동의생리병리학회지제 22 권 6 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(6):1509 1517, 2008 Lonicera Flower 의항산화활성과 LDL 산화억제효과및혈전용해능에관한연구 주신탁 이민자 이혜숙 정현정 김혁 김재은 1 박선동 2 박원환 * 동국대학교한의과대학기초의과학연구센터 & 진단학교실, 1 : 병리학교실, 2 : 방제학교실 Screening of Anti-atherosclerotic Effect of Lonicera Flower by Antioxidative and Anti-thrombotic Mechanism Shin Tak Ju, Min Ja Lee, Hye Sook Lee, Hyun Jung Jung, Hyuck Kim, Jai Eun Kim 1, Sun Dong Park 2, Won Hwan Park* Cardiovascular Medical Research Center and Department of Diagnostics, 1:Department of Pathology, 2:Department of Prescriptionology, College of Oriental Medicine, Dongguk University The flowers and buds of Lonicera Flower (LF), are used in Korean herbal medicine for latent-heat-clearing, antipyretic, detoxicant and anti-inflammatory ailments. This plant is used worldwide for the treatment of many types of inflammatory disease including respiratory infections, diabetes mellitus, rheumatoid arthritis and play an important role in immune reaction. These pharmaceutical effects of LF looks like to be related to its antioxidant capacity and phytochemicals containing in LF. In this study, the antioxidant activity of extract from LF was studied in vitro methods by measuring the antioxidant activity by TEAC, measuring the scavenging effects on reactive oxygen species (ROS) [superoxide anion, hydroxyl radical] and on reactive nitrogen species (RNS) [nitric oxide and peroxynitrite] as well as measuring the inhibitory effect on Cu 2+ induced human LDL oxidation and the inhibitory effect on collagen induced platelet aggregation. The LF extracts were found to have a potent scavenging activity, as well as an inhibitory effect on LDL oxidation and on platelet aggregation. In conclusion, the LF extracts have anti-oxidative and anti-atherosclerotic effects in vitro system, which can be used for developing pharmaceutical drug against oxidative stress and atherosclerosis. Key words : Lonicera Flower(LF), antioxidative, anti-atherosclerotic, LDL oxidation, platelet aggregation 서론 금은화 ( 金銀花, Lonicera Flower, LF) 는학명이 Lonicera japonica THUNB. 로서忍冬科에속한다년생반상록목질등본인인동 Lonicera japonica THUNB., 紅腺忍冬 L. hypoglaus MIQ., 山銀花 L. confusa DC. 및毛花柱忍冬 L. dasystyla REHD. 의꽃봉우리를건조한것으로, 여름철꽃이피기전에채취하여건조한것으로알려져있다 1,2). 淸熱解毒, 涼散風熱작용이있는금은화의약리작용을살펴보면항균, 항바이러스작용, 소염, 해열작용, 혈소판활성억제작용, 면역증강작용등이실험을통해입증되었으 * 교신저자 : 박원환, 경주시석장동, 동국대학교한의과대학진단학교실 E-mail : diapwh@dongguk.ac.kr, Tel : 054-770-2373 접수 : 2008/10/27 수정 : 2008/11/21 채택 : 2008/12/03 며, 금은화가들어가는대표적인처방으로은교산이있는데, 이는주로熱邪가津液을손상시켜서생기는병을치료하는약으로감기, 인후염, 편도선염, 폐렴등의치료에응용할수있다 3,4). 금은화추출물의생리학적효과에관한연구로는접촉성피부염에미치는영향 5), LPS 유도염증매개물억제효과 6), COX-2 저해효과 7), 항암효과 8) 및항균효과 9) 등이보고되어있다. 모든호기적인조건하에서생명체들은산소를이용한에너지대사과정에서발생하는유리기 (free radical) 에대한자기방어기전을가지고있으나, 생체조직의방어능을초월한유리기의생성은최근성인병이라불리어지는관절염, 순환기장애뿐만아니라치매등과같은여러질환의직접적인원인이되고있다 10). 흔히유리기 (free radical) 라불리어지는활성산소종 (reactive oxygen species; ROS) 및활성질소종 (reactive nitrogen species; - 1509 -
