대한한방내과학회지제 35 권 4 호 (2014 년 12 월 ) J. Int. Korean Med. 2014:35(4)505-518 고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서枸杞子加味方의효과연구 안가영, 조재준, 신민구, 전상윤동신대학교한의과대학내과학교실 Study of the Effects of Gugijagami-bang in a Hyperlipidemic Animal Model Induced with a High-Fat Diet Ga-young An, Jae-joon Joe, Min-koo Shin, Sang-yun Jeon Dept. of Internal Medicine, College of Korean Medicine, Dong-Shin University ABSTRACT Objectives: This study was undertaken to investigate the effects of Gugijagami-bang (GGB) in a hyperlipidemic animal model induced by a high-fat diet using diverse biological methods. Methods: This study was to determine whether fractionated GGB extracts inhibit reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) in RAW 264.7 cells. Hyperlipidemia was induced by a high-fat diet fed for 6 weeks. Total cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglyceride, liver function and histologic change of liver were measured after oral administration of GGB. Results: 1. DPPH scavenging bow performance was increased in a concentration-dependent manner by GGB. 2. Compared to the control group, NO production (%) and ROS production (%) were decreased significantly by GGB. 3. Total-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride were decreased significantly by GGB. 4. HDL cholesterol increased more than the control group, but not significantly. 5. In histopathologic examination, fatty liver (hepatic steatosis) was inhibited, almost no rounds of fat were observed in the liver. Conclusions: GGB would appear effective in the prevention and treatment of atherosclerosis, ischemic heart disease, other cardiovascular diseases caused by hyperlipidemia. Key words: Gugijagami-bang, hyperlipidemia, RAW 264.7 cell, antioxidant activity Ⅰ. 서론 현대사회는서구화된식생활습관으로탄수화물, 지방, 단백질의과다섭취와운동이부족해짐에따 교신저자 : 전상윤광주시남구월산로 141번지동신대학교광주한방병원한방내과 TEL: 062-350-7207 FAX: 062-350-7141 E-mail: damiano70@hanmail.net 이논문은 2013년도동신대학교일반대학원한의학박사학위논문임. 라혈액내콜레스테롤및지방축적이증가되고있다 1. 특히체내에과잉축적된지방은생체내의에너지대사에직접적으로영향을주어열량소비저하, 지방산화의억제및혈액내유리지방산의과잉 2, 혈중지질과산화의촉진, 중성지방의증가, 당대사의이상, 인슐린의분비와감수성의약화등 3, 생체내대사산물의생성과기능에이상을초래하고, 이로인해아니라심장질환, 등의각종성인병및만성질환을유발한다 4. 특히고지혈증은죽상 505
고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서枸杞子加味方의효과연구 경화증을일으키고, 이는우리나라주요사망원인인심혈관과뇌혈관질환의주요위험인자가되고있다 1. 한의학에서고지혈증은痰飮, 瘀血, 氣滯, 寒凝, 虛勞등의범주에속하며 5, 嗜食肥甘厚味의外因과肝脾腎機能失調의內因으로인해濕濁, 火熱, 脾胃濕熱등의원인에의해발생하는것으로인식하고있다 6. 고지혈증에대한한의학적연구로는정 7 의加味溫膽湯, 황 8 의茵蔯胃苓湯, 차 9 의降脂通脈飮, 유 10 의夏枯草散박 11 의加味地黃湯등처방과茵蔯蒿 12, 枳實 13, 白何首烏 14, 丹蔘 15 등약재를이용하여고지혈증에대한효과를실험적으로증명하고, 이에대한기전을밝히려는연구가이루어지고있다. 특히枸杞子는고지혈증에대한실험연구가활발히연구되고있다 16-18. 枸杞子加味方은현재동신대학교한방병원에서고지혈증에활용되고있는처방으로滋補肝腎益精明目하는枸杞子를군약으로하여生地黃, 丹蔘, 牧丹皮, 甘菊, 山査肉, 石菖蒲, 麥門冬, 黃連, 梔子, 柴胡, 黃芩, 防風등으로구성되어있다. 임상적으로혈중지질이감소하는효과를나타내는枸杞子加味方에대하여실험적으로규명하고, 기전을밝히고자연구하게되었다. 이에저자는枸杞子加味方추출물을 Raw 264.7 cell을이용하여세포독성, DPPH 소거능, No 생성억제, ROS 활성효과를측정하고, 고지혈증질환모델동물인 6주령의수컷 ApoE(k/o) 생쥐를이용하여간및신독성, 혈중인자등을관찰하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 실험 1. 재료 1) 약재본실험에사용한枸杞子加味方 (Gugijagami-bang, GGB) 의구성약물은대전대학교부속한방병원에 서구입하여정선한후사용하였다. 