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The Korean Journal of Microbiology (2011) Vol. 47, No. 1, pp. 14-21 Copyright c 2011, The Microbiological Society of Korea 아미노 - 말단리보플라빈생성효소단백질의형광특성 김류련 이정환 남기석 고경원 이찬용 * 충남대학교생화학과 Spectrofluorometric Characteristics of the N-Terminal Domain of Riboflavin Synthase Ryu-Ryun Kim, Jeong-Hwan Yi, Ki Seok Nam, Kyung Won Ko, and Chan Yong Lee * Department of Biochemistry, Chungnam National University, Daejeon 305-764, Republic of Korea (Received February 17, 2011 / Accepted March 23, 2011) Riboflavin synthase catalyzes the formation of one molecule of each riboflavin and 5-amino-6- ribitylamino-2,4-pyrimidinedione by the transfer of a 4-carbon moiety between two molecules of the substrates, 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine. The most remarkable feature is the sequence similarity between the N-terminal half (1-97) and the C-terminal half domain (99-213). To investigate the structure and fluorescent characteristics of the N-terminal half of riboflavin synthase (N-RS) in Escherichia coli, more than 10 mutant genes coding for the mutated N-terminal domain of riboflavin synthase were generated by polymerase chain reaction. The genes coding for the proteins were inserted into pqe vector designed for easy purification of protein by 6X-His tagging system, expressed, and the proteins were purified. Almost all mutated N-terminal domain of riboflavin synthases bind to 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine and riboflavin as fluorescent ligands. However, N-RS C47D and N-RS ET66,67DQ mutant proteins show colorless, indicating that fluorescent ligands were dissociated during purification. In addition, most mutated proteins show low fluorescent intensity comparing to N-RS wild type, whereas N-RS C48S posses stronger fluorescent intensity than that of wild type protein. Based on this result, N-RS C48S can be used as the tool for high throughput screening system for searching for the compound with inhibitory effect for the riboflavin synthase. Keywords: fluorescence, lumazine, riboflavin, riboflavin synthase, vitamin B 2 Vitamin B 2 로널리알려진리보플라빈 (riboflavin) 은다양한종의세균, 곰팡이및녹색식물에서합성되지만, 동물들은합성할수없으므로이들로부터섭취해야한다 (11). 리보플라빈의생리적활성화된형태인 FMN (flavin mononucleotide) 과 FAD (flavin adenine dinucleotide) 는조효소로서, 호흡에관여하는여러가지 flavo-protein 등대사작용에서많은부분을차지하는산화- 환원작용에서전자운반체 (electron carrier) 의중요한역할을수행한다 (4, 11). 리보플라빈생합성과정의가장마지막단계에서작용하는리보플라빈생성효소 (riboflavin synthase) 는기질인두분자의 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine과결합후, 매우독특한자리옮김 (dismutation) 반응을거쳐 (Fig. 1), 한분자의리보플라빈과한분자의 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidinedione * For correspondence. E-mail: cylee@cnu.ac.kr; Tel: +82-42-821-5482; Fax: +82-42-822-7548 을만들어낸다 (5, 18, 19). 