주신탁 이민자 이혜숙 정현정 김혁 김재은 박선동 박원환 RNS) 은가장안정한형태의산소인삼중항산소 ( 3 O 2) 가환원되어생성되는일중항산소인 superoxide anion ( 1 O - 2 ) 과 hydrogen peroxide (H 2O 2), hydroxyl radical ( OH) 을비롯하여내인성 외인성 nitric oxide synthase (NOS) 에의해만들어지는 nitric oxide radical ( NO) 및 peroxynitrite (ONOO - ) 와같은짝짓지않은상태의자유라디칼로서, 이들은산화적스트레스 (oxidative stress) 및질산화적스트레스 (nitrosative stress) 로작용하여단백질, DNA, 효소및 T세포와같은면역계통의인자를손상시켜만성퇴행성질환을일으킨다 11,12). 한편, 관상동맥성심혈관질환인동맥경화는노화와더불어산화적 질산화적스트레스에기인한주요질환중의하나로서, 임상및기초분야에서가장활발히연구되고있다. 관상동맥성심혈관질환은현재모든사망원인의 30% 이상을차지하고있으며미국, 유럽등선진국에서는심각한문제가되고있다 13). 한국에서문제가되고있는뇌혈관질환도모세혈관의경화현상에서기인되는경우가흔하다. 지금까지동맥경화증의발병메카니즘에대해서는여러가지가설이있는데, 그중에서도대표적인것으로는 ' 변형된저밀도지단백질 (modified low density lipoprotein; M-LDL)' 에대한가설을들수있다 14). LDL은세포내에서콜레스테롤합성을조절하는역할을하는데이것이산화변형되어산화된 LDL (Ox-LDL) 이생성된다. Ox-LDL은세포독성을나타내며내피의기능이상을촉진하고지방선조 (fatty streak) 를형성하여그영역을더넓혀가고동맥벽의다른유전자의발현에변화를가져와동맥경화를더욱악화시키기도한다 12). 따라서 LDL 내의항산화제함량은 LDL의산화억제에중요하게여겨지며, LDL 내에지방친화성항산화제가충분히존재한다면 LDL은산화적스트레스로부터보호될수있다. 이러한이유로항산화제의개발연구가활발히진행되어예방적항산화제인 superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (GPX), glutathione reductase (GR) 과같은항산화효소계와천연항산화제인 α-tocopherol, β-carotene, ascorbic acid, glutathione 및합성항산화제인 probucol, butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT) 및 tert-butylhydroquinone (TBHQ) 등많은항산화제가이용되고있다. 이들은산화정도를약화시키고죽종형성영역을감소시키는것으로알려져있으나, 합성항산화제경우변이원성및독성이지적되면서보다안전하고효력이강한천연항산화제의개발이절실히요청되고있는실정이다 15). 동맥경화용제는크게심혈관계약물인고지혈증치료제와혈액관련약물인항혈전 혈소판응집억제제 (antithrombotics antiplatelet agent), 항응고제 (anticoagulant), 혈전용해제 (fibrinolytics) 로대표된다. 이중혈액관련약물은주로혈전 (thrombus) 에초점이맞춰져있는데혈액응고계의균형이깨어지면체내에혈전이생성되고, 이러한혈전은정맥및동맥에서혈액의순환을방해하여조직으로의영양공급및산소공급을차단하여동맥경화를유발시킨다. 또한, 혈전은과잉혈소판응집에의해매개되는병리현상으로인식되고있다 16). 현재까지혈전용해제 (fibrinolytics) 로알려진약물들로는 urokinase, streptokinase, RH-tissue type plasminogen activator 등이있으며, 혈소판응집억제제로는 cyclooxygenase 저해제인 aspirin, ADP receptor 저해제인 clopidogrel, ticlopidine, phosphodiesterase 저해제인 cilostazol, glycoprotein ⅡB/ⅢA 저해제인 tirofiban, eptifibatide, adenosine reuptake 저해제인 dipyridamole 등이있다. 그러나이들은모두정제된화학물질로인체에투여하였을때, 지혈과다억제, 불임, 소화기장애등의여러부작용을야기하는문제점이있다 17). 따라서, 천연물로부터항동맥경화효과를갖는소재를발굴하여인체에무해하고부작용이없는기능성의약품을개발하는것이시급한실정이다. 본연구에서는금은화의항산화효과및 LDL 산화억제효과를 in vitro에서관찰하고천연항산화제로서의개발가능성을검토하는한편, 혈전용해능, 혈소판응집억제효과를탐색함으로써동맥경화의예방및치료에의응용가능성을검토하였다. 재료및방법 1. 시료및시료의제조본실험의시료로사용한금은화 ( 金銀花, Lonicera Flower, LF) 의학명은 Lonicera japonica THUNB. 로생약은 2006년산국산제품을 ( 주 ) 옴니허브에서구입한후정선수치하여사용하였다. 시료 100 g을마쇄한후 3 L round flask에넣고 2 L의물을가한다음가열맨틀에서 3 hr 전탕하였다. 이를 1 mm-pore-size filter (Whatman No. 2) 로여과한후불용성물질들은제거하였다. 여과된약액은 rotary vaccum evaporator (Buchi Labortechnik, Flawil, Switzerland) 를이용하여감압농축한후동결건조하여 31.03 g의동결건조분말시료를얻었다 ( 수율 : 31.03%). 2. 방법 1) TEAC assay에의한항산화효과의측정 LF 열수추출물의 TEAC 값은 Roberta와 Miller 등 18,19) 의방법에따라측정하였다. 