J. Biomed. Lab. Sci. 10 (2004) 9 13 Inhibitory Effect of Clavicepitaceae on Serotonin Release out of Human Platelets and Human Platelet Aggregation Hyun-Jeong Cho 1, Hye-Seon Ham 2, Chang-Ryul Lim 1, Sun-A Choi 1, Hyo-Chan Kang 1, Young-Cheol Ju 1 and Hwa-Jin Park 1 1 Department of Biomedical Laboratory Science, College of Biomedical Science and Engineering, Inje University, 607, Obangdong, Gimhae, Gyungnam 621-749, Korea, 2 Cancer Research Institute, Seoul National University, College of Medicine Yeongeon-dong, Jongno-gu, Seoul, Korea We have investigated the effects of hypha-water extracts (HWE), fruit body-water extracts (FWE) and cordycepin from Cordyceps militaris on serotonin release out of human platelets and human platelet aggregation. HWE and FWE inhibited the release of [ 3 H]-serotonin from human platelet stimulated by thrombin (2 U/ml) or collagen (20 µg/ml) in a dose-dependent manner. Furthermore, cordycepin, a major component of Cordyceps militaris, inhibited the human platelet aggregation induced by collagen (10 µg/ml) in a dose-dependent manner. These results suggest that cordycepin containing in HWE and FWE may inhibit the serotonin release by suppressing the collagen-induced human platelet aggregation. Accordingly, our data demonstrate that HWE and FWE containing much cordycepin might have antithrombotic and antimigrainous functions. Key Words: Clavicepitaceae, Serotonin release, Cordycepin, Platelet aggregation 서 동충하초 ( 冬蟲夏草 ) 는분류학적으로자낭균의맥각균목, 동충하초과에속하는버섯으로, 겨울에는곤충의몸속에있다가여름에는풀처럼나타난다. 이것은한국을비롯하여일본, 중국등에널리분포하고있고, 중국에서는성인병치료제, 정력강장제등한방약재로널리이용되고있다 14). 이외에항균작용, 혈압강하작용, 항암작용, 혈당저하작용 14) 등다양한약효가알려지고부터세인 ( 世人 ) 의흥미를불러일으키고있다. 그러나, 동충하초그자체또는그성분이혈전에미치는영향을검토한결과는거의없다. 본연구는혈소판응집반응과편두통의원인인자로알려져있는 serotonin 방출반응에미치는영향을검토하는것이목적이다. Serotonin 은일반적으로소화기관, 혈소판및중추신경계에서발견되지만, 혈소판의 dense body에가장많이농축되어있고 9), platelet activating factor (PAF), collagen, ADP, thrombin 등에의해자극을받았을때혈소판으로부터방출된다 3,5,6,10). Thrombosis * 논문접수 : 2004년 1월 6일수정재접수 : 2004년 1월 31일 별책요청저자 : 박화진, ( 우 ) 621-749 경남김해시어방동 607, 인제대학교임상병리학과 Tel: 055-320-3538, Fax: 055-334-3426 e-mail: mlsjpark@inje.ac.kr 론 는 serotonin의방출반응과밀접하게관련있는혈소판의비가역적응집에기인하고 3,5,6,10), 편두통의주요원인물질은혈소판으로부터방출되는 serotonin이다 4,11). 본연구에서동충하초의자실체와균사체물추출물이 collagen 및 thrombin 이유인하는 serotonin 방출반응을억제했을뿐만아니라동충하초의자실체와균사체의주요성분인 cordycepin은농도에의존하여 collagen (10 µg/ml) 이유인하는혈소판응집반응을억제시켰다. 이에본연구에서는동충하초의자실체및균사체물추출물이편두통및혈소판응집촉진인자인 serotonin의방출반응을억제시킴을확인하였다. 재료및방법 1. 재료본연구에사용한동충하초 (Cordyceps militaris) 의자실체및균사체는 ( 주 ) 고려식료 ( 경남김해시주촌면원지리 1066 번지 ) 에서인공적으로배양하여개발한것을사용하였으며, 추출물제조및성분분석에이용된모든시약은 Sigma Co. Ltd. 에서구입하였다. 2. 자실체및균사체의물추출물의제조 Mixer (4-8-5241, 한일전기 ) 로분쇄한자실체 100 g, 균사체 100 g 에증류수 1 l를첨가하여 70~80 에서 2시간씩 3번 - 9 -