이때생겨난피리미딘유도체는다시리보플라빈생합성과정에재사용된다. 리보플라빈생성효소의활성화부위 (active site) 에는제공부위 (donor site) 와수용부위 (accepter site) 가존재한다 (4, 10). 두부위에각각한분자의 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine이결합되면, 제공부위의친핵성잔기에의하여효소반응이개시되며, 제공부위의 4-탄소단위 (4-carbon unit) 가수용부위로이동하여, 결과적으로제공부위에는 pyrimidine 유도체, 수용부위에는리보플라빈이생성된다 (1, 4)(Fig. 1). 대장균 (Escherichia coli) 리보플라빈생성효소의아미노- 말단도메인절반 (N-terminal domain half) 과카복시 -말단도메인절반 (C-terminal domain half) 의내부자체아미노산서열 (intra-molecular amino acid sequence) 은매우유사하다 (2, 3, 20). 아미노 -말단도메인 (N-RS) 의아미노산 1-97 잔기의서열과카복시- 말단도메인 (C-RS) 의아미노산 98-213 잔기의서

리보플라빈생성효소단백질의형광특성 15 Fig. 1. Reaction mechanism of riboflavin synthase. The first steps of the reaction mechanism proposed by Beach and Plaut (1), where XH and YH are hydrogen bond donors on the protein. Z is a nucleophile and A is a proton acceptor. 열을비교하면, 24개의아미노산이동일하며 20개의아미노산이유사하다 (Fig. 2). 따라서, 이효소는위상학적으로매우비슷한두개의도메인으로접히게되며 (10, 14), 두개의동일한기질이리보플라빈생성효소의기질로작용하므로기질은아미노 -말단도메인과카복시- 말단도메인에대해비슷한결합능력을가짐을예측할수있다. 리보플라빈생성효소를 X-선결정학방법으로규명한구조에서도아미노 -말단과카복시- 말단도메인의기질결합부위는위상학적으로근접한위치에서매우유사하게접히게된다 (10, 21). 이러한정보는각각의도메인에한분자씩의 6,7- dimetyl-8-ribityllumazine 기질이결합함을지지하지만 (5, 8), 이러한결과가아미노- 말단혹은카복시 -말단중어느쪽이공여부위혹은수용부위로작용하는지등에대한리보플라빈생성효소와 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine 사이의상호작용에관한중요한직접적인정보를아직도제시해주지못하고있다. 특이한점은, 단백질의 4차구조가동종삼량체 (homotrimer) 인리보플라빈생성효소과는달리 (2, 21), 아미노 -말단도메인의리보플라빈생성효소 (N-RS) 는동종이량체 (homodimer) 의상태로존재한다는점이다 (14, 21). 이논문에서는형광을띠는최소단위의형광단백질발굴의일환으로변이된아미노- 말단도메인의리보플라빈생성효소의단백질들의형광의관찰을통한리간드와의결합세기, 고속다중스크리닝법 (high-throughput screening system), 형광공명에너지전이 (fluorescence resonance energy transfer) 로서의응용가능성등을조사하고자대장균리보플라빈생성효소의아미노- 말단도메인의다양한돌연변이단백질을코드하는유전자들을중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction) 을활용한위치지정돌연변이 (site-directed mutagenesis) 를통하여증폭시킨후, pqe30 벡터에삽입한재조합플라스미드를제조하고, 발현시켜그단백질들을분리 정제하였다. 재료및방법시약및재료제한효소와 T4 DNA ligase는 New England Biolabs (USA) 제품을사용하였으며 DNA polymerase는 GeNet Bio (Korea) 제품을사용하였고, 프라이머들은 Genotech (Korea) 에합성을의뢰했다. 균주및플라스미드 E. coli XL-1 Blue는클로닝균주로, E. coli M15은단백질발현균주로사용되었다. 또한 pqe30 플라스미드 (QIAGEN, (A) (B) 1 10 20 30 40 MRGSHHHHHHGSIHMFTGIVQGTA KLVSIDEKPN FRTHVVELPD HMLDGLETGA 50 60 70 80 90 SVAHNGCCLTVTEINGNHVS FDLMKETLRI TNLGDLKVGD WVNVERAAKF SDEIGGH Fig. 2. (A) Amino acid sequence similarity between N-terminal and C-terminal half of riboflavin synthase (RS) from E. coli. Identical amino acid sequences are shown in shadowed typeface. (B) 6X-His-tagged N-RS amino sequences. The attached 6X-His tagged amino sequences from pqe30 are shown in bold. The boxed amino acids were changed to relevant amino acids by site-directed mutagenesis. The numbers are the position of amino acid from original N-terminal domain of riboflavin synthase.

