(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/258 (2006.01) A61K 36/65 (2006.01) A61K 36/232 (2006.01) A61P 17/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2010-0100909 (22) 출원일자 2010 년 10 월 15 일 심사청구일자 2010 년 10 월 15 일 (65) 공개번호 10-2012-0039280 (43) 공개일자 2012 년 04 월 25 일 (56) 선행기술조사문헌 탁리소독음, 한국전통지식포탈 DB, 2007.12.06* 대한한방소아과학회지, 8(1), 1994.12.15, pp.27-37* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2013년04월12일 (11) 등록번호 10-1252107 (24) 등록일자 2013년04월02일 (73) 특허권자 이정복 경기도안성시금광면신양복리홍익아파트 117 동 103 호 (72) 발명자 임신혁 광주광역시북구첨단과기로 123, 광주과기원생명과학부 415 호 ( 오룡동 ) 유영법 광주광역시서구상무버들로 40 번길 14, 버들마을 103 동 201 호 ( 유촌동 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이원희 전체청구항수 : 총 5 항심사관 : 김강필 (54) 발명의명칭혼합생약재추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및치료용조성물 (57) 요약 본발명은혼합생약재추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및치료용조성물에관한것으로, 보다구체적으로인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복력, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피치료용조성물의시험관내 (in vitro), 생체외 (ex vivo) 및생체내 (in vivo) 실험을통하여, 면역글로불린 IgE, 히스타민 (histamine), 및사이토카인의분비를억제시키며, 또한특이적으로아토피를유발시킨항원에대한 IgE 를감소시키는효과를나타내므로, 본발명에따른혼합생약재추출물을아토피예방및치료용조성물로써유용하게이용할수있다. 대표도 - 도 5-1 -
(72) 발명자 이정복 경기도안성시금광면신양복리홍익아파트 117 동 103 호 황지선 광주광역시북구첨단과기로 123, 광주과기원생명과학부 415 호 ( 오룡동 ) 최재환 대전광역시유성구유성대로 1741, - 109 동 903 호 ( 전민동, 세종아파트 ) 김희택 충청북도제천시세명로 65, 한의과대학 ( 신월동, 세명대학교 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 B090072 부처명 보건복지부 연구사업명 한의약선도기술개발사업 연구과제명 KCNS-002를활용한아토피피부염제어외용제개발 주관기관 광주과학기술원 연구기간 2009.11.01 ~ 2011.10.31-2 -
특허청구의범위청구항 1 물, C 1 ~ C 2 의저급알코올또는이들의혼합용매로추출된인삼 1.5 ~ 9 중량부, 황기 3 ~ 15 중량부, 작약 3 ~ 10 중량부, 당귀 3 ~ 24 중량부, 백출 3 ~ 15 중량부, 진피 3 ~ 9 중량부, 연교 3 ~ 15 중량부, 금은화 3 ~ 9 중량부, 복령 3 ~ 18 중량부, 백지 3 ~ 9 중량부및감초 3 ~ 10 중량부의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및치료용약학적조성물. 청구항 2 삭제청구항 3 제 1항에있어서, 상기저급알코올은에탄올인것을특징으로하는아토피예방및치료용약학적조성물. 청구항 4 삭제청구항 5 물, C 1 ~ C 2 의저급알코올또는이들의혼합용매로추출된인삼 1.5 ~ 9 중량부, 황기 3 ~ 15 중량부, 작약 3 ~ 10 중량부, 당귀 3 ~ 24 중량부, 백출 3 ~ 15 중량부, 진피 3 ~ 9 중량부, 연교 3 ~ 15 중량부, 금은화 3 ~ 9 중량부, 복령 3 ~ 18 중량부, 백지 3 ~ 9 중량부및감초 3 ~ 10 중량부의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피의예방및개선용화장료조성물. 청구항 6 삭제청구항 7 물, C 1 ~ C 2 의저급알코올또는이들의혼합용매로추출된인삼 1.5 ~ 9 중량부, 황기 3 ~ 15 중량부, 작약 3 ~ 10 중량부, 당귀 3 ~ 24 중량부, 백출 3 ~ 15 중량부, 진피 3 ~ 9 중량부, 연교 3 ~ 15 중량부, 금은화 3 ~ 9 중량부, 복령 3 ~ 18 중량부, 백지 3 ~ 9 중량부및감초 3 ~ 10 중량부의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피의예방및치료용외용제. 청구항 8 삭제청구항 9 물, C 1 ~ C 2 의저급알코올또는이들의혼합용매로추출된인삼 1.5 ~ 9 중량부, 황기 3 ~ 15 중량부, 작약 3 ~ 10 중량부, 당귀 3 ~ 24 중량부, 백출 3 ~ 15 중량부, 진피 3 ~ 9 중량부, 연교 3 ~ 15 중량부, 금은화 3 ~ 9 중량부, 복령 3 ~ 18 중량부, 백지 3 ~ 9 중량부및감초 3 ~ 10 중량부의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및개선용건강기능식품. - 3 -
청구항 10 삭제 명세서 [0001] 기술분야본발명은아토피예방및치료용조성물에관한것으로, 보다구체적으로는인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복력, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및치료용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술아토피는심한가려움증을가지는재발성만성피부염으로, 어린이의약 10 ~ 15% 가아토피성피부염을가지고있으며, 90% 는 5년내저절로호전되는것으로보고되어있다. 이러한아토피는성인기에는대체로호전되어약 30 ~ 40% 는외관상으로피부염이재발되지않으나, 나머지는성인이되어서도피부건조, 자극성물질에의한피부자극, 주부습진등의피부염으로어려움을겪는것으로알려져있다. 또한, 민감성피부의경우, 수분보유력및그회복력이낮고, 피부각질화, 가려움증등이나타나기쉽기때문에아토피성피부로될확률이높다. 아토피의정확한병리생리는아직까지완전히이해되고있지않지만유전적소인과함께면역학적, 비면역학적기전이관여한다고보고있다. 아토피의대부분을차지하는외인성아토피은 IgE와연관된면역기전에의해발생되는데특정알레르겐 ( 알레르겐 (allergen)) 에대한즉시형면역반응보다는 T 세포이상에의한지연성면역반응이관여한다는보고들이많다. 또한, 요즘은 B세포로부터 IgE의생성을유도하는 IL-4 등 Th2 관련사이토카인 (cytokine) 들이아토피의원인이라고보고되고있다 (JS Kang et al., Ihhibition of atopic dermatitis by topical application of silymarin in NC/Nga mice. intl immunopharm. (2008) 8. 1475-1480). 이러한아토피를치료하기위하여, 종래세라마이드, 리놀레산, 식물유또는광물성오일등의성분들, 하이드로코티손 (hydrocortisone) 등의스테로이드 (steroid) 제제또는이들에항균및항염기능을강화한물질, 자외선요법을통한 DNA 합성억제게, 세포과증식억제제, 염증및가려움증억제제등이제안된바있다. 그러나, 상기스테로이드제제는표피의성장억제나부작용등의역효과를유발할수있으며, 우레아퍼록사이드등은피부의과다자극을야기할수있고, 항히스타민제등의항생물질은균의내성 (resistance) 및광과민등의부작용을유발할가능성이높은문제점이있다. 또한, 장기간피부에적용시모세혈관확장증및 / 또는각질층의두께증가내지확장을유발하는등의심각한부작용을발생시킬염려가있으며, 최근아토피완화에많이쓰이는감마-리놀레산 ( 한국특허공개 2000-0046633호 ) 은쉽게산화되므로안정성이열등함과아울러, 피부자극성이비교적강하여민감한피부에는사용하기곤란한등의문제점이있다. 이에최근에는아토피에효과를갖는천연물질을탐색하는데초점을맞추고있다. 대표적으로, 쑥추출물 ( 대한민국특허등록제10-0377262호 ), 영지버섯, 유근피, 감초, 백봉령, 백지마및백년초의추출물 ( 대한민국특허등록제10-0517465호 ), 달맞이유, 알로에, 목초액, 제비꽃, 대추, 송이버섯, 두릅, 인삼, 녹차, 두충, 복분자, 오미자, 쑥, 포공영, 삼백초, 황기, 하고초, 해송, 황금및우슬의추출물 ( 대한민국특허등록제10-0451444호 ), 청자소엽과적자소엽의추출물 ( 대한민국특허등록제10-0454752호 ), 건률, 의이인, 오미자, 길경, 나복자, 맥문동및석창포의추출물 ( 대한민국특허등록제10-0483539호 ), 라벤더, 유칼립투스및티트리오일 ( 대한민국특허등록제10-0597997호 ) 등이있고, 그외에도상기생, 합환피, 창이자, 맥아등이효과가있다고알려져있다. 그러나, 상기천연물질들은그효능이미미하거나, 효과는있더라도민감성피부에있어서는알레르기과민반응을보여그사용이제한되는단점이있었다. 따라서, 종래알려진아토피개선및치료제에비하여보다효과가뛰어나고안전한물질을개발하는것이요구되고있는실정이다. - 4 -