한첩분량은아래와같다 (Table 1). Table 1. The Compositions of Gugijagami-bang (GGB) Herbal Volume Scientific name name (g) 枸杞子 Lycii Fructus 20 生地黃 Rehmanniae Radix 8 丹蔘 Salvia miltiorrhiza Bunge 8 牧丹皮 Moutan Cortex 6 甘菊 Chrysanthemi Flos 6 山査肉 Crataegi Fructus 6 石菖蒲 Acori Graminei Rhizoma 6 麥門冬 Liriopis Tuber 6 黃連 Coptidis Rhizoma 4 梔子 Gardeniae Fructus 4 夏枯草 Prunellae Spica 4 柴胡 Bupleuri Radix 4 黃芩 Scutellariae Radix 4 防風 Saposhnikovia Radix 4 Total amount 90 2) 세포실험에사용된 RAW 264.7 세포는한국세포주은행 (Korea) 에서구입하였다. 3) 동물및사육조건실험동물은고지혈증질환모델동물인 6주령수컷 ApoE(k/o) 생쥐를미국 Jackson Lab. 으로부터수입하여사용하였다. 분양받은실험동물은 2 주간일반고형사료 (Table 2. AIN-76A diet Test Diet Co, USA) 로적응시킨후체중변화가일정하고건강한 10주령의생쥐를선별하여 4마리씩분리한후 0.15% cholesterol, 21% fat으로조성된 western 식이사료 (Table 3. Research Diet, USA) 와물을자유롭게공급하면서항온 (25±2 ), 항습 (50±5%) 및 12시간간격의광주기 (light on 07:00-19:00) 로명암이조절되는 SPF(Specific Pathogen Free) 실험실에서실험하였다. 506
안가영 조재준 신민구 전상윤 Table 2. Composition of AIN-76A Diet Diets ingredient Concentration (g/kg) Casein 200 DL-Methionine 3 Corn Starch 150 Sucrose 500 Cellulose 50 Con Oil 50 AIN-76 Mineral Mix 35 AIN-76A Vitamin Mix 10 Choline Bitartrate 2 Ethoxyquin 0.01 Table 3. Composition of Western Diet Diets ingredient Concentration (g/kg) Casein, 80 Mesh 195 L-Cystine 3 Corn Starch 50 Maltodextrin 10 100 Sucrose 341 Cellulose 50 Milk Fat, Anhydrous 200 Corn Oil 10 Mineral Mix S 10001 35 Calcium Carbonate 4 Vitamin Mix V10001 10 Choline Bitartrate 2 Cholesterol 1.5 Ethoxyquin 0.04 4) 시약 Dulbecco's phosphate buffered saline, RPMI 1640, Collagenase A, Penicillin, pyrogallol, Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA), 3-(4,5- Dimethyl -2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(mtt), Sodium citrate, N-2-hydroxylethyl -piperazine-n-2-ethane sulfonic acid(hepes), lipopolysaccaride(lps), 2,7-dichloro-dihydro fluorescin diacettate(dcfh-da), diethyl pyrocarbonate(depc), 2,2Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 는 sigma 사 (USA) 제품을, Dimethyl sulfoxide(dmso) 는 Sowa chemical 사 (Japan) 제품을, Ethylacrtate 는 Junsei 사 (Japan) 제품을, Potassium Phosphate Monobasic(KH 2PO 4) 는 Yakuri 사 (Japan) 제품을, RNAzolB M-MLV RT, dntps mix, RNase inhibitor Takara 사 (Japan) 제품을, First Strand cdna Synthesis kit는 Pharmacia 사 (USA) 제품을, DNase I는 Life Technologies사 (USA) 등을사용하였고, 이밖에일반시약은특급시약을사용하였다. 5) 기기본연구에사용된기기는 High performance liquid chromatography(hplc. Shimadzu Japan), Ice-maker (Vision, Korea), Centrifuge(Hanil Co., Korea), Rotary vaccum evaporator(büchi 461, Switzerland), Deep freezer(sanyo Co., Japan), Autoclave(Sanyo, Japan), Ultrasonic cleaner(branson Ultrasonics Co., USA), ELISA reader(molecular Divice., USA), Roller Mixer (Gowon scientific technology Co., Korea), 한약유출기 (DWP-1800T, 대웅, Korea), Spectrophotometer (UV-2450, Shimazu, Japan), cell cytometery(facs, Beckman Co., USA), Balance(Cass, korea), 생화학기 (AU400, Olimpus, USA), 감마카운터기 (WIZARD 1470, Finland) 등을사용하였다. 2. 방법 1) 시료추출 GGB 2첩 (180 g) 에멸균증류수 1.5 L를넣고전탕한후, 여과하여증류장치로농축하였다. 농축액을동결건조기를이용하여완전건조한다음얻어진분말 ( 수득률 17.8%, 32.1 g) 을냉동보관 (-80 ) 하면서실험농도로희석하여사용하였다. 2) 시료 HPLC 패턴확인 GGB 추출물 30 mg을멸균증류수 1 ml에녹여 0.45 μm membrane filter로여과후이중 20 μl를 HPLC 시료로사용하였다. HPLC 는 Shimadzu(Japan) 사의 system controller(cbm-20a), pump(lc-20ad), column oven(cto-20a), UV/VIS detector(spd-20a) 507
