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한국인에서약물수송체의 유전자변이및기능변동 연세대학교대학원 의과학과 최지하

한국인에서약물수송체의 유전자변이및기능변동 지도교수 김경환 이논문을박사학위논문으로제출함 2005 년 12 월일 연세대학교대학원 의과학과 최지하

최지하의박사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 2005 년 12 월일

감사의글 약리학교실에들어온지어느덧 4 년이지나이제졸업이라는 작은결실을맺게되었습니다. 먼저저에게연구와공부를할기회를주시고,4 년동안변함없는관심으로저의연구를지도해주신김경환교수님께깊이감사를드립니다. 그리고연구하는동안제게정말많은조언을주시고, 연구자로서의모범을몸소보여주신이민구교수님께깊이감사드립니다. 또한연구뿐만아니라모든일을열심히하시는약리학교실의안영수교수님, 김동구교수님, 김혜영교수님, 장정원교수님께모두감사드립니다. 부족한점이많은저에게임상약리학이라는새로운분야의학문을공부할기회를주신약리학교실박경수교수님과소아과학교실박민수교수님께정말감사드립니다. 교실내의모든대소사를챙기시느라항상애쓰시는임종수선생님, 김건태선생님, 민선해언니께매우감사드립니다. 너무재미있고열정적으로강의를하셔서저에게처음으로약리학이라는학문에흥미를갖도록해주신이화의대약리학교실이경은교수님께정말감사드립니다. 환자샘플을주셔서이번연구를할수있게해주신내과학교실전재윤교수님, 한광협교수님, 송시영교수님, 안상훈교수님과가톨릭의대내과학교실안병민교수님께감사드립니다. 교수

님들의도움이없었더라면제연구는시작하지못했을것입니다. 제논문을꼼꼼히보시고많은조언을주신해부학교실김명희교수님, 병리학교실조남훈교수님께감사드립니다. 또한제가약리학교실학생인데도항상귀찮아하지않으시고저의연구에관심을보이시고도움을주신미생물학교실이재면교수님, 생화학교실김하일선생님, 박상규선생님, 중문의대미생물학교실최용준교수님께감사드립니다. 아무것도모르던저에게실험을처음가르쳐주시느라정말고생을많이하신추상희선생님과김주영선생님께감사드립니다. 대학원생활을하는동안저에게많은조언과활력을준이진우선생님, 한원선언니, 이정호에게감사합니다. 4년동안동고동락한랩1 친구들과사랑스러운랩5 친구들 ( 현정, 성복, 효선, 윤정 ) 한테감사합니다. 특히저의연구를많이도와준이지현, 지헌영에게감사합니다. 제가모교인이화의대를떠나연세의대에서새로운생활을시작할때, 별어려움없이잘적응하게도와준여러기초전공의선배님들과동기들에게감사드립니다. 끝으로의학공부를시작한이래 10 년동안헌신적으로저를뒷 바라지해주시고항상저를믿어주신부모님과오빠에게깊은사 랑과감사를표합니다. 2005 년 12 월최지하

차례 국문요약 1 Ⅰ. 서론 2 Ⅱ. 대상및방법 7 1. 대상및시료 7 2. 유전자분석 7 3. 변이클론제작 8 4.Immunobloting 8 5.MDR 및 MRP 유전자기능측정 9 6. 역전사중합효소연쇄반응 10 7.MRP2promoterplasmid 제작 10 8.Luciferase 활성측정 11 9. 젤지연분석법 12 Ⅲ. 결과 13 1. 독성간염환자의임상적특성 13 2. 한국인에서의 MDR1,MRP2 및 MRP3 유전자변이 16 3.MDR1,MRP2 및 MRP3 변이유전자의기능 21 4.MRP2 변이유전자의단백발현 22 5.MRP2 유전자변이가 splicing 에미치는영향 23 6.MRP2 변이유전자의 luciferase 활성 24 7.MRP2 유전자의 promoter 변이부위에결합하는전사조절인자 26 Ⅳ. 고찰 27 Ⅴ. 결론 30 참고문헌 32 영문요약 38

그림차례 그림1.TDS 분석법을이용한 MRP2 유전자변이 17 그림2.MRP2 변이유전자의기능 21 그림3.MRP2 변이유전자의 MRP2 단백발현 22 그림4.MPR2 유전자의 exon4 에대한중합효소연쇄반응 23 그림5.MRP2 유전자의 promoter 변이일배체형의 luciferase 활성 24 그림6. 간독성을일으키는약물에의한 MRP2 유전자의 promoter 변이일배체형의 luciferase 활성변화 25 그림7.MRP2 유전자 promoter 부위 -1774/del 변이부위에결합하는전사조절인자 26

표차례 표1. 독성간염환자의간손상형태, 성별및연령에따른분포 14 표2. 원인약물에따른독성간염환자의분포 15 표3.RUCAM 점수에따른독성간염환자의분포 15 표4.MDR1 의유전자변이 18 표5.MRP3 의유전자변이 18 표6.MRP2 의유전자변이 19 표7.MRP2 유전자의주요일배체형 20

국문요약 한국인에서약물수송체의유전자변이및기능변동 동일한약물및용량에대한개체간의다양한약물반응은주로약물대사효소와약물수송체의유전적차이에기인한다. 본연구에서는체내의약물역동에중요한역할을한다고알려진약물수송체중 MDR1,MRP2,MRP3 의유전자변이를찾고자하였으며이들변이유전자의기능검색을통하여독성간염발병과이들유전자변이와의상관성여부를알아보고자하였다. 유전자분석결과정상인과독성간염환자간에 MRP2 유전자일배체형이빈도상통계적으로유의한차이가있었다. 또일배체형을구성하는변이중 promoter 부위의변이가중요한작용을할것이라는것을유추할수있었다.Luciferase 분석법을통하여 promoter 의기능을측정한결과 간세포형 독성간염환자와 담즙정체형 / 혼합형 독성간염환자에서유의한빈도차이를보인 AT,(-)C 일배체형의기능이 wild type 일배체형에비해현저히감소하였다. 특히 (-)C 일배체형은간독성을일으키는 chenodeoxycholicacid 약물을처리한후 promoter 활성증가정도도 wild type 일배체형에비해적었다. 이와같이 promoter 활성이감소된변이를가진개체는 MRP2 에의한담즙관으로의약물및담즙산등의배출능력이떨어지기때문에동일한약물및용량에의해서도정상인보다더쉽게간손상이초래될것이다. 본연구결과 MRP2 유전자는독성간염과관련성이높으며특히이에는 promoter 부위의활성이중요하다고생각된다. 핵심되는말 :MDR,MRP, 유전자변이, 독성간염, 일배체형,promoter 1

