전기영동
실험목적 기본적인분자실험장비인피펫, 저울, 원심분리 기, vortex mixer 사용법숙지 전기영동과정을통해서 DNA 크기비교
여러가지피펫종류들 Basic type P2 white tip P10 white tip P20 yellow tip P100 yellow tip P200 yellow tip P1000 blue tip Multi-channel pipette
Auto-pipettes
Electric Balance
원심분리기 g value: gravity rpm: round per minutes Rotor: 고정식과 swing bucket 원심분리기사용시주의사항 : - 축을중심으로항상좌우가같은무게가되도록한다. - 시료가하나밖에없을경우에는같은 blank tube를넣어무게를맞춘다. 고속이나대용량의원심분리기에서는열이많이발생함으로일반적으로냉각장치가부착되어있다.
Vortex Mixer 또는 Touch Mixer
Fume hood 공기의흐름 이곳에주로부식성또는인화성시약들을보관
전기영동 (electrophoresis) - 정의 : DNA나 RNA, protein과같은큰분자들을전기적인힘을이용하여 gel에서이동시켜크기에따라서로분리하는기술이다. - Agarose gel: 추출된 DNA의확인이나, PCR product의확인등을위해서는 0.005% 정도의 EtBr ( 또는대체물질 ) 을포함한 1~1.5% 정도의 agarose gel 을이용하여전기영동한다. - 완충액 (buffer): 전기영동을위한 buffer는 1X TAE (Tris base, Acetic acid, EDTA) 또는 1X TBE (Tris base, Boric acid, EDTA) 를사용하며, 10X로만들어사용전 1X로희석하여사용한다. X 라함은농도를뜻하고, 10X 용액이란 10배농도의저장용액을말한다. - DNA의이동방향 : 전기영동시에는시료의이동방향에주의한다 : DNA는 - 전하를띠고있으므로전기영동을하면 + 극으로이동한다. - 염료와침강제 : DW (distilled water) 또는 TE (Tris-EDTA) 에녹아있는 DNA는무색이고, 전기영동 buffer에들어가면즉시확산된다. 그러므로 DNA를전기영동할때에는 loading dye와섞어함께 loading 한다. Loading dye에는 bromophenolblue라는파란색의염료가들어있어이것과섞인 DNA의위치를눈으로확인할수있게하고, 또한 sucrose 등의고분자물질을넣어 DNA가 buffer 속에서확산되지않고 well 으로가라앉을수있게침강제의역할을한다.
손쉬운 DNA 의확인과정량방법 - DNA는무색으로눈으로보이지않는다. 그러므로일반적으로 EtBr (Ethidium bromide) 을이용하여간접적으로 DNA의존재와농도를확인할수있다. - EtBr은두개의염기가결합한 DNA 사다리의가로대와비슷한크기와구조를갖고있어 DNA 염기쌍사이로잘삽입된다. - EtBr은자외선 (ultra-violet ray) 을받으면가시광선으로전환시켜발광하는성질을갖는일종의형광물질이다. - 추출된 DNA를 EtBr을포함한 agarose gel 상에서전기영동시키면, DNA에 EtBr이결합하게되고이를자외선하에서관찰하면발광하는 EtBr의밝기로서상대적인 DNA의양을측정할수있게된다. - 일반적으로이미그양을알고있는 DNA와동일한조건에서같이전기영동하여그밝기를비교함으로서정량한다. EtBr은 DNA에삽입되는 intercalating agent로서틀변환돌연변이 (frame-shift mutation) 를일으키는발암물질이다. 그러므로제한된구역에서조심하여사용하여야한다. EtBr은수용성으로신체가오염되었을시에는즉시물로닦아내고, 빛에의해파괴됨으로항상어두운곳에보관하여야한다. EtBr은발암물질이므로최근 EtBr을대체할수있는많은물질들이개발되어있음. 하지만여전히 EtBr보다경제적이지못하고 DNA를검출해내는감도가떨어진다.