16 Kim et al. Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this study Strains/Plasmids Relevant characteristics Source Strains E.coli XL-1 Blue E.coli M15[pREp4] Plasmids pqe30 Cloning strain Expression strain Stratagene QIAGEN Expression vector pern pnco113 containing the gene for the wild type N-terminal domain of E. coli riboflavin synthase Reference 3 pern-a43l pnco113 containing the gene for the A43L mutant N-terminal domain Reference 9 pern-c48s pnco113 containing the gene for the C48S mutant N-terminal domain Reference 9 pern-et66,67dq pnco113 containing the gene for the ET66,67DQ mutant N-terminal domain Reference 9 USA) 를클로닝과단백질발현벡터로사용했다 (Table 1). 배양액및배양조건 대장균 (Escherichia coli) 은 ampicillin (100 μg/ml) 과 kanamycin (25 μg/ml) 이첨가된 Luria-Bertani (LB) 배지에서배양하였다. 재조합 E. coli 균주들은 37 C에서 600 nm의흡광도가 0.6이될때까지배양한후, isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) 를최종농도 0.1 mm 되게첨가하고 30 C에서 7시간동안추가적으로배양시켜단백질발현을유도하였다. 세포추출물들은원심분리를통해얻은뒤, -75 C 초저온냉장고에보관했다가필요시에녹여사용하였다. 위치지정돌연변이 (site-directed mutagenesis) 에의한돌연변이단백질의제조기존의 pnco 벡터에포함되어있던 N-RS 야생형및 N-RS A43L, N-RS C48S, N-RS ET66,67DQ 등의돌연변이단백질을코드하는유전자들은 (9) 정방향 (forward) 및역방향 (reverse) 프라이머를활용하여 PCR로증폭시킨후 pqe30 벡터에삽입되었다 (Table 1). 중합효소연쇄반응에의한 DNA 증폭중생길수있는돌연변이오류를최소화하기위하여교정 (proof-reading) 기능을지닌 Ex-Tag DNA polymerase를사용하였고아미노말단리보플라빈생성효소유전자가삽입 된재조합플라스미드 pern (3) 을주형으로사용하였다. PCR에사용된프라이머들은 Table 2에기재하였다. 상기의돌연변이이외의다른위치지정돌연변이는기존에알려진논문의방법 (12) 을변형하여다음과같이수행하였다. 돌연변이중합효소연쇄반응은 pqe 벡터염기서열및제한효소인식부위를포함하는정방향 (forward) 과역방향 (reverse) 으로향하는제한효소인식부위프라이머 (flanking primer) 와특정아미노산을다른부위로변화시키게하는돌연변이프라이머 (mutant primer) 를사용하여, 두차례의 PCR을수행하였다 (Fig. 3). 첫번째 PCR 단계에서는정방향프라이머와돌연변이프라이머를사용하여 25 사이클을증폭시켰다. 이 PCR 증폭 DNA 산물을 PCR Purification kit (Solgent, Korea) 을사용해정제한후, 다음 PCR 단계의프라이머로써사용하였다. 두번째 PCR단계에서는앞서정제한첫번째 PCR 산물과역방향프라이머를이용하여 25 사이클재증폭하였다. 두차례의 PCR을통해얻어진산물을제한효소 BamHI과 PstI으로절단하는반응후, PCR Purification kit를사용하여정제한후동일한제한효소로절단한 pqe30 벡터에 ligation 시킨후 (Fig. 3), ligation 혼합물은 E. coli XL-1 Blue competent cell에형질전환시켰다. 모든돌연변이된아미노 -말단리보플라빈생성효소단백질을코드하는유전자가삽입된재조합 DNA는플리스미드 DNA 방법으로추출되어 Genotech (Korea) Table 2. Primers for site-directed mutagenesis of N-terminal domain of riboflavin synthase. Codons specifying modified amino acid residues are shown in bold type. Novel restriction sites are underlined Primer Amino acid replacement Novel restriction site Nucleotide sequence Forward None BamHI 5 -GAG GAG AAA GGA TCC ATG TTT ACG G-3 Reverse None PstI 5 -GTC CTG CAG TTA GTG TCCGCC-3 1 S41 C KasI 5 -GCA GCA ACC GTT ATG CGC CAC aca ggc gcc GGT TTC-3 2 S41 V KasI 5 -GCA GCA ACC GTT ATG CGC CAC Gac ggc gcc GGT TTC-3 3 S41 W