한국인에서약물수송체의유전자변이및기능변동 < 지도교수김경환 > 연세대학교대학원의과학과 최지하 Ⅰ. 서론 같은약물을동일한용량으로투여하는경우대부분의사람들에서는비슷한치료효과를얻을수있지만일부사람들에서는효과가나타나지않거나심각한부작용이나타난다. 이와같이약물에대한반응이개체간에다르게나타나는이유로환자의나이, 몸무게, 성별, 간기능, 영양상태등다양한요소들을고려할수있겠다. 최근에는유전적요인의중요성이인정되면서약물대사효소, 약물수송체등체내의약물역동에관여하는인자의유전적차이가약물반응변동요인으로제시되고있다. 현재까지약물대사효소의유전자변이에따른약물반응의차이는비교적많이연구되었으나, 약물수송체의유전적변이와약물반응과의상관성에대한연구는아직시작단계라할수있다. 1 다중약물저항성단백 (multidrug resistanceprotein,mdr) 은약물이동에중요한역할을하는약물수송체중의하나이다. 이는항암치료에있어서의다중약물내성과관련되어처음발견되었다. 즉 MDR 에의해수송되는항암제를계속투여하면암세포내의 MDR 단백의양이증가하여초기에는항암제에반응을하던암세포가내성을갖게된다.MDR 은암세포뿐만아니라간, 소장, 콩팥, 뇌등의정상세포에도존재하면서다양한종류의비극성물질혹은유기양이온계물질 2

의수송을담당하고있다. 2,3 다중약물저항성관련단백 (multidrug resistance associated protein, MRP) 역시약물이동에중요한역할을하는수송체로, 사람에있어서현재까지 9개의아형이밝혀졌으며이중 MRP2,MRP3 에대한연구가가장많이진행되었다. 4 MRP2 는체내담즙관의상피세포에주로분포되어있으면서담즙산의장-간 (entero-hepatic) 순환뿐아니라포합또는불포합형태의여러가지약물의담즙관으로의배출역할을한다. 5, 6, 7 포합담즙산의체내축적을특징으로하는유전질환중의하나인 Dubin-Johnson 증후군의발병은 MRP2 의유전자변이와밀접하게관련이있는것으로알려졌다. 8 예를들어 MRP2exon30 의 1392 부터 1394 번째까지의염기가결실된변이를갖는 Dubin-Johnson 증후군환자의간에서는 MRP2 의단백이발현되지않는것으로알려졌다. 왜냐하면이변이를가질경우소포체내의 chaperon 이 MRP2 에결합하여 MRP2 가 olgi 로이동하지못하고소포체내에서붕괴되기때문이다. 9 MRP2 는정상조직뿐아니라난소암, 대장암, 백혈병, 간암등에서발현되면서 etoposide, vincristine,cisplatin,doxorubicin 등의여러가지항암제에대한내성에관여하는것으로알려졌다. 7,10,11,12 MRP3 의경우간, 콩팥등에분포되어있으면서다양한유기음이온계물질을수송한다.MRP3 은 MRP2 와는달리정상시에는간에서의발현량이적으나, 담즙정체성간질환과같이 MRP2 가손상된경우에는단백발현이증가하여 MRP2 와비슷하게담즙산의장-간순환에관여한다. 13,14,15 MDR 이나 MRP 의약물수송능력에영향을주는유전자변이를갖는개체의경우약물의역동이달라져그약물에대한반응이다른개체와다르게나타날수있으며그대표적인예로 MDR1 의 3435C/T 변이를들수있다.MDR1 에의하여체내에서수송되는약물인 digoxin 을동일한용량으로투여시 TT 유전자형을갖는개체는 CC 유전형 3

을갖는개체보다 digoxin 의혈중농도가높아지게된다. 이는 TT 유전자형을갖는개체에서 CC 유전형을갖는개체에비해 MDR1 단백발현이감소되어있기때문이다.Digoxin 의경우치료지수가매우적은약물이기때문에이와같은혈중농도의변화는환자에게매우치명적인독작용을초래할수있다. 16,17,18 본연구에서는한국인에서약물수송체중중요한역할을할것으로기대되는 MDR1,MRP2,MRP3 의유전자변이를검색하고각변이의기능을측정하였다. 또한이들약물수송체는간에서의약물수송과도관련이있으므로독성간염환자에서의유전자변이및일배체형의빈도를정상인과비교하여독성간염발병과약물수송체변이나일배체형간의상관성여부를밝히고자하였다. 19 독성간염을일으킬수있는약물은임상에서사용상제한을받게된다. 실제로 tienilic acid,benoxaprofen,bromfenac,tacrine,tasmar 등의약물이간독성때문에사용이금지되거나제한되고있다. 약물이독성간염을일으키는기전은다양하다. 예를들어독성간염을일으키는가장흔한약물인 acetaminophen 은정상상태에서는 glucuronide 와 sulfate 에의해포합되어대사되지만, 간내의 acetaminophen 양이많아지게되면포합되지못한약물이 P450 2E1 에의해 N-acetylbenzoquinone-imide 라는중간산물로대사되어간독성을일으킨다. 20 독성간염을진단하기위하여중요하게고려해야할사항은약물복용시점과증상이나타난시점의시간간격그리고, 약물중단시점과증상소실시점의사이의상관관계여부이다. 약물에의한독성간염진단기준은 1989 년에만들어진 RousselUclafcausality assessment method(rucam) 이주로이용되고있다.RUCAM 은약물복용후증상이나타나기까지의시간, 증상의경과, 약물반응의위험인자유무, 병용약물유무, 비약물적인원인유무, 약물에대한사전정보, 재투여시반응등에따라점수를산정하도록되어있다. 21 MDR1,MRP2,MRP3 유전자변이를바탕으로각각의일배체형을구 4

