홍콩 /1073/99(H9N2) 단백질복합체를농축시켰고실시예 7 에서상술한바와같이불연속슈크로스그래디언트상에서초고속원심분리에의해배양상층액으로부터정제하였다. 수크로오스구배분액의분취량 (aliquots) 을새로운방전플라스틱 / 탄소코팅된그리드상에흡수된 PBS, ph7.2 의 2% 글루타르알데히드 (glutaraldehyde) 로처리하고증류수로세척하였다. 상기샘플을 2% 소듐포스포텅스테이트 (sodium phosphotungstate), ph6.5 로염색하고, 투과전자현미경 ( 필립스사 ) 을사용하여관찰하였다. 2 개의수크로오스구배분액으로부터재조합조류인플루엔자 H9N2 단백질복합체의음성으로염색된샘플의전자마이크로그래프는 2 개의수크로오스구배분액으로인해구형과막대형입자를나타내었다 ( 도 8). 입자는크기 (60 및 80 nm ) 와형태가다르다. 막대형입자뿐만아니라, 양타입의입자들의더큰복합체들도또한검출되었다 ( 도 8). 모든관찰된단백질복합체구조는 HA 및 NA 페플로머 (peplomers) 와닮은표면돌출과같은스파이크를보였다. 이러한 80 nm입자의크기와외형은야생형인플루엔자바이러스입자의크기및외형과유사하기때문에, 이들구조는감싸진인플루엔자 VLP 를보일수있었다. 대략 60 nm의더작은입자들은아마도형태적으로그리고구조적으로모두상기 VLP 와는다른서브바이러스 (subvirial) 입자를나타내었다. 실시예 12: 적혈구응집 (hemagglutination) 시험에의한인플루엔자바이러스의기능적특징분석 - 12 -
정제된인플루엔자 VLP 와단백질이인플루엔자바이러스에대해특징적인적혈구응집과뉴라미니데이스 (neuraminidase) 활동과같은기능적활동을갖는지여부를판단하기위해, 적혈구응집과뉴라미니다아제시험에서정제된인플루엔자 VLP 와단백질을검사하였다. 적혈구응집시험을위해, 인플루엔자 VLP 또는양성대조군야생형인플루엔자바이러스타입 A 를포함하는일련의수크로오스구배분액의 2 배희석액을제조하였다. 그런후, 이들을 PBS(pH7.2) 에 0.6% 기니 (guinie) 돼지적혈세포와함께혼합시켜 1 내지 16 시간동안 4 에서배양하였다. 음성대조군으로서, PBS 를사용하였다. 적혈구응집시험의정도를시각적으로판단하였고기니돼지적혈세포를응집시킬수있는분액의최대희석을판단하였다 ( 도 9). 정제된인플루엔자 VLP 와단백질에대해관찰된최대적혈구응집역가 (titer) 는 1:4000 으로서, 상기역가는 1:2000 인야생형인플루엔자대조군에의해나타난역가보다더높다. 실시예 13: 뉴라미니다아제시험에의한인플루엔자단백질의기능적특성의분석 뉴라미니다아제시험에의해인플루엔자 VLP 함유수크로오스구배분액의뉴라미니다아제활동량을판단하였다. 이시험에서, NA( 효소 ) 는기질 ( 퓨틴 (futin)) 상에서작용하였고시알산 (sialic acid) 을방출하였다. 아비산염 (arsenite) 시약이효소활동을중단시키기위해첨가되었다. 배출된시알산의양은상기시알산을제거하는데비례하여핑크색을만드는티오바비튜릭산 (tiobarbituric acid) 을사용하여화학적으로결정된다. 594 nm파장의분광광도계 (spetrophotometer) 로색깔 ( 발색단 (chromophor)) 의양을측정하였다. 도 8 에도시된바와같이, 데이터는시알산의상당량이수크로오스구배의 VLP 함유분액에의해만들어졌고이들분액은적혈구응집활동성을나타내는이들분액에해당함을나타내었다. 실시예 13: 기능적동형재조합인플루엔자 H9N2 VLP 를갖는 BALB/c 쥐의접종 쥐의접종에잇따라면역혈청의웨스턴블럿분석에의해재조합인플루엔자 VLP 의면역원성 (immunogenicity) 을확신하였다. 조류인플루엔자바이러스타입 A/ 홍콩 /1073/99 로부터의바이러스 HA, NA 및 M1 단백질로구성되고수크로오스구배상에정제된재조합 VLP(1 μg / 주사 ) 이 0 일과 28 일에 10 마리의암컷 BALB/c 쥐의삼각근 (deltoid) 지역피하에접종되었다 ( 도 11). 음성대조군으로서 5 마리쥐에도마찬가지로 PBS(pH 7.2) 를투여하였다. 쥐들은 1 일 ( 출혈전 ), 27 일 ( 최초출혈 ), 및 54 일 (2 차출혈 ) 에안와상 (supraorbital) 동공으로부터출혈이있었다. 하룻밤동안응고및원심분리후에혈청을수집하였다. 웨스턴블럿분석을위해, 비활성조류인플루엔자바이러스타입 A H9N2 또는저온적응형조류인플루엔자바이러스타입 A H9N2, 뿐만아니라 See Blue Plus 2 염색전 (pre-stained) 단백질표준 ( 인비트로젠 ) 의 200ng 을변성시키고 (95, 5 분 ) 브로모페놀블루추적다이 (bromophenol blue tracking dye) 가사라질때까지 172 볼트로 MES 버퍼에서 4-12% 폴리아크릴아미드구배 NuPAGE 젤 ( 인비트로젠 ) 상에서환원조건하에서 (10mM β- 멜캅토에탄올 ) 전기영동하였다. 