즉, 10 μl의 LF 추출물희석용액 (1,000 μ g/ml) 또는 Trolox standard에 ABTS + 용액 1.0 ml를첨가하여 1분후 UV/Visible spectrophotometer (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) 를이용하여 734 nm에서흡광도를측정하였다. 6분간 monitoring하였고 1 mm Trolox와비교하여흡광도의저해 % 로나타내었다. 2) DPPH에의한유리기소거효과의측정 LF의유리기소거효과는 Blois에의한방법 20) 에따라측정하였다. 즉, DPPH (α,α'-diphenyl-β-picryl-hydrazyl) 16 mg을 100 ml의에탄올에녹인후 100 ml의증류수를혼합하여여과지로여과한후이여액 2.5 ml에일정농도의 LF 추출물 0.5 ml을혼합한후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를이용하여 517 nm에서시간에따른흡광도의변화를측정하였다. 3) Superoxide anion 소거효과의측정 LF의 superoxide anion 소거효과는 Gotoh와 Niki의방법 21) 에따라측정하였다. 시험관에 30 mm의 EDTA (ph 7.4), 50-1510 -
Lonicera Flower 의항산화활성과 LDL 산화억제효과및혈전용해능에관한연구 mm의 NaOH에녹인 30 mm hypoxanthine 및 1.42 mm nitro blue tetrazolium (NBT) 을각각 100 μl, 10 μl, 200 μl 첨가하여강하게교반하였다. 상온에서 3분간반응시킨혼합물에 0.5 U/mL xanthine oxidase 100 μl를첨가한후 50 mm phosphate buffer (ph 7.4) 를이용하여최종부피를 3 ml로조정하였다. 이를다시상온에서 20분간반응시킨후 microplate reader (Molecular Devices) 를이용하여 560 nm에서흡광도를측정하였다. 4) DCFDA assay에의한 hydroxyl radical 소거효과의측정 LF의 OH의제거능을측정하기위하여 2,7 -dichloro dihydofluorescein diacetate (DCFDA) 분석법 22) 을사용하여측정하였다. 10, 20 및 30 μg/ml 농도의시료 10 μl와 menadione 10 μl를넣고 potassium phosphate buffer (ph 7.4) 130 μl를혼합하여 OH를생성시킨후, 125 μm DCFDA에 esterase를넣어바꾼 DCFDH를 50 μl 첨가하여 60분간생성된형광의변화를측정하였다. 이형광의양을 excitation wavelength 485 nm 및 emission wavelength 530 nm에서 fluorescence microplate reader (Molecular Devices) 로측정하였다. 5) NO radical 소거효과의측정 LF의 NO radical 소거효과는 DAF-2 assay 23) 를이용하여측정하였다. LF의특이적인 NO의 indicator인 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) 는자신의 2개의아미노기사이에 NO를포집하여 490-495 nm의여기파장에서 green의형광을방출하는 triazolofluorescein을만든다. 시료 10 μl에 NO 제공물질인 SIN-1과 DAF-2를 96 well plate에첨가하였으며, DAF-2와 NO의반응에의해방출되는형광은 10분후 excitation wave length 485 nm 및 emission wave length 530 nm에서 fluorescence microplate reader (Molecular Devices) 를이용하여측정하였다. 6) Peroxynitrite 소거효과의측정 LF의 peroxynitrite 소거효과는 Crow의방법 24) 에따라측정하였다. 즉, 96-well microplate에 LF를농도별로취하고 90 mm NaCl, 5 mm KCl 및 100 μm diethylenetriaminepenta acetic acid 와 10 μm DHR 123를함유하는 sodium phosphate buffer (ph 7.4) 를가하였다. 이에 10 μm ONOO-를첨가한후 fluorescence microplate reader (Molecular Devices) 를이용하여 excitation wave length 500 nm, emission wave length 536 nm에서형광강도를측정하였다. 7) RT-PCR에의한항산화효소계활성측정농도별 LF를 Hep G2 세포에처리하고 24 시간이경과한후 TRI-reagent (MRC, Cincinnati, OH, USA) 를이용 RNA를추출하였다. 역전사효소반응은 Promega사에서제공된 manufacture에따라 DNase의처리및 reverse transcription 과정을순차적으로실시하였으며, 과정은다음과같다. 먼저 2 μl 의 RNA를 DNase와섞고 DNA 제거효소를 37 에서 30분동안활성화시켰다. 반응이종료한뒤 75 에서 DNase를불활성화시킨후역전사반응을진행하였다. 역전사반응에서는주형인 RNA와 oligo dt primer를섞고 70 에서 5분간반응을전개시킨후 4 에서 5분동안정치하였다. 다음으로 RNA inhibitor (1 unit/μl) 가포함된 15 μl의조성물과미리 oligo dt와반응을시킨 5 μl의 RNA 주형을혼합하여 25 에서 5분간 anneal하고, 42 에서 60 분동안 extension 과정을거친후마지막으로 70 에서 15분동안 heat-inactivate 하였다. 