성한결과 MRP2 유전자의일배체형이정상인과독성간염환자간에통계적으로유의한빈도차이를보였다. 이러한차이는일배체형을구성하는변이중 promoter 부위에있는변이에의한것으로추측되어이것이 MRP2 유전자발현에미치는영향에대하여알아보았다. MRP2 단백의발현은개체에따라그정도가약 15 배정도까지차이를보일수있다. 22 단백발현은 endocyticretrieval,exocyticinsertion 에의한세포막으로의 sorting 시의조절, 전이시의조절, 전사시의조절등에의하여달라질수있으며본연구에서는이중전사시의조절에초점을두었다. 7 MRP2 단백발현을위해서는특정 promoter/enhancer 부위가필요하다. 현재까지는전이시작점으로부터뒤로 197(-197) 부터 517(-517) 까지의염기부위가 MRP2 단백발현을유지하는데에필요한것으로알려졌다. 15 특히 -441 과 -436 사이에 TATA box 가중요한역할을하는데, 그이유는여기에 TATA binding protein(tbp) 과같은전사전개시복합체가결합하기때문이다. 흰쥐의 MRP2 단백발현에중요하다고알려진 Y box 나 C box 는사람엔없는것으로알려졌다. 15 또한전이시작점으로부터뒤로 81 로부터 248 까지의염기부위도 MRP2 단백발현에중요하며여기에는 hepatocyte nuclear factor 1(HNF1), upstream stimulatory factor(usf)-likeelement 등이결합하는것으로알려졌다. 23,24 현재까지의 MRP2 유전자의전사조절에대한연구중가장잘알려진것은핵내수용체인 farnesoid X-activated receptor(fxr), pregnane X receptor(pxr),constitutive androstane receptor(car) 에의한전사조절이다. 즉, 이들수용체의결합물질인 chenodeoxycholic acid,dexamethasone,phenobarbital 등이각각 FXR,PXR,CAR 수용체에결합하면이들수용체가역시핵내수용체인 retinoid X receptor(rxr) 와이종체 (heterodimer) 를이루어 MRP2 mrna 증가를유도한다. 이와는달리패혈증, 알코올, 자가면역, 바이러스성간염, 담 5

즙정체성간질환등과같이간에염증반응이유발되는경우에는 tumornecroticfactor-α,interleukin-6,interleukin-1β 등의급성반응때의염증매개물질이 MRP2mRNA 발현을감소시킨다. 7 본연구에서는체내의약물역동에중요한역할을한다고알려진약물수송체중 MDR1,MRP2,MRP3 의유전자변이를찾고자하였으며이들변이유전자의기능검색을통하여독성간염발병과이들유전자변이와의상관성여부를알아보고자하였다. 6

Ⅱ. 대상및방법 1. 대상및시료 본연구는 110 명의정상인과 94 명의독성간염환자를대상으로하였다. 독성간염환자는 RUCAM 에근거하여진단하였으며, 혈액시료채취전본연구에대한설명후서면동의서를받았다. 혈액샘플에서 DNA 는 DNA blood minikit(qiagen mbh,hilden,ermany) 을이용하여추출하였다.RUCAM 은각환자를약물복용후증상이나타나기까지의시간, 증상의경과, 약물반응의위험인자유무, 병용약물유무, 비약물적인원인유무, 약물에대한사전정보, 재투여시반응등에따라 -7 부터 14 까지의점수로분류하도록되어있다. 이점수는약물에의한독성간염의가능성을나타내는지표로서,9 점이상은확실함을,6-8 점은거의확실함을나타낸다. 또한 3-5 점은가능성이있음을,1-2 점은가능성이희박함을나타내며,0 점이하는진단에서배제된다. 2. 유전자분석 MDR1, MRP2, MRP3 유전자변이는 two-dimensional gene scanning(tds) 및 denaturing gradientgelelectrophoresis(de) 를이용하여분석하였다. 먼저 genomic DNA 를주형으로사용하여 MDR1,MRP2,MRP3 유전자를증폭시키는 long 중합효소연쇄반응 (PCR) 을시행한후, 여기서나온생성물을주형으로다시 multiplex short 중합효소연쇄반응을하여모든 exon 을증폭시켰다. 증폭후 DNA 조각을완전히 denaturation 시킨후다시 renaturation 시킴으로써변이가있는대립유전자를포함하는 DNA 의경우에는 heteroduplex 가형성되도록하였다. 또한 primer 에 HEX 라는형광물질 7

을붙여 DNA band 를분석하였다.Multiplex 중합효소연쇄반응을통하여증폭된 DNA 조각들은 urea,formamide 로이루어진화학적변성증감젤에서전기영동을시키면서분자량및녹는점에따라분리되도록하였다. 전기영동후젤은형광스캐너 (Bio-rad,Hercules,CA, USA) 를이용하여분석하였다. 변이의 heterozygote 와 homozygote 비율은 SNaPshot 방법 (DNA link,seoul,korea) 을이용하여측정하였다. MDR1,MRP2,MRP3 유전자의 promoter 상의유전자변이는전이시작점을기준으로 -2000 염기쌍까지를 automaticsequencer 를이용하여분석하였다. 각유전자의일배체형은 expectation-maximization algorithm 에근거한 Haploview 3.2(BroadInstituteofHarvardandMIT,Cambridge,MA, USA) 를이용하여구성하였다. 25 3. 변이클론제작 pmt21-mdr1,pcdna3.1-mrp2,pcdna3.1-mrp3 plasmid 를각각주형으로 Quickchange site-directed mutagenesis kit(stratagene,la Jola,CA,USA) 를이용하여중합효소연쇄반응을시행하였다. 여기서얻은생성물을전기천공법으로 transformation 시킨후 Plasmid mini preparation kit(qiagen mbh, Hilden, ermany) 을이용하여 DNA 를추출하고 automaticsequencer 로변이여부를재확인하였다. 4.Immunobloting HEK(human embryonic kidney) 293T 세포를 10% 우태아혈청 (ibco,rand Island,NY,USA),100 unit/ ml penicilin,100 μg / ml streptomycin(ibco, rand Island, NY, USA) 이포함된 Dulbeco's 8