KasI 5 -GCA GCA ACC GTT ATG CGC CAC cca ggc gcc GGT TTC-3 4 T50 A HinfI 5 -GAC ATG att ccc GTT AAT TTC CGT CAC GGc CAG GCA-3 5 T50 W HinfI 5 -GAC ATG att ccc GTT AAT TTC CGT CAC cca CAG GCA-3 6 T50 N HinfI 5 -GAC ATG att ccc GTT AAT TTC CGT CAC GtT CAG GCA-3 7 C47 A HphI 5 -C CGT CAC GGT gag GCA GgA ACC GTT ATG CGC C-3 8 C47 D HphI 5 -C CGT CAC GGT gag GCA Ggc ACC GTT ATG CGC C-3 9 C47 S HphI 5 -C CGT CAC GGT gag GCA Gtc ACC GTT ATG CGC C-3

리보플라빈생성효소단백질의형광특성 17 (A) (B) Japan) 를사용하여 408 nm에서 excitation 값을고정시키고, 방출스펙트라 (emission spectra) 를스케닝하였다. 10 μm로준비된시료에각각 1 M, 2 M, 3 M, 5 M로 urea의농도를첨가한후스펙트라를측정하였다. Fig. 3. Generation of mutant proteins of N-terminal domain of riboflavin synthase (N-RS). (A) The PCR fragment for cloning mutant variants; (B) Fragment inserted into plasmid DNA pqe30. The arrows indicate the flanking forward and reverse primers as well as mutant primer. 에보내져 Automatic DNA Sequencer ABI 3730 XL (Applied Biosystem, USA) 로써자동 DNA 서열분석순서 (automatic DNA sequencing protocol) 에따라 DNA 염기서열이확인되었다. 단백질정제 모든단백질정제과정은 4 C에서수행하였다. 얼린세포를완충용액 A (50 mm sodium phosphate, ph 7.0, 300 mm sodium chloride, 10 mm imidazole) 에녹인뒤, lysozyme 1 mg/ml의농도로넣고, DNase І 과 PMSF를 1 mm 되도록첨가시키고, 30분간배양시켰고이를두번의초음파분쇄과정을통해세포를파쇄시킨뒤, 원심분리하여얻은상등액을 0.4 μm pore의 membrane으로걸러서세포파쇄물 (lysate) 을준비하였다. 동일한완충용액 A로미리평형시킨 Ni-NTA 컬럼에준비된세포파쇄물을 1 ml/min의속도로흘려보냈다. 단백질이결합된칼럼에 imidazole의농도를각각 20 mm, 40 mm, 60 mm로증가시킨 A 완충용액으로세척한뒤, 완충용액 B (50 mm sodium phosphate, ph 7.0, 300 mm sodium chloride, 500 mm imidazole) 를사용하여칼럼에결합된단백질을용출시키거나혹은단백질이결합된칼럼을 Fast Protein Liquid Chromatography (BioLogic LP, Bio-Rad, USA) 와연결한뒤, 완충용액 A를이용하여 280 nm의흡광도가일정할때까지세척하고, 완충용액 B를점차적으로증가시켜용출시켰다. 각각의분별용액 (fraction) 들은 SDS-PAGE를통해확인하여선별하였다. 정제된단백질에포함된과량의 imidazole salt를제거하기위해과량의완충용액 A에밤새투석시킨뒤, 농도및흡광도를측정하였다. 단백질의농도결정 정제된단백질의농도는 280 nm에서의몰 흡광계수 6,000 M -1 cm -1 를사용하여계산하였다 (3, 17). 형광분광분석 완충용액 A에녹아있는단백질들을 10 μm의동일한농도로준비하고, Fluorescence spectrophotometer FS-2000 (Hitachi, 아미노-말단리보플라빈생성효소단백질의 3차원적구조모델링 Chembiooffic (Cambridge Soft, USA) 의하위프로그램인 Chemfinder, Chemdraw 그리고 chem3d 프로그램과 Bioclipse 프로그램을별도로이용하였다. PDB (protein databank) 에서얻은데이터베이스를이용하여용액상태의 E. coli 아미노- 말단리보플라빈생성효소 (N-RS) 야생형은 3D 구조를 Bioclipse 프로그램으로확인후, 야생형리보플라빈생성효소의핵심부분인리간드와반응하는부분을확대하여이를기초하여 3차구조를그렸다. Chemfinder로 6,7-dimethyl-8- ribityllumazine과 riboflavin을데이터베이스로부터받고나머지 Trp, Ser, Asp, Cys, Val, Gly 등을웹데이터베이스로부터받아그것들을 2D 상태인 chemdraw를이용하여 X, Y 평면상에그렸다. 이것을 Chem 3D 파일로옮긴후 3D 상태의이미지를구축하였다. 상호관계의거리를확실히하기위해서치수기능을이용하여정확한치수를기입하여거리를조정하였으며야생형의경우 Bioclipse에서치수를확인하여쉽게그릴수있으나돌연변이체의경우그거리를예측하여야하는데이는계산기프로그램의기능을사용하여그거리를예측하였다. 그리고원자간의기본적인안정화상태를만족시키기위해서 Chembiooffice의추가된기능인 MMFF94 기능을이용하여원자간의각종약한결합을계산하여그거리에맞게이미지화시켰다. 