고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서枸杞子加味方의효과연구 를사용하였으며, column 은 ACE 5 C18(250 4.6 mm, 5 μm) 을사용하였다. 이동상은 water(a) 와 acetonitrile(b) 로 gradient elution system 을적용시켜 0%(5 분 B), 0-30%(35분 B), 30-100%(10분 B) 로설정하였다. 유속은 1.0 μl/min 이었으며 column 온도는 40 를유지하였다. UV wavelength는 254 nm로설정하여분석하였다. 3) In vitro 실험 (1) 세포독성측정 Raw 264.7 cells은 96well plates에 10 4 cells/well 로분주하여 24시간동안배양한후, GGB를각각 50, 100, 200 ug/ml의농도로처리하여 24시간동안배양하였다. 배양후, 10 ul의 WST solution 을첨가한후 CO 2 배양기 (37, 5% CO 2) 에서 30분반응시킨후, 450 nm에서흡광도의변화를측정하여대조군에대한세포생존율을백분율로표시하였다. (2) 항산화활성측정 1 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 소거능측정 150 mm DPPH/EtOH 150 μl에 GGB를 25, 50, 100, 200 μg/ml 농도로희석하여 100 μl씩첨가한후 37 에서 30분간반응시켰다. 이를 ELISA reader 를이용하여 wave length 517 nm에서흡광도를측정한후아래의방법으로계산하였다. DPPH 소거능 (%) = ( 대조군의흡광도 -GGB 처리군의흡광도 ) 100 대조군의흡광도 2 Total Nitric oxide 생성억제효과측정 NO의농도는배양액내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System 을이용하여측정하였다. Raw 264.7 cells은 96 well plates 에 1 10 4 cells/100 μl로분주하여 24시간동안배양한후, GGB을각각 50, 100, 200 μg/ml 농도로처리하고, LPS 1 μg/μl을처리하여, 다시 24시간동안배양하였다. N 1 buffer 50 μl를각 well 에처리한후, 10분간상온에서암소반응후 540 nm에서흡광도를측정하였다. Nitrite standard 의농도별표준곡선을이용하여배양액의 NO 농도를결정하였다. 3 Reactive oxygen species(ros) 활성측정 Raw 264.7 cell 내에서 reactive oxygen species (ROS) 를측정하기위하여 2',7'-Dichlorodihydrofluorescin diacetate(dcfh-da) 를이용하였다. 48 well plate 에 Raw 264.7 cell를 2 10 5 /well/400 μl씩첨가하고 LPS 1 μg/ml 및 GGB 50, 100, 200 μg/ml 농도를처리한후 37, 5% CO 2 배양기에서 24시간배양하였다. 배양종료후 DCFH-DA 10 μm을처리하여 15분동안빛이차단된상온에서배양한후차가운 PBS를넣어 1,200 rpm에서 5분간원심분리한다음상청액을제거하고다시 PBS 400 μl를부유시켜유세포분석기 (Flow cytometer) 를이용하여형광강도의세기에따른 ROS를측정하였다. 4) In vivo 실험 (1) 약물투여각실험군은정상군, 대조군그리고 GGB 50, 100, 200, 400 투여군으로나누어정상군은일반사료와식수를충분히공급하였다대조군과 GGB 투여군은 Table 3의조성으로만들어진고콜레스테롤사료와식수를충분히공급하였으며, GGB 투여군은고콜레스테롤사료투여 2주후부터 400 mg/kg/0.5 ml의양으로정해진시간 ( 오전 11시 ) 에매일투여하였다. (2) 간및신독성측정실험종료후혈액을채취해혈청을분리하여 Alanine aminotransferase(alt), Alkaline Phosphatase (AST), 요소질소 (BUN) 등의검사를실시하였다. (3) 혈중지질인자측정실험종료후, ApoE(k/o) 생쥐에서심장천자를통하여채혈한후 Total cholesterol 및 HDL(Highdensity lipoprotein), LDL(Low-density lipoprotein), triglyceride 함량을바이오톡스텍 ( 오창, Korea) 에측정의뢰하였다. (4) Hematoxyline & Eosin 염색각실험군별로적출한간조직 10% 중성포르말린에 48시간고정하여고정이완료된각조직들은흐르는수돗물에서 12시간수세하여조직내고정액을완전제거하였다. 조직의탈수를위해 60% 에서부터 100% 알코올에이르기까지농도상승순으 508
안가영 조재준 신민구 전상윤 로통상의방법에따라탈수하고, xylene 에투명과정을거친다음파라핀블럭을제작하였다. 제작된블럭은박절기 (microtome) 를이용하여 3~4 μm 두께로 절편을만들어탈파라핀및함수과정을거친다음 hematoxyline & eosin(h&e) 일반염색을실시하여광학현미경상에서관찰및사진촬영하였다 (Fig. 1). Tissue Preparation Processing FIXATION 10% Neutral Formalin 48 hrs Washing Tab water, 12hrs DEHYDRATION 60%, 70%, 80%, 90%, 100% Ethyl Alcohol 1 to 2 hrs, each CLEARING Xylene 1 to 2 hrs, each, 2 times INFILTRATION Xylene : Paraffin, Paraffin 2 hrs, soft and hard each EMBEDDING Paraffin Wax SECTION Microtome 3-4 μm STAIN Hematoxylin & Eosin Hematoxylin : 5 mins Eosin : 1 min OBSERVATION Fig. 1. Hematoxyline & eosin stain processing. 3. 통계처리본실험에서얻은결과를 ANOVA multi t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1) 로분석하여 p값을구하였다. 각대조군을정상군과, 실험군을대조군과비교하여 p<0.05 일때유의성이있는것으로판정하였다. Ⅲ. 실험결과 1. HPLC 패턴확인 GGB 메탄올추출물을 HPLC로 pattern 분석한결과 254 nm에서 retention time이 16.7분, 22.7분, 24.1분, 26.4분대에 peak를확인할수있었다 (Fig. 2). mv Detector A Ch2:254nm 400 300 200 100 0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min Fig. 2. HPLC chromatogram of water extract of GGB. Column; ACE 5 C18 (250 4.6 mm, 5 μm), sample injection volume; 5 μl, mobile phase; H2O(A)/ACN(B) gradient elution : 0% (5min B), 0~30% (35min B), 30~100% (20min B), flow rate; 1.0 ml/min, detector; PDA detector 509
