2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 1 KUmbl 경북대학교미생물공학연구실 7 장. 아미노산발효
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 2 7-0. 아미노산발효의종류 * 아미노산발효의종류 1. 직접발효법 : 미생물을이용하여기질로부터발효에의해생산 1) 야생균주에의한방법 : Glu 2) 영양요구변이주에의한방법 : Lys, Thr 3) Analog 내성변이주 : Lys, Thr, Trp 4) 아미노산감수성변이주 : Thr, Met 5) 대사의 bypass 이용 : Ile 6) 전구체첨가법 : Ile 2. 효소법 : 주로미생물효소를이용하여기질을아미노산으로전환 -Lys, Asp, Trp, Phe, Tyr 일부 3. 화학합성 : Ala, Gly, Met - 극히일부
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 3 - 아미노산의생합성경로 1) 세린계열 (Ser, Gly, Cys) 3-Phosphoglycerate Serine Glycine Cysteine 2) 방향족아미노산계열 (pepptt) Phenylalanine PEP + E-4-P Chorismate Tyrosine Anthranilate Tryptophan 3) 피루브산계열 (Ala, Val, Leu) Alanine Pyruvate α-ketoisovaleric acid 4) 글루탐산계열 (Glu, Gln, Pro, Orn, Arg) Proline Valine Leucine α-kg Glutamate Ornithine Arginine Glutamine 5) 아스파르트산계열 (Asp, Asn, Lys, Met, Thr, Ile) Lysine OAA Aspartate Homoserine 6) 히스티딘의합성 Ribose-5-phosphate Histidine Asparagine Methionine Threonine Isoleucine
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 4 7-1. Glutamate 계열의아미노산 * Glutamate 계열의아미노산 : Glu, Pro, Arg, Orn Lyase Acetyl CoA Citrate Isocitrate Succinate Fumarate Malate OAA H2O ADP+ ADP+ ADPH2 H3 ADPH2 Oxalosuccinate CO2 Glyoxylate CoASH AD+ Acetyl CoA CO2 ADH2 Glyoxylate cycle Glutamate α-ketoglutarate Succinyl CoA TCA Glu dehydrogenase O=C-COOH a-kg α dehydrogenase CH2 CH2COOH Glucose(mw 180) + H3 + 1.5O2 ----- Glu(mw 147) + CO2 + 3H2O
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 5 1. Glu 발효 (-CH2-CH2COOH)-- 야생균주에의한직접발효법에의해생산 가. 생산균주 : Corynebacterium glutamicum 의야생주 1) Glu dehydrogenase 활성강, α-keto glutarate dehydrogenase 활성약 : α-kg 로부터 Glu 생산 - 탄수화물의 50% 를 Glu 로전환 : Succinyl CoA 로전환능약 - TCA cycle 약화 2) Biotin or glycerol 생육에요구 : 세포막투과성개량-합성 Glu 세포외분비가 ) biotin 제한배지 (5ppm 이하 : 2-5ppm) * biotin: acetyl CoA + CO2--malonyl CoA 생성반응의조효소 : 결핍시 oleic acid 등지방산합성불량 - 포화, 불포화지방산비불균형나 ) glycerol 제한배지 : glycerol 부족 - 인지질즉세포막형성불량
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 6 나. Glu 발효관리 1) 탄소원 가 ) 포도당, 전분당화액 : Glu 세포외분비양호, biotin 결핍으로증식불량 - 배지에소량의 biotin 첨가 나 ) 당밀 : 값이싸나 biotin 고농도함유 - 적당한시기에생육저해물질첨가 * 생육저해물질 - 항생물질첨가 : Penicillin 또는 Cephalosporin C- 세포벽합성불량 - biotin 길항제첨가 고급포화지방산 : C16(palmitate),C17(margariate),C18(stearate) 계면활성제 : Tween40(palmitate), Tween60(stearate 함유 ) 2) 질소원적당량유지 - H3 gas, H4OH 등산업적주로사용, 유안, 요소첨가로유가배양 - 과잉시 : Gln 생산 Glutamate H3 H2O - 결핍시 : α-ketoglutarate 생산 3) 산소과잉시 : ADPH2 가부족하여 α-ketoglutarate 축적결핍시 : 혐기적대사로젖산, 호박산생성 Glutamine H2-CH-COOH CH2 CH2-COOH2