반복중탕 교반한후원심 (4,000 g, 20 min, 20 ) 하여얻은상층액을 filter paper (Advantec No. 2) 로 filtration하였다. 이여과액을 40 에서농축하여동결건조시켜시료로사용하였다. 3. Concentrated human platelet-rich plasma (PRP) 제조사람혈소판풍부혈장 (platelet-rich plasma) 을 180 g, 25 에서 15분동안원심분리하여여분의다른세포즉백혈구, 적혈구를침전시킨후순수한 PRP만을얻었다. 이것을다시 1,100 g, 25 에서 10분동안원심하여 PPP (plateletpoor plasma) 와혈소판 pellets (PLTs) 으로분리하였다. 상층의 PPP 적당량을 PLTs 에조심스럽게첨가하여 cell suspension (5 10 8 platelets/ml) 을제조하였다. Cordycepin의영향을보기위해서우선 cordycepin의최종농도를 50 µm, 100 µm, 500 µm로하여, collagen 을첨가하기전에 37 에서 3분간 preincubation 시킨후 collagen (10 µg/ ml) 을첨가하여 collagen에의한응집반응과마찬가지로 aggregometer (Chrono Log Corp.) 에서응집에의한빛투과도의변화를측정했다. 7. Cordycepin 의함량측정동충하초 (Cordyceps militaris) 균사체및자실체로부터제조한물추출물및에탄올추출물 (40, 80 µg) 에 anthrone reagent 40 µl 및 80 µl를첨가하여 boiling water (100 ) 에서 10분간반응시키고, cooling한다음 260 nm에서흡광도를측정하였다. 이때표준용액으로 cordycepin (Sigma. Co. Ltd.) 1 4. Serotonin loading 건강한사람의 PRP를 125 g에서 10분동안 25 에서원심한후적혈구를제거시키고, PRP 40 ml에 5-hydroxy- [G- 3 H]-tryptamine (serotonin, 1 µm) 을첨가하여 37 에서 60 분간 incubation한후 1,100 g, 10분동안원심분리하고, 침전물인 platelets를 Tris-citrate-bicarbonate buffer (129 mm NaCl, 10.9 mm Na Citrate, 8.9 mm NaHCO 3, 1 mg/ml Glucose, 10 mm Tris-hydroxymetylamino methane, 2.8 mm KCl, 0.8 mm KH 2 PO 4, 2 mm EDTA, ph 6.5) 8) 에서 2회세척후, EDTA 가함유되어있지않은 Tris-citrate-bicarbonate buffer (ph 6.9) 8) 에서 5 10 8 cells/ml로조정하였다. 5. Serotonin 의방출반응측정 CaCl 2 2 mm을함유하는 platelets (10 8 /ml) 에서동충하초 (Cordyceps militaris) 물추출물을첨가또는첨가하지않은상태에서반응 tube ( 반응계 0.5 ml) 를 37 에서 stirring하면서 2분동안 preincubation 시킨다음 thrombin (2 U/ml) 또는 collagen (20 µg/ml) 을첨가하여 5분동안반응시켰다. 반응은 16.5% formaldehyde로정지시키고, 그후즉시 25 에서 1,100 g로 10분간원심하여생긴상층액 300 µl를 Scint A-XF (Packard) 10 ml가함유된 scintillation vial에첨가하여 liquid scintillation counter로 cpm을측정하였다. Serotonin의방출은 Costa and Murphy의방법 2) 에따라방출율 (%) 을계산하였다. 6. 혈소판응집반응 Platelet-rich plasma (PRP) 를 aggregometer (Chrono Log Corp.) tube에 10 8 platelets/ml이되게넣고, 37 에서 3분간 preincubation한후 collagen (10 µg/ml) 을첨가하여 5분동안 incubation시키고, 응집에의한빛의투과도증가를측정했다. Fig. 1. Effects of HWE from Cordyceps militaris on thrombininduced serotonin release out of human platelets. A: serotonin release (cpm) ([ 3 H]-serotonin), B: % inhibition to control. Data are given as the mean ± S.D. (n=3). HWE, hypha-water extracts. * P<0.001 compared with that of cell only. ** P<0.05 compared with that of thrombin-induced serotonin levels. - 10 -
