Journal of Korean Medicine Rehabilitation Vol. 25 No. 1, January 2015 pissn 1229-1854 eissn 2288-4114 Original Article 인동등과봉독약침이 Adjuvant 투여로유발된류마토이드병태모델에미치는실험적연구 배명현 염승룡 김진희 권영달원광대학교한의과대학한방재활의학과교실 Experimental Study of Lonicerae Caulis and Bee-venom Acupuncture on the Rheumatic Pathologic Model Induced by Adjuvant in Rats Myung-Hyun Bae, K.M.D., Seung-Ryong Yeam, K.M.D., Jin-Hee Kim, K.M.D., Young-Dal Kwon, K.M.D. Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Won-kwang University 본연구는 2013 년원광대학교교내지원에의해서수행되었습니다. RECEIVED December 29, 2014 ACCEPTED January 16, 2015 CORRESPONDING TO Young-Dal Kwon, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Won-Kwang University, 543-8, Juwol 1-dong, Nam-gu, Gwangju 503-310, Korea TEL (062) 670-6452 FAX (062) 670-6767 E-mail kwonyd@wonkwang.ac.kr Copyright 2015 The Society of Korean Medicine Rehabilitation Objectives This study was carried out to investigate the experimental effects of Lonicerae Caulis and Bee-venom Acupuncture in Yanglingquan ( 陽陵泉, GB34) that have clinical efficacy in the Rheumatoid Arthritis. Methods Materials of present study are Lonicerae Caulis Extracts (LCE), Bee-Venom Acupuncture (BVP), Sprague-dawley rats (250 g or so, ), and various kinds of needing experimental studies. We measured several experimental items of the rats with the arthritis induced by Freund's complete adjuvant (0.2 ml/kg), such as body weight, rate of paw edema, analgesic effect by hot plate method, WBC, TNF-α cytokine and IL-10 cytokine. Rats were divided into four groups; Normal group that was treated with normal saline 1.0 ml (o.p) and 15 μl/kg (GB34) to normal rats, Control group that was treated with normal saline 1.0 ml (o.p) and 15 μl/kg (GB34) to pathologic model rats induced by Freund's complete adjuvant 0.2 ml/kg, Experimental group A that was treated with LCE 1.0 ml (o.p) and normal saline 15 μl/kg (GB34) to pathologic model rats induced by Freund's complete adjuvant 0.2 ml/kg and Experimental group B that was treated with LCE 1.0 ml (o.p) and BVP 15 μl/kg (GB34) to pathologic model rats induced by Freund's complete adjuvant 0.2 ml/kg, and the experiment took over after 28 days. The results were analysed using SPSS for windows 12.0. Results Experimental group A showed the increase in body weight, paw licking times and IL-10 cytokine compared to Control group. Also it was decreased in rate of paw edema, WBC, and TNF-α cytokine compared with Control group. Experimental group B showed the increase in