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 7 다. Glu 의분리및정제 : Glu 분리 --Glu 정제 --MSG 제조 등전점침전법 1) Glu의분리 : 등전점침전법발효액의 ph를 3.2로조절 (Glu의석출 ) 하여원심분리 - HCl로용해 (Glu-HCl) 후농축 2) Glu의정제 : 재침전 Glu-HCl 온탕용해 - aoh로 ph3.2 조절하여 Glu 재침전 - 원심분리로 Glu 결정회수 - 냉수세척 (acl 및불순물제거 ) 3) MSG의제조유리 Glu 용해후 aoh로 ph6.5 조절 : a-glu 생성 (ph7.0 이상 : a 2 -Glu 생성 ) - 탈철, 탈색후농축하여결정화탈철 : a 2 S + Fe +++ --- Fe 2 S 3, a 2 HPO 4 + Fe +++ --- FePO 4 탈색 : 활성탄처리
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 8 2. Orn, Arg 발효 -- 의약용으로중요 Carbamyl phosphate Asp Glu -Acetyl -Acetyl Ornithine Citrulline Arginosuccinate Arginine glutamate ornithine Urea 가. Ornithine 발효 : C. glutamicum의 Cit - - citrulline 영양요구성변이주 - Ornithine으로부터 citrulline 전환불가 - Ornithine 분해불가, arginine에의한조절해제 - 배지에소량의 citruline 첨가하여배양 나. Arginine 발효 : -(CH2)3-H-C(=H)-H2 - 동물단백질에함량고 -성장기어린이에게필요 준필수아미노산의하나 - 최종산물로서영양요구변이주이용불가능 ( 최종산물조절 ) * Analog 내성변이주에의한발효가주 AH(Arginine hydroxamate) 내성변이주- arginine에의한조절해제
7-2. Aspartate 계열 (Asp 제외모두필수아미노산 ) 1. Lys 발효 : 곡류단백질에특히결핍, 열에불안정--한계아미노산가. 발효법 : C. glutamicum 변이주이용 -Homoserine dehydrogenase 활성약, Aspartokinase 조절해제 Glc OAA Asp β-aspartyl-p Aspartic-β-semialdehyde Homoserine Thr Aspartokinase Homoserine dehydrogenase Thr+Lys 협조적조절 Lys Met Ile * 변이주의특성 1) Hom - homoserine 영양요구성변이주 : Thr 합성불가 : Thr+Lys 조절해제, Lys 축적 : inhibition, : repression 2) Met s, Thr s - 감수성변이주 - Thr, Met 많으면생육저해 - Thr, Met 생산량매우적은변이주 H2-CH-COOH : Thr+Lys 조절해제, Lys 축적 (CH2)4 H2 3) AEC r : 2-aminoethyl-cysteine 내성변이주 : AEC 및 Lys에의한조절해제 Lys SH CH2 H2-C-COOH (CH2)2 H2 2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 9 AEC
* 발효조건 1) 탄소원 : 사탕수수당밀주로이용 2) 질소원 : 암모니아가스또는암모늄염 - 부원료 : 탈지대두박가수분해물등 3) 영양요구물질 : 필요에따라 homoserine, Thr, Met 소량첨가 4) Biotin 30ppm 이상유지 사탕수수당밀에충분히함유 나. 효소법에의한 Lys 의생산 : α-amino-ε-caprolactam 으로부터효소반응으로 Lys 생산 (cyclohexane 으로부터화학합성 - D, L 형 50% 함유 ) -D 형을 L 형으로전환후가수분해 D- -amino- -caprolactam L- -amino- -caprolactam L-Lysine Racemase Hydrolase H lactam H H2-CH-COOH Achromobacter obae Cryptococcus laurentii (CH2)4 O O ε -Racemase 강 -Hydrolase 강 H2 Hydrolase 약 Racemase 무 α H2 H2-1 - 2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 10