modifiedeaglemedium(ibco,randisland,ny,usa) 에서 37,5% CO 2 하에배양하였다.Wild type, 변이클론은 lipofectamine-plus reagent(invitrogen,carlsbad,ca,usa) 를이용하여 HEK293T 세포에각각 transfection 시켰다.Transfection 한지 24 시간후의세포를 0.05% trypsin-edta(ibco,rand Island,NY,USA) 를이용하여얻은다음찬인산완충액 (ibco,rand Island,NY,USA) 으로세번세척한후 lysisbufer 를넣고초음파분쇄기에서 10 초간 3회반복하여세포를파괴하였다. 이후 4 에서 13000 rpm 으로 10 분간원심분리하여상청액을얻었고, 단백의농도는 Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 로정량하였다. 일정량의단백을 acrylamide 젤에서전기영동하여분리한후 nitrocelulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,USA) 으로옮겼다. Membrane 을 5% 탈지분유,0.1% tween 20(Sigma Aldrich,St.Louis, MO,USA) 이함유된인산완충액으로상온에서 1시간동안차단한후일차항체를 4 에서 12 시간반응시켰다. 항 MDR1 단클론항체는 Calbiochem(San Diego,CA,USA), 항 MRP2 단클론항체는 Kamiya Biomedical Company(Seatle, WA, USA), 항 neomycin phosphotransferaseⅡ 다클론항체는 Upstate(LakePlacid,NY,USA) 에서각각구입하였고항 MRP3 다클론항체는 MRP3 펩티드를토끼에면역시켜얻었다.0.05% tween20 이함유된인산완충액을이용하여 3회세척한후이차항체로상온에서 1시간반응시켰다. 이후 0.05% tween 20 이함유된인산완충액으로 3회세척한다음 ECL solution kit(amersham bioscience,uppsala,sweden) 를사용하여현상하였다. 5.MDR 및 MRP 유전자기능측정 Wild type, 변이클론을 transfection 한 HEK293T 세포를 0.1 mm Ca 2+ 와 1mM Mg 2+ 를함유한인산완충액으로두번세척한후, 세포 9

수가 10 10 6 개 / ml이되도록 0.1mM Ca 2+ 와 1mM Mg 2+ 를함유한인산완충액으로희석하였다. 세포를 500 μl씩 fluorescenceactivated cel sorterflow cytometer 용튜브 (BD Bioscience,Bedford,MA,USA) 에분주한다음일정농도의형광물질을각각의튜브에넣었다. 형광물질로 MDR1,MRP3 유전자의경우에는 1 um 의 calcein-ammonium salt(molecularprobe,eugene,oregon,usa) 를,MRP2 유전자의경우에는 10 um 의 5-6-carboxyfluorescein-diacetate(Molecular probe, Eugene,Oregon,USA) 를사용하였다. 이상의모든과정은얼음위에서진행하였다.37 수조에세포를함유한튜브를 30 분간유지시켜세포가형광물질을배출하도록한후 FACS flow cytometer(bd Bioscience,Bedford,MA,USA) 를이용하여 1 10 4 개의세포내에남아있는형광물질양을측정하였다. 6. 역전사중합효소연쇄반응 MRP2 유전자의 334-49C/T (intron3) 염기가각각 CC,CT,TT 인혈액으로부터 RNA 을추출하였으며이 RNA 을주형으로 SuperscriptⅡ RNaseH-reversetranscriptase(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA) 을이용하여역전사반응을수행하였다. 여기서얻은 cdna 를주형으로 forward primer: 5'-CTTATAAATCCAACCAAAA-3', reverse primer:5'-aataaaacacaata-3' 을 용하여 MRP2exon4 에대한중합효소연쇄반응을실시하였다. 이 7.MRP2promoterplasmid 제작 MRP2 promoter 부위에서찾은특정변이를갖는 genomic DNA 와 wild type 을갖는 genomic DNA 을각각주형으로 forward primer: 5'-AATTCATACTTCCTCTCCTT-3',reverse primer:5'-ac 10

AACAATTCTCCTTCCTCACAC-3' 을이용하여중합효소연쇄반응을시행하여 2662 염기쌍의 promoter 부위 DNA 를얻었다. 이를다시주형으로,5'-KpnⅠ,3'-NheⅠ 으로잘리는염기서열을포함하는 primer 인 5'-CTACCTTATAACATTTAATTCT-3',5'-C TACTACATTCCTACTCTCT-3' 을이용하여중합효소연쇄반응을시행하였다. 이후생성물을 KpnⅠ,NheⅠ(NEB,Ipswich, MA, USA) 으로자른후이를 pl3-enhancer vector 에넣었다. Autonomicsequencer 로 DNA sequence 를재확인하였다. 8.Luciferase 활성측정 Luciferase reporter 유전자활성도는 Dualluciferase reporterassay system(promegacorporation,madison,wi,usa) 을이용하여측정하였다. 세포는 10% 우태아혈청,100 unit/ ml penicilin,100 μg / ml streptomycin 이포함된 Dulbeco's modified eagle medium 에서 37, 5% CO 2 하에배양한 Hep2 세포를이용하였다.luciferase 활성은 Hep2 세포에 wild type, 변이클론을 lipofectamine-plus reagent 를이용하여각각 transfection 한후 24 시간후에측정하였고, 이때에는 luminometer(berthold Technologies,Wildbad,ermany) 를이용하였다. 간독성약물이 MRP2promoter 의활성도에미치는영향을알아보기위한실험에서는 Hep2 세포에 wild type, 변이클론을각각 transfection 시킨후 24 시간후에 200 um 의 chenodeoxycholic acid(sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA) 를세포에처리하였다. 이후 24 시간후에 luciferase 활성도를측정하였다. 11