[0007] 이에, 본발명자들은황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물제조하여, 상기추출물이세포독성을유발하지않는농도를확립한후, 세포에서사이토카인의분비를억제하는효과를확인하였으며, 이러한효과가생체외 (ex vivo) 및생체내 (in vivo) 에서아토피과관련된면역사이토카인의분비를감소시키는효과및항균활성을확인함으로써, 아토피예방및치료용조성물의유효성분으로사용될수있음을밝힘으로써본발명을완성하였다. 발명의내용 [0008] 해결하려는과제 본발명의목적은혼합생약재추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및치료용조성물, 화장료조성물, 피부외용제및건강기능식품을제공하는것이다. [0009] [0010] [0011] [0012] 과제의해결수단본발명은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및치료용조성물을제공한다. 또한, 본발명은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및개선용건강기능식품을제공한다. 또한, 본발명은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피의예방및개선용화장료조성물을제공한다. 아울러, 본발명은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피의예방및치료용외용제를제공한다. [0013] 발명의효과본발명의인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복력, 백지및감초의혼합추출물은천연물유래의추출물로세포독성이거의없어안전하고, 아토피에서관찰되는 IgE, 사이토카인 (cytokine), 및히스타민 (hitamine) 의분비를억제시키며, 아토피증상을완화시키는효과를나타내므로, 아토피예방및치료용조성물, 개선용건강식품, 치료용피부외용제, 및화장료조성물의유효성분으로유용하게사용될수있다. [0014] 도면의간단한설명 도 1 는혼합추출물의세포독성시험결과이다. 도 2는혼합추출물과이를구성하고있는각각의약물의 IgE 분비억제를나타낸그래프이다. 도 3은혼합추출물과이를구성하고있는각각의약물의히스타민 (histamine) 분비억제를나타낸그래프이다. 도 4는혼합추출물과구성약물의생체외 (ex vivo) 에서사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-13 및 IFNg) 분비억제효과를나타낸그래프이다. 도 5는혼합추출물과구성약물의생체외 (ex vivo) 에서 IgE 분비억제를나타낸그래프이다. 도 6은아토피모델마우스를제조한방법을나타낸그림이다 : boosting: 2, 4-디니트로클로로벤 (2, 4-Dinitrochlorobenzene, DNCB) 과집먼지진드기추출물에의한아토피인덕션이전에생체내의알레르겐 (allergen) 에대한면역반응을증폭시키기위해동일한알레르겐인 DNCB로일주일전에귀에발라줌 ; DNCB: 아세톤과올리브오일이 1:3으로섞인용액에녹인 1% 의 2, 4-디니트로클로로벤 (2, 4- - 5 -
Dinitrochlorobenzene, DNCB) 을 20 μl씩양쪽귀에처리함 ; house dust mite: 집먼지진드기 (Dermatophagoides farinae, Der.f) 를 10 mg / ml의농도로녹인후양쪽귀에 20 μl를처리함 ; 및 paiting: 혼합추출물의효능을확인하기위해해당되는농도 (1 mg /ear, 5 mg /ear) 의양을매일각각의귀의양면에발라줌. 도 7의 A는혼합추출물의경피투여에따른아토피모델마우스의귀두께의변화를나타낸그래프이다 : cont: 무처리대조군 ; 1 mg : 70% 에탄올혼합추출물 (50 mg / ml ) 을양쪽귀에 20μl씩발라, 최종처리농도가 1 mg으로처리한군 (1mg /ear); 5 mg : 70% 에탄올혼합추출물 (250 mg / ml ) 을양쪽귀에 20μl씩발라, 최종처리농도가 5 mg으로처리한군 (1 mg /ear); 유도횟수 : 추출물및 ' 집먼지진드기 + DNCB' 를처리한횟수 ; 도 7의 B는혼합추출물의처리양에따른, 아토피증상완화를나타내는그림이다 ; cont: 무처리대조군 ; 1 mg : 70% 에탄올혼합추출물 (50 mg / ml ) 을양쪽귀에 20μl씩발라, 최종처리농도가 1 mg으로처리한군 (1mg /ear); 및 5 mg : 70% 에탄올혼합추출물 (250 mg / ml ) 을양쪽귀에 20μl씩발라, 최종처리농도가 5 mg으로처리한군 (1 mg /ear). 도 8은혼합추출물투여에따른생체내 (in vivo) IgE 분비억제를나타낸그래프이다 : cont: 무처리대조군 ; 1 mg : 70% 에탄올혼합추출물 (50 mg / ml ) 을양쪽귀에 20μl씩발라, 최종처리농도가 1 mg으로처리한군 (1mg /ear); 및 5 mg : 70% 에탄올혼합추출물 (250 mg / ml ) 을양쪽귀에 20μl씩발라, 최종처리농도가 5 mg으로처리한군 (1 mg /ear). 도 9는혼합추출물투여에따른쥐림프절사이토카인변화를나타낸그래프이다. 도 10은혼합추출물의아토피마우스모델의귀세포에서의사이토카인분비변화를나타낸그래프이다. 도 11은혼합추출물을포함하는연고의처치에따른아토피마우스모델혈청의 IgE 변화를관찰한나타낸그래프이다 : Control: 무처리대조군 ; 2.50 %: 혼합추출물 2.50% 가함유된연고를처리한군 ; 및 5 %: 혼합추출물 5 % 가함유된연고를처리한군. 도 12은혼합추출물의피부외용제제의유동성평가를나타낸그래프이다 : #9: 혼합추출물이함유된 o/w 제제처방 9번 ; #11: 혼합추출물이함유된액정제제처방 11번 ; 및 #18: 혼합추출물이함유된액정제제처방 18번. [0015] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명을상세히설명한다 - 6 -
[0016] [0017] [0018] 본발명은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및치료용조성물을제공한다. 상기아토피예방및치료용조성물에있어서, 인삼은 1.5 ~ 9 중량부 %, 황기는 3 ~ 15 중량부 %, 작약은 3 ~ 10 중량부 %, 당귀는 3 ~ 24 중량부 %, 백출은 3 ~ 15 중량부 %, 진피는 3 ~ 9 중량부 %, 연교는 3 ~ 15 중량부 %, 금은화는 3 ~ 9 중량부 %, 복령은 3 ~ 18 중량부 %, 백지는 3 ~ 9 중량부 % 및감초는 3 ~ 10 중량부 % 의혼합추출물을함유하는하는것이바람직하며, 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 총 1.25kg의생약재에대하여이에대한 10배부피의용매를이용하여추출하는것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 상기아토피예방및치료용조성물에있어서, 혼합추출물은추출용매로물, 알코올또는이들의혼합물, 바람직하게는 C 1 내지 C 2 의저급알코올또는이들의혼합용매로이루어진군으로부터선택된어느하나를사용하 는것이바람직하나, 이에한정되지않는다. [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] 상기저급알코올은에탄올또는메탄올인것이바람직하며, 에탄올인것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 상기추출용매의양은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초전체건조중량의 5배내지 15배를첨가하는것이바람직하고, 전체건조중량의 10를첨가하는것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 추출시온도는 10 내지 120 인것이바람직하나, 이에한정되지않고, 40 내지 100 인것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 상기추출시간은 1시간내지 7시간인것이바람직하고, 3시간내지 5시간인것이더욱바람직하나이에한정되지않으며, 3시간인것이가장바람직하나, 이에한정되지않는다. 상기추출물을제조하는방법은열수추출, 침지추출, 환류냉각추출, 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출또는초음파추출법등의추출장치를이용한방법또는 XAD 및 HP-20을포함한흡착수지를이용하는방법등당업계의통상적인추출방법을사용할수있으며, 이에한정하는것은아니다. 본발명의구체적인실시예에서, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물의아토피예방및치료효과를측정하기위하여, 시험관내 (in vitro), 생체외 (ex vivo) 및생체내 (in vivo) 실험을통하여, 아토피에서관찰되는면역글로불린 IgE, 히스타민 (histamine), 및사이토카인의분비또는발현을측정하였다. 본발명의구체적인실시예에서, 본발명자들은시험관내 (in vitro) 실험을통하여, 본발명에따른혼합추출물의세포독성을나타내지않는농도를확인하였으며 ( 도 1 참조 ), 세포주에혼합추출물을처리하였을때, 아토피에서관찰되는면역글로불린 IgE의분비및사이토카인및히스타민의분비가감소하는것을확인하였다 ( 도 1, 도 2 및도 3 참조 ). 또한, 본발명의구체적인실시예에서, 본발명자들은마우스아토피모델을제조하여, 본발명에따른혼합추출물을처리한후마우스의 T 세포와 B 세포를분리하여사이토카인의분비를측정하였으며, 그결과는시험관내실험결과와유사하게혼합추출물처리에의해서사이토카인의분비가감소하는것을확인할수있었다 ( 도 4 및도 5 참조 ). 또한, 본발명의구체적인실시예에서, 마우스아토피모델에본발명에따른혼합추출물을처리하였을때, 아토피증상이완화되는것을관찰할수있었으며, 이러한혼합추출물은마우스아토피모델의혈청의 IgE 분비를감소시켰으며, T 세포에서의사이토카인의분비를억제하였다 ( 도 7, 도 8 및도 9 참조 ). 또한, 아토피를유발시킨후, 본발명에따른혼합추출물을경피투여한마우스의귀조직을분리하여, 사이토카인의분비를살펴본결과, 아토피마우스모델의 T 세포에서보다사이토카인의분비가더욱효과적으로감소되는것을관찰할수있었다 ( 도 10 참조 ). 이러한결과는아토피마우스모델의귀부위에직접본발명에따른혼합추출물을처리하여, 그효과가증가된것으로추정되었다. 따라서, 본발명에따른인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는조성물을아토피예방및치료용조성물로유용하게사용할수있다. [0028] 본발명의조성물은약제의제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형제및희석제를더포함할수있다. - 7 -
