07.fm

pissn 1229-1153 / eissn 2465-9223 J. Food Hyg. Saf. Vol. 31, No. 4, pp. 286~293 (2016) http://dx.doi.org/10.13103/jfhs.2016.31.4.286 Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.kr Ursolic acid 의위손상에대한방어효과 김선회 황인영 이선이 정춘식 * 덕성여자대학교약학대학 Protective Effects on Gastric Lesion of Ursolic acid Sun Whoe Kim, In Young Hwang, Sun Yi Lee, and Choon Sik Jeong* College of Pharmacy, Duksung women's University, Seoul 01369, South Korea (Received May 30, 2016/Revised June 20, 2016/Accepted July 12, 2016) ABSTRACT - This study is an experiment for gastric protective effects of ursolic acid. In order to identify the effects of ursolic acid on gastrointestinal disorder, acute and chronic gastritis were also observed using HCl ethanol and indomethacin-induced gastric lesion models, respectively. As for gastric acid, it was also identified through proton pump (H + /K + -ATPase) inhibiting activity. In regards to protective factor for gastric damage, prostaglandin E 2 (PGE 2 ) was quantitatively analyzed. Antibacterial activity experiment was done on Helicobacter pylori (H.pylori), which is known to be the causing factor of chronic gastritis, gastric ulcer and gastric cancer. By making use of AGS cell, it was confirmed that ursolic acid was involved in apoptosis of gastric cancer cell through 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) staining and flow cytometry analysis. As a result, ursolic acid reduced gastric lesions caused by HCl ethanol and indomethacin. Ursolic acid inhibited acid secretion by inhibiting proton pump (H + /K + -ATPase), which is the gastric acid secreting enzyme involved at the final phase of gastric acid secretion. And ursolic acid was identified with gastric mucosa protection effects by increasing the concentration of PGE 2, a protective factor of gastric mucosa preservation. The antibacterial activity on H. pylori, which is aggressive factor in gastrointestinal disorder, ursolic acid showed inhibitory effects on H. pylori colonization. In the DAPI nuclear staining, unlike the control group, shape of the nucleus has deformed, and has been observed either shrinked cell or chromatin condensation phenomenon. In the Flow cytometry assay, confirmed the growth rate of apoptosis in a concentration-dependent manner. Key words : H + /K + -ATPase, PGE 2, H. pylori, Apoptosis 위는위장의운동및소화액분비등의특징에의해급만성위염, 소화성궤양, 소화불량, 위암등여러가지병리가발생하는기관이다. 