합성이완료된 cdna는 polymerase chain reaction (PCR) 에이용하였다. PCR 과정을수행하기위한조건으로다음과같은 primers를제작하였다. Table 1. Primer set list for polymerase chain reaction. Genes SOD1 SOD2 GPx GR Catalase GAPDH Sequences 5'-AGGGCATCATCAATTTCGAG-3' 5'-ACATTGCCCAAGTCTCCAAC-3' 5'-AGCACTAGCAGCATGTTGAG-3' 5'-ACTTCTCCTCGTTGACGTTC-3' 5'-GTACGGAGCCCTCACCATT-3' 5'-AGCCCAGAATGACCAGACC-3' 5'-TTACTGCAGTTCCCGGTAGG-3' 5'-CAGCAGCTATTGCAACTGGA-3' 5'-CCCTCTCATCCCAGTTGGT-3' 5'-TAGTTGGCCACTCGAGCAC-3' 5'-GGAAGGACTCATGACCACAG-3' 5'-TTGGCAGGTTTTTCTAGACG-3' 8) Relative Electrophoretic Mobility (REM) 의측정 Human LDL의 REM은윤등의방법 25) 에따라 agarose gel electrophoresis로분석하였다. PBS (ph 7.4) 에녹인 LDL (120 μ g/ml) 을일정농도의 LF 추출물, 10 μm CuSO 4 와혼합하여 3 7 에서 12 시간동안인큐베이션한후, 3 μg의 LDL을 0.7% agarose gel에 loading하여 TAE buffer (40 mm Tris, 40 mm acetic acid, and 1 mm EDTA) 에서 85 V로 1 hr 동안전기영동하였다. Gel은건조하여 Coomassie brilliant blue R-250로염색하였고, 샘플의 inhibition ratio (%) 는다음식에의해계산하였다. migration distance of ox LDL-migration distance of s LDL % Inhibition = migration distance of ox LDL-migration distance of n LDL ox LDL: oxidized LDL, s LDL: sample LDL, n LDL: native LDL 100 9) Human LDL 산화억제효과의측정 LF 추출물의 human LDL 산화억제효과는 Yagi의방법 26) 에의해측정하였다. 즉, human LDL 0.5 ml에 10 mm PBS buffer (ph 7.4) 를 1.5 ml, 0.1 mm CuSO 4 40 μl 및용매또는시료 40 μl를첨가하여 37 에서 30분간배양하였다. 여기에 20% TCA를 1.5 ml, 0.05 M NaOH에녹인 0.67% TBA를 1.5 ml 첨가하였다. 반응혼합액을 90, 45분간 water bath에서배양하고차갑게냉각한후 2,000 g에서 5분간원심분리하였다. 상등액을취하여기포를제거한후 microplate reader (Molecular Devices) 를이용하여 532 nm에서흡광도를측정하였다. 10) Fibrinolytic clear zone의측정 LF 추출물의혈전에대한분해활성은 human fibrin plate를이용하여 Astrup와 Mullertz의방법 27) 을토대로측정하였다. 100 mm petri dish에 thrombin 용액 (50 unit/ml) 을 100 μl 주입한후, 여기에 0.1 M phosphate (ph 7.5) buffer에 0.5%(w/w) 가되 - 1511 -
주신탁 이민자 이혜숙 정현정 김혁 김재은 박선동 박원환 도록녹인 fibrinogen 용액 5 ml를주입하고잘섞어주었다. Fibrin이굳을때까지실온에서 30분간방치하여 fibrin plate를제작하였다. 제작된 fibrin plate의중앙에 LF 추출물 0.2 g을놓고 37 에서 20시간까지반응을행하며 lysis zone의직경을측정하였다. 11) 혈소판응집억제활성의측정 LF의혈소판응집억제활성을검색하기위하여전혈응집분석기 (Chrono Log, Havertown, PA, USA) 를이용하여혈소판응집억제활성을 impedance 법으로측정하였다. 먼저, Sprague Dawley (SD) male rat의혈액을 3.8% sodium citrate 항응고제가포함되어있는 vaccutainer (Becton Dicknson, Franklin Lakes, USA) 에채혈한후, 1,000 rpm으로 10분간원심분리하였다. 상등액 (platelet rich plasma, PRP) 을분리하여 2,300 rpm으로 10분간원심분리한후침전물 (platelet rich pellet) 을 washing buffer (ph 6.5: 138 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 12 mm NaH 2CO 3, 0.36 mm NaH 2PO 4, 5.5 mm Glucose 및 1 mm EDTA) 로두번세척하고, 2,300 rpm에서 10분간재원심분리하였다. 상등액 (platelet poor plasma, PPP) 을제거한후, suspending buffer (ph 7.4: 138 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 12 mm NaH 2CO 3, 0.36 mm NaH 2PO 4, 5.5 mm Glucose, 0.49 mm MgCl 2 및 0.25% Gelatin) 로부유하여 2,300 rpm으로 10분간세정한후혈소판수가 4~5 10 8 cells/ml가되도록희석하여실험에사용하였다. Cuvette에 PRP 400 μl, agonist (ADP, thrombin, collagen) 50 μl, sample 50 μl 를넣고, 항혈전작용을평가하였다. 혈소판활성화억제작용은 collagen으로유도된 aggregation(%) 을대조군 (A) 으로, LF 추출물을전처리한후유도된 aggregation(%) 을시료군 (B) 으로하여다음계산식에따라 inhibition (%) 로나타내었다. 