9. 젤지연분석법 (electrophoreticmobility shiftassay) 핵단백은 Hep2 세포에서추출하였고,MRP2 유전자의 promoter 부위변이에대한 primer 는 -1774 (CACTTATCTTTTTTTTT), HNF3 consensus (CCCATTTTTTTTTAACC), Evi-1 consensus(tatattctctttaattttcc) 와같이제작하였다. 이들 primer 에 T4 polynucleotide kinase(promega, Madison, WI, USA) 와 [γ- 32 P]ATP(NEN,Boston,MA,USA) 을이용하여표지하였다. 이후각각의 antisense 에해당하는 primer 를넣은후 95 에서 5 분간 annealing 시켰다. 표지된소식자 (5 10 4 cpm) 를 10 μl의결합완충액에넣은후핵단백 (10 μg ) 과상온에서 30 분간반응시켰다. 미리 200V 에서 2시간동안전기영동을시킨 non-denaturing 4% polyacrylamide 젤에반응물을부하시켰다. 전기영동은 200V 에서 1시간 40 분동안시행하였고이후젤을건조시킨다음자가방사법으로기록하였다.Competitionassay 에서는표지하지않은소식자를표지소식자보다 100 배많이넣은후반응시켰다. 12

Ⅲ. 결과 1. 독성간염환자의임상적특성 독성간염환자 94 명중 61% 가 간세포형 독성간염형태를보였으며 간세포형 과 담즙정체형 / 혼합형 독성간염환자모두 50 대의연령층이가장많았다 ( 표1). 간세포형 독성간염환자는여자가 66% 를차지한반면 담즙정체형 / 혼합형 독성간염환자는남녀비율이비슷하였다 ( 표1). 독성간염환자중한약및한약재가원인이었던예는 간세포형 이 33 명 (58%), 담즙정체형 / 혼합형 이 16 명 (43%) 이었다. 원인약물이건강보조식품이었던예는 간세포형 이 17 명 (30%), 담즙정체형 / 혼합형 이 15 명 (41%) 이었다.RUCAM 가 6점이상인경우가 간세포형 에서는 46 명 (81%), 담즙정체형 / 혼합형 에서는 29 명 (78%) 로대부분독성간염의발병이약물로인한것임이확실하였다 ( 표1, 표3). 13

표 1. 독성간염환자의간손상형태, 성별및연령에따른분포 연령 간세포형 a 환자 담즙정체형 b / 혼합형 c 환자 남여남여 20-29 1 1 3 1 30-39 5 5 0 5 40-49 5 7 4 3 50-59 2 16 7 7 60-69 5 8 3 1 70-79 0 1 2 1 80-89 1 0 0 0 소계 19 38 19 18 합계 57 37 a alanineaminotrasferase 수치가정상상한치보다 2배이상증가하거나 R d ' 수치가 5이상인경우 b alkalinephosphatase 수치가정상상한치보다 2배이상증가하거나 R' 수치가 2이하인경우 c alanine aminotrasferase 수치가정상상한치보다 2배이상증가하고 R' 수치가 2-5 사이인경우 d 혈청 alanineaminotrasferase 와혈청 alkalinephosphatase 수치의비 14

표 2. 원인약물에따른독성간염환자의분포 원인약물 간세포형 환자 담즙정체형 / 혼합형 환자 한약및한약재 a 33(58%) 16(43%) 건강보조식품 b 17(30%) 15(41%) 양약 c 7(12%) 6(16%) 합계 57 37 a 한약은한의사에의해처방된약물을, 한약재는환자의자가처방에의한약물을의미한다. b 인진쑥, 버섯, 노루즙, 글루코사민, 클로렐라등 c 결핵치료제 (4), 진균치료제 (1), 위염치료제 (1), 고지혈증치료제 (1), 아세트아미노펜 (1), 항히스타민제 (1), 기타항생제 (4) 등 ( 괄호안의숫자는환자수를나타냄 ) 표 3.RUCAM 점수에따른독성간염환자의분포 RUCAM 점수 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 간세포형 환자 1 3 7 7 13 17 5 2 1 1 담즙정체형 / 혼합형 환자 0 1 7 6 10 8 2 1 1 1 합계 1 4 14 13 23 25 7 3 2 2 RUCAM 점수 9: 원인이확실함 6-8: 원인이거의확실함 3-5: 원인일가능성이높음 1-2: 원인일가능성이낮음 0: 원인일가능성이없음 15

2. 한국인에서의 MDR1,MRP2 및 MRP3 유전자변이 정상인과독성간염환자의 MDR1,MRP2,MRP3 유전자변이를검색한바 ( 그림1), MDR1 와 MRP3 유전자의경우에는각각 14 개와 16 개의변이를찾았다. 그러나이들유전자변이중정상인과환자간에통계적으로유의한빈도차이를보이는것은없었다 ( 표4, 표5).MRP2 유전자의경우 promoter 부위를포함하여총 12 개의변이를확인하였다 ( 표6). 이들을일배체형으로구성하였을때 2개의일배체형이정상인과환자간에통계적으로유의한빈도차이를보였다. 즉정상인과 간세포형 독성간염환자사이에서는 3번일배체형이, 정상인과 담즙정체형 / 혼합형 독성간염환자사이에서는 1번일배체형이통계적으로유의한빈도차이를보였다 ( 표7). 16

A 정상인 독성간염환자 B exon 28-sense C,T DE exon 28 500 bp 분자량 100 bp 500 bp 분자량 100 bp 그림1.TDS 분석법을이용한 MRP2 유전자변이.(A) 다단계중합효소연쇄반응결과증폭된 46 개의 MRP2 조각이젤에분자량과녹는점에따라분포되었다. 변이가있는경우 heteroduplex 를형성하기때문에 1개의점으로나타나지않고위와같이 3-4 개의점으로나타난다.(B)TDS,DE 법으로찾은변이를 automaticsequencer 로재확인한결과이다. 17

표 4.MDR1 의유전자변이 변이 -8669T/C -8534C/T -2353/A -935A/ -709C/A,T -693T/C N21D 변이 1000-44/A (intron9) 1236C/T 1554+24C/T (intron13) 1725+38/A (intron14) A893S/T 3435C/T V1251I 표 5.MRP3 의유전자변이 변이 -2137A/ -1767/A -1306C/T -1213C/ -1134C/T -890C/del 349-53/A (intron3) 613-22/A (intron5) 변이 A565T 2526C/T 2600-123C/T (intron19) 2714+29C/T (intron20) 3039C/T 3579-66C/T (intron24) 3972C/T 4509A/ 18