단백질젤에대해, 전기영동된단백질은콜로이드쿠마시블루시약 (Colloidal Coomassie Blue reagent)( 인비트로젠 ) 으로염색함으로써가시화되었다. 단백질은표준웨스턴블럿절차에의해젤에서메탄올의니트로셀룰로오스막으로전달되었다. 비활성조류인플루엔자바이러스 H9N2( 양성대조군혈청 ) 로면역된 VLP 면역된쥐와토끼로부터의혈청을 PBS 용액 (ph 7.2) 에 1:25 및 1:100 으로각각희석시켰고 1 차항체로서사용하였다. 5% 케이신 (casein) 으로차단된단백질결합형막 (protein-bound membrane) 을실온에서 60 분동안일정하게흔들며 1 차항혈청과반응시켰다. Tween 20 을포함하는포스페이트버퍼식염수로 1 차항체막을세척한다음에, 2 차항혈청 [ 염소항뮤린 IgG- 알카리성포스파타아제접합 (1:10,000) 또는염소항토끼 IgG- 알카리성포스파타아제접합 (1:10,000)] 을막과함께 60 분동안반응시켰다. Tween 20 을포함하는포스페이트버퍼식염수로 2 차항체막을세척한다음에, NBT/BCIP( 인비트로젠 ) 와같은발색기질 (chromogenic substrate) 과함께현상함으로써상기막상에항체결합단백질을가시화하였다. 웨스턴블럿분석의결과 ( 도 12) 는바이러스 HA 및 M1 단백질 ( 각각 75 및 30 kd) 과동일한분자량을갖는단백질이양성대조군혈청 ( 도 12b) 및재조합인플루엔자 H9N2 VLPs( 도 12a) 로면역된쥐의혈청에속하는것이었다. 이들결과는재조합인플루엔자 H9N2 VLPs 만이이러한투여경로에의해쥐에서의면역원성이었음을나타내었다. 다음참고문헌은본명세서에참조로포함되었다 : - 13 -
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당업자들은단지일상적인실험, 본명세서에기술된본발명의특이적실시예들에대한많은등가물을사용하는것을인식하거나확인할수있을것이다. 산업상이용가능성 본발명의내용중에있음 (57) 청구의범위 청구항 1. (a) 제 1 인플루엔자바이러스 M1 단백질및 (b) (i) 제 2 인플루엔자바이러스 M1 단백질 ; (ii) (a) 제 1 인플루엔자바이러스 HA 단백질, (b) 제 2 인플루엔자바이러스 HA 단백질 ; (iii) (a) 제 1 인플루엔자바이러스 NA 단백질, (b) 제 2 인플루엔자바이러스 NA 단백질 ; 및 - 15 -
(iv) (a) 제 1 인플루엔자바이러스 M2 단백질, (b) 제 2 인플루엔자바이러스 M2 단백질로이루어진그룹으로부터선택되는부가적구조단백질을포함하며, 상기부가적구조단백질이하위그룹 (i) 에속하지않는다면, 하위그룹 (ii), (iii) 및 (iv) 의적어도하나의두요소가포함되는고분자단백질구조. 청구항 2. 제 1 항에있어서, 고분자단백질구조는서브바이러스입자, 바이러스유사입자 (VLPs), 캡소머구조또는이의일부, 백신, 다가백신및이의혼합물로이루어진그룹으로부터선택되는고분자단백질구조. 청구항 3. 제 1 항에있어서, 부가적구조단백질은핵단백질 (NP) 및비인플루엔자바이러스이외의종들의막단백질로이루어진그룹으로부터선택되는고분자단백질구조. 청구항 4. 제 3 항에있어서, 부가적구조단백질은비인플루엔자출처로부터의막단백질인고분자단백질구조. 청구항 5. 제 1 항에있어서, 단백질구조는재조합구조물로부터의숙주세포에서자가결합되는고분자단백질구조. 청구항 6. 제 1 항에있어서, 적어도하나의구조단백질은조류또는포유류출처로부터유도되는고분자단백질구조. 청구항 7. 제 1 항에있어서, 구조단백질은인플루엔자바이러스의다른아형으로부터유도되는고분자단백질구조. - 16 -
청구항 8. 제 7 항에있어서, 인플루엔자바이러스의아형은아형 A 및 B 인플루엔자바이러스로이루어진그룹으로부터선택되는고분자단백질구조. 청구항 9. 제 7 항에있어서, 인플루엔자바이러스는야생형인플루엔자바이러스를포함하는고분자단백질구조. 청구항 10. 제 1 항에있어서, 상기고분자단백질구조는이형바이러스유사입자 (VLPs) 속에자가결합하는능력을가진적어도하나의구조단백질을포함하는고분자단백질구조. 청구항 11. 제 2 항에있어서, 적어도하나의단백질의일부는인플루엔자바이러스에의해생성되지않는모이어티를가진키메라단백질구조를포함하는고분자단백질구조. 청구항 12. 제 2 항의고분자단백질구조및담체또는희석제를포함하는조성물. 청구항 13. 제 12 항에있어서, 보조제를더포함하는조성물. 청구항 14. 제 2 항에있어서, 상기구조는적혈구응집성을나타내는조성물로부터선택되는고분자단백질구조. 청구항 15. 제 2 항에있어서, - 17 -