[0029] [0030] [0031] 본발명에따른조성물은, 각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의경구형제형, 외용제, 좌제및멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있다. 본발명의조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는본발명의조성물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슘스테아레이트, 탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴등이사용될수있다. 본발명의조성물은경구또는비경구로투여될수있으며, 비경구투여법이라면어느것이나사용가능하고, 전신투여또는국소투여가가능하나, 국소투여가더바람직하며, 경피투여가가장바람직하다. 본발명의조성물의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 당업자에의해적절하게선택될수있다. 그러나, 바람직한효과를위해서, 본발명의조성물은 1일 0.0001 내지 1 g/ kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 mg / kg으로투여하는것이좋다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수도있다. 상기투여량은어떠한면으로든본발명의범위를한정하는것은아니다. [0032] [0033] [0034] 또한, 본발명은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및개선용화장료조성물을제공한다. 상기아토피예방및개선용화장료조성물에있어서, 인삼은 1.5 ~ 9 중량부 %, 황기는 3 ~ 15 중량부 %, 작약은 3 ~ 10 중량부 %, 당귀는 3 ~ 24 중량부 %, 백출은 3 ~ 15 중량부 %, 진피는 3 ~ 9 중량부 %, 연교는 3 ~ 15 중량부 %, 금은화는 3 ~ 9 중량부 %, 복령은 3 ~ 18 중량부 %, 백지는 3 ~ 9 중량부 % 및감초는 3 ~ 10 중량부 % 의혼합추출물을함유하는하는것이바람직하며, 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 총 1.25kg의생약재에대하여이에대한 10배부피의용매를이용하여추출하는것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 본발명의구체적인실시예에서, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물은아토피마우스모델에서전체 IgE 및아토피마우스모델을제조하는데사용한집먼지진드기에대한 IgE를특이적으로감소시키는효과를보이며, 아토피동물모델에서임상적아토피증세를현저히호전시키므로, 아토피예방및개선용화장료조성물로유용하게이용될수있다. [0035] [0036] [0037] 본발명의화장료조성물은나노리포좀제형으로만들어지는것이바람직하나, 이에한정되지않는다. 상기나노리포좀은통상적인리포좀의형태를갖는것으로평균입자지름이1-100nm인리포좀인것이바람직하나, 이에한정되지않고, 30-70nm인것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 상기리포좀은수용성머리와불용성의꼬리를가진양친매성분자로구성된입자의상호자발적인결합및정렬된콜로이드입자로, 세포막과유사한이중막구조를가지며, 이를함유한조성물은손상된피부장벽의회복, 피부장벽의강화, 피부자극의완화의효과를기대할수있다. 또한, 나노리포좀은 C 12-22 알킬체인의포화또는불포화지방산및세포간지질을포함한다. 본발명의나노 리포좀의제조에이용되는 C 12-22 알킬체인의포화또는불포화지방산은, 바람직하게는라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레산및팔미트올레인산을포함하며, 보다바람직하게는스테아린산, 팔 - 8 -
미트올레인산및이의혼합물로구성된군으로부터선택되는어느하나일수있으나, 이에한정되지않으며, 상기나노리포좀은피부외용제총중량에대하여 0.05-5.0 중량 % 로함유되는것이바람직하나, 이에한정되지않고, 더욱바람직하게는 0.1-4.0 중량 % 이나, 이에한정되지않는다. 나노리포좀에포함되는인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물의함량은나노리포좀의총중량에대해서 1.0-20.0 중량 % 인것이바람직하나, 이에한정되지않고, 3.0-12.0 중량 % 인것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. [0038] [0039] 본발명의화장료조성물의구체적인제형으로서는스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도등의제형을포함한다. 또한, 상기화장료조성물은본발명의인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물에추가로지방물질, 유기용매, 용해제, 농축제및겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형또는비이온형유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제및킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성또는친유성활성제, 지질소낭또는화장품에통상적으로사용되는임의의다른성분과같은화장품분야에서통상적으로사용되는보조제를함유할수있다. [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] 또한, 본발명은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및치료용피부외용제를제공한다. 상기아토피예방및치료용피부외용제에있어서, 인삼은 1.5 ~ 9 중량부 %, 황기는 3 ~ 15 중량부 %, 작약은 3 ~ 10 중량부 %, 당귀는 3 ~ 24 중량부 %, 백출은 3 ~ 15 중량부 %, 진피는 3 ~ 9 중량부 %, 연교는 3 ~ 15 중량부 %, 금은화는 3 ~ 9 중량부 %, 복령은 3 ~ 18 중량부 %, 백지는 3 ~ 9 중량부 % 및감초는 3 ~ 10 중량부 % 의혼합추출물을함유하는하는것이바람직하며, 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 총 1.25kg의생약재에대하여이에대한 10배부피의용매를이용하여추출하는것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 본발명의구체적인실시예에서, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물은아토피마우스모델에서전체 IgE 및아토피마우스모델을제조하는데사용한집먼지진드기에대한 IgE를특이적으로감소시키는효과를보이며, 아토피동물모델에서임상적아토피증세를현저히호전시키므로, 아토피예방및치료용피부외용제로유용하게이용될수있다. 본발명의피부외용제는나노리포좀제형으로만들어지는것이바람직하나, 이에한정되지않는다. 상기나노리포좀은통상적인리포좀의형태를갖는것으로평균입자지름이1-100nm인리포좀인것이바람직하나, 이에한정되지않고, 30-70nm인것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 상기리포좀은수용성머리와불용성의꼬리를가진양친매성분자로구성된입자의상호자발적인결합및정렬된콜로이드입자로, 세포막과유사한이중막구조를가지며, 이를함유한조성물은손상된피부장벽의회복, 피부장벽의강화, 피부자극의완화의효과를기대할수있다. 또한, 나노리포좀은 C 12-22 알킬체인의포화또는불포화지방산및세포간지질을포함한다. 본발명의나노 리포좀의제조에이용되는 C 12-22 알킬체인의포화또는불포화지방산은, 바람직하게는라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레산및팔미트올레인산을포함하며, 보다바람직하게는스테아린산, 팔미트올레인산및이의혼합물로구성된군으로부터선택되는어느하나일수있으나, 이에한정되지않으며, 상기나노리포좀은피부외용제총중량에대하여 0.05-5.0 중량 % 로함유되는것이바람직하나, 이에한정되지않고, 더욱바람직하게는 0.1-4.0 중량 % 이나, 이에한정되지않는다. 나노리포좀에포함되는인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물의함량은나노리포좀의총중량에대해서 1.0-20.0 중량 % 인것이바람직하나, 이에한정되지않고, 3.0-12.0 중량 % 인것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. [0046] 본발명의인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을피부외용 제로사용하는경우, 추가로지방물질, 유기용매, 용해제, 농축제및겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, - 9 -