body weight, paw licking times, and IL-10 cytokine compared to Control group, and showed the decrease in rate of paw edema, WBC and TNF-α cytokine compared to Control group. Especially TNF-α cytokine and rate of paw edema were accepted statistical significance compared with Control group. Conclusions It is suggested that Lonicerae Caulis (o.p) and Bee-venom Acupuncture (GB34) can be used in the treatment of rheumatoid arthritis. (J Korean Med Rehab 2015;25(1):17-26) Key words Lonicerae Caulis, Bee-venom Acupuncture, Yanglingquan, GB34, Rheumatoid Arthritis, Freund's complete adjuvant www.e-jkmr.org 17
배명현 염승룡 김진희 권영달 서론»»» 류마토이드관절염 (rheumatoid arthritis) 은가장흔한류마티스질환이다. 주로 20 40 세사이에발병하며만성적이고간헐적인관절염증을나타낸다. 류마토이드관절염에걸린관절에는 CD4와 CD8 T세포, B세포, 림프구, 형질세포, 호중구및대식세포등의백혈구가관절활액막에침윤한다. 활성화된자가면역 CD4 T세포는대식세포를활성화시켜염증이일어난활액막에염증전구사이토카인인 TNF-α, IL-1, IL-6 및 IL-7을분비하며, 이는조직파괴를더욱증가시킨다. 관절내의염증세포에서만들어진단백질분해효소와아교질분해효소가연골과인대나힘줄과같은지지구조물, 그리고궁극적으로뼈를손상시켜관절의변형과강직을초래한다 1). 한의학에서風寒濕熱의邪氣가經絡으로침입하거나關節에응체됨으로써血氣運行을저해하여肌肉, 筋骨, 關節에痲木, 重着, 酸楚, 疼痛, 腫脹, 屈伸不利가일어나는병을骨關節의痺症이라하며이는현대의류마토이드관절염의임상증상과유사하다 2). Adjuvant 유발관절염은열처리된 acid-fast bacilli, mineral oil, emulsifying agent를섞어 complete Freund's adjuvant를쥐에주사하여만드는관절염으로, 류마토이드관절염및만성염증성통증에관한실험에널리쓰이고있다 3). 인동등은淸熱解毒藥중하나로인동과 (Caprifoliaceae) 에속한다년생半常綠纏繞灌木인인동 (Lonicera japonica Thunb.) 의莖枝이며, 淸熱解毒疏風通絡의效能을가지며, 經絡을통하게하는작용이있어經絡에風熱을없애止痛시켜風熱痺痛과關節紅腫熱痛등經絡이不舒하여된證을치료하는데상용하므로 4), 저자는류마토이드관절염병태모델에인동등이효과가있을것으로사료되어경구투여약물로선정하였다. 관절염치료법의하나인봉독약침요법은꿀벌 (Apis mellifera) 의독낭에들어있는독을인위적으로추출, 정제하여질병과유관한부위및경혈에주입함으로써자침의효과와봉독이지니고있는생화학적약리작용을질병의치료에이용하는요법이다 5). 足少陽膽經에속한양릉천혈은膝關節炎, 膝關節痛, 下肢麻木不伸, 下脚痛, 筋痙攣등의主治를가지며 6), 김등 7) 이수행한문헌고찰에의하면류마토이드성슬관절염에 양릉천혈이예로부터가장많이사용되었다고하였다. 이에저자는류마토이드관절염에효과가있을것으로기대되는인동등추출물의경구투여와양릉천혈에봉독약침을시술하는것에관한실험적연구로병행치료효과를규명코자하였다. 따라서저자는 Freund's complete adjuvant 시약을백서에투여하여류마토이드관절염을유발시킨후, 인동동추출물만을투여하였을때와양릉천에봉독약침을병용시술하였을때나타나는체중의변화, 부종율억제및진통효과, WBC 변화그리고혈청내염증성사이토카인인 TNF-α의변화및항염증작용을가진 IL-10의변화를관찰하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법»»» 1. 재료 1) 약물본연구에사용된인동등 (Lonicerae Caulis) 8) 은인동과에속한다년생半常綠纏繞灌木인인동 (Lonicera japonica Thunb.) 의莖枝로가을과겨울에채취하여曬乾한것으로 옴니허브에서구입하여사용하였다. 2) 동물본연구에서는 Sprague-dawley 계흰쥐 (250±10g, 수컷 ) 를 1주일이상적응시킨후실험에적용하였다. 사육실의온도는 20±3 o C 하였고, 습도는 55±5% 를유지하였으며, 명암은 12시간주기로조절하였다. 고형 pellet 사료 ( 등록성분량 : 조단백질 22.1% 이상, 조지방 3.5% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 항생제ㆍ삼양프리믹스-무첨가 1.3%) 와물을자유로이섭취하게하였다 ( 동물실험승인번호 : 2014-05-01-02). 3) 약침액본연구에사용한봉독약침액은원광대광주한방병원에서희석된약침액을공급받아사용하였다. 봉독은벌을전기자극하여채집가공한건조봉독 ( 유밀농원, 한국 ) 을정선하여멸균생리식염수 ( 대한약품공업주식회사, 한 18 J Korean Med Rehab 2015;25(1):17-26