1.2% agarose gel 만들기 - Agarose gel을만들수있는 cast와 cassette를결합하고 comb을꽂아놓음 - 250ml 비이커에 1) 40ml 1X TAE buffer 2) 0.48g agarose 를넣고잘흔들어준다음 vinyl wrap 으로덮고구멍을 2~3개뚤어줌 - 전자레인지에서 1분간가열한후흔들어줌 - 다시 30초간가열하여 agarose가완전히녹았는지확인함 ( 알갱이가보이면 15초정도더가열하여완전히녹임 ). - Vinyl wrap을벋겨내고 ( 뜨거운수증기조심 ) 피펫으로 EtBr 또는대체시약 (Goodview) 4ul를넣고흔들어완전히섞어줌. 이때기포가발생하면안됨. - 준비된 cast에부어넣음. Gel의두께는약 7mm 정도가되도록함. 이때만약기포가발생하였다면 pipette tip을이용하여기포를제거 ( 제거가어려울시에는적어도 cassette 벽으로기포를이동시킴. Comb에기포가붙어있으면절대안되고 comb에붙은기포제거가어려울경우 comb을다시빼낸후기포를제거한후재장착시킴 ). - 10~20분후 gel이완전히굳은후사용함. Gel 을만들고장시간 (1시간이상 ) 이후에사용하려고할때는 vinyl wrap으로싸거나밀폐된용기에보관하여 gel의수분증발을막아야함.
전기영동 준비물 : 전기영동장치, agarose, 1XTAE buffer, 전자레인지, 피펫, EtBr 또는대체물질 (Goodview TM), 침강제및염료, parafilm, UV gel-documentation system 실험방법 1. 보고자하는 DNA의크기에따라 agarose의양을조절하여 TAE/TBE buffer와비이커에넣고전자레인지에넣어녹인다. ( 주의 ; agarose가잘녹았는지확인한다 ) 2. 녹은 agarose 가따뜻할정도로식으면 EtBr 또는대체물질 (Goodview) 을넣고잘섞는다.
전기영동 3. 깨끗이닦은 gel plate 에기포가생기지않도록조심스럽게분주한다음, comb 을끼우 고 gel 이굳도록한다. 4. DNA size marker 와 gel loading dye 와섞은 sample 을 parafilm 상에서피펫을이용하 여섞은후 well 에넣는다. 5. 50-100V 로 15-30 분동안전기영동을한다.
전기영동 6. UV transilluminator로 agarose gel을관찰및이미지를획득한다. ( 이때, EtBr이들러간 agarose gel은반드시폴리글러브를착용하고잡도록한다.) UV 광선을맨눈으로보는것은매우위험하므로항상 UV protector를통하여 UV 상에서 gel을관찰한다. 아가로오스겔을통한 DNA 의이동속도 : DNA 분자의크기, 아가로오스의농도, DNA 형태, 전류의세기, 염기조성및온도등에좌우.
Lamda phage DNA 의전기영동 - Lamda phage를이용하여 serial dilution 하여다양한농도의 DNA를 만든후이를한꺼번에전기영동하여 DNA 농도차이를확인한다. - Serial dilution Lamda DNA DW 1 1/10 3ul 27ul 2 1/50 1 3ul 12ul 3 1/250 2 3ul 12ul - Loading 하는방법 1) Parafillim을잘라놓고 loading dye ( 푸른색 ) 를 loading할시료수만 큼 1ul씩분주하여방울을만들어놓는다. 2) 1번 lane에준비된 ladder를 3ul loading 3) 2~4 번 lane에각각시료 5ul와준비한 1ul의 loading dye 를 pipette 으로펌프하여잘섞고 ( 기포가생기면안됨 ) 전체 6ul를 loading
정확한 DNA 정량법 - 일반적으로추출된 DNA를정확히정량하기위해서는 spectrophotometer를이용한다. DNA는 260nm의파장을흡수하기때문에그양은 260nm에서의 OD (optical density) 값에비례한다. 이를이용하여 DNA의양을측정한다. - 단백질의흡수파장은 280nm로서 OD 260/280 값은추출된 DNA가얼마나순수한지를측정하는지표이다. - spectrophotometer를이용하기위해서는일정부피 (cuvette의크기에따라약 1ml~100ul 정도 ) 이상이필요하며, OD 값또한측정을위한유효한범위가존재하기때문에일반적으로추출된 DNA는 1/10~1/100정도로희석하여측정한다. - spectrophotometer는소량의 DNA의정량에는한계가있다. - 최근개발된특수한형태의 spectrophotometer인 Nanodrop과같은측정장치는 1ul정도로도정량이가능하므로소량의 DNA의정밀한정량이가능해졌다.
UV-visible Spectrophotometer
Nano drop spectrophotometer
전기영동과정
보고서 실험의 Background 설명을참조하여아래질문에대한해답을정확히이해한후 답을 1 페이지정도작성해서제출하시오 ( 기말고사문제가될수있음 ). 1. 추출된 DNA 를어떻게정량할수있는지각각의방법과그원리를설명하시오. 2. DNA 를전기영동할때 DNA 는어떤방향으로이동하는가와그이유에대하여 설명하시오.