안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형또는비이온형유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제및킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성또는친유성활성제, 지질소낭또는피부용외용제에통상적으로사용되는임의의다른성분과같은피부과학분야에서통상적으로사용되는보조제를함유할수있다. 또한, 상기성분들은피부과학분야에서일반적으로사용되는양으로도입될수있다. [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] 또한, 본발명은인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피예방및개선용건강기능식품을제공한다. 상기아토피예방및개선용건강기능식품에있어서, 인삼은 1.5 ~ 9 중량부 %, 황기는 3 ~ 15 중량부 %, 작약은 3 ~ 10 중량부 %, 당귀는 3 ~ 24 중량부 %, 백출은 3 ~ 15 중량부 %, 진피는 3 ~ 9 중량부 %, 연교는 3 ~ 15 중량부 %, 금은화는 3 ~ 9 중량부 %, 복령은 3 ~ 18 중량부 %, 백지는 3 ~ 9 중량부 % 및감초는 3 ~ 10 중량부 % 의혼합추출물을함유하는하는것이바람직하며, 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 총 1.25kg의생약재에대하여이에대한 10배부피의용매를이용하여추출하는것이더욱바람직하나, 이에한정되지않는다. 본발명의구체적인실시예에서, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물은아토피마우스모델에서전체 IgE 및아토피마우스모델을제조하는데사용한집먼지진드기에대한 IgE를특이적으로감소시키는효과를보이며, 아토피동물모델에서임상적아토피증세를현저히호전시키므로, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는조성물을아토피예방및개선용건강기능식품으로유용하게사용할수있다. 상기식품의종류에는특별한제한은없다. 상기물질을첨가할수있는식품의예로는드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를포함한낙농제품, 각종스프, 음료수, 알콜음료및비타민복합제등이있으며, 통상적인의미에서의건강식품을모두포함한다. 본발명의인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물은식품에그대로첨가하거나다른식품또는식품성분과함께사용될수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용될수있다. 유효성분의혼합양은그의사용목적 ( 예방또는개선용 ) 에따라적합하게결정될수있다. 일반적으로, 건강기능식품중의상기추출물의양은전체식품중량의 0.1 내지 90 중량부로가할수있다. 그러나건강및위생을목적으로하거나또는건강조절을목적으로하는장기간의섭취의경우에는상기양은상기범위이하일수있으며, 안전성면에서아무런문제가없기때문에유효성분은상기범위이상의양으로도사용될수있다. 본발명에따른건강기능식품중건강기능성음료조성물은지시된비율로필수성분으로서상기추출물을함유하는외에는다른성분에는특별한제한이없으며통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등 ; 디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등 ; 및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당, 및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 상술한것이외의향미제로서천연향미제 ( 타우마틴, 스테비아추출물 ( 예를들어레바우디오시드 A, 글리시르히진등 ) 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를유리하게사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 1 내지 20g, 바람직하게는약 5 내지 12 g이다. 상기외에본발명의인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물은여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제 ( 치즈, 초콜릿등 ), 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물은천연과일쥬스및과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은그렇게중요하진않지만본발명의인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초의혼합추출물 100 중량부당 0.1 내지약 20 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. - 10 -
[0054] [0055] 이하, 본발명을실시예및제조예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기실시예및제조예에한정되는것은아니 다. [0056] [0057] [0058] 실시예 1 본발명의혼합추출물제조 <1-1> 70% 에탄올추출물본발명의혼합추출물에포함되는인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초를정선하여약전통칙중절도에따라조절로한다음인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 각생약을추출기에넣고 ( 총 1.25kg), 약품무게에대해 10배량의 70%(v/v) 에탄올 (12.5L) 을넣어침지하고, 80 에서 3시간추출한후농축건조하였다. 건조한추출물을생체외 (ex vivo) 및생체내 (in vivo) 에실험하기직전 70% 에탄올에농도별로녹여평가하였다. 이하, 실시예의실험은 70% 에탄올추출물을이용하여실험하였다. [0059] [0060] <1-2> 70% 메탄올추출물본발명의혼합추출물에포함되는인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초를정선하여약전통칙중절도에따라조절로한다음인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 각생약을추출기에넣고 ( 총 1.25kg), 약품무게에대해 10 배량의 70%(v/v) 메탄올 (12.5L) 을넣고 40 에서 3 시간동안초음파추출하여추출액을여과하고여액을 60 이하에서감압농축하여건조하였다. [0061] [0062] <1-3> 열수추출물본발명의혼합추출물에포함되는인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초를정선하여약전통칙중절도에따라조절로한다음인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 각생약을추출기에넣고 ( 총 1.25kg), 약품무게에대해 10 배량의정제수 (12.5L) 를넣어 100 에서 3 시간추출하여추출액을여과하고여액을 60 이하에서감압농축하여건조하였다. [0063] 표 1 혼합추출물의제조방법에따른추출수율함량 (%) 70% 에탄올 70% 메탄올 100% 증류수 건조분말 16.8 13.1 28.56 [0064] [0065] 실시예 2 단일구성성분추출물의제조본발명의혼합추출물에포함되는인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지및감초를정선하여약전통칙중절도에따라조절로한다음인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지, 감초각각 200g 따로추출기에넣고, 약품무게에대해 10배량의 70%(v/v) 에탄올을넣어침지하고, 80 에서 3시간추출한후농축건조하였다. 건조한추출물을생체외 (ex vivo) 및생체내 (in vivo) 에실험하기직전 70% 에탄올에농도별로녹여평가하였다. - 11 -