본연구에서는경험적으로효능과안전성이입증된천연물유래성분에서위손상을개선할수있는물질을찾기위해열을내리고답답함을없애열병, 흉통, 위산과다, 구내염, 황달, 담낭염등에효능이있는치자시탕 ( 梔子湯 ) 의조성물중치자 ( 梔子 ) 의성분인 ursolic acid를이용하여실험하였다. Ursolic acid는항균항염작용항암작용을이용한의약품의연구 1,2), 치과영역에서구강염증에활용방안연구 3,4,5), 항산화작용을이용한피부미용의미백, 청각세포보호연구 6), 골격근에서의에너지소비증가 7), 등국내외적으로연구가많이되고있는성분으로알려져있다. 올레아놀산과구조가유사하 *Correspondence to: Choon Sik Jeong, College of Pharmacy, Duksung women's University, Seoul 01369, Republic of Korea Tel: 82-2-901-8382, Fax: 82-2-901-8386 E-mail: choonsik@duksung.ac.kr 여비슷한항암작용을하며특히, 다제내성암세포를효과적으로억제하고혈관신생을저지하여암세포의성장과침습, 전이를봉쇄하는것으로보고되었다. 또한 ursolic acid는 NF-κB 활성도를차단하여암유전자의핵내전사를못하게하여암증식을억제시킨다고 2003년도 Cancer Research 논문에에보고된바있다. 이외에도 ursolic acid 는 caspase 3을통하여 apoptosis를유도한다고한다 8). 또한우리국민들의사랑을많이받는오매추출물이 Helicobacter pylori (H. pylori) 의 urease활성에강한억제력을나타내었는데 NMR분석에의해정제된오매추출물에함유된활성성분이 ursolic acid로확인되었다. 오매에함유된이성분이항생제를대신하여 H. pylori의항균작용을돕는약물로활용될수있음을시사하고있다 9). 이러한연구결과를토대로본실험에서는 ursolic acid의위장관질환및위암에대한효능을확인하고자한다. 에탄올과염산의경구투여는위장점막방어체계를손상시켜위점막의 necrosis와 apoptosis를가속화시켜급성위 286

Protective Effects on Gastric Lesion of Ursolic acid 287 염을발생시킨다. 또한 nonsteroidal antiinflammatory drug (NSAID) 인 indomethacin을경구투여시위장관에직접적인국소적손상과간접적인점막저항성감소뿐아니라점막의 Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 분비의억제로인한점액층과 HCO 3 의감소에의해궤양이만들어진다. 이를이용하여각각위염및위궤양동물모델을만들어 ursolic acid의위손상억제효과를확인하였다. 또한, 위손상에있어중요한공격인자인과도한위산에대한억제효과를확인하기위해흰쥐기초위액분비량, ph 및산분비량에미치는작용을확인하였다. Proton pump (H + /K + -ATPase) 는위내에서 H + 가 Cl 와반응하여염산을만드는벽세포의자가항체로알려져있으며이에대한억제활성도함께확인하였다. 위손상에대한보호인자로는아라키돈산캐스케이드 (arachidonate cascade) 에서생성되어위점막에대한방어인자로작용하는 PGE 2 에대한정량을실시하였다. H. pylori는만성위염, 위궤양, 위축성위염및위암의발병원인으로잘알려져있는균이다. 궤양의치료에있어위산분비억제제와더불어항생제투여를할경우 H. pylori의제균치료는재발률을현저히낮추는것으로보고되었다. 따라서 H. pylori에대한항균활성효능을확인해보았다. 위암세포로는 AGS 세포주를사용하여암세포에대한세포독성을 MTT assay을통해확인하였다. 또한 DAPI 핵염색법및 flow cytometry analysis를실시함으로써 ursolic acid가암세포의 apoptosis를유발함을확인하였다. Materials and Methods 재료본실험에사용된소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), phosphate buffer saline (PBS) 10X, penicilin-streptomycin, RPMI medium 1640 및 trypsin-edta 는 Gibco (Massachusetts, USA) 에서구입하여사용하였고, ampicillin, adenosine triphosphate (ATP), cimetidine, DAPI, indomethacin, phenol red, Tris-HCl은 Sigma-Aldrich (Missouri, USA) 에서, magnesium chloride는 Wako (Osaka, Japan) 에서, potassium chloride, eher, ethanol, trichloroacetic acid는삼천화학 (Kyunggi-do, Korea) 에서, ApoScreen TM annexinv-fitc kit 는 Southern Biotech (Alabama, usa) 에서 rebamipide는대희화학 (Kyunggi-do, Korea) 에서, HCl, sodium biocarbonate, sodium hydroxide, methyl orange는덕산화학 (Kyunggi-do, Korea) 에서, PGE 2 assay kit는 R&D Systems (Minneapolis, USA) 에서구입하여사용하였으며기타시약및용매는분석용일급시약을사용하였다. 