표 6.MRP2 의유전자변이 변이 담즙정체형 / 혼합형 정상인 간세포형 환자환자 ( 명 ) ( 명 ) P 값 ( 명 ) P 값 -1774/del +/+ 50 30 0.28 9 0.04 * +/- 46 23 20 -/- 14 4 8-1549/A +/+ 66 30 0.03 * 24 0.11 +/- 42 22 10 -/- 2 5 3-24C/T +/+ 74 31 0.06 25 0.75 +/- 34 22 11 -/- 2 4 1-23/A +/+ 105 55 37 +/- 5 2 0 334-49C/T +/+ 66 28 0.06 23 0.20 (intron3) +/- 41 24 11 -/- 3 5 3 V417I(exon10) +/+ 92 47 0.22 34 0.29 +/- 15 10 3 -/- 3 0 0 T486I(exon10) +/+ 107 56 36 +/- 3 1 1 2620+3A/ +/+ 110 56 37 (intron19) +/- 0 1 0 2934/A +/+ 100 52 0.52 35 0.35 (exon22,s978) +/- 9 5 2 -/- 1 0 0 3972C/T +/+ 61 29 0.02 * 23 0.12 (exon28,i1324) +/- 47 22 11 -/- 2 6 3 4147-35/A +/+ 107 52 37 (intron29) +/- 3 5 0 4508+12/A +/+ 108 57 37 (intron31) +/- 2 0 0 P 값은 (+/+ vs-/-) 정상인과비교하였을때의값이며, 카이 - 제곱분석법을 이용하여구하였다. * P<0.05 19

표 7.MRP2 유전자의주요일배체형 - 1774 /del - 1549/A - 24C/T - 23/A 334-49C/T V417I T 486I 2620+ 3A/ 2934/A 3972C/T 4147-35/A 4508+ 12/A 그룹 정상인 간세포형 환자 담즙정체형 / 혼합형 환자 명 (%) 명 (%) 명 (%) 1 del C C V T A C 72 (32.7) 30 (26.3) 36 (48.6) a 2 C C V T A C 51 (23.1) 30 (26.3) 15 (20.8) 3 A T T V T A T 31 (14.1) 28 (24.6) b 13 (17.5) 4 C C I T A C 19 (8.6) 5 (4.4) 3 (4.1) 5 C C V T A A C 11 (5.0) 4 (3.5) 2 (2.7) 합계 220 114 74 밑줄친굵은글씨는변이를나타낸다. 정상인에서의빈도가 5% 이상의일배체형을빈도가높은순으로나타내었다. 정상인과환자군간의빈도차이의유의성여부는카이-제곱분석법을이용하여결정하였다. a P=0.013, b P=0.017 20

3.MDR1,MRP2 및 MRP3 변이유전자의기능 MDR1,MRP2,MRP3 변이유전자의기능을세포수준에서알아보기위하여 FACS flow cytometer 를이용하여형광물질수송능을측정하였다. 그결과본연구에서찾은 MDR1,MRP2,MRP3 변이유전자의기능은 wildtype 에비하여큰차이를보이지않았다. 단 MRP2 변이유전자중 Dubin-Johnson 증후군의발병과관련이있다고알려진 R768W 변이의경우그기능이 80% 정도감소하였으나이변이는본연구대상중에는없었다 ( 그림2). A HEK-pcDNA3.1: 1950.21 HEK-MRP2: 981.63 HEK-R768W: 1745.32 B export activity (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 HEK-V417I HEK-MRP2 HEK-R768W HEK-A1450T HEK-3972C/T HEK-2934/A 그림2.MRP2 변이유전자의기능.(A) 네모안의숫자는 10 10 4 개의세포가형광물질을배출한뒤, 세포내에남은형광물질의상대적인양을나타내며,(B)MRP2 유전자의배출기능을 100% 로보았을때변이유전자의기능을상대적으로표시한그래프이다. 21

4.MRP2 변이유전자의단백발현 MRP2 유전자변이가 MRP2 단백발현에영향을미치는지알아보기위하여 immunobloting 을시행하였다. 그결과한국인에서발견된 MRP2 변이는 wildtype 에비하여단백발현량이의미있게차이가나지않았고, Dubin-Johnson 증후군의발병과관련있다고알려진 R768W 변이는단백발현량이현저하게감소하였다 ( 그림3A). A (a) (b) (c) (d) (e) 190 kda B 30 kda (a) (b) (c) (d) (e) 그림3.MRP2 변이유전자의 MRP2 단백발현.(A) 은 MRP2 발현정도를본것이고, (B) 는 transfection 정도를보정하기위하여 neomycin phosphotransferaseⅡ 의발현정도를본것이다.(a) 는 MRP2wild type,(b) 는 V417I 변이,(c) 는 R768W 변이,(d) 는 2934/A 변이,(e) 는 3972C/T 변이의단백발현량을나타낸것이다. 22

5.MRP2 유전자변이가 splicing 에미치는영향 간세포형 독성간염환자에서통계적으로유의한빈도차이를보인 3번일배체형을구성하는변이중 334-49C/T (intron3) 변이가 splicing 에영향을주는지알아보기위하여역전사반응을수행하였다. 즉각각 2개씩의 wild,hetero,mutanttype 의 cdna 을합성한후이를주형으로 exon4 에대한중합효소연쇄반응을수행하였다. 그결과모든경우에중합효소연쇄반응의산물이 364 bp 로,exon4 가 skipping 이되는경우는없었다. 단 mutant 중 1개의경우 wildtype 과비교하였을때중합효소연쇄반응산물의양이약간감소하였다 ( 그림4A). CC CT TT A subject 1 2 3 4 5 6 500 bp 400 bp 300 bp B 200 bp 100 bp 그림 4.MRP2 유전자의 exon4 에대한중합효소연쇄반응.(A) 은 exon4, (B) 는 β-actin 에대한중합효소연쇄반응산물이다. 23