바있다. Nicoletta 등 29) 은다양한채소, 과일, 음료및오일에대한 TEAC 값을측정한결과, 블랙베리가 20.24로가장높은항산화능을나타내었으며, 아스파라거스, 아보카도, 브로콜리역시각각 3.92, 2.22, 2.94로우수한항산화능을보인데반해올리브오일, 당근, 바나나가각각 0.63, 0.44 및 0.64의 TEAC 값을나타내어 LF 추출물이이들시료와비교하여다소낮은 ABTS 라디칼양이온소거활성을갖는것으로판단되었다. DPPH법은실제항산화활성과연관성이높은방법으로활성라디칼에전자를공여하여지방질의산화를억제시키는척도로사용되고있을뿐아니라인체내에서활성라디칼에의한노화를억제하는작용의척도로도이용되고있다. DPPH법에의한 LF 열수추출물의전자공여능을측정한결과, LF 열수추출물의유리기소거효과는 IC 50 값이 450.19±13.28 μg/ml로대조군으로쓰인 AA 및 BHT 보다높게나타났다. Nam 등 30) 은한약재열수추출물의항산화효과를평가한결과, DPPH 자유라디칼에대한전자공여능이가장큰한약재는필발 (Piper longum L.) 이었으며, 목과, 창출, 지모, 조작자, 시호, 오약, 황금, 목통, 초두구, 대복피, 육계, 백자, 토복령, 백모, 소자, 삼릉, 산사, 빈량, 백두구, 오가피, 화피, 합환피, 당귀, 청피, 금은화의 25종의한약재들이대조군에비하여 80% 이상의 DPPH 자유라디칼에대한전자공여능을가지고있다고보고하였다. 세포가성장하고자라면서발생되는 free radical에의해세포가산화되어손상되는데페놀성화합물은환원성이강해서 free radical에전자를공여하여산화를억제하는항산화능력이있다고알려져있다 31). 이상의결과로부터 LF에서도 free radical에전자를공여하여산화를억제하는능력이있음이확인되었으며이는 LF 내에함유된페놀성화합물의작용에기인한것으로판단된다. A-B Inhibition (%) = 100 A A: control aggregation (%), B: sample aggregation (%) 12) 통계처리통계분석은 SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA) program을이용하여각군의평균과표준편차를산출하고군간의차이유무를 one-way ANOVA로분석한뒤 p<0.05에서유의한차이가있는경우 Tukey test를이용하여검정하였다. 결과및고찰 1. LF의항산화효과 LF를열수추출하여 TEAC법및 DPPH법을이용하여 LF의항산화능을평가하였다 (Table 2). LF의 TEAC 값은 0.023±0.001 로항산화효과는다소낮게나타났다. TEAC법은혈장에서 ABTS의양이온라디칼의흡광도가항산화제에의해억제되는것에기초하여개발되었고, 체액이나항산화제의능력을 trolox 의값과비교하여나타내었다. Fogliano 등 28) 은 TEAC법을이용해포도주의항산화활성을모니터링했는데, 포도주속의 phenol 함량이직접적으로항산화활성과관련있음을보고한 Table 2. Antioxidant activities of the extract of LF as determined by the ABTS + assay and DPPH assay. TEAC (mm Trolox equivalent) DPPH radical scavenging activities LF Positive control W a AA BHT 0.023±0.001 b 0.327±0.001 1.217±0.002 450.19±13.28b b 162.80±9.64 191.15±10.12 a: W, water extract, b: Each value represents the mean ± SE of triplicate measurements. 2. LF 의 ROS 및 RNS 소거효과 정상적인산화적인산화의과정동안소모되는전체산소의 0.4-4.0% 정도는 free radical superoxide ( O - 2, superoxide anion) 로전환되며생성된 superoxide anion은다른 ROS로전환되어직접적또는간접적으로세포손상을유발하는것으로알려져있다. 정상적으로는 superoxide anion은내인성항산화방어기전을통해 superoxide dismutase (SOD) 에의해빠르게과산화수소로전환된다. 그러나이내인성항산화방어체계가세포내산화-환원균형을유지하는데문제가생길경우결과적으로산화적스트레스가일어나게되며이산화적스트레스는직접적으로세포내거대분자의손상을일으키거나세포손상을일으키는데중요한역할을한다 10,14). 따라서 superoxide anion을소거할수있는 - 1512 -
Lonicera Flower 의항산화활성과 LDL 산화억제효과및혈전용해능에관한연구 물질의경우산화적손상의예방에유용할것으로기대된다. LF 열수추출물의 superoxide anion 소거활성을측정한결과 Table 3에나타난바와같이 IC 50 값이 2.69±0.38 mg/ml로항산화효과가널리알려진 AA (IC 50=1.22±0.02 mg/ml) 보다는다소낮았으나비교적우수한소거활성나타내어 superoxide anion에대해효과적인소거제로작용하는것으로나타났다. Hydroxyl 라디칼은활성산소라디칼중에서화학적으로가장반응성이크며, 기질을산화시킬수있는라디칼로, 특히 superoxide anion( O - 2 ) 을생성하는원천으로작용하여인접한분자에매우심각한손상을초래한다. LF 열수추출물의 hydroxyl radical 소거효과를측정한결과 IC 50 값이 634.46±12.47 μg/ml로나타나강력한항산화제로알려져있는 AA (IC 50=59.79±2.96 μg/ml) 보다는낮지만 hydroxyl radical에대한소거활성을갖는것으로나타났으며 (Table 3), 이는산화방지제인 AA와는달리순수한화합물이아닌조추출물이기때문에낮은것으로생각된다. Chung 32) 은한국산약초잎의항산화효과를측정한결과삼나물, 삽주, 오갈피나뭇잎이 90% 이상의 hydroxyl radical 소거능을나타낸다고보고한바있다. 