인동등과봉독약침이 Adjuvant 투여로유발된류마토이드병태모델에미치는실험적연구 국 ) 100 cc에 10,000:1 (0.01% 환산 ) 로희석하고밀봉한봉독액을사용하였다. 4) 시약및기기관절염유발에사용된시약은 Freund's complete adjuvant (Sigma F5881, USA), 사이토카인을측정하기위한시약은 rtnf-α ELISA kit (Biosource, CA, U.S.A.) 와 ril-10 ELISA kit (Biosource, CA, U.S.A.) 를사용하였으며, 기기는 Plethysmometer (7150 UGO Basile Italy, Digital), Hot plate (DS37), Hema Vet 5 (Italy), Basic (70VB0358, SECOMAM, France), Balancs (E-210DS) 등을사용하였다. 2. 방법 1) 검액의조제인동등 (Lonicerae Caulis) 400.0 g을 1,500 ml 증류수와함께상온에서 100 o C 2시간동안전탕한후, 전탕액을 1,500 rpm으로 30분간원심분리하였다. 그후감압농축기 (Rotary vacuum evaporator, EYELA Co., Japan) 를이용하여 100 ml로농축한다음동결건조하여인동등건조분말 (Lonicerae Caulis extracts, LCE) 31.2 g을얻었다. 2) 약침액의희석봉독약침 (bee venom acupuncture, BVP) 을개봉한후, 생리식염수에 1/10,000 의농도로희석하여사용하였다. 희석된약침액은 0.22 mm syringe filter (BD, U.S.A.) 로 filtering하여사용하였다. 3) 혈위혈위는양릉천 (GB34) 에해당되는상응부위 9) 로선정하였다. GB34 에상응하는부위는슬관절하 1 寸에해당하는부위로비골소두전하방함몰된곳이다. 4) 류마토이드병태모델유발병태모델유발은 Freund's complete adjuvant 시약 0.2 ml/kg 를흰쥐의우측뒷다리발바닥부위에주입하고 14일이경과한후에발적, 부종이인정된흰쥐만을선정하여실험에사용하였다. 5) 실험군분류및검액투여 실험군은정상군 (Nomal group), adjuvant 관절염이유발된대조군 (Control group), adjuvant 관절염유발후인동등추출물을경구투여하고생리식염수를주입한실험군 A (Experimental A), adjuvant 관절염유발후인동등추출물을경구투여하고봉독약침을주입한실험군 B (Experimental B) 로총 4개의군으로구분하였다. 각실험군은무작위로 8마리씩분류하여, 정상군과대조군은연구개시 14일후부터 14일동안매일 1회생리식염수 1.0ml을경구투여하면서 GB34부위에생리식염수 15 μl/kg을주입하였다. 실험군 A는연구개시 14일후부터 14일동안매일 1회 LCE 500 mg/kg 1.0 ml을경구투여하면서 GB34부위에생리식염수 15 μl/kg 을대조군과동일한방법으로주입하였고, 실험군 B는연구개시 14일후부터 14일동안매일 1회 LCE 500 mg/kg 1.0 ml과 GB34에 BVP 15 μl/kg 을주입하였다. 단, 혈액학적변화를관찰하기위해모든동물들을하루전에절식시켰다. 6) 체중변화측정 체중의변화는실험개시, adjuvant 시약처치 14일후병태모델유발을확인한다음, 그리고연구종료시동물의체중을전자저울을이용하여측정하였다. 7) 부종억제효과측정 Winter 10) 등의방법을이용, Plethysmometer로측정한후부종이유발되지않은좌측뒷다리발바닥체적과의차로산출하였다. 부종율 (%)= 우측뒷다리발바닥체적 좌측뒷다리발바닥체적 ( ) 100 우측뒷다리발바닥체적 8) Hot plate method 에의한진통효과측정 열판 ( 가로 32 cm, 세로 27 cm, 높이 16 cm) 의온도가 55±0.5 o C가되도록하여정상군, 대조군, 실험군 A, 실험군 B를열판에놓은다음처음회피반응시간을측정하여진통효과를관찰하였다. www.e-jkmr.org 19
배명현 염승룡 김진희 권영달 9) 혈액학적변화측정부종과진통실험을마친후흰쥐를우레탄마취하에서심장채혈한다음채혈한혈액중 1.0 ml은 Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)-2K bottle에담아잘혼합시킨후, Fonio법 11) 에준하여 Hema Vet 5로 WBC를측정하였다. 10) Tumor necrosis factor (TNF)-α 측정상기방법과같이혈청을분리한후혈청내에서생성되는 TNF-α를 rtnf-α ELISA kit를이용하여측정하였다. 96 well plate에 rtnf-α standard diluent buffer 50 μl를넣은다음, 나머지 well에혈청과 control (high, low) 을각각 50 μl씩분주한후 standard diluent buffer 50 μl를넣었다. 이후각 well에 biotin-labeled anti-rtnf-α 50 μl를넣고실온에서 90분동안 incubation 한다음 washing buffer 로 4회세척하였다. 