상기구조는해리능을나타내는조성물로부터선택되는고분자단백질구조. 청구항 16. 제 2 항에있어서, 인플루엔자바이러스중화항체를유도하는인플루엔자 VLP 의입체적항원결정부위를포함하는고분자단백질구조. 청구항 17. 제 16 항의고분자단백질구조및담체또는희석제를포함하는백신조성물. 청구항 18. (a) 인플루엔자구조유전자를암호화하며 M1, HA 및인플루엔자바이러스로부터유도된적어도하나의구조단백질을암호화하는재조합구조물을제조하는단계 ; (b) 적절한숙주세포를상기재조합바큘로바이러스로이입, 감염또는형질전환하고 M1, HA 및인플루엔자바이러스로부터유도된적어도하나의구조단백질의발현을허용하는조건에서숙주세포를배양하는단계 ; (c) 상기숙주세포에 VLP 를형성하는단계 ; (d) 기능성인플루엔자 VLP 를함유하는감염된세포배지를채취하는단계 ; 및 (e) VLP 를정제하는단계를포함하여인플루엔자로부터유도된 VLP 를생산하는방법. 청구항 19. 제 18 항에있어서, 인플루엔자바이러스로부터유도된구조단백질은 NA, M2 및 NP 로이루어진그룹으로부터선택되는방법. 청구항 20. 제 18 항에있어서, 적어도하나의구조단백질은조류또는포유류출처로부터유도되는방법. 청구항 21. 제 18 항에있어서, 구조단백질은아형 A 및 B 인플루엔자바이러스로이루어진그룹으로부터선택되는방법. - 18 -
청구항 22. 제 18 항에있어서, 숙주세포는진핵세포인방법. 청구항 23. 제 18 항에있어서, VLP 는키메라 VLP 를포함하는방법. 청구항 24. 제 18 항에있어서, (a) VLP 내에포함된제 2 인플루엔자단백질을암호화하는제 2 재조합구조물을가진숙주세포를공동이입, 공동감염또는공동형질전환하는단계를더포함하는방법. 청구항 25. (a) 인플루엔자바이러스유전자를암호화하는재조합구조물을숙주세포에도입하는단계 ; (b) 재조합인플루엔자바이러스단백질을세포들속의기능성동형또는이형 VLP 속에자가결합하는단계 ; (c) 인플루엔자 VLP 를분리및정제하는단계 ; 및 (d) 인플루엔자 VLP 를함유하는약물을제제화하는단계를포함하여인플루엔자 VLP 를함유하는약물을제제화하는방법. 청구항 26. 제 25 항에있어서, 상기약물물질은보조제를더포함하는방법. 청구항 27. 인플루엔자 VLP 를함유하는제 25 항의약물과지질소포를혼합하는단계를포함하여약품을제제화하는방법. 청구항 28. 제 27 항에있어서, 지질소포는비이온성지질소포인방법. - 19 -
청구항 29. (a) 인플루엔자바이러스고분자구조의적어도하나의입체적항원결정부위를가진인플루엔자바이러스단백질의유효항체 - 탐지량을포함하는표적시약을제공하는단계 ; (b) 표적시약을인플루엔자바이러스감염을위해검사되는척추동물의체액샘플과접촉시키는단계 ; (c) 항원 - 항체복합체들을형성하기위해서상기샘플에함유된인플루엔자바이러스특이적항체를인플루엔자바이러스고분자구조의상기입체적항원결정부위와결합하는단계 ; (d) 결합되지않은복합체들로부터상기복합체들을분리하는단계 ; (e) 상기복합체들을탐지가능하게표지화된면역글로블린 - 결합제와접촉하는단계 ; 및 (f) 상기복합체들과결합된탐지가능하게표지화된면역글로블린 - 결합제의양을결정하는단계를포함하여척추동물에서인플루엔자바이러스감염에대한체액성면역을탐지하는방법. 청구항 30. (a) 상기인플루엔자바이러스의입자의적어도하나의입체적항원결정부위에대한특이성을가지며, 탐지가능한신호생성표지를가지거나탐지가능하게표지된시약에부착되는항체들을제공하는단계 ; (b) 표본과상기항체들을접촉하는단계 ; (c) 상기항체들을인플루엔자바이러스와결합하는단계 ; 및 (d) 탐지가능한표지에의해표본에존재하는인플루엔자바이러스의존재를결정하는단계를포함하여상기바이러스에감염될위험이있는동물또는인간의표본에서인플루엔자바이러스를탐지하는방법. 청구항 31. 제 13 항의조성물의유효량을척추동물에투여하는단계를포함하는치료방법. 청구항 32. 제 17 항의백신제제의유효량을척추동물에투여하는단계를포함하는인플루엔자예방법. 청구항 33. 제 13 항의조성물을투여하는단계를포함하는방어적면역반응을제공하는방법. 도면 - 20 -
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도면 4 도면 5-22 -
도면 6 도면 7-23 -
도면 8 도면 9-24 -
도면 10 도면 11 도면 12 서열목록 SEQUENCE LISTING <110> Robinson, Robin A. Pushko, Peter M. <120> Functional Influenza Virus-Like Particles (VLPS) <130> NVR-404-25 -