고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서枸杞子加味方의효과연구 2. In vitro 실험 1) 세포독성에미치는영향정상군의세포생존율 100±0% 로했을때, GGB 의 50, 100, 200(μg/ml) 농도에서는각각 132±5, 130±6, 130±6(%) 로나타났다 (Fig. 3). GGB were reacted with DPPH for 30 minutes at 37, and the absorbance at 517 nm due to DPPH radical was determined. The results are the mean±sd of three independent experiments. (2) NO 생성억제효과대조군을 100.0±8.7% 로나타냈을때, 정상군은 27.7±12.7%, GGB50은 101.8±3.1%, GGB100은 86.8 ±7.5%, GGB200은 62.5±3.1% 로나타나 GGB100과 GGB200에서유의성있는 (** p<0.01, *** p<0.001) 감소를나타내었다 (Fig. 5). Fig. 3. Effects of GGB on the cell viability of RAW 264.7 cells. Cells were treated with 50, 100, 200 μg/ml of Caesalpinia sappan Lignum for 24hrs. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean±sd from three independent experiments. 2) 항산화활성측정 (1) DPPH 소거활성측정 DPPH 의소거활성은 25, 50, 100, 200(μg/ml) 농도에서각각 8.2±4.5, 22.5±5.0, 44.3±5.2, 76.5±3.4 (%) 로나타나농도의존적으로소거활성이증가하는것으로나타났다 (Fig. 4). Fig. 5. NO production rate of GGB. NO production rate of GGB at final concentration 50, 100, 200 (μg/ml). The results are the mean±sd of three independent experiments. Normal : Raw 264.7 cells, Control : Raw 264.7 cells and LPS (2 μg/ml), GGB50 : Raw 264.7 cells and LPS and GGB 50 μg/ml, GGB100: Raw 264.7 cells and LPS and GGB 100 μg/ml, GGB200 : Raw 264.7 cells and LPS and GGB 200 μg/ml. The results are expressed as mean±s.d from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with control group by ANOVA multi t-test (** p<0.01, *** p<0.001). 3) ROS 활성측정대조군을 100.0±0% 로나타냈을때, 정상군은 34±18%, GGB50은 90±9%, GGB100은 86±12%, GGB200은 75±8% 로나타나대조군에비해실험군에서농도의존적으로감소하였으며, 특히 GGB200에서유의성있는 (* p<0.05) 감소를나타내었다 (Fig. 6). Fig. 4. Scavenging activity of GGB on DPPH free radical. 510
안가영 조재준 신민구 전상윤 (k/o) hyperlipidemia mice. Normal : normal mouse, Control : Hyperlipidemic diet and normal saline (0.2 ml/day) treated group, GGB400 : Hyperlipidemic diet and GGB (400 mg/0.2 ml/day) treated group, Values represent the means±sd of 4 mouse. Fig. 6. The inhibitory effect of GGB on reactive oxygen species (ROS). Raw 264.7 cells were incubated with GGB for 24hr at 37. The cells were stressed with LPS for 30 min and were labeled with DCFH-DA for 15 min. Normal : Raw 264.7 cells, Control : Raw 264.7 cells and LPS (2 μg/ml), GGB50 : Raw 264.7 cells and LPS and GGB 50 μg/ml, GGB100 : Raw 264.7 cells and LPS and GGB 100 μg/ml, GGB200: Raw 264.7 cells and LPS and GGB 200 μg/ml. The results are expressed as mean±s.d from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with control group by ANOVA multi t-test (* p<0.05). 3. In vivo 실험 1) 간독성평가 AST 는정상군이 80.3±15.0(I.U/L), 대조군이 118.5 ±15.0(I.U/L), GGB400이 104.3±11.4(I.U/L) 으로나타났으며, ALT는정상군이 30.2±3.7(I.U/L), 대조군이 40.0±14.1(I.U/L), GGB400이 37.7±14.0(I.U/L) 으로나타났다 (Fig. 7). 2) 신독성평가 BUN 은정상군이 25.0±3.3(I.U/L), 대조군이 20.3 ±4.0(I.U/L), GGB400이 19.5±3.0(I.U/L) 으로나타났다 (Fig. 8). Fig. 8. Effect of GGB on the ALT and AST in ApoE (k/o) hyperlipidemia mice. Normal : normal mouse, Control : Hyperlipidemic diet and normal saline (0.2 ml/day) treated group, GGB400 : Hyperlipidemic diet and GGB (400 mg/0.2 ml/day) treated group, Values represent the means±sd of 4 mouse. 3) 혈중지질인자측정 (1) 총콜레스테롤에미치는영향정상군이 116.8±7.6(mg/dl), 대조군이 1929.0±12.9 (mg/dl), GGB400은 1575.5±132.9(mg/dl) 으로나타나 GGB400에서대조군에비하여유의성있는 (** : p<0.01) 감소를나타내었다 (Fig. 9). Fig. 7. Effect of GGB on the ALT and AST in ApoE 511