실험동물샘다코 ( 주 ) 에서분양받은체중 170~190 g 의 Sprague- Dawley계웅성흰쥐및체중 28-32 g의 ICR계웅성생쥐를 22 ± 2 o C에서 2주간사육하여적응시킨뒤실험에사용하였으며동물실내의명암은 12시간씩자동조절시켰고고형사료 ( 삼양사료 ) 및물은충분히공급하였다. 위암세포주및균주 AGS cell은 Korean Cell Line Bank (KCRB) 에서구입하였고, SNU638, AGS 배양액은 RPMI1640에 10% FBS, 100 units/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을혼합하여사용하였다. 세포배양액은 5% CO 2 로조정된배양기내에서 37 o C로배양하였으며배양된세포는 1% trypsin- EDTA에부유시킨후사용하였다. Helicobacter pylori는 Korean Type Culture Collection (KTCC) 에서구입하였다. 위염및위궤양에대한실험 HCl ethanol에의한위염급성위염에대한보호효과를알아보고자체중 180 g 내외의수컷흰쥐를사용하여 24시간절식시킨후, 검체를경구투여하고 30분뒤에 HCl ethanol (60% ethanol에 150 mm HCl을함유 ) 1 ml를경구투여하고절식, 절수하에 1시간방치한뒤 ether로치사시켜위를적출하였다. 적출한위를 2% formalin 수용액으로 10분간침적하여위내외를가볍게고정한다음대만부를절개하여선위부에발생한손상의길이 (mm) 를현미경 ( 10) 하에서측정하여 gastric lesion index로하였다 10). Indomethacine에의한위궤양위궤양에대한보호효과를알아보고자체중 180 g 내외의수컷흰쥐를사용하여 24시간절식시킨후, Kasuya 11) 등의방법에따라 30 mg/kg의 indomethacin을 50 mm sodium biocarbonate solution에함께녹여 2 ml/kg의용량으로피하주사하였다. 정상군에서는동일한양의 50 mm sodium biocarbonate solution을투여하였다. 실험동물은 indomethacin투여 7시간후에희생하여위를적출하였다. 적출한위는 2% formalin 수용액으로 10분간침적하여위내외를가볍게고정한다음대만부를절개하여선위부에발생한손상면적 (mm 2 ) 을현미경 ( 10) 하에서측정하여 gastric lesion index로하였다. 위액분비량, ph 및산분비량에미치는작용 위손상의공격인자로작용할수있는위액의분비량과 ph 및산분비량 (total acid output) 을알아보기위하여, 체중 200 g 내외의수컷흰쥐를사용하여 24시간절식시킨후 ether 마취하에개복하고위의유문부를결찰하고측정하였다 12). 즉, 흰쥐를 ether 마취하에개복하고위의유문부를결찰하고 ursolic acid를십이지장내로주입한뒤 4

288 Sun Whoe Kim, In Young Hwang, Sun Yi Lee, and Choon Sik Jeong 시간후에치사시켜위를적출하여위액을채취하였다. 채취한위액은 3,000 rpm에서 10분간원심분리한후위액량, ph 및산분비량을측정하였다. 산도는 phenol red를지시약으로하여 0.1 N NaOH로적정하였으며 ph는 electrode ph meter로측정하였다. H + /K + -ATPase의활성 H + /K + -ATPase는위산을분비하는효소로서 H + 펌프 (proton pump) 이다. 냉동된 pig의 gastric membrane protein을 bradford법으로정량한후 300 μg protein으로실험하였다. 20 mm Tris-HCl(pH 7.4) 와 ursolic acid를 assay medium에가하고 37 o C에서 30분간 preincubation시킨다. 2 mm MgCl 2, 2 mm ATP, 2 mm KCl, 20 mm Tris-HCl(pH7.4) 를포함하는 substrate mixture를 0.5mL씩가하고 37 o C에서정확히 30분간배양한다. 여기에 22% trichloroacetic acid 0.2 ml 를가하여반응을종결시키고 4 o C에서 15분간 3,000 rpm 으로원심분리후상징액을취해 ATP hydrolysis에의해생성된무기인산염의정량을실시한다. Inorganic phosphate 의정량은이상의과정을통해얻은상징액에 molybdic acid solution 0.4 ml를가한후, 400 nm에서흡광도 (ASIS UVM340) 를측정하였다. Prostaglandin E 2 정량 Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 는대표적인위손상에대한보호인자로, 음성대조군으로 indomethacin과양성대조군으로 rebamipide를사용 13) 하여 PGE 2 assay kit (R&D Systems, KGE004) 로정량하였다. 