이후희석하여준비해놓은 streptavidin-hrp 를각 well에 100 μl씩분주한다음다시실온에서 45분동안 incubation 한후 washing buffer 로 4회세척하였다. 그다음 stabilized chromogen을각 well에 100 μl씩분주한후빛이차단된실온에서 30분동안 incubation 한후 stop solution 을각 well에 100 μl씩분주한다음 microplate reader 를이용하여 450 nm 파장에서측정하였다 12,13). 11) Intereukin (IL)-10 측정상기방법과같이혈청을분리한후혈청내에서생성되는 IL-10을 ril-10 ELISA kit를이용하여측정하였다. 96 well plate에 standard diluent buffer 100 μl씩분주한후나머지 well에혈청과 control (high, low) 을각각 50 μl씩분주한다음 standard diluent buffer 50 μl를넣었다. 이후각 well에 biotin-labeled anti-ril-10 50 μl를넣고실온에서 2시간 incubation 한다음 washing buffer 로 4회세척하였다. 이후희석하여준비해놓은 streptavidin-hrp를각 well에 100 μl씩분주한다음다시실온에서 30분동안 incubation 한후 washing buffer 로 4회세척하였다. 그다음 stabilized chromogen 을각 well에 100 μl씩분주한후빛이차단된실온에서 30분동안 incubation한후 stop solution을각 well에 100 μl씩분주한다음 microplate reader 를이용하여 450 nm 파장에 서측정하였다 14,15). 3. 통계처리수합된데이터의통계처리는 SPSS 12.0 ver. for windows program 을사용였으며, 3개이상의군은분산분석 (ANOVA) 을사용하여통계적으로유의한경우사후검정 (post hoc) 은 Tukey 방법을시행하였고, 2개의군간의비교는 independent sample t-test 를사용하였으며, p-value 가 0.05 미만인경우유의한것으로인정하였다. 결과»»» 1. 체중변화에미치는효과류마토이드관절염 (rheumatoid Arthritis, RA) 병태모델에인동등추출물 (Lonicerae Caulis extracts, LCE) 과양릉천 (GB34) 에봉독약침 (Bee Venom acupuncture, BVP) 을병용투여하였을때변화되는체중을측정한결과다음과같았다. 연구개시전 229.6±2.80 g이었던정상군의체중은연구개시 2주후에 335.6±7.00 g으로증가하였고, 생리식염수 1.0 ml과 GB34 에생리식염수 15 μl/kg을 14일동안처리하였을때는 378.0±10.03 g으로연구개시전보다 64.64% 증가하였다. 연구개시전 232.0±1.28 g이었던대조군의체중은병태모델유발후에는 322.5±5.54 g으로증가하였고, 생리식염수 1.0 ml과 GB34 에생리식염수 15 μl/kg을 14일동안처리하였을때는 355.6±7.11 g으로연구개시전보다 53.3% 증가하였지만정상군에비해서는감소되었다. 연구개시전 231.8±1.88 g이었던실험군 A의체중은병태모델유발후에는 329.4±5.66 g으로증가하였고, LCE 500 mg/kg 과 GB34에생리식염수 15 μl/kg을 14일동안처리하였을때는 365.1±4.92 g으로연구개시전보다 57.5% 로대조군에비해서도증가하였다. 연구개시전 227.1±1.14 g이었던실험군 B의체중은병태모델유발후에는 330.3±3.85 g으로 33.7% 로증가하였고, LCE 500 mg/kg 과 GB34에 BVP 15 μl/kg을 14 일동안처리하였을때는 369.0±1.60 g으로연구개시 20 J Korean Med Rehab 2015;25(1):17-26
인동등과봉독약침이 Adjuvant 투여로유발된류마토이드병태모델에미치는실험적연구 전보다 62.2% 로대조군에비해서도증가하였다 (Fig. 1). 4. 백혈구수에미치는효과 2. 부종율에미치는효과류마토이드관절염병태모델에인동등추출물 (LCE) 과양릉천 (GB34) 에봉독약침 (BVP) 을병용투여하였을때변화되는부종율을측정한결과다음과같았다. 우측뒷다리발바닥체적과좌측뒷다리발바닥체적을비교한체적차를부종율로산정한결과, 정상군의부종율을 0% 라하였을때, 대조군의부종율은 54.80±1.62% 로증가하였다. 실험군 A의부종율은 51.62±1.57% 로대조군의부종율보다감소하였고, 실험군 B의부종율도 48.6549.79±1.53% 로대조군의부종율보다유의성 (p< 0.05) 있게감소하였다 (Fig. 2). 류마토이드관절염병태모델에인동등추출물 (LCE) 과양릉천 (GB34) 에봉독약침 (BVP) 을병용투여하였을때변화되는백혈구수를측정한결과다음과같았다. 정상군의 WBC는 5.14±0.47 ( 10 3 /μl) 이었지만대조군의 WBC는 6.67±0.23 ( 10 3 /μl) 로정상군에비해유의성 (p<0.05) 있게증가하였다. 그러나실험군 A와실험군 B의 WBC 는각각 6.34±0.46 ( 10 3 /μl) 와 5.42±0.20 ( 10 3 /μl) 로대조군의 WBC에비해감소하였다 (Fig. 4). 