고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서枸杞子加味方의효과연구 (mg/dl), GGB400은 314.0±72.7(mg/dl) 으로나타나 GGB400에서대조군에비하여증가하였으나유의성은나타나지않았다 (Fig. 11). Fig. 9. Effect of GGB on the Total-cholesterol level in ApoE (k/o) hyperlipidemia mice. Normal : normal mouse, Control : Hyperlipidemic diet and normal saline (0.2 ml/day) treated group, GGB400 : Hyperlipidemic diet and GGB (400 mg/0.2 ml/day) treated group, Values represent the means±sd of 4 mouse. Statistical significance is based on the difference when compared with control (** p<0.01). (2) LDL cholesterol 에미치는영향정상군이 13.3±4.1(mg/dl), 대조군이 1541.7±69.3 (mg/dl), GGB400은 1219.3±57.3(mg/dl) 으로나타나 GGB400 에서대조군에비하여유의성있는 (*** : p<0.001) 감소를나타내었다 (Fig. 10). Fig. 11. Effect of GGB on the HDL level in ApoE (-/-) hyperlipidemia mice. Normal : normal mouse, Control : Hyperlipidemic diet and normal saline (0.2 ml/day) treated group, GGB400 : Hyperlipidemic diet and GGB (400 mg/0.2 ml/day) treated group, Values represent the means±sd of 4 mouse. (4) Triglyceride에미치는영향정상군이 88.3±44.5(mg/dl), 대조군이 348.0±80.2 (mg/dl), GGB400은 228.3±29.5(mg/dl) 으로나타나 GGB400 에서대조군에비하여유의성있는 (* : p<0.05) 감소를나타내었다 (Fig. 12). Fig. 10. Effect of GGB on the LDL-cholesterol level in ApoE (k/o) hyperlipidemia mice. Normal : normal mouse, Control : Hyperlipidemic diet and normal saline (0.2 ml/day) treated group, GGB400 : Hyperlipidemic diet and GGB (400 mg/0.2 ml/day) treated group, Values represent the means±sd of 4 mouse. Statistical significance is based on the difference when compared with control (*** p<0.001). (3) HDL cholesterol에미치는영향정상군이 99.8±11.3(mg/dl), 대조군이 305.0±84.7 Fig. 12. Effect of GGB on the triglyceride level in ApoE (k/o) hyperlipidemia mice. Normal : normal mouse, Control : Hyperlipidemic diet and normal saline (0.2 ml/day) treated group, GGB400 : Hyperlipidemic diet and GGB (400 mg/0.2 ml/day) treated group, Values represent the means±sd of 4 mouse. Statistical significance is based on the difference when compared with control (* p<0.05). 512
안가영 조재준 신민구 전상윤 4) 조직변화에미치는영향 (1) 간조직에미치는영향실험종료후간을적출하여염색한결과대조군에서는간세포에서지방질축적에의한광범위한지방공포인흰색원형조직이많이분포하여전형적인지방간모습 ( 화살표 ) 병변소견이나타나있으며세포핵이줄어든반면, GGB 400에서는대조군에비하여지방간 (hepatic steatosis) 이억제되어간에원형의지방 (fat) 이사라진상태가관찰되었다 (Fig. 13). Fig. 13. Representative microscope photographs of liver stained with hematoxylin and eosin. Normal : normal mouse, Control : Hyperlipidemic diet and normal saline (0.2 ml/day) treated group, GGB400 : Hyperlipidemic diet and GGB (400 mg/0.2 ml/day) treated group Ⅳ. 고찰 인류는현대의기술과학문명이가져다준혜택을고스란히누리며그어느시대보다풍요로운삶을살아가고있다. 하지만이러한생활환경의변화및식생활의서구화로인하여고칼로리음식과동물성식품의섭취가증가함에따라고지혈증발생률이큰폭으로증가하고있다 19. 고지혈증이란혈중지질중의한가지또는여러 가지의성분농도가정상수준을초과한것을가리킨다. 혈중지질이란혈장또는혈청중의지방류를통칭하는말로서, 지용성물질을포괄하며, cholesterol, triglyceride, phospholipid, 및 free fatty acid 등을주요성분으로한다 20. 고지혈증은단순히혈청지질의증가만이중요한것이아니라지방단백 (lipoprotein) 의역할이중요한데, 이는지방입자가물과섞일수없기에단백질성분과결합하여친수성이있는입자로존재해야하기때문이다 21. 이런지방단백을자세히살펴보면, 비수용성인 cholesterol 과중성지방은내부에위치하고, 외부에는수용성인인지질과한개이상의아포지질단백 (apolipoprotein : Apo B-100, Apo B-48, Apo E, Apo A-Ⅰ, Apo A-Ⅱ, Apo C-Ⅱ, Apo C-Ⅲ) 이입자의표면을둘러싸며수분과접촉하면서수용성환경의혈장환경을통과해전달할수있게하며, 이런지방단백은지질과단백질이결합된고분자량의수용성복합체로내부의중성지방과 cholesterol 을장또는간으로부터말초조직으로, 반대로말초조직으로부터간으로운반하는데관여한다 22,23. 이런혈청지방단백은 5가지유형으로나눌수있는데, 킬로미크론 (chylomicron), 초저비중지질단백 (VLDL), 중간비중지질단백 (IDL), 저비중지질단백 (LDL), 고비중지질단백 (HDL) 등이다 24. 킬로미크론 (Chylomicron) 은지방식후장에서합성되어식이로섭취된지질의주요운반체역할을하고식후 12시간후에는혈액내에는존재하지않는다 25. 초저비중지질단백은 (VLDL) 식이로섭취된외인성중성지방과체내의간에서생성, 합성됨으로써유리지방산으로만들어진중성지방을말초조직으로운반하는역할을한다 26. 저비중지질단백 (LDL) 은간에서생성, 합성된콜레스테롤을간이외의세포에공급하는역할을하는데, LDL이동맥벽의내피에서산화되어순환중의 monocytes 를동맥벽으로유도함으로써동맥경화를일으킨다 27. 자세히살펴보면 LDL이혈관 513