<160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1404 <212> DNA <213> Avian <400> 1 atgaatccaa atcaaaagat aatagcactt ggctctgttt ctataactat tgcgacaata 60 tgtttactca tgcagattgc catcttagca acgactatga cactacattt caatgaatgt 120 accaacccat cgaacaatca agcagtgcca tgtgaaccaa tcataataga aaggaacata 180 acagagatag tgcatttgaa taatactacc atagagaagg aaagttgtcc taaagtagca 240 gaatacaaga attggtcaaa accgcaatgt caaattacag ggttcgcccc tttctccaag 300 gacaactcaa ttaggctttc tgcaggcggg gatatttggg tgacaagaga accttatgta 360 tcgtgcggtc ttggtaaatg ttaccaattt gcacttgggc agggaaccac tttgaacaac 420 aaacactcaa atggcacaat acatgatagg agtccccata gaaccctttt aatgaacgag 480 ttgggtgttc catttcattt gggaaccaaa caagtgtgca tagcatggtc cagctcaagc 540 tgccatgatg ggaaggcatg gttacatgtt tgtgtcactg gggatgatag aaatgcgact 600 gctagcatca tttatgatgg gatgcttacc gacagtattg gttcatggtc taagaacatc 660 ctcagaactc aggagtcaga atgcgtttgc atcaatggaa cttgtacagt agtaatgact 720 gatggaagtg catcaggaag ggctgatact aaaatactat tcattagaga agggaaaatt 780 gtccacattg gtccactgtc aggaagtgct cagcatgtgg aggaatgctc ctgttacccc 840 cggtatccag aagttagatg tgtttgcaga gacaattgga agggctccaa tagacccgtg 900 ctatatataa atgtggcaga ttatagtgtt gattctagtt atgtgtgctc aggacttgtt 960 ggcgacacac caagaaatga cgatagctcc agcagcagta actgcaggga tcctaataac 1020 gagagagggg gcccaggagt gaaagggtgg gcctttgaca atggaaatga tgtttggatg 1080 ggacgaacaa tcaagaaaga ttcgcgctct ggttatgaga ctttcagggt cgttggtggt 1140 tggactacgg ctaattccaa gtcacaaata aataggcaag tcatagttga cagtgataac 1200 tggtctgggt attctggtat attctctgtt gaaggaaaaa cctgcatcaa caggtgtttt 1260 tatgtggagt tgataagagg gagaccacag gagaccagag tatggtggac ttcaaatagc 1320 atcattgtat tttgtggaac ttcaggtacc tatggaacag gctcatggcc cgatggagcg 1380 aatatcaatt tcatgtctat ataa 1404 <210> 2 <211> 1683 <212> DNA <213> Avian <400> 2 atggaaacaa tatcactaat aactatacta ctagtagtaa cagcaagcaa tgcagataaa 60 atctgcatcg gccaccagtc aacaaactcc acagaaactg tggacacgct aacagaaacc 120 aatgttcctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacag agcataatgg aatgctgtgt 180 gcaacaagcc tgggacatcc cctcattcta gacacatgca ctattgaagg actagtctat 240 ggcaaccctt cttgtgacct gctgttggga ggaagagaat ggtcctacat cgtcgaaaga 300 tcatcagctg taaatggaac gtgttaccct gggaatgtag aaaacctaga ggaactcagg 360 acacttttta gttccgctag ttcctaccaa agaatccaaa tcttcccaga cacaacctgg 420 aatgtgactt acactggaac aagcagagca tgttcaggtt cattctacag gagtatgaga 480 tggctgactc aaaagagcgg tttttaccct gttcaagacg cccaatacac aaataacagg 540 ggaaagagca ttcttttcgt gtggggcata catcacccac ccacctatac cgagcaaaca 600 aatttgtaca taagaaacga cacaacaaca agcgtgacaa cagaagattt gaataggacc 660-26 -