결과및고찰 야생형또는돌연변이아미노 -말단리보플라빈생성효소를코드하는유전자를포함하는재조합플라스미드를재료및실험에서기술한방법 (Fig. 3) 으로얻었고, 이들을과발현시켜다량의단백질을얻었다. SDS-PAGE를통한이들의대략적인분자량은 13 kda이었는바, 이는재조합단백질의아미노산서열로예측된질량과일치한결과이다. 또한, 정제된단백질은 25 kda 부근에서도 band가나타났는데 (Fig. 4), 이는아미노-말단리보플라빈생성효소가강력한동종이량체 (homodimer) 를형성 (3, 9) 하기때문에나타난결과로추정된다. 대부분의야생형및돌연변이형정제된아미노- 말단도메인의리보플라빈생성효소 (N-RS) 단백질들은노란색을지녔는바, 이는 isoalloxazine ring의존재로노란색을띠는리간드인리보플라빈이단백질에결합되어있는전단백질 (holoprotein) 상태로존재하기때문이다. 하지만, N-RS C47D와 N-RS ET66,67DQ 돌연변이단백질들은분리과정중무색을띄었으며, 이는이들잔기의변화로, 리간드와결합능력이감소했음을나타내는결과이다. 이전의보고 (5, 21) 에의하면 Cys47과 Thr67은 lumazine 및 riboflavin의 ribityl 그룹과의수소결합

18 Kim et al. Fig. 4. SDS-PAGE analysis of wild type and mutated proteins of N-terminal domain of riboflavin synthase (N-RS). The recombinant N-terminal riboflavin synthases were analyzed by Coomassie blue-stained 15% acryl-amide gel: Lanes: 1, NRS-S41C; 2, N-RS S41V; 3, N-RS S41W; 4, N-RS T50A; 5, N-RS T50N; 6, N-RS T50W; 7, N-RS wt; 8, N-RS C47S; 9, N-RS A43L; 10, N-RS ET66,67DQ; 11, N-RS C48S; 12, N-RS wt; M, protein size marker. Upper arrow indicates dimer and lower one does monomer of N-terminal of riboflavin synthase. 에관여하는바, 이들이돌연변이되었을때현저히낮은 lumazine 혹은 riboflavin과의결합세기를약화시킨것으로사료된다. 아미노 -말단도메인의리보플라빈생성효소단백질의리간드와의결합을확인하기위하여 10 μm의정제된단백질에각각의농도로 urea를첨가해주면서형광방출스펙트라 (fluorescence emission spectra) 를측정하였다. N-RS A43L 단백질의형광스펙트럼은 Fig. 5A에서보는바와같이 470 nm에서의 6,7- dimetyl-8-ribityllumazine peak 뿐만아니라, 520 nm 부근의 riboflavin peak도지니고있으며이는정제된단백질에 lumazine과 riboflavin이결합되어있다는사실을지지해주는결과이다. Table 3. The urea concentration at which maximal fluorescence intensity of N-terminal domain of riboflavin synthase wild type and mutant variants N-RS proteins Urea concentration N-RS wt 3 M N-RS A43L 5 M N-RS C48S 2 M N-RS S41C 3 M N-RS S41W 5 M N-RS C47A 5 M N-RS C47S 3 M N-RS T50A 3 M N-RS T50N 5 M N-RS T50W 8 M 또한 urea를첨가함에따라 470 nm 또는 520 nm에서의형광세기 (fluorescence intensity) 가증가한바, 이는형광성리간드가리보플라빈생성효소와결합되면서파생되는형광세기 (fluorescence intensity) 가감소하는쇄광 (quench) 효과때문인것으로사료된다 (3, 17). 즉리보플라빈생성효소의기질인 lumazine과생성물인 riboflavin이아미노-말단도메인리보플라빈생성효소단백질과결합된채로쇄광 (quench) 되어있다가, urea에의해단백질로부터해리되면서원래의리간드의형광성인 lumazine은 470 nm에서리보플라빈은 520 nm 에서형광세기가각각증가된것으로해석된다. Urea가첨가되면결합된리간드가해리되면서최대형광세기가 N-RS A43L은 478 nm에서 515 nm로, N-RS C48S는 476 nm에서 483 nm로각각장파장으로이동하는현상을보이는데, 이는리간드가리보플라빈생성효소에서해리되면형광세기가장파장으로이동된다는기존의보고 (3, 17) 와일치하는결과이다. 각돌연변이단백질들은최대형광세기를갖게되는 urea (A) (B) Fig. 5. Fluorescence spectra of N-terminal domain of riboflavin synthase mutant variants with adding of urea. Protein concentration, 10 μm. Excitation, 408 nm. (A) N-RS A43L protein; (B) N-RS C48S mutant proteins.