3. 진통에미치는효과 류마토이드관절염병태모델에인동등추출물 (LCE) 과양릉천 (GB34) 에봉독약침 (BVP) 을병용투여하였을때변화되는회피반응시간을측정한결과다음과같았다. 처음회피반응시간은정상군이 4.93±0.13 sec이었지만대조군에서는 3.35±0.27 sec로정상군의처음회피반응시간보다유의성 (p<0.05) 있게단축되었다. 그러나실험군 A의처음회피반응시간은 4.36±0.39 sec로, 실험군 B의시간도 4.80±0.09 sec로대조군에비해연장되었다 (Fig. 3). Fig. 2. Effects of LCE and BVP (GB34) on the Rate of Paw Edema in Rats Induced by Freund's Complete Adjuvant. *Statistically significant compared with Control (*p<0.05). Fig. 1. Effects of LCE and BVP (GB34) on the Body Weight in Rats Induced by Freund's Complete Adjuvant. Fig. 3. Effects of LCE and BVP (GB34) on the Paw Llicking Times in Rats Induced by Freund's Complete Adjuvant. + Statistically significant compared with Normal ( + p<0.05). www.e-jkmr.org 21
배명현 염승룡 김진희 권영달 5. TNF-α 양에미치는효과류마토이드관절염병태모델에인동등추출물 (LCE) 과양릉천 (GB34) 에봉독약침 (BVP) 을병용투여하였을때변화되는 TNF-α 양을측정한결과다음과같았다. 정상군의 TNF-α 양은 88.73±1.02% 이었지만대조군의 TNF-α 양은 100.00±1.62% 로정상군에비해유의성 (p<0.01) 있게증가하였다. 그러나실험군 A의 TNF-α 양은 97.38±1.96% 로대조군에비해감소하였고, 실험군 B의 TNF-α 양은 91.55±1.45% 로대조군의 TNF-α 양에비해유의성 (p<0.01) 있게감소하였다 (Fig. 5). 6. IL-10 양에미치는효과 고찰»»» 류마토이드관절염은원인불명의만성전신성질환이며, 말단관절을침범하는지속적인염증성활액막염으로대칭적으로분포하면서연골의파괴와골미란 (erosion) 을일으키고결국관절의변형을가져오는질환이다 16). 류마토이드관절염의국내유병률은보건복지부에서 2013년에발행한국민건강통계에따르면만30세이상기준으로약 2% 로남녀성비는남 : 여 =1.1:2.8 정도이며 17), 직접적인원인이아직규명되어있지는않지만, 환경적인요인과유전적소인이복합적으로작용하여관절염이발생하는것으로추정하고있다. 류마토이드관절염을치료하기위해아스피린과비스 류마토이드관절염병태모델에인동등추출물 (LCE) 과양릉천 (GB34) 에봉독약침 (BVP) 을병용투여하였을때변화되는 IL-10 양을측정한결과다음과같았다. 정상군의 IL-10 양은 115.10±2.62% 이었지만대조군의 IL-10 양은 100.00±1.06% 로정상군에비해유의성 (p <0.05) 있게감소하였다. 그러나실험군 A와실험군 B 의 IL-10 양은각각 107.35±1.37% 와 110.20±0.82% 로대조군의 IL-10 양에비해증가하였다 (Fig. 6). Fig. 5. Effects of LCE and BVP (GB34) on the TNF-α in rats induced by Freund's complete adjuvant. + Statistically significant compared with Normal ( ++ p<0.01, +++ p<0.001). *Statistically significant compared with Control (**p<0.01). Fig. 4. Effects of LCE and BVP (GB34) on the WBC in rats induced by Freund's complete adjuvant. + Statistically significant compared with Normal ( + p<0.05). Fig. 6. Effects of LCE and BVP (GB34) on the IL-10 in rats induced by Freund's complete adjuvant. + Statistically significant compared with Normal ( + p<0.05). 22 J Korean Med Rehab 2015;25(1):17-26