mg/ml 을사용하였다. 결 과 1. Thrombin에의한 [ 3 H]-serotonin 방출에미치는동충하초의균사체물추출물 (hypha-water extracts) 및자실체물추출물 (fruit body-water extracts) 의효과 Fig. 1은 thrombin (2 U/ml) 에의한 [ 3 H]-serotonin의방출반응에미치는동충하초의균사체물추출물 (hypha-water extracts, HWE) 의영향을표시한것이다. Fig. 1-A에표시한바와같이사람혈소판 (10 8 /ml) 을 thrombin (2 U/ml) 으로자극하여혈소판응집반응을일으키면, control에비해 thrombin (2 U/ml) 에의하여현저하게 serotonin이방출되었다 (Fig. 1-A). 그러나 HWE를농도별로첨가하여 3분간 37 에서 preincubation 시킨후, thrombin (2 U/ml) 으로 5분간반응시키면, 그농도에의존하여 [ 3 H]-serotonin의방출이 control에비해감소했다. 이것은 HWE가 thrombin (2 U/ml) 에의해사람혈소판으로부터방출되는 [ 3 H]-serotonin의방출을억제시키고있음을보여준다 (Fig. 1-B). Fig. 2는 thrombin (2 U/ml) 에의한 [ 3 H]-serotonin 방출반응에미치는동충하초자실체물추출물 (fruit body-water extracts, FWE) 의영향을표시한것이다. Fig. 2-A에표시한바와같이사람혈소판 (10 8 /ml) 을 thrombin (2 U/ml) 으로자극하여혈소판응집반응을일으키면, control 에비해 thrombin (2 U/ml) 에의하여현저하게 [ 3 H]-serotonin이방출되었다 (Fig. 2-A). 그러나 FWE를농도별로첨가하여 3분간 37 에서 preincubation 시킨후, thrombin (2 U/ml) 으로 5분간반응시키면, 그농도에의존하여 [ 3 H]-serotonin의방출이감소하는것을볼수있다. 이것은 FWE가 thrombin (2 U/ml) 에의해사람혈소판으로부터방출되는 [ 3 H]-serotonin의방출을억제시키고있음을보여준다 (Fig. 2-B). 2. Collagen에의한 [ 3 H]-serotonin 방출반응에미치는동충하초의자실체물추출물 (fruit body-water extracts) 의영향 Fig. 3은 collagen (20 µg/ml) 에의한 [ 3 H]-serotonin의방출반응에미치는동충하초의 FWE의영향을표시한것이다. Fig. 3에표시한바와같이사람혈소판 (10 8 /ml) 을 collagen (20 µg/ml) 으로자극하여혈소판응집반응을일으키면, collagen (20 µg/ml) 단독에의한 serotonin 방출반응에비해 FWE를농도별로첨가하여 3분간 37 에서 preincubation 시킨후, collagen (20 µg/ml) 으로 5분간반응시키면, 그농도에의존하여 [ 3 H]-serotonin의방출이 collagen (20 µg/ml) 단독에비해감소하는것을볼수있다. 이것은 FWE가 collagen (20 µg/ml) 에의해사람혈소판으로방출되는 [ 3 H]-serotonin의방 출을억제시키고있음을보여준다. FWE (µg/ml) Fig. 2. Effects of FWE from Cordyceps militaris on thrombininduced serotonin release out of human platelets. A: serotonin release (cpm) ([ 3 H]-serotonin), B: % inhibition to control. Data are given as the mean ± S.D. (n=3). FWE, fruit body-water extracts. * P<0.001 compared with that of cell only. ** P<0.05 compared with that of thrombin-induced serotonin levels. 3. Collagen 에의한사람혈소판응집반응에미치는 cordycepin의영향 Table 1에서볼수있듯이동충하초의자실체와균사체물추출물에는 cordycepin이다량함유되어있고, 또한전술한바와같이 cordycepin은다양한기능을가지고있는것으로알려져있지만, 혈소판응집반응에대해연구한것은없다. 또한 collagen, thrombin 등에의한혈소판응집반응시에혈소판의 dense body에서분비되는 serotonin은 autacoid로서혈 - 11 -