리보플라빈생성효소단백질의형광특성 19 Fig. 6. Fluorescence spectra of N-terminal domain of riboflavin synthase as well as mutant variants. Protein concentration, 10 μm. Excitation, 408 nm. 의농도가각각상이함을보이는데 (Table 3), 이는최고형광세기를보이는 urea의농도가높을수록, N-RS 돌연변이단백질과리간드와의결합및소수성상호작용 (hydrophobic interaction) 정도가강한것으로추정된다. 정제된야생형및돌연변이단백질들을 excitation 408 nm 에서고정하여형광방출스펙트라 (fluorescence emission spectra) 를측정한결과, 대부분의돌연변이단백질들은야생형보다낮은형광세기를가지고있는데, 특히 Fig. 6에서보는바와같이 N-RS C47의경우그형광세기가가장낮음을확인할수있었다. 이는앞에서의설명과같이이단백질이분리 정제동안무색을띠는것으로비추어형광성을띠는리간드가해리되었기때문으로풀이되며, 또한 N-RS C47S 및 N-RS T50W 돌연변이단백질인경우가장장파장으로이동함을보였다. 특이하게 N-RS C48S 돌연변이단백질은야생형단백질보다 2배이상의형광세기를보이는데 (Fig. 6), 이는리보플라빈생성효소의 super-family인루마진단백질 (lumazine protein) 에서이유를유추할수있다. 발광세균에특유한루마진단백질 (13) 은리보플라빈생성효소와비슷한염기서열을가지고있으며, lux 유전자군 (operon) 의상류에유전자가존재한다 (22). 루마진단백질은리보플라빈생성효소의기질인 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine과리간드로서결합함으로써이들은효소작용을하지않으나형광성의특징을가진다 (6). 한분자의루마진단백질에한분자의 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine이결합될수있으며, 이단백질의 4차구조는단량체 (monomer) 로존재한다 (16). 이러한특징을갖는루마진단백질의 48번아미노산잔기는모든루마진단백질에서 Ser으로보존되어있다 (15, 22). 리보플라빈생성효소의 Cys48은 lumazine ring의 C7α의 methylene 그룹과수소결합을하는것으로알려져있다 (14). Cys48은 lumazine에근접하여이런작용을통해형광성리간드의쇄광을파생시켰으나, 아미노말단리보플라빈생성효소단백질의 Cys48 잔기의 Ser로의변이가형광성리간드와결합하여도형광성을지니지않는리보플라빈생성효소의특성에서형광성을갖는루마진단백질의특징을지닌아미노산으로의변화에기인하여야생형보다강한형광성을지닌단백질로전환된것으로추정된다. 이러한 N-RS C48S 돌연변이단백질의형광세기강화특성은효과적인효소저해제를발굴하는고속다중발굴시스템 (high-throughput screening system) 으로써활용될수있을것이다. 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine 분자와결합된아미노- 말단리보플라빈생성효소의 3차구조예측과이들 N-RS 야생형과 N-RS C48S, T50A, T50W 돌연변이단백질의형광성의변화와구조와의상관관계를유추하기위하여 Chemoffice 프로그램을이용하여이들단백질의리간드결합부위의 3차구조를모델링하였다 (Fig. 7). 아미노산잔기를배열한후기존의 X- 선결정 (14) 에의한 N-RS의 3차구조를활용하여돌연변이된각각의아미노산잔기를공유결합시켰다. 1차구조를이룬펩타이드의역학적에너지를최소화시키는리보플라빈생성효소구조로만들기위해 MM2 기능을사용하였으며접힌구조가형성된리보플라빈생성효소와기질인 6,7-dimethyl-8- ribityllumazine molecules가이루는 3차구조를형성하기위해또다시에너지를최소화시켰다. 역학적에너지만을고려하여예측한이데이터및 3-D 모델링은분자의상동성을고려한 3차구조와기존의 X-선결정학 (14) 에의하여규명된리보플라빈생성효소의 3차구조와유사하였으며, 기존의알려진리보플라빈생성효소의 Thr50과기질인 6,7-dimethyl-8- ribityllumazine 분자의수소결합을예측한데이터 (14, 21) 와동일하게나타났다. 