고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서枸杞子加味方의효과연구 내피하에서산화변성을받아산화 LDL이되어 scavenger pathway 라고부르는경로를거쳐세포내에축적되어염증반응을악화시키고내피세포- 의존성혈관확장을억제하여동맥경화를악화시키는것이다 28. 고비중지질단백 (HDL) 은혈관에부착된콜레스테롤을간으로운반하여소화시키는, 혈관내의콜레스테롤을제거하는기능을가진다 29. 역학적연구결과고비중지질단백 (HDL) 은동맥경화증의진행을방해하는것으로밝혀져있는데 30, 고비중지질단백 (HDL) 이 1mg/dL 높을때마다 2-3% 심혈관질환을줄일수있다는보고가있다 31. 외인성경로, 즉식이성으로들어온 cholesterol 은 chylomicron 과결합되는데모세혈관의내피의 lipoprotein lipase 에의하여가수분해되어간의수용체로흡수된다. 그렇게흡수된간장내의일부 cholesterol은 free cholesterol 또는담즙산이되어장으로분비되며, 나머지 cholesterol 은내인성경로를통하여궁극적으로저비중지질단백 (LDL), 초저비중지질단백 (VLDL) 의농도상승과고비중지질단백 (HDL) 의농도를저하시켜고지혈증을유발한다 29. 고지혈증의분류는대개원발성과속발성으로구분되는데, 유전적인결함에의한것을원발성 (1 차성 ) 고지혈증이라하고, 환경인자 ( 질병, 약물, 식이 ) 에의해유발되는것을속발성 (2차성 ) 고지혈증이라한다. 원발성은 lipid나 lipoprotein 대사에서유전적형질의결손에의한이상으로유발되는것이고, 속발성은신증후군, 요독증, 갑상선기능저하증, 통풍, 담즙울체, 조절이잘안되는당뇨병, 비만, 알콜중독, 췌장염등의질환외에임신이나경구피임약복용등으로인하여 2차적으로발생되는것을말한다 32. 고지혈증의진단기준은국제기구나국가에따라달라지는경향을보인다 5. 영국심장학회 (British Cardiac Society, 1987) 에서는 cholesterol 수치가 250 mg/dl 이상일때식이요법, 300 mg/dl 이상일 때약물요법을쓰도록하고, 적절한치료목표는 200 mg/dl 이하로유지하도록하였으며, 유럽학회 (European Consensus Conference) 에서는혈중총 cholesterol 수치가 200-250 mg/dl 일때식이요법, 총 cholesterol이 300 mg/dl 이상이거나총 cholesterol 이 200 mg/dl 이상이고중성지방이 200 mg/dl 이상이면약물요법의병용이필요하다고하였다. 일본동맥경화학회에서는총 cholesterol이 220 mg/dl 이상및중성지방 150 mg/dl 이상일때고지혈증으로진단하였다 33. 고지혈증은임상적으로는혈청중 total cholesterol 치가 240 mg/dl 이상이거나 triglyceride 치가 200 mg/dl 이상일때를가리키며, 특히지단백인저밀도지단백 (LDL) 치가 160 mg/ 이이상인경우와고밀도지단백 (HDL) 치가 35 mg/dl 이하일경우동맥경화및관상동맥질환의위험이높아치료의대상으로하고있다 34. 고지혈증의예방및치료방법이다양하게연구되어왔다. 양방제제는 statin 계열의약물, 음이온교환수지, 프로브콜, 니코틴산유도체, 피브린산유도체등여러가지가사용되고있으나, 투여를중지를할경우혈중지질치가다시상승되므로지속적인장기간의투여를요하게되며, 장기간투여할경우약에따라피로, 수면장애, 오심, 피부발진, 근육통, 위장장애, 두통, 소양증, 변비또는설사등의부작용이있는것으로보고되고있다 35,36. 한의학에서는고지혈증에대한직접적인언급은없지만, 張景岳은 痰涎皆本血氣, 若失化失其正, 則臟腑病津液敗, 而氣血則成痰涎 이라하여痰濁이血脈上에있어脈絡을壅塞不通하게하여痰濁으로말미암아血瘀에이르게되어痰瘀互結로인해脈痹가되고中風을일으킬수있다고보았다 37. 고지혈증의원인을보면痰濁, 火熱, 氣滯血瘀, 脾胃濕熱등의實證과肝腎陰虛, 脾腎虧虛등의虛證으로인한것으로보고있다 38. 치법은化瘀逐瘀, 利濕淸熱, 活血化瘀, 健脾益腎, 祛痰化濁, 補腎培本및補氣益元등으로다양하게제시되고있는데, 중국에 514
안가영 조재준 신민구 전상윤 서는活血化瘀藥을고지혈증이나죽상동맥경화증을치료하는단미제로활용하거나이들약을주로사용하여辨證處方이아닌專治方을만들어활용한경우가많이보고되고있고, 국내에서의연구결과도주로痰濁과瘀血을치료하는약물들이고지혈증에유효함을보고하고있다 39. 枸杞子加味方은滋補肝腎益精明目하는枸杞子, 淸熱生津凉血止血하는生地黃, 活血祛瘀凉血消癰除煩安神하는丹蔘, 凉血止血活血祛瘀하는牧丹皮, 散風淸熱平肝明目하는甘菊, 建脾行氣化痰祛瘀消食積하는山査肉, 開竅割痰醒神益智化濕開胃하는石菖蒲, 養陰潤肺淸心除煩益胃生津하는麥門冬, 淸熱燥濕淸熱除煩瀉火解毒하는黃連, 淸熱瀉火除煩瀉熱利濕養血止血消腫止痛하는梔子, 淸肝散結하는夏枯草, 淸熱解毒升擧陽氣하는柴胡, 淸熱燥濕瀉火解毒止血하는黃芩, 祛風解表祛濕解痙하는防風등 40 으로구성되어있는처방으로현재동신대학교한방병원에서고지혈증에활용되고있다. 이에임상적으로혈중지질이감소하는효과를나타내는枸杞子加味方에대하여실험적으로규명하고, 기전을밝히고자연구하게되었다. 