[0066] 표 2 단일구성성분추출물의제조방법에따른추출수율함량 (%) 복령 진피 작약 백지 인삼 황기 당귀 백출 감초 연교 금은화 수율 11.5 21.5 25.7 38.5 26.0 11.9 33.3 10.3 19.6 22.8 24.9 [0067] [0068] [0069] 실시예 3 세포배양 <3-1> 비장세포배양 6 ~ 8주령의암컷 Balb/c 마우스에서비장을체취한후, 갈아서전체비장세포를획득하였다. 상기세포들을 DMEM 배지에 10% FBS, 3 mm L-글루타민 (L-glutamine), 10mM HEPES, 100 U/ ml페니실린 (penicillin), 100 U/ ml스트렙토마이신 (spreptomycin), 0.05 mm 2-베타-메르캅토에탄올 (2-beta-mercaptoethanol) 이포함되어있는 T 세포배지에깔아준후 37, 5% CO 2 의농도의배양기에서배양하였다. [0070] [0071] <3-2> B 세포주배양사람의다발성골수종세포 (multiple myeloma cells) 인 U266B1를 RPMI 1640 기본배지에 10% FBS, 1 mm 피루브산나트륨 (sodium pyruvate), 2mML-글루타민 (2mML-glutamine), 100U 페니실린 (penicillin) 및 50 mg/ ml스트렙토마이신 (streptomycin) 이첨가되어있는 B세포배지에서 37, 5% CO 2 의농도의배양기에서배양하였다. [0072] [0073] <3-3> HMC-1 세포주배양 사람의대식세포주인 HMC-1 세포를 IMDM 기본배지에 10% FBS 와 1% 의페니실린 (penicillin)/ 스트렙토마이신 (streptomycin) 이첨가된배양액에서 37, 5% CO 2 의농도의배양기에서배양하였다. [0074] [0075] [0076] [0077] <3-4> T 세포주배양아토피가유도된마우스의림프절을체취한후갈아서, 단일세포로분리한후, 비드시스템 (bead system) 을이용해 T 세포를분리하였다. T 세포의표면에발현되고있는 CD4를인지하는항체가연결되어있는마그네틱비드 (bead) 를전체세포와 15분동안 4 에서인큐베이션을하였다. 이를통해 T 세포와마그네틱비드간의상호작용을통해결합을이루게되고이를강한자석판에연결된컬럼에흘러주게되면이 CD4+T 세포만이컬럼안에존재하게된다. 마지막에이컬럼에결합되어있는 T 세포를용리 (elution) 시켜분리하였다. 상기의과정을통하여분리된 CD4+T 세포는 DMEM 배지에 10% FBS, 3 mm L-글루타민 (L-glutamine), 10mM HEPES, 100 U/ ml페니실린 (penicillin), 100 U/ ml스트렙토마이신 (spreptomycin), 0.05 mm 2-베타-메르캅토에탄올 (2- beta-mercaptoethanol) 이포함되어있는 T 세포배지에 1.5 10 6 세포 / ml의농도로깔아준후, 37, 5% CO 2 의농도의배양기에서배양하였다. T 세포를자극하기위하여, PMA 또는이오노마이신 (ionomycine) 을배지에 첨가하였다. [0078] [0079] 실시예 4 마우스아토피모델제조 마우스아토피모델을제조하기위하여, 본과기원의동물사육실에서직접키운 6 ~ 8 주령의암컷 Balb/c 마우 - 12 -
스를사용하였다. 먼저 3 그룹을각각 5 마리의마우스로나누고 7 일동안알레르겐 (allergen) 에대한면역시 스템을활성화시키기위한부스팅 (boosting) 기간을보냈다. [0080] 그후, 4 주간에걸쳐마우스의양쪽귀에 10 mg/ ml의집먼지진드기 (house dust mite extract, GREER source materials) 20 μl와햅틴 (hapten) 계열의 1% DNCB(2, 4-Dinitrochlorobenzene)(Sigma) 를 20 μl각각주 1 회씩 교대로처리하였다. ( 도 6). [0081] [0082] 실시예 5 혼합추출물을포함하는피부외용제제제조하기표 3의조성에따라 " 실시예 " 는액정유화기술을통한외용제제를개발하였고, " 비교예 " 는일반 O/W 에멀젼외용제제를제조하였다. 먼저수상과유상을각각 75 로가열용해한후유상을수상에첨가하고호모믹서 6,000 rpm 조건하에서 10분간유화시킨후 30 까지냉각하여제조하였다. [0083] 표 3 아토피예방및치료용조성물을유효성분으로함유하는피부외용제의구성성분 성분 제조예 1 제조예 2 비교예 1 비교예 2 수상 정제수 to 100 to 100 to 100 to 100 트리에탄올아민 0.15 0.15 0.15 0.15 카르복시비닐폴리머 (1 중량 % 용액 ) 15 15 15 15 글리세린 5 5 5 5 부틸렌글리콜 5 5 5 5 파라옥시안식향산에스테르 0.2 0.2 0.2 0.2 에탄올복합추출물 2.5 5.0 2.5 5.0 유상 세토스테아릴알콜 3 3 1 1 글리세릴모노스테아레이트 1 1 1 1 레시친 1 1 - - 세라마이드 03 0.6 0.6 - - 스쿠알란 5 5 5 5 카프릴릭, 카프릴트리글리세리드 3 3 3 3 디메치콘 0.5 0.5 0.5 0.5 PEG-100스테아레이트 1.5 1.5 1.5 1.5 파라옥시안식향산프로필 0.1 0.1 0.1 0.1 파라옥시안식향산메칠 0.2 0.2 0.2 0.2 파라옥시안식향산에칠 0.1 0.1 0.1 0.1 [0084] 상기표 3 의수치단위는중량 % 이며, 카르복시비닐폴리머로는미국비. 에프. 굿리치 (B.F.Goodrich) 사의상품인 카보폴 940(Carbopol 940) 을 1 중량 % 수용액으로사용하였다. [0085] [0086] [0087] [0088] 실시예 6 본발명의혼합추출물의세포독성측정 <6-1> 본발명의혼합추출물세포독성측정시험관내 (in vitro) 에서본발명에따른혼합추출물의아토피개선및치료의효능을확인하기에앞서, 세포에대한독성이없으며최적의효과를낼수있는적합한농도를결정하기위해세포독성검사를하였다. MTT assay의일종인 WST-assay를통해서세포에독성을주지않고, 세포사멸을유도하지않는최적의농도를확인하고자하였다. WST-1 assay는살아있는세포내의미토콘드리아탈수소효소에의해테트라졸리움 (tetrazolium) 염 (WST-1) 이포르마잔 (formazan) 색소로변환되는원리를이용한다. 배지에첨가한테트라졸리 - 13 -
움염은미토콘드리아의호흡사슬에존재하며생존세포에만활성이있는 succinate-tetrazolium-reductase에의해포르마잔색소로변환한다. 살아있는세포수가증가하면시료중의미토콘드리아탈수소효소의전체의활성이증가하여이효소활성의증가가포르마잔색소의생성증가를유도하기때문에포르마잔색소와배지중에서대사활성이있는세포의수는직선적인상관관계를나타내게된다. 즉, 농도가높을수록살아있는세포수가많다는것을확인할수있다. [0089] 우선, 마우스의비장에서비장세포 (splenocyte) 를분리한후적혈구세포 (red blood cell, RBC) 를제거한후, 5 10 5 세포에 0.25 mg / ml또는 0.5 mg / ml의두가지농도의 70% 에탄올혼합추출물및이를구성하고있는구성성분을처리한후, 37 배양기에서 48시간배양하였다. 48시간후, WST-1 테스트를위해 10 μl의테트라졸리움염을배양액에첨가한후, 다시 37 배양기에서배양하여배양액의색깔이변하는적당한 O.D가된시점에 440 nm에서 O.D를측정하였다. [0090] 그결과, 도 1 에나타난같이혼합추출물및이를구성하고있는 11 가지의구성한약재들은대부분두가지농 도에서세포독성을나타내지않는것으로확인이되었으며, 0.25 mg / ml에서세포독성이좀더낮게나타났으므 로상기농도를이용하여본발명에따른혼합추출물의아토피치료효과를확인하였다 ( 도 1). [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] 실시예 7 ELISA를이용한혼합추출물의 IgE 분비측정아토피에있어가장큰지표타겟으로알려진물질은 IgE이므로, 본발명자들은가장먼저혼합추출물과이를구성하고있는각각의구성성분이세포주에서의 IgE의분비를억제하는효과가있는지를확인하고자하였다. IgE의분비를억제하는효과를확인하기위하여, U266B1 세포주를이용하였다. 상기세포주는여러가지항체아이소타입 (isotype) 중에서도특별히 IgE를많이분비하는사람에서유래된 B세포주이다. B 세포가분화가되어플라스마세포가되면기본적으로여러가지면역글로불린 (immunoglobμlin) 중에서 IgM을분비하게되고클래스스위칭반응 (class switching reaction) 에의해서여러가지아이소타입 (isotype) 으로전환된다고알려져있다. 이러한아이소타입결정에있어서, T 세포에서분비되는다양한사이토카인 (cytokine) 이중요한역할을하며각각의환경에많이존재하는사이토카인에의해 IgA, IgE, IgE 등의다양한아이소타입으로변화된다고알려져있다. 이중에서 IgE로의변환에있어서는지질다당류 (polysaccharide, LPS)/ 안티-CD40 및인터루킨- 4(interleukin-4, IL-4) 에의한자극이필요하다는것이알려져있으므로, 본발명자들은 B 세포가 IgE를분비시키는환경을조성하기위하여, B 세포의배양시 LPS와 IL-4을배양액에첨가하였다. 우선, 상기실시예 <4-1> 에서배양한 B 세포에 10 μg / ml의 LPS와 5 ng/ ml의 IL-4를배양액에첨가한후, 세포를 72시간정도 37 배양기에서배양하여, B 세포를자극하였다. 72시간후, 0.25 mg / ml의혼합추출물및이를구성하고있는각각의구성성분 (0.25 mg / ml ) 을세포에처리한후, 3일을배양하였다. 3일배양후, 세포를수득한후, 배양액에존재하는 IgE의농도를 ELISA(BETHYL) 를이용하여측정하였다. 그결과, 도 2에나타난바와같이, 본발명에따른혼합추출물과이를구성하고있는각각의구성성분은 B 세포의 IgE 분비를억제하였으며, 구체적으로구성성분중당귀가 IgE 분비억제능력이가장낮았으며, 그외의성분및전체성분을함유하고있는혼합추출물에서 IgE 분비억제능이관찰되지않았다. 본발명자들은이러한효과가동물실헐 (in vivo) 에서도동일하게나타나는것인지확인하기위하여, 하기실시예에서본발명에따른혼합추출물및각각의구성성분에대한 IgE 분비억제능을측정하였다 ( 도 2). [0097] [0098] 실시예 8 ELISA를이용한혼합추출물의히스타민분비측정아토피에있어서가장큰특징은 IgE의분비증가이지만, 또다른특징으로아토피및알러지환자에서관찰되는비만세포 (mast cell) 나호염세포 (basophil) 가분비하는히스타민 (histamine) 농도의증가가있다. 비만세포의경우세포표면에 IgE에대한강한반응성의수용체 (high affinity receptor) 를발현하고있어외부의알러젠 ( 알레르겐 (allergen)) 이몸속으로들어왔을때 IgE가여기에결합하게되고이 IgE가다시알러젠을붙잡기 - 14 -