즉, 96 well plate에 AGS cell의농도를 1 10 4 /well이되도록하고, ursolic acid를농도에맞게처리하여 1시간 preincubation 하고 50 μl의 primary antibody solution을가하여 1시간동안 shaking 후 50 μl conjugate를첨가하고 2시간 shaking 후 wash buffer를이용하여 4번씻어주고 200 ul의 substrate solution을가하여 30분암실에서방치후 100 μl의 stop solution을넣어반응을종결시키고 30분이내에 450 nm와 540 nm에서흡광도 (ASIS UVM340) 를측정하였다. Helicobacter pylori 균에대한항균활성만성위염및위궤양, 위암의원인인자로잘알려진 H. pylori 14) 생장억제효과를확인하기위하여 Bae의방법 15) 및 Kim의방법 16) 을조금변형하여실험하였다. 먼저 7mL 의 brucella agar 배지및 7% 의 horse serum이담긴 petri dish에해당농도로녹인 1mL의 ursolic acid를주입한다. 여기에 5 10 5 CFU의 H. pylori 를분주하고 37 o C에서 AnaeroPak Campylo (Mitsubishi Gas chemical, 85% N 2, 10% CO 2 and 5% O 2 ) 를이용하여 3일간배양한다. 양성 대조군으로써 ampicillin 을사용하였다. 위암세포사멸에대한실험 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylinodole 핵염색법 dihydrochloride) DAPI는핵을염색하는 dye로, apoptosis가일어나면 DAPI의결합능이좋아져 brightness의 intensity가증가하며핵의분절 (nuclear fragmentation) 이관찰된다. 이를이용하여체외배양중인 AGS cell에 ursolic acid 처리시세포의핵변화를시각화하기위하여 DAPI 핵염색법을수행하였다. 24 well plate에 AGS cell (2 10 5 cells/ml) 를넣은후 37 o C 배양기에증식시켜 ursolic acid를처리하여 24시간 37 o C 배양기에서배양후, 1 PBS로 3번깨끗이세정해주고, 4% p-form aldehyde solution으로 20분간고정하여, 최종농도를 4μg/mL의 DAPI로 10분간염색하였다. 그후 PBS로 10분간 3회세척하고 mounting 후형광현미경에서무작위로선정된현미경 (Zeiss LSM 700) 시야의세포를촬영기록한후그영상에서세포사멸을분석하였다. Flow cytometry assay 세포를 4 o C에서 16시간이상방치한후, flow cytometry 로 DNA content를분석한다. 세포를 PBS로세척한후, trypsinization하여세포를배양용기로부터탈리시킨다음, 원심분리 (1,200 rpm) 하여세포 pellet을얻고, 다시 PBS와 McIlvaine's buffer (0.2 M Na2HPO4, 0.1 M citric acid, ph 7.5) 1:1 혼합액으로세척후찬 (4 o C) ethanol 2 vol을가하여조심스럽게섞어서고정시킨세포를 0.1% Triton X- 100, 32 μg/ml RNase A 및 50 μg/ml propidium iodide를포함하는 4 mm sodium citrate 용액에현탁시킨다. 세포를 4 o C에서 16시간이상방치한후, flow cytometry (Easycyte guava, Merck Millipore) 로 DNA content를분석한다. 통계처리 모든실험결과는평균치와표준오차를계산하고, 각군간의차이는 Student t-test를사용하여 p < 0.05 일때통계적으로유의성이있다고판정하였다. 여러가지실험방법에의해위염및위궤양을유발시켰을때실험약물에의한위염및위궤양의억제작용은다음과같이 inhibition (%) 로나타내었다. *Inhibition(%) = Control lesion index Sample lesion index 100 Control lesion index