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 11 2. Thr 발효 Glc OAA Asp β-aspartyl-p Aspartic-β-semialdehyde Homoserine Thr Aspartokinase Homoserine dehydrogenase Lys Met Ile : 조절해제 (Thr, Lys, Met), Thr 의분해억제, 중간산물타물질로의전환방지 * E. coli와 C. glutamicum 변이주사용한직접발효법 : 포도당으로부터생산 : E. coli - Thr 합성경로는 Corynebacterium sp. 와동일하나조절현상상이 ***E. coli의 Asp 계열조절현상 :..\Asp 계열조절현상.ppt 가 ) α-ahv r : Thr analog 내성변이주 (α-amino-β-hydroxyvaleric acid) 나 ) DAP - : diaminopimelic acid 합성불가 - Lys 합성불가, ASA 분해방지다 ) Met - : homoserine으로부터 Met 합성불가 - Met 조절해제, homoserine 분해방지라 ) Ile - : Thr로부터 Ile 합성불가 - Thr 분해방지
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 12 3. Ile 발효 1) S. marcescens, C. Glutamicum 변이주를이용한직접발효법 주 2) Serratia marcescens를이용한대사의 bypass 또는전구체첨가법 - 기질로서 D-Thr 또는 α-amino butyrate 사용 L-Threonine α-ketobutyrate Ile H3 α-amino butyrate α-ketobutyrate Ile H2O H3 AD+ ADH2 4. 효소법에의한 Asp의생산 : E. coli aspartase를고정화하여 fumarate를 amination시켜제조 E. coli의 aspartase Fumarate+ H3 또는 ammonium fumarate Aspartate ( 거의 100% 전환가능 ) CHCOOH HOOCHC CHCOOH4 HOOCHC H2-CH-COOH CH2-COOH
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 13 2 H + O2 7-3. Aromatic 계열 : Phe, Tyr, Trp : 구조유사, 생합성경로공통, 조절기구복잡 - 발효법생산곤란 - 효소적생산 1. Trp 의생산 : Lys 다음으로곡류 ( 특히옥수수 ) 에결핍되기쉬운필수아미노산 1) 효소법 : E. coli Trp synthetase 또는 Providencia rettgeri 의 tryptophanase 사용 + 3 H + HOOCOC 3 HC 3 1 4 5 6 2) 발효법 : C. glutamicum 의 Phe -, Tyr -, 5-FT r H elodni Phenylalanine PEP + E-4-P Chorismate Tyrosine Anthranilate Tryptophan 2 HC HOOC- HC -
2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 14 2. Phe, Tyr의생산 - 생체내생합성경로거의유사 - C. glutamicum, B. subtilis의변이주를이용한직접발효법 1) 영양요구성변이주 : Tyr 생산시 Phe -, Phe 생산시 Tyr - 2) analog 내성변이주 : Phe - P(M)FP(p or m-fluorophenyl alanine), PAP(p-aminophenylalanine) : Tyr - 3-amino tyrosine, tyrosine hydroxamate * Phe : aspartame ( 설탕의 200배감미 ) 의원료 - L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester 3. DOPA (3,4-dihydroxy phenylalanine) : Parkinson 씨병 (P's syndrome) 등노인성뇌신경장해치료약 - 미생물의대사와무관 : 직접발효에의한생산불가 L- or D-Serine(-CH2OH) or Pyruvate + H3 pyrocatechol + OH OH β-tyrosinase -Erwinia herbicola 의효소주로사용 H2-CH-COOH CH2 OH OH + H2O DOPA
7-4. 기타 1. Histidine(His 하나뿐 ): hemoglobin에많이함유 - 빈혈치료제, Arg와함께소아의필수아미노산 - C. glutamicum의 analog 내성변이주 (2-TA r, 1,2,4-TA r 이용하여생산 ) (2-TA : 2-thiazole alanine, 1,2,4-TA : 1,2,4-triazole alanine) H2 - CH - COOH CH3 Alanine H2 - CH - COOH CH2 His S Thiazole alanine 2 3 1 Triazole alanine 2. Pyruvate 계열 : 산업적으로중요한것없음 3. Serine 계열 : 생산거의무 2016-10-25 KU Microbial Biotechnology Laboratory 15