때문에비만세포가활성화되게된다. 이때활성화된비만세포는탈과립 (degranμlation) 에의해히스타민및염증성매개인자들을분비하게되고아토피나알러지증상을심화시킨다. 따라서세포에적정농도의혼합추출물을처리하여자극을준후배양액에분비되는히스타민의농도를히스타민검출키트 (histamine assay ki t) 을이용해측정하하여, 혼합추출물및이를구성하고있는구성성분의항알러지또는항아토피효과를간접적으로확인하고자하였다. [0099] [0100] 우선, 사람에서유래된비만세포주인 HMC-1세포주에 0.25 mg / ml의혼합추출물및 0.25 mg / ml의혼합추출물을구성하고있는각각의구성성분을세포에처리함과동시에, 세포를활성화시키기위하여, 20 nm의 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, sigma) 와 2 mm의아이오노마이신 (ionomycin, sigma) 을 24시간처리한후세포배양액에분비된히스타민의양을 ELISA를통해확인하였다. 그결과, 도 3에나타난바와같이세포배양액에아무것도처리하지않은무처리대조군에비하여, 감초, 당귀, 복령, 및혼합추출물이히스타민의분비정도를감소시켰으며, 특히감초와복령은약 40% 정도로크게감소시키는효과를나타냄을확인할수있었다 ( 도 3). [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] 실시예 9 본발명의혼합추출물의생체외 (ex vivo) 사이토카인의발현억제효과 <9-1> 혼합추출물의 T 세포에서분비하는사이토카인의발현억제효과혼합추출물의세포주를이용해확인된사이토카인의분비를억제하는효과가생체내 (in vivo) 상황에서도나타나는지확인하고자, 상기 < 실시예 4> 에서아토피에근접한상황으로아토피를유도한마우스의림프절에서같이 MACs bead를이용하여 T세포를분리하여혼합추출물및혼합물을구성하는구성성분을처리하여추출물의효능을검증하였다. T 세포에서분비하는사이토카인의발현량에미치는영향을살펴보기위해아토피를유도한마우스에서 T 세포를분리한후, 혼합추출물및구성성분을 0.25mg/ml의농도로세포에처리하고, 이때 20 nm의 PMA와 2 mm의 ionomycin으로함께 4시간자극하였다. 상기세포에서 RNA를분리한후, cdna를합성해아토피에서알려진병리학적사이토카인 (pathogenic cytokine) 인 IL-4, IL-5, IL-13, IFNg의 mrna 발현량을정량적실시간 PCR(quantitative real time PCR) 을통해확인하였다. 실험에있어서항상일정량발현한다고알려져있는하우스키핑유전자 (house keeping gene) 인 HPRT를내부적대조군 (internal control) 로사용하였고, 대조군에대해서상대적인발현량을그래프로나타내었다. PCR 조건은 95 에서 5분간변성 (denature) 를수행한후, '94 30초, 60 30초, 72 30초 ' 의과정을 40회반복한후, 72 에서 5분동안연장 (extension) 과정을수행하였으며, 사용한프라이머서열은하기와같다 : 마우스 HPRT; 정방향프라이머 ( 서열번호 1): 5'-GCC CAA GAT CGT CAA AAA GA-3'; 역방향프라이머 ( 서열번호 2): 5'-ATT GTG GAC CAG GAA CTT GC-3'; IL-4; 정방향프라이머 ( 서열번호 3): 5'-ACA GGA GAA GGG ACG CCA T-3'; 역방향프라이머 ( 서열번호 4): 5'-GAA GCC GTA CAG ACG AGC TCA-3'; IL-5; 정방향프라이머 ( 서열번호 5): 5'-AGC ACA GTG GTG AAA GAG AC-3'; 역방향프라이머 ( 서열번호 6): 5'-TCC AAT GCA TAG CTG GTG ATT T-3'; IL-13; 정방향프라이머 ( 서열번호 7): 5'-GCA ACA TCA CAC AGG ACC AGA-3'; 역방향프라이머 ( 서열번호 8): 5'-GTC AGG GAA TCC AGG GCT AC-3'; - 15 -
[0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] IFN-g; 정방향프라이머 ( 서열번호 9): 5'-TCA AGT GGC ATA GAT GTG GAA GAA-3'; 역방향프라이머 ( 서열번호 10): 5'-TGG CTC TGC AGG ATT TTC ATG-3'; TNF-a; 정방향프라이머 ( 서열번호 11): 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3'; IL-17; 정방향프라이머 ( 서열번호 12): 5'-TTC ATC TGT GTC TCT GAT GCT-3'; 역방향프라이머 ( 서열번호 13): 5'-TTG ACC TTC ACA TTC TGG AG-3'; IL-31; 정방향프라이머 ( 서열번호 14): 5'-ATA CAG CTG CCG TGT TTC AG-3'; 및역방향프라이머 ( 서열번호 15): 5'-AGC CAT CTT ATC ACC CAA GAA-3'. [0129] 그결과, 도 4에나타난바와같이, 먼저 IL-4의경우감초, 당귀, 백출, 연교, 복령, 작약, 혼합추출물이, IL-5의경우당귀, 백출, 연교, 혼합추출물이, IL-13의경우감초, 당귀, 백출, 연교, 혼합추출물이, IFNg의경우감초, 당귀, 백출, 연교, 백지, 작약, 혼합추출물이사이토카인의발현량을유의하게감소시켰다. 본발명에따른구성성분중에서는공통적으로감초, 당귀, 백출, 연교가 IL-4, IL-5, IL-13 및 IFNg에서공통적으로효능이있는것을확인할수있었으며, 각구성성분을모두포함하고있는혼합추출물또한확인한 4가지의사이토카인을모두유의하게감소시킴을확인할수있었다. [0130] [0131] [0132] <9-2> 본발명의혼합추출물의 B 세포에서분비하는사이토카인의발현억제효과혼합추출물의 B 세포에서분비하는사이토카인의분비를억제하는지확인하고자, 본발명에서제조한아토피를유도시킨마우스의 B 세포를분리하여, LPS와 IL-4를 B 세포배양시첨가한후, 0.25 mg / ml또는 0.5 mg / ml농도의혼합추출물을배양액체첨가한후, 72시간동안배양하였다. 배양 3일후, 배양액에존재하는 B세포에서분비된 IgE의농도를 ELISA를통해확인하였다. 대조군으로사용한 70% 알코올을처리한경우의농도를 100% 로보고나머지처리샘플들의농도를상대적으로나타냈다. 그결과, 도 5에나타난바와같이혼합추출물을비롯한이를구성하고있는각각의구성성분이무처리대조군에비하여 IgE 농도를크게감소시키는것을관찰할수있었다. 그중에서도감초, 당귀, 연교, 백출및혼합추출물이더욱큰감소효과를나타냈다. 또한두가지농도 (0.25 mg / ml또는 0.5 mg / ml ) 를처리하여비교하였을경우, 농도가증가함에따라 IgE가감소되는정도가증가하였다. 이러한본발명의혼합추출물의 B 세포에있어서 IgE 농도를감소시키는효과는 T 세포에서있어서혼합추출물의효과와일관성을보였으며, 본발명에따른혼합추출물이 B세포뿐만아니라 T 세포에도영향을미쳐아토피의유발인자들을감소시킴을확인할수있었고특히각구성성분중에서는감초, 당귀, 연교, 백출이효능이가장우수함을확인할수있었다 ( 도 5). [0133] [0134] [0135] 실시예 10 본발명의혼합추출물의아토피증상완화효과본발명자들은 < 실시예 4> 에서제조한아토피마우스모델을이용하여, 본발명에따른혼합추출물의약리활성을측정하고자하였다. 4주동안집먼지진드기와 DNCB를처리한마우스모델에, 나머지 3주동안집먼지진드기와 DNCB로주 1회씩인덕션을계속진행하면서 70% 에탄올에서추출한혼합추출물 (1 mg또는 5 mg ) 을매일귀에처리하였다. 집먼지진드기와 DNCB를마우스의귀에처리하였을때, 아토피가유도됨에따라서염증이유도되어귀두께가증가하므로, 아토피마우스모델의귀두께를측정함으로써혼합추출물의효능을간접적으로확인하였다. - 16 -
[0136] [0137] 그결과, 도 7에서나타난바와같이, 추출물처리 2주후에대조군에비해추출물을처리한그룹의평균귀두께가감소됨을확인하였고그효과가농도에의존적임을확인할수있었다. 또한도 7의 B에나타난바와같이, 아토피가유도되면서건조함이심화되어각질, 홍반및염증등의아토피증상이대조군에서관찰되었으나, 본발명에따른혼합추출물을귀에바른경우에는대조군에서관찰되는아토피증상이감소되며, 건조함이크게감소되어부드러워짐을확인할수있었다 ( 도 7). [0138] [0139] [0140] [0141] 실시예 11 본발명의혼합추출물의생체외 (in vivo) 사이토카인의발현억제효과 <11-1> 본발명의혼합추출물의 B 세포에서분비하는사이토카인의발현억제효과 B세포에미치는영향을확인하기위해각그룹의쥐들에서피를뽑아혈청을준비한후항원비특이적 IgE(antigen non specific IgE) 및항원으로사용한집먼지진드기에대한 IgE의농도를 ELISA(BD bioscienc e) 를통해확인해보았다. 그결과, 도 8에나타난바와같이, 대조군에비해전체 IgE의농도및집먼지진드기특이적인 IgE의농도가본발명에따른혼합추출물을처리한군에서감소하는것을확인할수있었다. 아토피의경우알레르겐 ( 알레르겐 (allergen)) 이다양하기때문에, 항원으로사용한집먼지진드기특이적인 IgE의농도가혼합추출물에의해서감소하였다는점에서더의미가있다고볼수있다 ( 도 8). [0142] [0143] [0144] [0145] <11-2> 본발명의혼합추출물의 T 세포에서분비하는사이토카인의발현억제효과상기 < 실시예 10> 에서혼합추출물을아토피를유발시킨마우스의귀에처리하였을때, 아토피의증상이완화되는효과를관찰하였다. 이에, 본발명자들은본발명에따른혼합추출물의아토피증상완화효과에관련된구체적인기작을확인하기위하여, 상기 < 실시예 10> 에서아토피증상을관찰한마우스를희생시켜, 혼합추출물의마우스의생체내 (in vivo) 에미치는영향을확인하고자하였다. 