Protective Effects on Gastric Lesion of Ursolic acid 289 Table 1. Effect of ursolic acid on HCl ethanol-induced gastritis in rats Treatment Dose (mg/kg) Results and Discussion 위염및위궤양에대한실험 Lesion index (mm) Inhibition (%) Control - 99.5 ± 19.9-50 92.8 ± 8.7 6.7 Ursolic acid 100 91.5 ± 11.0 8.0 Hydrotalcite 100 65.0 ± 12.7 * 34.7 The value represents the mean ± S.D. Significantly difference, *p < 0.01 compared to the control. Table 2. Effect of ursolic acid on indomethacin-induced gastric ulcer in rats Treatment Dose (mg/kg) Lesion index (mm 2 ) Inhibition (%) Control - 22.3 ± 9.4-50 18.6 ± 9.2 16.6 Ursolic acid 100 17.0 ± 12.2 23.6 Cimetidine 150 12.0 ± 3.7 46.1 The value represents the mean ± S.D. Table 3. Effect of ursolic acid on gastric secretion in pylorusligated rats Treatment Dose (mg/kg) Volume (ml) HCl ethanol에의한위염동물모델을사용하여 HCl ethanol로유발된위염에대한효과를알아보고자실험한결과, 대조군의경우위손상지수가 99.5 ± 19.9 mm인것에비하여 ursolic acid는 100 mg/kg 투여시 91.5± 110mm로 8.0% 억제하였고양성대조군으로사용한 hydrotalcite는 100 mg/kg 투여시 65.0 ± 12.7 mm로손상지수를 34.7% 억제하였다. 이는위장점막방어체계의손상을억제함으로써나타난결과로생각된다 (Table 1). ph Total acid output (meq/4hrs) Control - 7.0 ± 0.7 1.4 ± 0.1 0.7 ± 0.1 50 6.0 ± 0.5 1.4 ± 0.1 0.6 ± 0.1 Ursolic acid 100 5.3 ± 0.5 ** 1.5 ± 0.1 * 0.5 ± 0.1 * Cimetidin 150 3.5 ± 0.6 *** 2.2 ± 0.4 ** 0.3 ± 0.0 *** The value represents the mean ± S.D. Significantly difference, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compared to the control. Fig. 1. Structure of Ursolic acid. 징으로, 점막혈류의감소와 PG 분비의억제로인한점액층과 HCO 3 의감소에의해위장내병변이유도된다. 동물모델을이용하여 indomethacin 투여후위손상을살펴보았다. 대조군에서는 22.3 ± 9.4 mm 2 로궤양병소가확인되었고 ursolic acid 50 mg/kg 18.6 ± 9.2 mm 2, ursolic acid 100 mg/kg 17.0 ± 12.2 mm 2 의궤양변소가관찰되어, 대조군에비하여각각 16.6%, 23.6% 억제된결과로양성대조군인 cimetidine 46.1% 에비해유의성있게억제되었다. 이는 ursolic acid가유의성있는방어효과가있었으며, indomethacin에의한위손상에대해점액분비의중가나방어인자의존재를확인할수있다 (Table 2). 위액분비량, ph 및산분비량실험 흰쥐의위액분비량과 ph 및산분비량에미치는작용실험을통해공격인자인위액에의한위손상억제 mechanism 을확인하였다. 그결과, 대조군의위액 volume은 7.0 ± 0.7 ml, ph는 1.4 ± 0.1이었으며 total acid output (TAO) 은 0.7 ± 0.1 meq/4hrs로나타났다. ursolic acid를투여하였을때위액 volume은 5.3 ± 0.5 ml, ph는 1.5 ± 0.1이었으며 total acid output (TAO) 은 0.5 ± 0.1 meq/4hrs로나타났다. Ursolic acid는양성대조군으로사용한 cimetidine 보다는약하지만위액의 volume을줄이고, ph를약간올렸으며 TAO를줄인것으로나타나공격인자에대한방어작용을보이는것으로생각된다 (Table 3). H + /K + -ATPase의활성억제 H + /K + -ATPase의활성을측정한결과는, 양성대조군인 pantoprazole이 50 μm과 100 μm에서각각 33.7%, 36.2% 의억제효과를보였으며 ursolic acid는 35.0%, 32.4% 로억제하였다. 따라서 ursolic acid는용량의존적으로 H + /K + - ATPase활성을억제하지는않았으나위산분비억제의효능을보여 ursolic aicd의위산분비억제기전을제시하였다 (Fig. 2). Indomethacin 에의한흰쥐위궤양 Indomethacin 을경구투여하였을때산화적손상을특 Prostaglandin E 2 정량 AGS cell 을이용하여 ursolic acid 를처리하여 PGE 2 를정