ttcaaaccag tgatagggcc aaggcccctt gtcaatggtc tgcagggaag aattgattat 720 tattggtcgg tactaaaacc aggccaaaca ttgcgagtac gatccaatgg gaatctaatt 780 gctccatggt atggacacgt tctttcagga gggagccatg gaagaatcct gaagactgat 840 ttaaaaggtg gtaattgtgt agtgcaatgt cagactgaaa aaggtggctt aaacagtaca 900 ttgccattcc acaatatcag taaatatgca tttggaacct gccccaaata tgtaagagtt 960 aatagtctca aactggcagt cggtctgagg aacgtgcctg ctagatcaag tagaggacta 1020 tttggagcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagtcgc tggctggtat 1080 ggtttccagc attcaaatga tcaaggggtt ggtatggctg cagataggga ttcaactcaa 1140 aaggcaattg ataaaataac atccaaggtg aataatatag tcgacaagat gaacaagcaa 1200 tatgaaataa ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta gactcaatat gatcaataat 1260 aagattgatg accaaataca agacgtatgg gcatataatg cagaattgct agtactactt 1320 gaaaatcaaa aaacactcga tgagcatgat gcgaacgtga acaatctata taacaaggtg 1380 aagagggcac tgggctccaa tgctatggaa gatgggaaag gctgtttcga gctataccat 1440 aaatgtgatg atcagtgcat ggaaacaatt cggaacggga cctataatag gagaaagtat 1500 agagaggaat caagactaga aaggcagaaa atagaggggg ttaagctgga atctgaggga 1560 acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaatgggg 1620 tttgctgcct tcctgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 3 <211> 759 <212> DNA <213> Avian <400> 3 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccatc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcgcagag acttgaggat gtttttgcag ggaagaacac agatcttgag 120 gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180 gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgatttgtc 240 caaaatgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acagggcagt taaactatac 300 aagaagctga agagggaaat gacattccat ggagcaaagg aagttgcact cagttactca 360 actggtgcgc ttgccagttg catgggtctc atatacaacc ggatgggaac agtgaccaca 420 gaagtggctc ttggcctagt atgtgccact tgtgaacaga ttgctgatgc ccaacatcgg 480 tcccacaggc agatggcgac taccaccaac ccactaatca ggcatgagaa cagaatggta 540 ctagccagca ctacggctaa ggccatggag cagatggctg gatcaagtga gcaggcagca 600 gaagccatgg aagtcgcaag tcaggctagg caaatggtgc aggctatgag gacaattggg 660 actcacccta gttccagtgc aggtctaaaa gatgatctta ttgaaaattt gcaggcttac 720 cagaaacgga tgggagtgca aatgcagaga ttcaagtga 759-27 -