또한 luteolin-7-o-β-d glucoside의 hydroxy radical 소거능이 0.1 mg/ml의농도에서도 77.5% 그리고 1 mg/ml에서 99.1% 의강한 hydroxy radical 소거능을보고한바있다. Lee 등 33) 은울릉도산산채식물들중쇠무릎잎과뿌리, 물엉겅퀴씨, 울릉미역취씨는 116.9, 84.8, 94.3, 93.9% 로높은저해율을보였다고보고하였다. 따라서, LF 추출물은이들천연물과비교하여저농도에서 hydroxyl radical을 50% 이상소거하여 microsome의지질과산화를효과적으로억제시킬것으로사료되었다. Nitric oxide (NO) radical은생리적인현상인혈압조절과신경전달매개체로작용하며, 면역반응에중추적인역할을하고있으며, 뼈를형성하는 chonodrocyte와 synoviocyte같은세포에서도발현되며, 과량의 NO 생성이염증반응을일으키고, 조직의파괴및면역체계의이상을일으킨다고보고되고있다 11,12). LF 추출물의발암성 nitrosamine의직접적인생성인자인 nitric oxide 소거활성을측정한결과 LF의 IC 50 값이 9.79±0.18 μg/ml 로탁월하게높은 NO radical 소거활성을나타내었다. 반면, 대조군으로이용된 AA (IC 50=59.79±2.96 μg/ml) 는 LF에비해현저히낮은소거효과를보였다. Lee 등 34) 의연구에서올리브용매별추출물의농도가증가할수록 NO radical 소거활성이 72.8% 까지뚜렷히증가하는경향을보였으며한약재로쓰이는약용식물추출물의 NO radical 소거능을살펴본연구 35) 에서는동일조건에서당귀 35%, 목통 42%, 골담초 33%, 찔레영지버섯 64% 의제거능을나타나본실험에서사용한 LF의 NO radical 소거능은높은수준의활성을보인것이라사료된다. Peroxynitrite는 superoxide anion과 nitric oxide의제한된반응에의해생성되는강력한생물학적산화제로유리형 L-tyrosine 또는단백질내 tyrosine 잔기의 nitration을유도하여정상적단백질형태에영향을미치게된다. Peroxynitrite의생성비율은 superoxide anion 및 nitric oxide의농도에의존되는데비록작은양의기질증가에의해서도 peroxynitrite 생성량은현 저하게증가되어세포독성효과를나타내게된다. 또한, peroxynitrite는자극을받은대식세포, 호중구, 내피세포에서생성되며동맥경화성심장질환, 급성폐렴, 만성염증시 in vivo에서도생성된다. 이는 in vitro와 in vivo에서강력한산화제로작용하며단백질, 아미노산, DNA 등과반응하여세포및조직손상을야기할뿐만아니라노화, 암, 관절염, 동맥경화, 피부염증등여러질환을유발하는것으로보고되고있다 36,37). 본실험은 peroxynitrite 소거능실험으로 LF 추출물이 RNS의생성을효과적으로방지할수있는지를살펴보고자하였다. LF 열수추출물의 peroxynitrite 소거효과를측정한결과, 열수추출물 (IC 50=4.10±0.25 μg/ml) 의 peroxynitrite 소거효과는대조군으로사용된 AA(IC 50=2.54±0.04 μg/ml) 보다는낮았으나비교적높은소거효과를보여, LF가효과적인 peroxynitrite 소거제로작용함을알수있었다 (Table 3). Lee 등 38) 은 20종염생식물의유기용매추출물에대해 peroxynitrite 소거활성을측정한결과해당화메탄올추출물에서 L-ascorbic acid 및 penicillamin과유사한 97.03% 의소거활성을나타내었다고보고한바있다. Table 3. Reactive oxygen species and reactive nitrogen species scavenging activities of the extract of LF. LF Positive control W a AA BHT Superoxide anion scavenging activities 2.69±0.38 b 1.22±0.02 NA c (IC 50=mg/mL) Hydroxyl radical scavenging activities 634.46±12.47 b 59.79±2.96 NA c Nitric oxide radical scavenging activities 9.79±0.18 b 59.79±2.96 NA c Peroxynitrite scavenging activities 4.10±0.25 b 2.54±0.04 572.41±28.90 a: W, water extract; AA, ascorbic acid, b: Each value represents the mean ± SE of triplicate measurements, c: NA is not active. 3. RT-PCR 에의한항산화효소계활성 죽상동맥경화, 염증, 당뇨, 허혈성심장질환등을포함하는퇴행성질환의원인으로여겨지는산화적인스트레스에대한보호기작으로생체는 SOD, GPx, GR 및 catlase 등의효소적항산화방어체계를활성화시키게된다 10). 본연구에서 HepG2 세포에 H 2O 2 로산화적스트레스를유발한뒤 LF 추출물을처리하여세포의산화적손상및항산화효소의 mrna 발현을관찰하였다. 그결과, Fig. 1에나타난바와같이 Cu Zn-SOD의 mrna 발현에있어 HepG2 세포에 H 2O 2 를처리하였을때, 항산화효소활성이현저히감소되었으나 LF 추출물농도에의존적으로항산화효소활성이증가하는것을관찰할수있었다. 반면 GPx, GR 및 catalase의 mrna 발현양상에는큰변화가나타나지않았다. 이상의결과로부터 LF는산화적스트레스로부터의세포내손상을효과적으로방어하는것으로사료되었다. 4. Relative Electrophoretic Mobility (REM) Assay에의한 LF의 LDL 산화억제효과 - 1513 -