Table 1. Contents of cordycepin in hypha and fruit body Cordycepin (µg/mg-powder) Hypha Fruit body 166.4±12.1 78.7±9.1 Fig. 3. Effects of FWE from Cordyceps militaris on collageninduced serotonin release out of human platelets. Data are given as the mean ± S.D. (n=3). FWE, fruit body-water extracts. * P<0.001 compared with that of collagen-induced serotonin levels. ** P<0.05 compared with that of collagen-induced serotonin levels. 소판응집반응을강력하게촉진시키는물질이므로 collagen 에의한혈소판응집반응에대해 cordycepin이미치는영향을함께검토했다. Fig. 4는사람혈소판 (10 8 /ml) 의응집반응에미치는 cordycepin의영향을표시한것이다. Fig. 4에서보는바와같이혈소판응집은 collagen (10 µg/ml) 으로유도하였으며, cordycepin 50 µm에서부터약간의혈소판응집억제반응을보이기시작하였고, 100 µm, 500 µm로농도를높여진행할수록혈소판응집억제효과는더욱커졌다. 즉 cordycepin은 collagen (10 µg/ml) 에의한사람혈소판응집반응을농도의존적으로강하게억제시키고있음을제시하고있다 (Fig. 4). 한편, cordycepin은 ethanol에의해서재구성되었기때문에, 용매에의한혈소판응집반응율을감안하여혈소판응집억제율을계산하였다. 즉 cordycepin은 collagen에의한사람혈소판응집반응을농도의존적으로강력하게저해시키는항혈소판제로서의의미를가진다고할수있다 (Fig. 4). 따라서 collagen에의한혈소판응집반응을강력하게억제시키는 cordycepin 은 serotonin의방출을억제시키는 HWE 및 FWE에함유되어있으므로, cordycepin이 serotonin 의방출을억제할가능성이있지만이것에대한것은금후검토해볼필요가있다. 또한혈소판응집억제반응은 serotonin Fig. 4. Effect of cordycepin on collagen-induced human platelet aggregation. Arrow is indicated as a collagen-addition point. A: collagen 10 µg/ml, B: cordycepin 50 µm + collagen, C: cordycepin 100 µm + collagen, D: cordycepin 500 µm + collagen. 의방출억제반응과관계가있으므로혈소판응집반응을억제하면서 cordycepin을함유하는동충하초의 HWE 및 FWE 는항혈소판작용및항편두통작용을가지고있을것으로사료된다. 고 혈소판은 collagen 및 thrombin에의해자극을받으면혈소판의응집반응을촉진하는 thromboxane A 2 (TXA 2 ) 가막인지질로부터분해되어나오는 arachidonic acid로부터생성된다 7). 특히높은농도의 collagen (5~20 µg/ml) 및 thrombin (1~5 U/ml) 으로혈소판이자극받았을때분비되어나오는 serotonin은혈소판의비가역적인응집반응을촉진한다 7). 이와같은사실을통해 collagen 및 thrombin에의한 serotonin 의방출반응을억제하면, 혈소판의응집반응을촉진하는 TXA 2 의생성을저해시킬수있음을알수있다. Fig. 1과 Fig. 2에서보면 HWE와 FWE는 thrombin (2 U/ ml) 및 collagen (20 µg/ml) 에의해증가된 serotonin의방출반응을농도의존적으로억제하고있다. 이러한사실은 HWE 와 FWE가 thrombin 또는 collagen에의한혈소판응집반응에서 TXA 2 의생성을억제시킬수있음을의미한다. 또한이것을반영해주는것은 HWE 및 FWE에다량함유되어있는 cordycepin (Table 1) 이 collagen에의해일어나는혈소판 찰 - 12 -
응집반응을농도의존적으로강력하게억제하고있다는사실이다 (Fig. 4). 다시말해서 cordycepin은 collagen 이나 thrombin 자극에의한혈소판응집반응에서 TXA 2 의생성을억제시킬가능성을제시하고있다. 실제로다른실험에서 cordycepin은 TXA 2 의전구물질인 arachidonic acid를결합하고있는 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate의분해를강력히저해했다 (data not shown). 그러나 HWE 및 FWE에함유되어있는어떤성분이 collagen 또는 thrombin에의한 serotonin의방출억제및혈소판응집억제에관여하는지는현재알려져있지않지만, 강력한후보물질로서 cordycepin을들수있다. 또한동충하초의 HWE 및 FWE에는 oleic acid (18:1) 가각각 30.6%, 11.1% 함유되어있다 13). 그리고 oleic acid는 linoleic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid와더불어동맥경화의위험인자인혈소판의응집반응을억제시키는것으로알려져있다 13). 따라서 HWE 및 FWE에의한사람혈소판응집반응의억제는각각 30.6%, 11.1% 함유되어있는 oleic acid에서기인될수도있다. 한편, HWE 및 FWE의아미노산조성을살펴보면, HWE 및 FWE에는 lysine이각각 28.6%, 14.4%, arginine이 31.7%, 7.2% 함유되어있다 13). Lysine 은 polyamine으로서혈소판을강력하게억제시키는것으로알려져있다 1). 