아미노- 말단리보플라빈생성효소와이들의리간드인 lumazine은단백질의펩타이드의골격에위치하는산소또는질소와수소결합을이룬다. Thr50의 side chain의산소원자는 lumazine의 ring 시스템의 5번질소의 imido 그룹과 Thr50의 amide group의수소는 lumazine ring 4번산소와수소결합을하고있는것으로알려져있다 (10, 14). 따라서 Thr50 아미노산의 Ala과 Trp로의치환은리간드와의이들단백질의 2차구조에는영향이없지만전체적인 3차구조에는영향을주어결합의거리및배향에변이를초래함으로써 (Fig. 7), Fig. 6에서보는바와같이형광의세기및최대파장에많은영향을미친것으로사료된다. Ser41은 Thr50과수소결합을통하여 antiparallel β-pleated sheet 구조를형성하고있다 (21). 이는 Ser41은 lumazine 결합부위로부터두번째껍질에위치하게됨을나타내고단백질이량체화의영역에존재하며 (14), 반응물인 lumazine을고정시키는역할을하는것으로알려져있으며이아미노산이 Ala 로바뀐경우에효소의활성도가 1% 이하로감소함을보였다 (7). Ser41이형광성을지닌아미노산인 Trp로바뀌는경우 (S41W) 에는 Fig. 6에서보는바와같이형광세기만감소하고형광의형태는유사함을보인반면에, Thr50이 Trp로돌연

20 Kim et al. <N-RS wild-type> <N-RS C48S> <N-RS T50A> <N-RS T50W> Fig. 7. Stereodiagram of the N-terminal domain of riboflavin synthase wild type and mutants with bound ligand 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine. These models were based on the previous published data (14). 변이될경우 (T50W), 최대형광의파장이바뀌는것은야생형과달리리간드와형광성아미노산사이에에너지전환이초래되었기때문으로사료된다. 이들 3-D 구조와형광의세기변화, 형광세기의이동등의특성은, 가까운미래에수행될형광탐침자 (fluorescence probe) 를이용한형광공명에너지전환 (FRET: fluorescence resonance energy transfer) 의방법으로단백질의구조및리간드와의결합거리및배향에관한정보를제공할수있어, 신약개발및디자인에유용하게쓰여질것으로사료된다. 적요리보플라빈생성효소 (riboflavin synthase) 는기질인두분자의 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine과결합후, 4-탄소단위 (4-carbon unit) 의자리옮김반응을거쳐한분자의리보플라빈과한분자의 pyrimidine 유도체를형성하는반응을촉매한다. 대장균 (Escherichia coli) 리보플라빈생성효소의아미노 -말단도메인절반 (N-terminal domain half) 과카복시- 말단도메인절반 (C-terminal domain half) 은매우유사한내부자체아미노산서열 (intra-molecular amino acid sequence) 을갖는다. 아미노- 말단영역리보플라빈생성효소 (N-RS) 단백질의구조와형광특성을알아보기위하여중합효소연쇄반응과 위치지정돌연변이를통하여 10개이상의돌연변이아미노- 말단리보플라빈생성효소단백질을코드하는유전자를증폭시켜 pqe30 벡터에삽입한재조합플라스미드를제조하여, 과발현시킨후분리 정제하였다. 대부분의아미노- 말단도메인리보플라빈생성효소의돌연변이단백질들은야생형과같이형광성리간드인 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine 혹은리보플라빈과결합할수있는능력을지니고있었으나, N-RS C47D, N-RS ET66,67DQ 돌연변이단백질의경우는리간드와의결합능력이현저히떨어져형광을띠지않았다. 대부분의돌연변이단백질들의형광세기는야생형단백질 (N-RS wt) 보다낮았으나, N-RS C48S는예외적으로야생형단백질에비해 2 배이상의형광세기를가졌다. 이와같은결과를바탕으로리보플라빈생성효소와형광성리간드사이의상호작용을예측할수있으며, N-RS C48S 돌연변이단백질의형광성을활용하여효과적으로효소저해제를발굴할수있는고속다중스크리닝법 (high-throughput screening system) 으로써활용될수있을것이다. 감사의말본연구는 2009년도충남대학교자체연구사업학술연구비에의하여이루어졌으며이에감사드립니다.