이에저자는枸杞子加味方추출물을 Raw 264.7 cell을이용하여세포독성, DPPH 소거능, No 생성억제, ROS 활성효과를측정하고, 고지혈증질환모델동물인 6주령의수컷 ApoE(k/o) 생쥐를이용하여하여간및신독성, 혈중인자등을관찰하여다음과같은결과를얻었다. GGB 의안전성검증을위하여 Raw 264.7 세포에대한세포독성을관찰한결과대조군의세포생존율 100±0% 로했을때, GGB의 50, 100, 200(μg/ml) 농도에서는각각 132±5, 130±6, 130±6(%) 의세포생존율을보여세포독성이없는것으로생각된다 (Fig. 3). GGB의항산화활성에미치는영향을알아보기위해 DPPH 소거활성능, NO 생성능, ROS 생성능을조사하였다. DPPH는그자체가매우안정한 free radical로서 proton-radical scavenger에의해 탈색되어항산화활성을육안으로도쉽게관찰할수있는장점때문에항산화물질을검색하는데많이이용되고있다 41. DPPH 의소거활성은 25, 50, 100, 200(μg/ml) 농도에서각각 8.2±4.5, 22.5±5.0, 44.3±5.2, 76.5±3.4 (%) 로나타나농도의존적으로소거활성이증가하는것으로확인되었고 (Fig. 4), Raw 264.7 세포에서 NO의생성량 (%) 을측정한결과, 대조군을 100.0 ±8.7% 로나타냈을때정상군은 27.7±12.7%, GGB50 은 101.8±3.1%, GGB100은 86.8±7.5%, GGB200은 62.5±3.1% 로나타나 GGB100군과 GGB200에서유의성있는감소를나타내었고 (Fig. 5), Raw 264.7 세포에서 ROS 의생성량 (%) 을측정한결과, 대조군을 100.0±0% 로나타냈을때정상군은 34±18%, GGB50 은 90±9%, GGB100은 86±12%, GGB200은 75±8% 로나타나 GGB200에서유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 6). 간독성평가요소인 AST와 ALT를측정한결과 AST는정상군이 80.3±15.0(I.U/L), 대조군이 118.5 ±15.0(I.U/L), GGB 400투여군이 104.3±11.4(I.U/L) 로나타났으며, ALT는정상군이 30.2±3.7(I.U/L), 대조군이 140.0±14.1(I.U/L), GGB400 투여군이 37.7 ±14.0(I.U/L) 로나타나대조군에서는증가했으며 GGB 투여군에서는대조군보다감소되어 GGB가 AST, ALT 수치를감소시키는작용이있는것으로추정되며, 약물에대한간독성은없을것으로생각된다 (Fig. 7). 신기능측정의지표성분인 BUN은정상군이 25.0±3.3(I.U/L), 대조군이 20.3±4.0(I.U/L), GGB 투여군이 19.5±3.0(I.U/L) 로나타나신독성은없을것으로생각된다 (Fig. 8). Cholesterol 변화에미치는영향을관찰하기위하여혈청내 Total Cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, Triglyceride를측정하였다. 실험종료후혈청내 Total Cholesterol 의변화는정상군이 116.8±7.6(mg/dl), 대조군이 1929.0±12.9 (mg/dl), GGB400 투여군은 1575.5±132.9(mg/dl) 으 515
고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서枸杞子加味方의효과연구 로나타나 GGB400 투여군에서대조군에비하여유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 9). LDL cholesterol 의변화는정상군이 13.3±4.1(mg/dl), 대조군이 1541.7±69.3(mg/dl), GGB400 투여군은 1219.3 ±57.3(mg/dl) 으로나타나 GGB400 투여군에서대조군에비하여유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 10). HDL cholesterol 의변화는정상군이 99.8±11.3(mg/dl), 대조군이 305.0±84.7(mg/dl), GGB400 투여군은 314.0 ±72.7(mg/dl) 으로나타나 GGB400 투여군에서대조군에비하여증가하였으나유의성은나타나지않았다 (Fig. 10). Triglyceride 의변화는, 정상군이 88.3 ±44.5(mg/dl), 대조군이 348.0±80.2(mg/dl), GGB400 투여군은 228.3±29.5(mg/dl) 으로나타나 GGB400 투여군에서대조군에비하여유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 12). 조직학적검사결과, 대조군에서는간세포에서지방질축적 (hepatic eatosis) 에의한광범위한지방공포인흰색원형조직이많이분포하여전형적인지방간모습의병변소견이나타나있으며세포핵이줄어든반면, GGB 400 mg/kg 투여군에서는대조군에비하여지방간 (hepatic steatosis) 이억제되어간에원형의지방 (fat) 이거의사라진상태가관찰되었다 (Fig. 13). 따라서 GGB가간조직을보호하는효과가있을것으로생각된다. 이상의결과들을종합해보면, 枸杞子加味方은세포독성및간, 신독성은없었으며, DPPH 소거활성능을농도의존적으로증가시켰고, NO 생성량 (%), ROS 생성량 (%) 은유의성있는감소시키는효과가있는것으로보아枸杞子加味方은항산화효과가있음을알수있었고, Total Cholesterol 과 LDL cholesterol, TG를감소시키는것으로보아枸杞子加味方이혈중지질의농도를감소시키는효과가있음을알수있었다. 또한조직검사상간조직을보호하는효과가있을것으로생각된다. 이러한결과는枸杞子加味方이임상에서고지혈증으로야기되는동맥경화, 허혈성심질환, 기타심혈관질환의예방과치료에효과가있을것으로 사료되며향후보다지속적이고심도있는연구가필요하리라사료된다. Ⅴ. 결론枸杞子加味方이고지혈증에대한효과및항산화에미치는영향을알아보기위하여고지혈증질환모델동물인 6주령수컷 ApoE(k/o) 생쥐에경구투여한후, in vitro 에서는세포독성, 항산화활성측정, in vivo에서는간및신독성, 혈중지질인자, 간조직의효소활성을측정및간조직의 cholesterol 인자발현에미치는영향등을관찰하여다음과같은결론을얻었다. 1. 枸杞子加味方은 in vitro에서세포독성은없었으며, DPPH 소거활성능을농도의존적으로증가시켰고, 대조군에비해 NO 생성량 (%), ROS 생성량 (%) 은유의성있게감소시켰다. 2. 枸杞子加味方은 in vivo 에서혈청내 Total Cholesterol 과 LDL cholesterol, TG를유의성있게감소시켰으나, HDL cholesterol 을증가시켰으나유의성은없었다. 3. 枸杞子加味方은조직검사상지방간 (hepatic steatosis) 이억제되어간에원형의지방 (fat) 이거의사라진상태가관찰되었다. 참고문헌 1. 서울대학교의과대학내과학교실. 일반의와의대생이알아야할 145가지일차진료에서흔히접하는임상적문제들. 서울 : 군자출판사 ; 1997, p. 149-54. 2. Nielsen S, Jensen MD. Obesity and Cardivascular disease is body structure a factor. Curr Opin Lipidol 1997;8(4):200-4. 3. Lee KU, Lee HK, Koh CS, Min HK. Artificial 516