주신탁 이민자 이혜숙 정현정 김혁 김재은 박선동 박원환 LDL은주로인지질, cholesterol ester, cholesterol, apo B-100 등으로구성된 heterogeneous molecule이다 39). In vitro 연구에서지질과산화를측정하기위해 apo B-100의산화적손상을평가하는방법인 REM assay를실시하였다. Fig. 2는 Cu 2+ 에의해유도되는 LDL 과산화의 REM에대한 LF의효과를보여주고있다. Native LDL의 REM을 1이라고가정했을때, Cu 2+ 첨가에의해 REM이 4.2까지증가하였고, LF 첨가에의해 1, 10 μg/ml 농도에서각각 1.1, 1.0까지감소되어 62.5%, 68.7% 의 LDL 산화보호효과를나타내었다. 본실험에서 LF의유리기소거효과는 LDL 과산화억제효과에영향을미쳐 LF 추출물이유리기를안정한형태의대사물로변화시켜 radical chain 반응을종결시킬것으로사료되었다. Fig. 1. Effects of LF on hepatic antioxidative enzymes (SOD, GPx, GR and catalase) mrnas expression after H 2O 2 exposure in HepG2 cells by RT-PCR. A PCR blot of antioxidant enzyme mrnas obtained by RT-PCR after exposure of HepG2 cells to indicated concentrations of H 2O 2 for 24 hrs. Lane 1,8: M, step-ladder marker; Lane 2: Control; Lane 3,4: 5, 10 μg/ml of LF; Lanes 5: 1 mm of H 2O 2; Lanes 6,7: 1 mm of H 2O 2 + 5, 10 μg/ml of LF (A) (B) Relative electrophoretic mobility (protection %) 120 100 80 60 40 20 0 Native LDL Ox-LDL W-1 W-10 Fig. 2. The relative electrophoretic mobility (REM) of human LDL incubated with Cu 2+ and with or without extracts of LF. LDL (120 μ g/ml) was oxidized with 10 μm CuSO 4 at 37 in the presence of LF extracts for 12 h. (A) Lane 1: native LDL; Lane 2: LDL and Cu 2+ ; Lane 3: LDL and Cu 2+ and 1 μg of LF; Lanes 4: LDL and Cu 2+ and 10 μg of LF (B) Protection rate (%), Each value represents the mean ± SE of triplicate measurements. 5. LF의 human LDL 산화억제효과 LDL은단구-마크로파지와평활근세포 (smooth muscle cell), 내피세포 (endothelial cell) 와같은동맥벽의주요세포에서철, 구리와같은전이금속에의해산화적으로변형될수있다 40,41). LDL의초기산화에서는상대적으로 apo B-100 단백질은고유의성질을유지하게되며 LDL 입자는최소한으로변형된다. 그러나반응이진전되고계속되면산화된지질산물은입자내에서증가하고축적된다. 그리고 apo B-100 단백질에서아미노산잔기를변형시켜 LDL 입자의음전하를증가시키고 LDL의단백질구성성분을단편화시킨다. 이러한 apo B-100 단백질의산화적변형은 LDL 수용체와의결합을막고 scavenger acetyl-ldl 수용체와상호작용하는새로운 binding epitope를생성하고, 입자의 lipid core에서 cholesterol ester로부터 oxysterols를생성하게할뿐아니라 phosphatidylcholine을 lysophosphatidylcholine으로전환시켜서세포독성을나타낸다 11,39). CuSO 4 유도-LDL 산화억제효과에대한 LF 추출물의효과를검토한결과 Table 4에나타난바와같이 LF 열수추출물은 IC 50 값이 53.14.±2.06 μg/ml로대조군으로사용된 AA (IC 50=21.09±0.62 μg/ml) 및 BHT (IC 50=26.31±0.22 μg/ml) 보다는낮았으나, 비교적높은효과를나타내었다. Zhenbao 등 42) 은육계에틸아세테이트, 부탄올, 물층의 LDL 산화억제효과를측정한결과 0.25 1 mg/ml의농도에서농도의존적으로 malondialdehyde (MDA) 의생성을억제하였으며, 특히에틸아세테이트층의효과가 0.5 mg/ml 농도에서 61.88% 로가장높았다고보고하였다. 본실험에서 LF 열수추출물의경우 53.14 μg/ml 농도에서 LDL 산화를 50% 억제하였으므로육계보다더우수한 LDL 산화억제활성을나타내었다. 이상의결과로본실험에이용한 LF의강력한항산화활성이산화 LDL 내의지질과산화물의축적에의해일어나는각종연쇄반응을억제함으로써세포의존성동맥경화의초기단계를예방할수있는기능성물질로이용될수있음을시사한다. Table 4. Inhibitory effect on Cu 2+ -induced LDL oxidation of the extract of LF. LF Positive control W a AA BHT Inhibitory effect on Cu 2+ - induced LDL oxidation 53.14.±2.06 b 21.09±0.62 26.31±0.22 a: W, water extract; AA, ascorbic acid, b: Each value represents the IC50, mean ± SE of triplicate measurements. 6. LF 에의한 fibrinolytic clear zone 의측정 혈관계질환의주요원인은체내혈액의응고와용해의불균형에그원인이있다고할수있다. 혈전의생성은과도한스트레스, 노화, 지방성분의과다섭취등의요인에의해그생성이크게촉진되며또한이와같은요인은생체내의혈전용해시스템을억제하는것으로알려져있다. 현재까지사용되어온혈전용해제로서는바실러스속으로부터분리되는단백질제제 (streptokinase 등 ), 생물학적제제 (urokinase 등 ) 및은행엽또는산사자를함유한한방및생약제제가사용되고있으나, 이러한종래의혈전용해제들은혈전의중요성분인피브린을직접분해하여작용하는것이아니라플라스미노겐을플라스민으로활성화시켜플라스민이혈전을용해한다. 또한, 이들제제는혈전관 - 1514 -