상기 < 실시예 10> 에서 2주동안아토피유도를위하여집먼지진드기추출물및 DNCB를혼합추출물과함께처리한마우스를희생시킨후, 마우스로부터 T 세포를추출하였다. 쥐의림프절에서 CD4+T세포를분리한후, 20 nm의 PMA와 2uM의 ionomycin으로 4시간동안세포를활성화시킨후아토피에있어병리학적사이토카인으로알려져있는 IL-4, IL-5, IL-13, IL-17, IL-31, IFNg, TNFa의 mrna 발현량을실시간 PCR(real time PCR) 을통해확인하였다. PCR 조건은 95 에서 5분간변성 (denature) 를수행한후, '94 30초, 60 30초, 72 30초 ' 의과정을 40회반복한후, 72 에서 5분동안연장 (extension) 과정을수행하였으며, 사용한프라이머서열은상기 < 실시예 9> 와동일하다. 그결과, 도 9에나타난바와같이 IL-4, IL-5, IL-13의양이혼합추출물을처리했을때크게감소하는것을확인하였다. 이러한결과는. IL-4, IL-5, IL-13 사이토카인은 B 세포가 IgE를생성하는데있어중요한사이토카인이라는사실을고려할때, 혼합추출물을처리에의한 T 세포에서상기사이토카인의감소로인해서 B세포의 IgE양이감소하였다는것을알수있었다 ( 도 9). [0146] [0147] [0148] <11-3> 본발명의혼합추출물의의아토피모델마우스귀조직에서사이토카인의발현억제효과아토피를유도하고추출물을처리한직접적인위치인귀에서의변화를살펴보기위해귀에서전체세포를분리한, IL-4, IL-5, IL-13, IL-17, IL-31, IFNg, TNFa의 mrna 발현량을실시간 PCR(real time PCR) 을통해확인하였다. 그결과, 도 10에나타난바와같이, 혼합추출물을처리한군에서무처리대조군에비하여염증성사아토카인의분비가감소되는것을관찰할수있었으며, 이러한효과는처리한조성물의농도가 1mg/ear 에서 5mg/ear으로증가함에따라비례하였다. 또한, 본발명에따른혼합추출물이림프절에서분리한 T 세포보다더욱효과적으로 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, TNFa의발현량을감소시킴을확인할수있었다 ( 도 10). - 17 -
[0149] [0150] [0151] [0152] 실시예 12 본발명의혼합추출물을포함하는피부외용제의아토피치료효과측정 < 실시예 5> 에서제조한혼합추출물을포함하는외용제를연고형태로만든 " 제조예 1" 과 " 제조예 2" 의완제품을이용해아토피마우스에효능이있는지를혈청내에존재하는 IgE level을측정하여확인하였다. 집먼지진드기와 DNCB를이용해아토피를 4주간유도한후나머지 3주동안위와동일한방법으로아토피를계속유도하면서 ( 각주 1회씩처리 ), 외용제를 3주동안매일동일량을귀에발라주어그효능을확인하였다. 이때, 동일량을발라주기위해노란색팁의끝으로외용제를찍은후, 귀에발라흡수가잘되게문질러주었으며, 외용제처리 3주후쥐를죽여서심장에서피를뽑아혈청을준비한후 IgE 농도를 ELISA로확인하였다. 그결과, 도 11에나타난바와같이, 표 3에서기재된 " 제조예 1" 의 2.5 w/w% 로함유된외용제제는큰효과가보이지않았으나표 3에서기재된 " 제조예 2" 의 5.0 w/w% 로함유된외용제제의경우는 30% 정도의감소를보여완제품또한지속적으로바를경우아토피에효능이있음을알수있었다 ( 도 11). [0153] [0154] [0155] 실시예 13 본발명의혼합추출물의유동성평가본발명의혼합추출물을함유하는제형의유동성을평가하기위하여, 상기표 3에기재된피부외용제의비교예 ( 도 12의 #9, #11) 및실시예 2( 도 12의 #18) 의처방을 Rheometer(RHEOTECH사, MODEL;FUDOH RHEO METER RT- 2002J) 를이용해상온에서 2.5cm로압력을가했을때의유동성을평가하였다. 그결과, 도 12에나타난바와같이액정유화기술을이용하였을때실시예의제형은거의일정하였으나, 비교예의제형은보름에서 1달정도가경과한후, 점도가떨어지는양상을보였다 ( 도 12). [0156] 하기에본발명의조성물을위한제조예를예시한다. [0157] [0158] < 제조예 1> 약학적제제의제조 <1-1> 산제의제조 [0159] [0160] 에탄올혼합추출물 유당 20 mg 20 mg [0161] 상기의성분을혼합한후, 기밀포에충진하여산제를제조하였다. [0162] <1-2> 정제의제조 [0163] [0164] [0165] [0166] 에탄올혼합추출물옥수수전분유당스테아린산마그네슘 10 mg 100 mg 100 mg 2 mg [0167] 상기의성분을혼합한후, 통상의정제의제조방법에따라서타정하여정제를제조하였다. [0168] <1-3> 캡슐제의제조 [0169] [0170] 에탄올혼합추출물 결정성셀룰로오스 10 mg 3 mg - 18 -
[0171] [0172] 락토오스 스테아린산마그네슘 14.8 mg 0.2 mg [0173] 상기의성분을혼합한후, 통상의캡슐제의제조방법에따라서젤라틴캡슐에충전하여캡슐제를제조하였다. [0174] <1-4> 액제의제조 [0175] [0176] [0177] [0178] 에탄올혼합추출물이성화당만니톨정제수 20 mg 10 g 5 g 적량 [0179] 통상의액제의제조방법에따라정제수에각각의성분을가하여용해시키고레몬향을적량가한다음상기의성 분을혼합한다음정제수를가하여전체를정제수를가하여전체 100 ml로조절한후갈색병에충진하여멸균시 켜액제를제조한다. [0180] <1-5> 주사제의제조 [0181] [0182] [0183] 에탄올혼합추출물 묽은염산 BP 주이용염화나트륨 BP 10 μg / ml ph 7.6 로될때까지 최대 1 ml [0184] 적당한용적의주이용염화나트륨 BP 중에에탄올혼합추출물을용해시키고, 생성된용액의 ph를묽은염산 BP 를이용하여 ph 7.6로조절하고, 주이용염화나트륨 BP를이용하여용적을조절하고충분히혼합하였다. 용액을투명유리로된 5 ml타입 I 앰플중에충전시키고, 유리를용해시킴으로써공기의상부격자하에봉입시키고, 120 에서 15 분이상오토클래이브시켜살균하여주사액제를제조하였다. [0185] [0186] [0187] [0188] < 제조예 2> 식품의제조본발명의열수혼합추출물을포함하는식품들을다음과같이제조하였다. <2-1> 밀가루식품의제조본발명의열수혼합추출물 0.5 ~ 5.0 중량부를밀가루에첨가하고, 이혼합물을이용하여빵, 케이크, 쿠키, 크래커및면류를제조하여건강증진용식품을제조하였다. [0189] [0190] <2-2> 유제품 (dairy products) 의제조 본발명의열수혼합추출물 5 ~ 10 중량부를우유에첨가하고, 상기우유를이용하여버터및아이스크림과같 은다양한유제품을제조하였다. [0191] [0192] [0193] [0194] <2-3> 선식의제조현미, 보리, 찹쌀, 율무를공지의방법으로알파화시켜건조시킨것을배전한후분쇄기로입도 60 메쉬의분말로제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도공지의방법으로쪄서건조시킨것을배전한후분쇄기로입도 60 메쉬의분말로제조하였다. 본발명의열수혼합추출물을진공농축기에서감압농축하고, 분무, 열풍건조기로건조하여얻은건조물을분쇄기로입도 60 메쉬로분쇄하여건조분말을얻었다. - 19 -
[0195] [0196] [0197] [0198] [0199] [0200] 상기에서제조한곡물류, 종실류및에탄올혼합추출물의건조분말을다음의비율로배합하여제조하였다. 곡물류 ( 현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부 ), 종실류 ( 들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부 ), 열수혼합추출물 (3 중량부 ), 영지 (0.5 중량부 ), 지황 (0.5 중량부 ) [0201] <2-4> 건강보조식품의제조 [0202] [0203] [0204] [0205] [0206] [0207] [0208] [0209] [0210] [0211] [0212] [0213] [0214] [0215] [0216] [0217] [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] [0223] 열수혼합추출물비타민혼합물비타민 A 아세테이트비타민 E 비타민 B1 비타민 B2 비타민 B6 비타민 B12 비타민 C 비오틴니코틴산아미드엽산판토텐산칼슘무기질혼합물황산제1철산화아연탄산마그네슘제1인산칼륨제2인산칼슘구연산칼륨탄산칼슘염화마그네슘 100 mg적량 70 μg 1.0 mg 0.13 mg 0.15 mg 0.5 mg 0.2 μg 10 mg 10 μg 1.7 mg 50 μg 0.5 mg적량 1.75 mg 0.82 mg 25.3 mg 15 mg 55 mg 90 mg 100 mg 24.8 mg [0224] 상기의비타민및미네랄혼합물의조성비는비교적건강식품에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하 였지만, 그배합비를임의로변형실시하여도무방하며, 통상의건강식품제조방법에따라상기의성분을혼합 한다음, 과립을제조하고, 통상의방법에따라건강식품조성물제조에사용할수있다. [0225] < 제조예 3> 건강음료의제조 [0226] 열수혼합추출물 100 mg - 20 -