6.MRP2 변이유전자의 luciferase 활성 본연구에서찾은 MRP2 유전자의 promoter 부위변이를이용하여일배체형을구성한후이의기능을 dualluciferase reporter assay system 을이용하여측정하였다. 그결과 wild type 일배체형과비교했을때 (-)C 일배체형은 35.7%,AT 일배체형은 39.2% 그활성이감소된반면 AC 일배체형은큰차이를보이지않았다 ( 그림5). 담즙정체형간독성의원인이되는 chenodeoxycholicacid 약물을처리한후 MRP2 유전자의 promoter 활성도를보면, 약물을처리하기전에비해그활성이 wild type 일배체형의경우 60.9% 증가한반면 (-)C 일배체형은 28.6% 증가하였다.AT 일배체형은약물처리전보다활성이 78.4% 증가하였다 ( 그림6). relative luciferase activity (%) 120 100 80 60 40 20 0 C ** ** 64.3% 60.8% (-)C AT AC MRP2 promoter haplotype 그림 5.MRP2 유전자의 promoter 변이일배체형의 luciferase 활성.wild type 인 C 일배체형의 luciferase 활성정도를 100% 로보았을때나머지 일배체형의활성정도를상대적으로나타내었다. ** P<0.01 24

relative luciferase activity (%) 250 200 150 100 50 0 * 160.9% 128.6% C (-)C AT MRP2 promoter haplotype 그림 6. 간독성을일으키는약물에의한 MRP2 유전자의 promoter 변이일배체형의 luciferase 활성변화.200 um 의 chenodeoxycholicacid 를처리하기전의각일배체형의 luciferase 활성정도를 100% 로보았을때약물처리후의활성정도를 % 로나타내었다. * P<0.05 25

7.M RP2 유 전 자 의 pr omot er 변 이 부 위 에 결 합 하 는 전 사 조 절 인 자 MRP2 유전자의 pr omot er부위 변이 중에서 정상인과 독성 간염 환 자 간에 통계적으로 유의한 빈도 차이를 보인 일배체형 중 ( -) C 일 배체형에 영향을 주는 전사조절 인자를 알아보기 위해 젤 지연 분석법 을 이용하였다.그 결과 -1774/ de l부위에는 HNF3 전사조절 인자가 결합함을 알 수 있었다.또한 이 변이 부위에는 Evi -1 전사조절 인자 도 결합하지만 이는 HNF3보다는 훨씬 약하게 결합하는 것을 알 수 있 었다( 그림7). (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) 그 림 7.M RP2 유 전 자 pr omot er 부 위 -1774,/ del변 이 부 위 에 결 합 하 는 전 사 조 절 인 자.( a),( b) 는 -1774, 소식자와 핵 단백 간의 결합,( c ),( d) 는 -1774, 소식자에 대한 compe t i t i on ass ay,( e ) 는 HNF3cons ens us소식자와 핵 단백 간의 결합,( f ) 은 HNF3cons ens us소식자에 대한 c ompet i t i on assay, ( g) 는 Evi -1cons ens us소식자와 핵 단백 간의 결합,( h) 은 EVi -1c onse nsus 소식자에 대한 compe t i t i onass ay결과이다. 26

Ⅳ. 고찰 약물수송체는 10 개이상이알려져있으나그중 MDR1,MRP2, MRP3 가체내약물동태에중요한역할을한다고알려졌다. 이들수송체는간에서발현되며 MDR1,MRP2 는담즙관으로의약물및담즙산배출,MRP3 은혈액으로의약물배출역할을한다. 19 따라서이들수송체의기능이떨어지는경우약물에의한간손상이정상일때보다쉽게발생할수있을것이라고생각되었다. 실제로 MRP2 의유전자변이중 10 여개가포합담즙산이축적되는 Dubin-Johnson 증후군과관련있음이이미밝혀졌다. 26 본연구에서찾은 MPR2 유전자변이를이용하여구성한일배체형중 2개의일배체형이정상인과독성간염환자간에유의한빈도차이를보였다. 이일배체형을구성하는변이중 MPR2 유전자 exon 부위변이의기능을측정해보았으나이는 MRP2 의배출능력에큰영향을주지않았다. 현재까지알려진 MRP2 유전자변이는 60 여개가있으나이중변이의기능변동여부가밝혀진것은거의없으며,I1173F, R1150H 와같은몇몇변이만이기능이감소한다고알려졌다. 27 일배체형을구성하는 intron 부위의변이역시 splicing 에영향을주지않는것으로확인되어 promoter 부위의변이가중요할것으로예측되었다. MRP2 단백발현은여러인자에의해조절된다. 지금까지의연구에의하면 chenodeoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, glucocorticoid,endothelin-1,interleukin-1β,tumornecrosis factor α, interleukin-6 등과같은내인성인자와 arsenic,cisplatin,rifampicin, spironolactone, nifedipine, oltipraz, sulforaphane, phenobarbital, tamoxifen,genipin 등의외인성인자가 MRP2 단백발현조절에관여한다고알려졌다. 28 본연구결과에서정상인과비교했을때 담즙정체형 / 혼합형 독성간 27

염환자에서유의한빈도차이를보인 (-)C 일배체형과 간세포형 독성간염환자에서유의한빈도차이를보인 AT 일배체형은 wild type 일배체형에비해 promoter 활성이감소되었다. 특히 (-)C 일배체형은 chenodeoxycholicacid 를처리했을때의 promoter 활성증가정도도 wildtype 일배체형에비해적게나왔다. Chenodeoxycholicacid 는 cholesterol 의간내분해산물중의하나로, 장에서 lithocholicacid 로전환된후다시간으로재흡수되는데이것이과다한경우에는담즙정체형간독성이일어날수있다. 29 Chenodeoxycholicacid 가 MRP2 단백발현을증가시킨다는것은이미선행된다른연구에서밝혀졌다.Chenodeoxycholicacid 와의결합을통해 FXR 가활성화되면 FXR 이 RXRα 와이종체를형성한후 MPR2 의 promoter 부위에결합하여 MRP2 의발현을증가시킨다는것이지금까지알려진기전이다. 이때 FXR/RXRα 이종체가결합하는 MRP2 의부위는흰쥐의경우이미선행연구에서밝혀졌다. 즉전사시작점으로부터 440 염기쌍앞부분에위치한곳으로, 8개의염기쌍을사이로 ATTCA 가거꾸로반복되어있어 ER-8(everted repeatwith 8-bp spacer) 라고명명된부위이다. 29, 30 다른연구결과에의하면 cholic acid 나 ursodeoxycholicacid 와같은담즙산은 FXR 의활성과무관하게 MRP2 의단백발현을증가시킨다고알려졌다. 31, 32 또한, taurineconjugated ursodeoxycholicaicd 도 FXR 의활성과는무관하게 protein kinasc 의존적기전에의해담즙관내막으로의 MRP2 의삽입을증가시키는것으로알려졌다. 33 본연구에서는 -1774/del 변이부위에결합할수있는전사조절인자를 MatInspector 라는프로그램을이용하여예측해보았다. 그결과 HNF3 라는전사조절인자가결합할것이라고예측하였고, 실제로이인자가변이부위에결합한다는것을젤지연분석법을통하여확인하였다.HNF3 은 α1-antitrypsin 과 transthyretin 유전자의 promoter 에결합하는전사조절인자로처음알려졌으며간, 췌장, 소장, 폐등에발현 28