290 Sun Whoe Kim, In Young Hwang, Sun Yi Lee, and Choon Sik Jeong Table 4. Colonization inhibiting activity of ursolic acid on H.pylori Material Dose (µg/ml) Colonization Control - ++++ Ursolic acid 10 ++ 50 ++ 100 + 10 - Ampicillin 50-100 - : none, +: 1-64 colonies, ++: 65-84 colonies, +++: 85-104 colonies, ++++: > 105 colonies Fig. 2. H + /K + -ATPase inhibitory activity of ursolic acid. The value represents the mean ± S.D. Significantly difference, *p < 0.05 compared to the control. 보다는약하지만용량을증가하거나장기간복용시상당한효과가있을것으로기대된다 (Table 4). 위암세포사멸에대한실험 Fig. 3. Quantification of Prostaglandin E 2 of ursolic acid in AGS cell. The value represents the mean ± S.D. Significantly difference, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compared to the control. 량하였다. 실험결과, 위점막보호제로사용하는 rebamipide 는 50 μm과 100 μm에서각각 184.9 pg/ml, 446.8 pg/ml의 PGE 2 가생성되어농도의존적으로증가되었다. 반면아라키돈산에서 PGE 2 로의생합성을억제하는 indomethcin은 50 μm과 100 μm에서각각 28.5 pg/ml, 15.2 pg/ml로농도의존적으로감소시켰다. 50 μm과 100 μm로처리시 ursolic acid는 109.3 pg/ml, 224.9 pg/ml로확인되어우수한작용을나타내었으며같은농도에서 rebamipide 보다는낮지만농도의존적으로증가하는것을확인할수있었으며, ursolic acid가위점막방어인자를증강시킴으로써위를보호함을나타냈다 (Fig. 3). Helicobacter pylori 균에대한항균활성만성위염, 위궤양및위암의원인으로알려진 H. pylori 에대한항균효과를실험한결과대조군에비하여 (++++) ursolic acid 10 μg/ml 및 50 μg/ml에서 H. pylori 에대한항균작용 (++) 을, 100 μg/ml에서 H. pylori 에대한항균작용 (+) 을확인할수있었다. 양성대조군으로사용한 ampicillin DAPI 핵염색법 DAPI staining은핵을염색하여세포의형태학적변화를시각화하는분석방법으로 DAPI가 intact cell membrane 을투과하여 DNA와 binding 하여약 358 nm (Max) 파장대의빛을흡수하여파랑 ~ 남색의형광을나타내는것으로확인한다. DAPI는 nucleus 상태에따라의존적으로막투과성이다르게나타나며 apoptosis 혹은 necrosis가일어나세포막의막투과성이높아지게되면 normal cell에비하여더많은양의 DAPI가핵을투과하여 light intensity가높아지는경향을보인다. Ursolic acid를투여하였을때대조군과달리핵의모양에변형이일어났으며세포모양이수축되거나염색질농축현상이관찰되었다. 또한 light intensity가높아짐을확인할수있었다. 이것은 ursolic acid가 apoptosis를유도하여암세포주들의사멸에관여함을나타낸것이다 (Fig. 4). Flow cytometry assay Apoptosis가일어난세포는단편화된 DNA를소실하므로, flow cytometry 방법을이용하여 sub-g1 DNA content 를가진세포수를측정함으로써 apoptosis를확인, 정량할수있다. Ursolic acid는 early apoptosis가일어나고있는세포수의증가를보여암세포의 apoptosis에관여함을나타냈다 (Fig. 5). Ursolic acid는많은종류의약용식물과인간식이에널리분포되어있는펜타사이클릭트리테르펜화합물이다. 다양한약리학적성질을가지고있는데, 특히종양과관련된인자중 NF-κB의활성화를억제하는것으로보고되었는데 ursolic acid가 NF-κB의 DNA 결합을억제하고 NF-κB 유도키나제 (NIK) 에의해활성화된 NF-κB 의존