인동등과봉독약침이 Adjuvant 투여로유발된류마토이드병태모델에미치는실험적연구 테로이드성소염제, 스테로이드, DMARD (disease modifying antirheumatic drugs), 면역억제제, 사이토카인억제제등을사용하고있으며 18), 이들약재의목적은 1) 만성적으로진행하는염증현상을적절하게조절함으로서, 2) 결과적으로임상적증상인부종과통증을완화시키고, 3) 골과연골의손상과파괴를억제하여관절의변형과신체적인불구를방지하고 4) 삶의질을개선함으로써사회복귀를촉진하며, 5) 전신적인염증현상을조절하는것이라고할수있다 19). 한의학에서痺란閉, 즉막혀서잘통하지않는다는뜻이며, 骨關節의痺症은風寒濕熱의邪氣가인체의營衛失調, 腠理空疎혹은正氣虛弱한틈을타고經絡으로침입하거나關節에응체됨으로써血氣運行을저해하여肌肉, 筋骨, 關節에痲木, 重着, 酸楚, 疼痛, 腫脹, 屈伸不利, 심하면관절의강직성변형을초래하는병증의하나로, 비증의병인병리와임상증상은류마토이드관절염과유사하다 2). 류마토이드관절염에대한연구는유발유전자나질병악화물질의단백질구조가밝혀지고새로운면역조절물질이발견되면서, 점차면역학적, 유전학적인논문들이주종을이루고있는실정으로 20), 최근한의학에서는박 21), 설 22), 손 23) 의논문등에서처럼면역학적관점의논문들이발표되고있다. 본실험에서사용된병태모델유발물질은 adjuvant 시약으로 T세포매개자가면역성관절염 (T cell-mediated autoimmune arthritis) 병태모델을유발하며, 이는류마토이드관절염 (RA) 이나염증질환에있어항염증약물을실험하기위해사용된다 24). 인동등은淸熱解毒藥중하나로인동과 (Caprifoliaceae) 에속한다년생半常綠纏繞灌木인인동 (Lonicera japonica Thunb.) 의莖枝이며, 淸熱解毒疏風通絡治溫病發熱熱毒血痢癰腫瘡瘍風濕熱痺關節紅腫熱痛의效能主治를가지며, 성미가甘寒하여淸熱解毒시키는작용이있고, 그解毒작용이금은화에미치지못하나, 經絡을통하게하는작용이있어經絡에風熱을없애止痛시키므로風熱痺痛과關節紅腫熱痛등經絡이不舒하여된證을치료하는데상용한다 4). 최근의연구에따르면면역조절작용 25,26), 혈압하강작용 27) 등이보고되었으나인동등의류마토이드관절염에대한효과에대해서는보고되지않았기에인동등을경구투여약물로선정하였다. 봉독약침요법은살아있는꿀벌 (Apis mellifera) 의독낭 에들어있는독을인위적으로추출, 정제하여질병과유관한부위및경혈에주입함으로써자침의효과와벌독이지니고있는생화학적약리작용을질병의치료에이용하는요법을말한다 5). 봉독약침에대해많은연구가이루어지고있으며, 소염진통에대한연구 28,29), 신경보호효과 30), 항암효과 31,32) 등이보고되었으며, 임상연구 33-35) 도또한활발하게이루어지고있다. 陽陵泉 (GB34) 은足少陽膽經에속하고 36) 膝關節炎, 膝關節痛, 下肢外側痛, 筋病下肢筋虛弱, 下肢麻木不伸, 下脚痛, 筋痙攣등의主治를가진다 6). 김등 7) 에의하면류마토이드성슬관절염에陽陵泉穴이예로부터가장많이사용되었다고하여陽陵泉穴을약침주입혈위로선정하였다. 본연구는임상에서류마토이드관절염 (RA) 에사용될것으로기대되는인동동 (LCE) 과양릉천 (GB34) 에봉독약침 (BVP) 의효능을실험적으로구명하고자 adjuvant 시약으로류마토이드병태모델을유발시킨후 LCE만을투여하였을때와 GB34에 BVP를병용시술하였을때변화되는체중, 부종억제율, 회피반응시간, WBC 그리고혈청내친염증사이토카인과항염증사이토카인변화를관찰하였다. 본실험결과 adjuvant 시약을이용하여류마토이드관절염을유발한대조군의체중증가가 53.3% 로류마토이드관절염을유발하지않은정상군의체중증가의 64.64% 에비해낮은증가율을보였고, 관절염유발로야기된염증으로인한스트레스등으로체중이감소하는경향을보였다 37). 그에반해나머지실험군 A, 실험군 B 모두체중증가가 57.5%, 62.2% 로대조군보다증가하였다. 부종은모세혈관이확장되고, 혈류량이증가하게되며, 모세혈관의투과성이커짐으로써혈장성분이이동되고백혈구가삼출되어세포간질액의용적이늘어나게되어발생한다 38,39). 본실험결과우측뒷다리발바닥체적과좌측뒷다리발바닥체적을비교한체적차를부종율로계산한결과실험군 A가 51.62±1.57%, 실험군 B가 48.65±1.53% 로실험군 A, B 모두에서대조군의 54.80± 1.62% 부종증가율보다억제되었고, 특히인동등추출물경구투여와함께봉독약침을시술한실험군 B의부종율이대조군보다유의성 (p<0.05) 있게억제되었다. Lewis 는염증이증가하면부종이증가하므로부종의억제를평가함으로써간접적으로소염효과를확인할수있다고하였 www.e-jkmr.org 23
배명현 염승룡 김진희 권영달 다 40). 이는본시술이 adjuvant 로유발된관절염에의해발생한부종에대해부종억제효과가있음을나타내주는결과라사료된다. 진통효과측정에서대조군의처음회피반응시간이 3.35±0.27 sec로정상군의 4.93±0.13 sec보다유의성있게단축되었는데 (p<0.05), 이는관절염이통증과민을유발한다는보고와일치하며 41), 실험군 A가 4.36±0.39 sec, 실험군 B가 4.80±0.09 sec로두실험군모두처음회피반응시간은대조군보다연장되었다. 이는인동등경구투여와봉독약침시술로인해류마토이드관절염유발로야기된부종이감소하고쥐의발바닥에서느껴지는열감도가감소하여진통시간이연장된것으로사료된다. WBC측정에서대조군의 WBC 는 6.67±0.23 ( 10 3 /μl) 로정상군의 5.14±0.47 ( 10 3 /μl) 에비해유의성 (p <0.05) 있게증가하였다. 이는류마토이드관절염을유발한대조군이정상군에비해유의하게염증이증가하였음을나타내준다. 이에반해실험군 A와실험군 B의 WBC는각각 6.34±0.46 ( 10 3 /μl) 와 5.42±0.20 ( 10 3 /μl) 로대조군의 6.67±0.23 ( 10 3 /μl) 에비해감소하였다. 