[0227] [0228] [0229] [0230] [0231] 구연산올리고당매실농축액타우린정제수를가하여전체 100 mg 100 mg 2 mg 100 mg 500 ml [0232] [0233] 통상의건강음료제조방법에따라상기의성분을혼합한다음, 약 1시간동안 85 에서교반가열한후, 만들어진용액을여과하여멸균된 1 l용기에취득하여밀봉멸균한뒤냉장보관한다음본발명의건강음료조성물제조에사용한다. 상기조성비는비교적기호음료에적합한성분을바람직한실시예로혼합조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도등지역적, 민족적기호도에따라서그배합비를임의로변형실시하여도무방하다. [0234] [0235] < 제조예 4> 나노리포좀의제조 하기 [ 표 4] 의조성으로나노리포좀을제조할수있다. [0236] 성분 함량 ( 중량 %) 글리세린 15.0 레시친 5.0 콜레스테롤 5.0 유사세라마이드 5.0 스테아린산 2.0 카프릴릭 / 카프릭트리글리세라이드 5.0 에탄올혼합추출물 20.0 정제수 To 100 표 4 [0237] [0238] [0239] < 제조예 5> 화장품의제조 <5-1> 유연화장수 ( 스킨 ) 본발명의에탄올혼합추출물을포함하는아토피피부용유연화장수를제조하기위해하기 [ 표 5] 에기재된것처럼배합하여통상적인화장품분야에서의제조방법에따라제조할수있다. [0240] 성분 함량 ( 중량 %) 에탄올혼합추출물 0.1 ~ 30 % 1,3-부틸렌글리콜 3.0 글리세린 5.0 폴리옥시에틸렌 (60) 경화피마자유 0.2 에탄올 8.0 구연산 0.02 구연산나트륨 0.06 방부제 미량 향료 미량 정제수 To 100 표 5 [0241] <5-2> 영양화장수 ( 로션 ) - 21 -
[0242] 본발명의에탄올혼합추출물을포함하는아토피피부용영양화장수를제조하기위해하기 [ 표 6] 에기재된것 처럼배합하여통상적인화장품분야에서의제조방법에따라제조할수있다. [0243] 성분 함량 ( 중량 %) 에탄올혼합추출물 0.1 ~ 30 % 1,3-부틸렌글리콜 8.0 글리세린 5.0 스쿠알란 10.0 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 2.0 유창목오일 0.1 ~ 30 % 1,3-부틸렌글리콜 3.0 글리세린 5.0 폴리옥시에틸렌 (60) 경화피마자유 0.2 에탄올 8.0 구연산 0.02 구연산나트륨 0.06 방부제 미량 향료 미량 정제수 To 100 표 6 [0244] [0245] <5-3> 에센스 본발명의에탄올혼합추출물을포함하는아토피피부용에센스를제조하기위해하기 [ 표 7] 에기재된것처럼 배합하여통상적인화장품분야에서의제조방법에따라제조할수있다. [0246] 성분 함량 ( 중량 %) 에탄올혼합추출물 0.1 ~ 30 % 시토스테롤 1.7 플리글리세릴2-올레이트 1.5 세라마이드 0.7 세테아레스-4 1.2 콜레스테롤 1.5 디세틸포스페이트 0.4 농글리세린 5.0 카르복시비닐폴리머 0.2 산탄검 0.2 방부제 미량 향료 미량 정제수 To 100 표 7 [0247] [0248] <5-4> 세안제 ( 클렌징폼 ) 본발명의에탄올혼합추출물을포함하는아토피피부용세안제 ( 클렌징폼 ) 를제조하기위해하기 [ 표 8] 에기 재된것처럼배합하여통상적인화장품분야에서의제조방법에따라제조할수있다. - 22 -
표 8 [0249] 성분 함량 ( 중량 %) 에탄올혼합추출물 0.1 ~ 30 % N-아실글루타민산나트륨 20.0 글리세린 10.0 PEG-400 15.0 프로필렌글리콜 10.0 POE(15) 올레일알코올에테르 3.0 라우린유도체 2.0 메틸파라벤 0.2 EDTA-4Na 0.03 향료 0.2 정제수 To 100 [0250] [0251] <5-5> 영양크림 본발명의에탄올혼합추출물을포함하는아토피피부용영양크림을제조하기위해하기 [ 표 9] 에기재된것처 럼통상적인화장품분야에서의제조방법에따라제조한다. [0252] 배합성분 함량 ( 중량 %) 에탄올혼합추출물 0.1 ~ 30 % 바셀린 7.0 유동파라핀 10.0 밀납 2.0 폴리솔베이트60 2.5 솔비탄세스퀴올레이트 1.5 스쿠알란 3.0 프로필렌글리콜 6.0 글리세린 4.0 트리에탄올아민 0.5 산탄검 0.5 토코페닐아세테이트 0.1 향, 방부제 미량 정제수 To 100 표 9 [0253] [0254] <5-6> 마사지크림 본발명의에탄올혼합추출물을포함하는아토피피부용마사지크림을제조하기위해하기 [ 표 10] 에기재된 것처럼통상적인화장품분야에서의제조방법에따라제조한다. 표 10 [0255] 배합성분 함량 ( 중량 %) 에탄올혼합추출물 0.1 ~ 30 % 프로필렌글리콜 6.0 글리세린 4.0 트리에탄올아민 0.5 밀납 2.0 토코페닐아세테이트 0.1 폴리솔베이트60 3.0-23 -
솔비탄세스퀴올레이트 2.5 세테아릴알코올 2.0 유동파라핀 30.0 산탄검 0.5 향, 방부제 미량 정제수 To 100 [0256] [0257] <5-7> 팩 본발명의에탄올혼합추출물을포함하는아토피피부용팩을제조하기위해하기 [ 표 11] 에기재된것처럼통 상적인화장품분야에서의제조방법에따라제조한다. 표 11 [0258] 배합성분 함량 ( 중량 %) 에탄올혼합추출물 0.1 ~ 30 % 프로필렌글리콜 2.0 글리세린 4.0 폴리비닐알코올 10.0 에탄올 7.0 파이지-40 히드로게비이티드캐스터오일 0.8 트리에탄올아민 0.3 향, 방부제 미량 정제수 To 100 [0259] 이상의본발명은상기에기술된실시예들에의해한정되지않고, 당업자들에의해다양한변형및변경을가져올수있으며, 그외의색채화장품을포함하는다양한용도의화장품에적용될수있는것이고, 그효능에따라인체에얇게도포하여바를수있는약제즉, 연고로제조에이용될수있고, 이는첨부된청구항에서정의되는본발명의취지와범위에포함된다. [0260] 산업상이용가능성상기에서보는바와같이, 본발명의인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복력, 백지및감초의혼합추출물을유효성분으로함유하는아토피치료용조성물은 IgE, 사이토카인및히스타민의분비를억제시킴으로써, 아토피의증상의완화효과를나타내므로, 아토피예방및치료용조성물, 화장료조성물, 건강기능식품및피부외용제로유용하게사용될수있다. - 24 -
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도면 11 도면 12 서열목록 <110> LEE, JUNG BOK <120> omposition for the prevention or treatment of atopic dermatitis containing herbal medicines - 32 -
<130> 10p-06-22 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> mouse HPRT forward primer <400> 1 gcccaagatc gtcaaaaaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> mouse HPRT reward primer <400> 2 attgtggacc aggaacttgc 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-4 forward primer <400> 3 acaggagaag ggacgcca 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-4 reward primer <400> 4 gaagccgtac agacgagctc a 21 <210> 5 <211> 20-33 -
<212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-5 forward primer <400> 5 agcacagtgg tgaaagagac 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-5 reward primer <400> 6 tccaatgcat agctggtgat tt 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-13 forward primer <400> 7 gcaacatcac acaggaccag a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-13 reward primer <400> 8 gtcagggaat ccagggctac 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IFN-g forward primer <400> 9 tcaagtggca tagatgtgga agaa 24 <210> 10-34 -
<211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IFN-g reward primer <400> 10 tggctctgca ggattttcat g 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> TNF-a forward primer <400> 11 catcttctca aaattcgagt gacaa 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-17 forward primer <400> 12 ttcatctgtg tctctgatgc t 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-17 reward primer <400> 13 ttgaccttca cattctggag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-31 forward primer <400> 14-35 -
atacagctgc cgtgtttcag 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> IL-31 reward primer <400> 15 agccatctta tcacccaaga a 21-36 -