Protective Effects on Gastric Lesion of Ursolic acid 291 Fig. 4. Morphological change of ursolic acid in AGS cells. Fig. 5. Flow cytometry analysis of ursolic acid. 수용체 유전자의 발현 및 signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) 신호 전달을 억제함으로써 세 포 사멸을 가져오는 것으로 알려져 있다.17) Uursolic acid의 위에 대한 작용을 알아보고자 실험한 결 과, 위염 및 위궤양에 대한 실험 중 HCl ethanol에 의한 흰 쥐 위염, 실험에서는 대조군 보다 위 손상지수를 억제 하였고, indomethacine에 의한 흰 쥐 위궤양 실험에서도 대조군에 비해 궤양병소를 억제함을 확인하였다. 흰쥐의 위액분비량, ph 및 산분비량에 미치는 작용 실험에서는 공격인자로 작용할 수 있는 위액 volume을 줄이고, ph는 증가시켰으며 total acid output (TAO)도 억제함을 알 수 있었다. H+/K+-ATPase의 활성 실험 결과에서는 ursolic acid 가 용량 의존적으로 H+/K+-ATPase활성을 억제하지는 않았 으나 위산분비억제의 효과가 있음을 알 수 있었다. H. pylori 균에 대한 항균활성 실험결과로 H. pylori 균에 대 한 항균작용(+)을 확인할 수 있었다. 양성대조군으로 사용 한 ampicillin보다는 약하지만 용량을 증가하거나 장기간 복용 시 상당한 효과가 있을 것으로 기대된다. 대표적인 위 보호 인자인 PGE2 정량 실험결과, 양성 대조군으로 사 용된 rebamipide 보다는 낮지만 농도 의존적으로 PGE2를 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 기능성 소화불량에 있어 위저류를 개선시키는 것이 중 요한데, ursolic acid는 위배출능 및 장관 수송능을 향상시 켰다. 위암 세포 사멸에 대한 실험으로 실시한 DAPI 핵 염색법에서는 대조군과 달리 핵의 모양에 변형이 일어났 으며 세포 모양이 수축되거나 염색질 농축 현상이 관찰되 었다. 또한 light intensity가 높아짐을 확인 할 수 있었는 데 이것은 ursolic acid가 암세포의 apoptosis에 효과가 있

292 Sun Whoe Kim, In Young Hwang, Sun Yi Lee, and Choon Sik Jeong 음을나타낸다. Flow cytometry assay결과는농도의존적으로 early apoptosis가일어나고있는세포수의증가를보여암세포의 apoptosis에관여함을나타냈다. 본연구결과, ursolic acid는 HCl ethanol에기인한급성위염과 indomethacin 유발위궤양에실험에서약물을투여하지않은대조군에비해위손상지수를감소시켰으나유의성없는결과를보였지만, gastric secretion 실험에서공격인자로작용할수있는산을중화하는효능이대조군에비해유의적으로증가됨을확인하였다. 위산분비에관여하는 H + /K + -ATPase에서위산분비억제의효과가있어위를보호하였고, PGE 2 양을증가시켜방어인자를증강함으로써위점막을보호하는효능을나타냈다. H. pylori에대한항균활성을나타냈고, AGS 위암세포주로실험한 DAPI 핵염색법과 FACS 실험에서암세포의 apoptosis에관여하는것으로나타났다. 이에따라 ursolic acid는공격인자인산, proton pump, H. pylori의작용을억제하고 PGE 2 의양을증가시켜방어인자를증강, 위점막을보호하여위염및위궤양에효과를나타내며암세포에대한세포독성을나타내고 apoptosis에관여하여위암에대한효과를나타내는것으로볼수있었다. 위염및위궤양에대한실험중 HCl ethanol에의한흰쥐위염, 실험에서는대조군의경우위손상지수가 99.5 ± 19.9 mm인것에비하여 ursolic acid는 91.5 ± 11.0 mm로억제하였고양성대조군으로사용한 hydrotalcite는 100 mg/ kg 투여시 65.0 ± 12.7 mm로위손상지수를억제하였다. 대조군과는약간의차이만있을뿐이고양성대조군에비해서억제율이현저히낮은편이었다. Indomethacine에의한흰쥐위궤양실험에서는대조군에서는 22.3 ± 9.4 mm 2 로궤양병소가확인되었고 ursolic acid는 17.0 ± 12.2 mm 2 의궤양병소가관찰되었는데이것은대조군에비하여 23.8% 억제된결과이며양성대조군의 cimetidine 12.0 ± 3.7 mm 2 (46.1%) 보다는낮은결과였다. Acknowledgement 본연구는 2015년덕성여자대학교의지원으로수행된것으로연구비지원에깊이감사드립니다. 국문요약 본연구에서는 ursolic acid의위의보호효과를위한실험을실시하였다. 위장질병에대한 ursolic acid의효과를확인하기위해서급성, 만성위염은각각의 HCl ethanol과 indomethacin에의해유도된위염동물모델을사용하여관찰하였다. 대표적인공격인자인위산에관해서는 PPI activity를통해서확인하였고, 위의손상에대한보호인자에관해서는, PGE 2 를정량적으로분석하였다. 