그리고 arginine은혈소판내부에서혈소판응집의주요인자인 Ca 2+ 의동원을억제하는작용을가진 cgmp의생성을촉진시킴으로서혈소판응집을억제시키는작용을가진다 12). 이상과같이동충하초의 HWE, FWE는혈소판응집을강력하게억제하는 cordycepin (Table 1), oleic acid, lysine 및 arginine 등을함유하고있기때문에동맥경화의병리현상인혈소판의응집반응억제와 serotonin의방출반응을억제시키는후보물질이될수있음을시사한다. 감사의말씀본연구는인제대학교학술연구조성비지원 ( 연구과제번호 : 00011999239) 에의해수행된연구결과이며, 깊이감사드립니다. 참고문헌 1) Cho HJ, Ham HS, Lee DS and Park HJ (2003): Effects of proteins from hen egg yolk on human platelet aggregation and blood coagulation. Biol Pharm Bull, 26: 1388-1392. 2) Costa JL and Murphy DL (1975): Platelet 5-HT uptake and release stopped rapidly by formaldehyde. Nature, 255: 407-408. 3) Dale GL, Friese P, Batar P, Hamilton SF, Reed GL, Jackson KW, Clemetson KJ and Alberio L (2002): Stimulated platelets use serotonin to enhance their retention of procoagulant proteins on the cell surface. Nature, 415: 175-179. 4) Durham P and Russo A (2002): New insights into the molecular actions of serotonergic antimigraine drugs. Pharmacol Ther, 94: 77-92. 5) Maurer-Spurej E, Pittendreigh C and Solomons K (2004): The influence of selective serotonin reuptake inhibitors on human platelet serotonin. Thromb Haemost, 91: 119-128. 6) Mustard JF and Packham MA (1970): Factors influencing platelet function: adhesion, release, and aggregation. Pharmacol Rev, 22: 97-187. 7) Narita H, Park HJ, Tanaka K, Matsuura T and Kito M (1985): Insufficient mobilization of calcium by early breakdown of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate for aggregation of human platelets by collagen. J Biochem (Tokyo), 98: 1063-1068. 8) Rittenhouse-Simmons S and Deykin D (1976): Isolation of membranes from normal and thrombin-treated gel-filtered platelets using a lectin marker. Biochim Biophys Acta, 426: 688-696. 9) Segawa T (1981): Storage and release of serotonin (author's transl). Tanpakushitsu Kakusan Koso, 26: 1662-1666. 10) Tollefsen DM, Feagler JR and Majerus PW (1974): The binding of thrombin to the surface of human platelets. J Biol Chem, 249: 2646-2651. 11) Villalon CM, Centurion D, Valdivia LF, De Vries P and Saxena PR (2002): An introduction to migraine: from ancient treatment to functional pharmacology and antimigraine therapy. Proc West Pharmacol Soc, 45: 199-210. 12) Walter U (1989): Physiological role of cgmp and cgmpdependent protein kinase in the cardiovascular system. Rev Physiol Biochem Pharmacol, 113: 41-88. 13) 박화진, 최미애 (1998): 동충하초 ( 冬蟲夏草 ) 함유성분의약리학적기능고찰. 인제대학교, 인제논총, 14: 1145-1153. 14) 이지열 (1996): 버섯이야기 2 동충하초. 임산버섯. 11: 46-48. - 13 -