이는인동등경구투여와봉독약침시술로인해류마토이드관절염유발로야기된염증반응이감소하여백혈구수치가감소한것으로사료된다. TNF-α는면역반응의발현과조절에있어중요한역할을담당하는친염증성사이토카인으로 42) 류마토이드관절염환자의활막조직에서 TNF-α의 mrna 와단백질발현이보고되었고 43,44), In Vitro실험에서 TNF-α는연골과뼈의흡수를촉진됨이보고되었으며 45,46), 류마토이드관절염환자에항 TNF-α 항체를투여한경우방사선검사상관절파괴의진행이억제됨이보고되어 47) TNF-α가류마토이드관절염에서병리적으로중요한역할을함을알수있다. 본실험결과류마토이드병태모델을유발한대조군의 TNF-α 양이 100.00±1.62% 로정상군의 TNF-α 양인 88.73±1.02% 에비해유의성 (p<0.01) 있게증가하였다. 실험군 A의 TNF-α 양은 97.38±1.96% 로대조군에비해감소하였고, 실험군 B의 TNF-α 양은 91.55± 1.45% 로대조군의 TNF-α 양에비해유의성 (p<0.01) 있게감소하였다 (Fig. 5). 이를보아인동등경구투여와봉독약침병용시술이인동등단독경구투여보다류마토이드관절염모델치료에더효과적일것이라사료된다. IL-10은 18.5 kda의 160개아미노산으로이루어진강 력한항염증작용을가진사이토카인으로자가분비 (autocrine) 양상으로음성되먹임 (negative feedback) 작용을함으로써자체생성을조절하게되며, 생성된 IL-10은염증을일으키는데관여하는사이토카인인 IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, TNF, G-CSF, GM-CSF 그리고 IL-8과 MIP-1α 와같은케모카인의합성을저해하여항염증작용을나타낸다 48). 여러관절염동물모델에서 IL-10을치료목적으로투여한경우 TNF-α, IL-6, IL-1β의생성이감소되고관절염의활성이억제되는소견을보였다 49,50). 본실험결과대조군의 IL-10의양은 100.00±1.06% 으로정상군의 IL-10의양 115.10±2.62% 보다유의성있게 (p<0.05) 감소하였고, 실험군 A는 107.35±1.37%, 실험군 B의 IL-10의양은 110.20±0.82% 로대조군보다증가하여인동등경구투여와양릉천혈의봉독약침의병행시술이염증반응에대해항염증효과가있을것이라사료된다. 이상의실험결과들로보아인동등 (LCE) 경구투여와양릉천 (GB34) 에봉독약침 (BVP) 을시술하게되면치료적중재를전혀하지않은채 adjuvant 시약으로류마토이드관절염만을유발시킨대조군에비해체중증가와함께부종억제, 진통효과뿐만아니라항염증효과, 친염증사이토카인의감소및항염증사이토카인이증가하는것으로나타났다. 특히, 부종율과 TNF-α의감소가인동등 (LCE) 경구투여와양릉천 (GB34) 봉독약침 (BVP) 의병행시술에서유의성있는결과를나타낸것으로보아향후인동등경구투여와양릉천봉독약침이각각단독으로시행되었을때와같이쓰였을때의효능에대한비교에대한추가적인연구가필요할것으로생각된다. 이를바탕으로향후임상연구를통한검증을한다면임상에도움이될것으로사료된다. 결론»»» Adjuvant 시약으로유발된류마토이드관절염병태모델에미치는효과를알아보기위하여인동등추출물을투여한실험군 A와인동등추출물투여와함께양릉천에봉독약침을병용시술한실험군 B의체중의변화, 부종억제율, 처음회피반응시간변화, 혈액내 WBC 변화그리고혈청내사이토카인의변화등을관찰한결과다음 24 J Korean Med Rehab 2015;25(1):17-26
인동등과봉독약침이 Adjuvant 투여로유발된류마토이드병태모델에미치는실험적연구 과같은결론을얻었다. 1. 실험군 A와실험군 B의체중은연구종료시대조군의체중보다증가하였다. 2. 실험군 A와실험군 B의부종율은대조군에비해감소하였고, 특히실험군 B의부종율이유의성있게억제되었다. 3. 실험군 A와실험군 B의처음회피반응시간은대조군에비해연장되었고, WBC도대조군보다감소하였다. 4. 실험군 A와실험군 B의 TNF-α의양은대조군에비해감소하였고, 특히실험군 B는대조군에비해유의성이인정되었다. 5. 실험군 A와실험군 B의 IL-10의양은대조군보다증가하였다. 이상의결과, 인동등과봉독약침이류마토이드관절염에유의한효과를나타낼것으로기대되며, 이를바탕으로향후임상연구를통하여검증을한다면임상에도움이될것으로사료된다. 참고문헌»»» 1. Peter Parham. The Immune System. Third edition. 서울 : 라이프사이언스. 2011:399. 2. 한방재활의학과학회. 한방재활의학. 서울 : 군자출판사. 2008:83. 3. William N. Kelly. Textbook of rheumatology. 2nd. USA W.B:Saunders company. 1985:884. 4. 한의과대학본초학출판위원회. 본초학. 서울 : 도서출판영림사. 2007:265-6. 5. 대한약침학회학술위원회. 약침학. 서울 :ELSEVIER KOREA L.L.C.. 2008:167. 6. 전국한의과대학침구경혈학교수. 침구학 ( 상 ). 경기도 : 집문당. 1991:648-9. 7. 김무진, 윤종화, 김경호, 이승덕, 김갑성. 류마티스성슬관절염의침구치료에관한문헌고찰. 대한침구학회지. 2005; 22(1):191-201. 