안가영 조재준 신민구 전상윤 induction of intravascular lipolysis by lipidheparin infusion leads to insulin resistance in man. Diabetologia 1988;31(5):285-90. 4. 노영무. 대사증후군과심혈관질환. 한국건강관리협회지 2004;2(1):71-6. 5. 전국한의과대학심계내과학교실. 심계내과학. 서울 : 군자출판사 ; 2006, p. 169-73. 6. 방혜정. 고지혈증에대한한의학적고찰. 동서의학 1995;20;25-36. 7. 정수미, 김경수, 전상윤, 안정조, 홍석. 가미온담탕의항고지혈작용에대한연구. 대한한의방제학회지 2005;13(1):85-102. 8. 황윤규, 김동희. 茵蔯胃笭湯이高脂血誘發白鼠의血液學的變化에미치는影響. 대전대학교한의학연구소논문집 2005;14(2):71-85. 9. 차관배, 안정조, 조현경, 유호룡, 김윤식, 설인찬. 降脂通脈飮이항산화활성과高脂血誘發과白鼠에미치는영향. 대한한방내과학회지 2008;29(3) :703-15. 10. 유현숙, 최학주, 김선빈, 김동희. 하고초산이고지혈유발 SHR 백서에미치는영향. 대전대학교한의학연구소논문집 2008;17(2):101-16. 11. 박소애, 조현경, 유호룡, 김윤식, 설인찬, 안정조. 加味地黃湯이高脂血症關聯因子에미치는영향. 대한한방내과학회지 2009;30(2):338-54. 12. 함인혜, 정성웅, 이경진, 박규하, 최호영. 인진호와한인진이 Triton WR-1339 로유도된고지혈증흰쥐에미치는영향. 대한본초학회지 2005;20(1) :45-52. 13. 함인혜, 이웅철, 이병희, 최호형. 국산과중국산지실이 Triton WR-1339 유발고지혈증흰쥐에대한효능연구. 대한본초학회지 2007;22(3):109-16. 14. 함인혜, 이주영, 윤예진, 양갑식, 태진, 부영민, 김호철. 국산및중국산白首烏의 Triton WR-1339 유발고지혈증흰쥐에대한효능연구. 대한본초학회지 2007;22(4):279-86. 15. 김형철, 김형우, 조수인, 김용성, 이장식, 권정남, 김영균. 단삼이고지혈증흰쥐의혈중지질변화와간조직에미치는영향. 대한본초학회지 2007;22(4):239-45. 16. 한성희, 박성혜. 구기자분말첨가식이가 1% 가고콜레스테롤급여휜쥐의지질대사에미치는영향. 한국식생활문화학회지 2008;23(4):521-8. 17. 황은영, 홍정희, 최준혁, 이은정, 이인선. 구기자추출물의항비만및혈당강화효과. 한국식품영양과학회지 2009;38(11):1528-34. 18. 감잎, 메밀잎및구기자잎추출물의식이보충이흰쥐의체지방감량과지질대사조절에미치는효과. 한국식품영양과학회지 2011;40(9):1215-26. 19. Sanders, TA Okaley, FR Miller, GJ. Mitropoulos, KA Influence of n-6 versus n-3 polyunsaturated fatty acids in diets low in saturated fatty acids on plasma lipoproteins and hemostatic factors. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17(12):3449-60. 20. 이문호. 내과학. 서울 : 학림사 ; 1986, p. 1495-502. 21. 김창종. 병태생리학. 서울 : 계추문화사 ; 2010, p. 360-2, 597-9. 22. Guerin M, Bruckert E, Dolphin PJ, Urpin G, Chapman MJ. Fenofibrate reduces plasma cholesterol ester transfer from HDL to VLDL and normalizes the atherogenic. dense LDL profile in combined hyperlipidemia. Arteriosclerb Thromb Vasc Biol 1996;16:763-72. 23. Packard CJ, Demant T, Stewart JP, Bedford D, Caslake MJ et al. Apolipoprotein Bmetabolism and the distribution of VLDL and LDL subfractions. J lipid Res 2000;41:305-18. 24. 병리학. 대한병리학회. 서울 : 고문사 ; 1995, p. 476-7. 25. 박영배. 고지혈증. Medical Postgraduates 2003;31 :160-5. 26. 이귀녕, 권오헌. 임상병리파일. 서울 : 의학문화사 ; 2003, p. 148-220. 27. Christopher KG, Joseph IW. Atherosclerosis: 517
고지방식이로유발된고지혈증동물모델에서枸杞子加味方의효과연구 The road ahead. Cell 2001;104(4):503-16. 28. 고지혈증치료지침제정위원회. 고지혈증의진단과치료. 서울 : 신광출판사 ; 2000, p. 59, 221-33. 29. 최영길. 내분비학. 서울 : 의학출판사 ; 1995, p. 476-7. 30. 안지현. 한눈에알수있는내과학. 서울 : 이퍼블릭 ; 2010, p. 146-7. 31. 정우영, 박영배. 새로운콜레스테롤혈증치료방침. 서울 : 신광출판사 ; 2001, p. 31, 1093-102. 32. 김진규. 임상지질학. 서울 : 의학출판사 ; 1995, p. 11-48. 33. 대한가정의학회. 가정의학 < 임상편 >. 서울 : 계축문화사 ; 2002, p. 303-9. 34. 민헌기. 임상분비학. 서울 : 고려의학사 ; 1999, p. 489-520. 35. 고지혈증치료지침제정위원회編. 고지혈증과동맥경화증. 서울 : 신광출판사 ; 1998, p. 27-8, 61-7. 36. 이원로편저. 임상심장학. 서울 : 고려의학사 ; 1998, p. 751. 37. 안근형, 이현. 양릉천천궁약침이흰쥐의고지혈증에미치는영향. 대한침구학회지 2010;27(4) :137-46. 38. 송왕기, 강재희, 이현. 양릉천갈근약침이흰쥐의고지혈증에미치는영향. 대한침구학회지 2009; 26(4):79-90. 39. 신형섭, 김규열, 김호현, 서일복. 蒲黃이흰쥐의식이성고지혈증치료에미치는영향. 동의생리병리학회지 2003;17(1):225-9. 40. 전국한의과대학공동교재편찬위원회. 본초학. 서울 : 영림사 ; 2011, p. 165, 184, 188, 209, 218, 220, 233, 237, 414, 461, 565, 647, 657. 41. Philip Molyneux. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl(dpph) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol 2004;26(2):211-9. 518