리보플라빈생성효소단백질의형광특성 21 참고문헌 1. Beach, R.L. and G.W. Plaut. 1970. Stereospecificity of the enzymatic synthesis of the o-xylene ring of riboflavin. J. Am. Chem. Soc. 92, 2913-2916. 2. Eberhardt, S., G. Richter, W. Gimbel, T. Werner, and A. Bacher. 1996. Cloning, sequencing, mapping and hyper-expression of the gene coding for riboflavin synthase of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 242, 712-719. 3. Eberhardt, S., N. Zingler, K. Kemter, G. Richter, W. Gimbel, M. Cushman, and A. Bacher. 2001. Domain structure of riboflavin synthase. Eur. J. Biochem. 268, 4315-4323. 4. Fischer, M. and A. Bacher. 2005. Biosynthesis of flavocoenzyme. Nat. Prod. Rep. 22, 324-350. 5. Fischer, M. and A. Bacher. 2008. Biosynthesis of vitamin B 2: Structure and mechanism of riboflavin synthase. Arch. Biochem. Biophys. 474, 252-265. 6. Gast, R. and J. Lee. 1978. Isolation of the in vivo emitter in bacterial bioluminescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 833-837. 7. Illarionov, B., K. Kemter, S. Eberhardt, G. Richter, M. Cushman, and A. Bacher. 2001. Riboflavin synthase of Escherichia coli. Effect of single amino acid substitutions on reaction rate and ligand binding properties. J. Biol. Chem. 276, 11524-11530. 8. Kim, R.R., B. Illarionov, M. Joshi, M. Cushman, C.Y. Lee, W. Eisenreich, A. Bacher, and M. Fischer. 2010. Mechanistic insights on riboflavin synthase inspired by selective binding of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine exomethylene anion. J. Amer. Chem. Soc. 132, 2983-2980. 9. Lee, C.Y., B. Illarionov, Y.E. Woo, K. Kempter, R.R. Kim, S. Eberhardt, M. Cushman, M. Fischer, W. Eisenreich, and A. Bacher. 2007. Ligand binding properties of the riboflavin synthase from Escherichia coli. J. Biochem. Mol. Biol. 40, 239-246. 10. Liao, D.I., Z. Wawrzak, J.C. Calabrese, P.V. Vitanen, and D.B. Jordan. 2001. Crystal structure of riboflavin synthase. Structure 9, 399-408. 11. Marcus, R. and A.M. Coulston. 1990. Water soluble vitamin. The vitamin complex and ascorbic acid. The pharmacological basis of therapeutics, pp. 1534-1536. In Gilman, Rall, Nies, and Tayler (eds.) 8th eds. Pergamon press, New York, USA. 12.Marini, F., A. Naeem, and J.N. Lapeyre. 1993. An efficient 1-tube PCR method for internal site-directed mutagenesis of large amplified molecules. Nucleic Acids Res. 21, 2277-2278. 13. Meighen, E.A. 1991. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142. 14. Meining, W., S. Eberhardt, A. Bacher, and R. Ladenstein. 2003. The structure of the N-terminal domain of riboflavin synthase in complex with riboflavin at 2.6Å resolution. J. Mol. Biol. 331, 1053-1063. 15. O'Kane, D.J. and D.C. Prasher. 1992. Evolutionary origins of bacterial bioluminescence. Mol. Microbiol. 6, 443-449. 16. O'Kane, D.J., B. Woodward, J. Lee, and D.C. Prasher. 1991. Borrowed proteins in bacterial bioluminescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1100-1104. 17. Otto, M.K. and A. Bacher. 1981. Ligand-binding studies on light riboflavin synthase from Bacillus subtilis. Eur. J. Biochem. 115, 511-517. 18. Plaut, G.W. 1963. Studies on the nature of the enzymatic conversion of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine to riboflavin. J. Biol. Chem. 238, 2225-2243. 19. Plaut, G.W., R.L. Beach, and T. Aogaichi. 1970. Studies on the mechanism of elimination of protons from the methyl groups of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine by riboflavin synthetase. Biochemistry 9, 771-785. 20. Schott, K., J. Kellerman, F. Lottspeich, and A. Bacher. 1990. Riboflavin synthase of Bacillus subtilis. Purification and amino acid sequence of the alpha subunit. J. Biol. Chem. 265, 4204-4209. 21. Truffault, V., M. Coles, T. Diercks, K. Abelmann, S. Eberhardt, H. Luttgan, A. Bacher, and H. Kessler. 2001. The solution structure of the N-terminal domain of riboflavin synthase. J. Mol. Biol. 309, 949-960. 22. Woo, Y.E., S.Y. Kim, and C.Y. Lee. 2005. Expression, and generation of amino-terminal domain of the gene coding for the lumazine protein from Photobacterium phosphoreum. Kor. J. Microbiol. 41, 306-311.