8. 전국한의과대학본초학교수공편저. 本草學. 서울 : 영림사. 2012:265-6. 9. 전국한의과대학침구 경혈학교수편저. 침구학 ( 상 ). 서울 : 집문당. 1991:648-9. 10. 韓國藥學大學協議會藥物學分科會. 藥物學毒性學實驗. 서울 : 신일상사. 1993:135. 11. 金井泉. 臨床檢査法提要. 서울 : 高文社. 1984:.217-31,389-92,432-37. 12. Stepaniak JA, Gould KE, Sun D, Swanborg RH. A comparative study of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis and DA rats. J. Immunol. 1995:2762-9. 13. Rivera DL, Olister SM, Liu X, Thompson JH, Zhang XJ, Pennline K, Azuero R, Clark DA, Miller MJ. Interleukin-10 attenuates experimental fetal growth restriction and demise. FASEB J. 1998;12(2):189-97. 14. Okura, Y, Takeda K, Honda S, Hanawa H, Watanabe H, Kodama M, Izumi T, Aizawa Y, Seki S, Abo T. Recombinant murine interleukin-12 facilitates induction of cardiac myosin-specific type 1 helper T cells in rats. Circ Res. 1998;82(10):1035-42. 15. Lobell A, Weissert R, Storch MK, Svanholm C, de Graaf KL, Lassmann H, Andersson R, Olsson T, Wigzell H. Vaccination with DNA encoding an immunodominant myelin basic protein peptide targeted to Fc of immunoglobulin G suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Exp. Med. 1998;187(9):1543-8. 16. 대한내과학회해리슨내과학편집위원회. HARRISON'S 내과학. 16th edition vol.2. 서울 : 도서출판 MIP. 2006:2148. 17. 문형표, 양병국. 2013 국민건강통계국민건강영양조사제 6 기 1 차년도 (2013). 보건복지부건강정책과. 2014:703 18. 의학교육연수원. 가정의학. 서울 : 서울대학교출판부. 1998:837. 19. 유대현. 류마티스관절염의최신치료경향. 대한정형외과학회지. 2010;45(6):419-25. 20. 김영태, 이재동, 이윤호. 최근 RA 와관련된임상및실험논문의경향. 대한침구학회지. 2002;19(5):190-4. 21. 박진상, 한명금, 임양의, 이수경, 신병철, 권영달, 송용선. 생체외류마토이드관절염실험모델에서청열사습탕의효과. 한방재활의학과학회지. 2004;14(2):29. 22. 설재욱, 신미숙, 최진봉. 마황강활탕이 Adjuvant 관절염에미치는실험적효과. 한방재활의학과학회지. 2005;15(2):55. 23. 손동우, 김순종, 서일복. 趁痛散이흰쥐의 Adjuvant 유발관절염및척수내 C-fos 발현에미치는영향. 한방재활의학과학회지. 2005;15(3):2 24. Van Eden W, Wagenaar-Hilbers JP, Wauben MH. Adjuvant Arthritis in the Rat. Current Protocols in Immunology. 2001;Chapter 15:Unit 15.4. 25. 이영철권택현옥인수서창우김양진노성수서영배. 인동등 ( 忍冬藤 ) 의면역조절작용 ( 免疫調節作用 ) 에대한실험적 ( 實驗的 ) 연구 ( 硏究 )(II) - 인동등 ( 忍冬藤 ) 각 fraction 이 mice 비장세포에서 cytokines 생성에미치는영향. 대한본초학회지. 2005;20(4):141-9. 26. 하태광이영철. Chlorogenic acid 및인동등 ethyl acetate 분획의비장및흉선세포에서의유전자발현분석을통한면역조절효과. 대한본초학회지. 2011;26(2):1-10. 27. 유윤조. 忍冬藤전탕액이자연발증고혈압백서의혈압에미치는영향. 동의생리병리학회지 2001;15(6):993-7. 28. 서병관, 박동석, 백용현. Collagen-induced Arthritis Rat Model 에서염증성통증에대한봉독약침의진통효과및기전연구 : 5HT-3 & Muscarinic Cholinergic Mechanisms 에대한연구. 대한침구의학회지. 2011;28(1):37-44. 29. 정인태, 백용현, 박동석, 최도영. 봉독약침이 collagen 유발관절염에미치는진통효과및그기전연구. 대한침구학회 www.e-jkmr.org 25
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