Lonicera Flower 의항산화활성과 LDL 산화억제효과및혈전용해능에관한연구 련질환의치료목적을달성하는데한계가있으므로근본적으로혈전용해제의치료목적을달성할수있는혈전용해제의개발이시급히요구되고있는실정이다. 본연구에서 LF 추출물의혈전분해활성을 fibrin plate 상에서평가한결과, fibrin clot을효과적으로분해하였다 (Fig. 3). 반응시작 15 시간이경과된후혈전분해량이눈에띄게증가하였으며 20 시간후분해된혈전은약 3,648 mg으로, LF의항산화 항염증효과를통한혈전용해능을관찰할수있었다. Aggregation (%) 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 Fig. 4. Effects of the extract of LF on the platelet aggregation induced by collagen. 1. Platelet rich plasma (PRP) 400 μl+d.w 50 μl; 2. PRP 400 μl+d.w 50 μl+collagen 50 μl (100 μg/ml); 3. PRP 400 μl+collagen 50 μl (100 μg/ml)+lf 10 μl (50 μg/ml); 4. PRP 400 μl+collagen 50 μl (100 μ g/ml)+lf 20 μl (50 μg/ml); 5. PRP 400 μl+collagen 50 μl (100 μg/ml)+lf 50 μl (50 μg/ml); 6. PRP 400 μl+collagen 50 μl (100 μg/ml)+eugenol 50 μl (50 μg/ml). Fig. 3. Fibrinolytic activity of LF by fibrin-plate assay. 7. LF의혈소판응집억제활성혈전성유발질환의원인으로고혈압설, 지질침착설및혈류부전설등이알려져있지만이들중어느학설로도혈전성질환을완벽하게설명할수는없다. 가장설득력있는가설은혈관상해반응설 (response-to-injury) 로이상해반응에는혈소판의응집반응이주요한역할을한다. 즉, 혈관손상부위로부터의지혈과혈전에관련하는반응이바로혈소판응집반응이다. 고지혈증, 비만, 고혈압, 당뇨병등에의해혈관내막이손상되면지혈을시키기위해혈소판의혈관조직의손상부위에점착되고혈소판의형태변화가일어나혈소판응집이라는일련의혈전형성단계의반응이일어난다 43). 따라서, 혈소판이각종과민반응에의해활성화되면혈전성질환인동맥경화, 심근경색, 뇌졸중등의발현에기여할뿐만아니라, 혈소판활성시순환혈액내방출되는혈소판저장물질과각종인테그린은염증반응을중재하는데도중요한역할을하는것으로알려져있다. 이러한혈전관련질환은우리나라뿐만아니라세계적으로도주요한사망원인이되고있어이를예방하고치료하는데관심이높다. 따라서본연구에서는 LF의혈행개선과관련한 in vitro 실험적효능평가방법으로전혈응집억제능을실시하였다. 농도별 LF 추출물에대한혈소판응집억제활성을측정한결과, 음성대조군으로혈소판에증류수만을처리하였을때는 5분동안 19.04% 의혈소판응집률을보였고, 양성대조군으로혈소판, 증류수외에혈소판응집제인 collagen을첨가하였을때는 94.58% 의응집률을보였다. LF 추출물을최종농도 1, 2, 5 μg/ml로처리했을때, 각각 83.14%, 62.67%, 24.34% 의혈소판응집률을보여농도의존적응집억제효과를나타내었다. 또한잘알려진혈소판응집억제물질인 eugenol을처리했을때, 혈소판응집률이 25.68% 로약 75% 의응집억제효과를보여 LF가 eugenol과유사한억제효과를보여동맥경화의예방및치료에응용할수있을것으로기대되었다. 결론 항염증작용을하는대표적인약물인 LF를열수추출하여 in vitro 상에서항산화효과, LDL 산화억제효과, 혈전용해능및혈소판응집억제효과에대한연구를통하여다음과같은결론을얻었다. TEAC법에의한 LF 열수추출물의항산화효과와 DPPH를이용한유리기소거효과를측정한결과 LF 열수추출물의유의한항산화효과를확인하였으나, AA 및 BHT와비교하여다소낮은항산화활성을갖는것으로보였다. ROS (superoxide anion, hydroxyl radical) 소거효과및 RNS (NO radical, peroxynitrite) 소거효과에대한 LF 열수추출물의효과를알아본결과, 특히 RNS 소거활성이우수한것으로나타났다. H 2O 2 로자극된 Hep G2 세포의항산화효소계 mrna 발현에미치는 LF 추출물의영향을살펴본결과, LF 추출물처리에따른 GPx, GR 및 catalase의 mrna 발현변화는관찰되지않았으나, Cu Zn-SOD의유의적인증가를확인하였다. LF 추출물의 human LDL 산화억제효과를검토한결과 AA 및 BHT 보다는낮았으나, 비교적우수한 LDL 산화억제효과를보였다. LF 추출물의혈전분해활성을관찰한결과, LF 추출물에의한유의적인 fibrin 분해증가를확인하였다. 농도별 LF 추출물에대한혈소판응집억제활성을측정한결과, collagen 유도혈소판응집에대해농도의존적응집억제효과를나타내었다. 이상의결과로 LF는우수한항산화활성과 LDL 산화를억제효과, 항혈전및혈소판응집효과를바탕으로동맥경화예방및치료소재로의개발가능성이매우높을것으로사료된다. 감사의글 본연구는과학기술부 / 한국과학재단기초의과학연구센터육성사업 (grant #: R13-2005-01001-0) 및동국대학교학술지원사업비의지원으로수행되었음. - 1515 -
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