항균활성실 험은만성위염, 위궤양, 위암에원인인자로잘알려진 H. pylori로실험하였다. AGS cell를이용하여 DAPI 염색, Flow cytometry assay를통하여 ursolic acid가위암세포의 apoptosis에관여하는지를확인하였다. 그결과 ursolic acid 는 HCl ethanol과 indomethacin에의해유도된급성, 만성에대한위손상을억제하였다. Ursolic acid는위산분비의마지막단계인위염분비효소인 proton pump를억제시킴으로써산의분비를억제하였다. 그리고 ursolic acid는위점막의보호인자인 PGE 2 의농도가증가함으로써위점막보호효과를확인하였다. 또한 ursolic acid는공격인자인 H. pylori colonization을억제하였다. DAPI를이용한핵염색에서, 대조군과는달리, 핵형상의변형과함께수축된세포또는염색질의응축현상이관찰되었다. Flow cytometry assay에서 ursolic acid에의해 apoptosis가증가하는것을확인하였다. 이를통하여 ursolic acid는위손상에대한방어효과가있음을확인할수있었다. References 1. Yie, Y.Y., Zhao, S.Y., Tang, Q., Zheng, F., Wu, J.J., Yang, L.J., Deng, S.G. and Hann, S.S.: Ursolic acid inhibited growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cells through AMPKα-mediated reduction of DNA methyltransferase., 1. Mol. Cell. Biochem., 402, 63-74 (2014). 2. Heo, J.K., Hwang, D.S. and Lee, K.S.: Inhibitory Effects of Ursolic Acid from Prunella Vulgaris on Osteoclast Differentiation. J. Korean Obstet. Gynecol., 27, 59-70 (2014). 3. Kim, S.Y., Song, M.J., Roh, B.D., Park, S.H. and Park, J.W.: Inhibition of Streptococcus mutans biofilm formation on composite resins containing ursolic acid. Restorative Dentistry & Endodontics(RDE), 38, 65-72 (2013). 4. Park, S.N. and Kook. J.K.: Antimicrobial Activity of Oleanolic Acid, Ursolic Acid, and Sophoraflavanone G against Periodontopathogens. Intern. J. Oral Biol., 38, 149-154 (2013). 5. Jo, E.J., Choi, M.H., Kim, H.S., Park, S.N., Lim, Y.K., Kang, C.K. and Kook, J.K.: Antimicrobial Effects of Oleanolic Acid, Ursolic Acid, and Sophoraflavanone G against Enterococcus faecalis and Propionibacterium acnes. Intern. J. Oral Biol., 39, 75-79 (2014). 6. Yu, H.H., Seo, S.J., Hur, J.M., Park, R.K., So, H.S., Jeon, B.H. and You, Y.O.: Protective Effect of Ursolic Acid from Corni fructus on the Hydrogen Peroxide-induced Damage of HEI-OC1 Auditory Cells. Korean J. Orient. Physiol. Pathol., 20, 1524-1529 (2006). 7. Chu. X., He, X., Shi, Z.P., Li, C.J., Guo, F.C., Li, S.T., Li, Y., Na, L.X. and Sun, C.H.: Ursolic acid increases energy expenditure through enhancing free fatty acid uptake and β- oxidation via an UCP3/AMPK-dependent pathway in skeletal muscle. Molecular Nutrition & Food Research, 59, 1491-1503 (2015). 8. Viver R. Yadav, Sahdeo Prasad, Bokyung sung, Ramaswamy Kannappan, and Bharat B. Aggarwal.: Targeting Inflamma-

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