되어있는 100 개이상의유전자가 HNF3 에대한결합부위를갖고있다. HNF3 은 α,β,γ 와같이세종류로되어있는데이중 HNF3β, HNF3γ 가전사활성에중요한역할을한다.HNF3 은간, 췌장, 소장의분화와체내대사조절등에중요한역할을하는것으로알려졌다. 34 흰쥐의배아줄기세포를이용하여수행한연구결과에의하면 HNF3 이배아줄기세포의간세포로의분화및간세포에서의 organicanion transporting peptide 1(oatp1),mrp1,mrp2,mrp3,bilirubin uridine glucuronosyltransferase(ugt1a1) 의발현에반드시필요하다는것이밝혀졌다. 35 몇몇선행연구에의하면 HNF3 은 duck hepatitis B virus majorsurface antigen promoter,fibrinogen β promoter 등의활성에도중요한역할을하는것으로알려졌다. 36, 37 HNF3 이흰쥐의 α -fetoproteinpromoter 의활성을억제한다는연구결과도있어 HNF3 이유전자의종류에따라향상또는억제작용둘다할수있음을알수있다. 38 하지만아직까지 MRP2 의전사에있어서 HNF3 의역할에관해서는알려진바가없다. 본연구에서는약물로인한간독성에취약성을줄수있는 MRP2 의유전자변이를밝혀냈다. 즉 AT 일배체형은 wild type 일배체형에비해 promoter 활성이감소하기때문에, 그리고 (-)C 일배체형은 wild type 일배체형에비해 promoter 활성이떨어질뿐아니라담즙산에의한 promoter 활성증가도 wild type 일배체형에비해감소하기때문에이들일배체형을갖는경우약물이나담즙산의담즙관으로의배출이정상보다감소할것이다. 본연구결과 MRP2 유전자는독성간염과관련성이높으며특히변이에따른 promoter 의활성감소가발병에중요한결정인자임을알수있었다. 29

Ⅴ. 결론 본연구에서는약물수송체의유전자변이와독성간염발병간의상관성여부를밝히기위해 110 명의정상인과 94 명의독성간염환자에서 MDR1,MRP2,MRP3 의유전자변이를분석하였다. 각유전자변이의통계적분석과기능측정을통해다음과같은결과를얻었다. 1. 독성간염환자의 61% 가 간세포형 독성간염형태를보였으며대부분한약및한약재나건강보조식품에기인한것이었다. 간세포형 과 담즙정체형 / 혼합형 독성간염환자모두 50 대에서가장많았다. 간세포형 독성간염환자는여자가많은반면 담즙정체형 / 혼합형 독성간염환자는남녀비율이비슷하였다. 2. 각각 14 개,16 개의 MDR1,MRP3 유전자변이를발견하였으나 이중정상인과환자간에통계적으로유의한빈도차이를보이 는변이는없었다. 3. MRP2 유전자의경우일배체형을구성한결과 간세포형 독성간염환자와 담즙정체형 / 혼합형 독성간염환자에서각각 1개의일배체형이통계적으로정상인과유의한빈도차이를보였고이는 MRP2 유전자의 promoter 부위의변이때문임을알수있었다. 4. 간세포형 독성간염환자에서유의한빈도차이를보인 AT 일배체형은 wild type 일배체형에비해 promoter 활성이감소하 였다. 5. 담즙정체형 / 혼합형 독성간염환자에서유의한빈도차이를보 30

인 (-)C 일배체형은 wild type 일배체형에비해 promoter 활성이감소하였고,chenodeoxycholicacid 와같은간독성약물을처리한후의활성증가정도도 wild type 일배체형에비하여감소하였다. 본연구결과 MRP2 유전자는독성간염과관련성이높으며특히변 이에따른 promoter 의활성감소가발병에중요한결정인자임을알 수있었다. 31

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Abstract eneticvariationandfunctionalchangeofdrug transportersin Korean JiHaChoi DepartmentofMedicalScience TheraduateSchool,YonseiUniversity (Directedby ProfessorKyung HwanKim) The genetic diference in drug metabolizing enzymes and drug transporterscausesthevariabledrug responseto thesamekind of and dose of drugs. To examine its correlation with the toxic hepatitis,the genetic variation ofmdr1,mrp2,and MRP3,which are known to be importantdrug transporters,and their functions were investigated in toxic 94 hepatitis patients and 110 healthy volunteers. enetic analysis showed thatmrp2 haplotypes have a statistical significancein theirfrequenciesbetween thetoxichepatitispatients and the healthy volunteers. We could infer that the genetic variations in the promoter region might have an efect on the function of the MRP2. To examine this hypothesis, we did luciferase assay for the genetic variations in the promoter region and we found thatthe function ofat and (-)C haplotype was significantly decreased in hepatocelular type toxic hepatitis 38

and cholestatic/mixed type toxic hepatitis patients compared with that of wild-type haplotype. Especialy, we also found chenodeoxycholic acid which can induce hepatotoxicity less increased the promoteractivity of(-)c haplotype than thatof wild-typehaplotype. When the promoter activity in MRP2 is decreased,itcould be more dificultto secrete drugs and bile acid into bile duct.this could bethereason why thesamedrug hasmoretoxicefects on theliverintoxichepatitispatientsthanhealthyvolunteers. These results showed that MRP2 is closely related to toxic hepatitisand especialy thedecreased activity ofmrp2 promoteris animportantpredisposing factorofit. Key Words : MDR, MRP, genetic variation, toxic hepatitis, haplotype, promoter 39