최종보고서 - 환경중항생제내성균관리방안마련 (Ⅰ) - 2013 환경부국립환경과학원 전북대학교산학협력단 국립환경과학원
제출문 국립환경과학원장귀하 본보고서를 환경중항생제내성균관리방안마련 (I) 의 최종보고서로제출합니다. 2013 년 12 월 연구책임자 : 채종찬 연구원 : 조 민 이옥재유영남조항욱조민근서영석박준혁고은별장예진김벼리유용재김경택김민호최재영연구기관 : 전북대학교산학협력단
요약문 I. 과업의개요 1. 사업명 : 환경중항생제내성균관리방안마련 (I) 2. 과업목표 국가항생제내성안전관리사업 수행을위한 2단계사업으로환경중항생제내성균의잔류실태조사와항생제의잔류오염으로인한내성균의영향을규명하고관리방안을마련하고자한다. 3. 추진배경및필요성가. 범정부차원의 국가항생제내성안전관리 1단계사업 ( 08 12년) 에서환경중에잔류하는항생제가검출됨으로서이로인한항생제내성균확산가능성이있으므로이를관리하기위한연구의필요성이제기되었다. 나. 최근전세계적으로항생제의과다사용으로인한항생제다제내성균이출현하고있고우리나라는 OECD 국가중항생제사용량및미생물의항생제내성률이높은국가로분류되고있어항생제내성균의관리가국가적이슈로부각되고있다. II. 연구내용및방법 2010년부터 2012년까지실시된잔류의약물질분석방법연구및실태조사의결과에따라항생제의검출지역을검토하였다. 항생제의검출농도와검출빈도를고려하여수계별하천수 4지점과토양 2지점을선정하였다 ( 한강수계의원주천, 금강수계의익산천, 낙동강수계의금호강, 영산강수계의무안, 토양시료의경 - i -
우나주지점과장항지점 ). 또한항생제내성균의존재가능성이높은병원하수처리후방류지점과일반하수처리방류지점을고려하였으며같은전주천지점에위치하고있는전북대병원하수처리방류지점 ( 전주천1) 과전주시하수처리장방류지점 ( 전주천2) 을선정하였다. 각수질시료로부터이화학적분석과총대장균군분포조사결과, 익산천과전주천2( 하수처리방류지점 ) 수질시료의생물학적오염도가높았다. 하천 4지점, 토양 2지점, 병원방류 1지점, 하수방류 1지점등총 8지점으로부터시료를채취하여환경중총세균분포및항생제내성실태를조사하였다. Nutrient agar(na) 배지와항생제감수성조사에서사용되는 Muller-Hinton(MH) 배지를영양배지로사용하였으며배양된총세균을관찰하였을경우항생제내성률이 0~20% 사이의수준을보였으나 Enterobacteriaecea Enrichment(EE) 배지에서배양된세균에대한내성조사결과, 최대 80% 이상의높은내성률을보였다. 따라서환경중총세균에비해 Enterobacteriaecea 세균을포함한 EE 배지에서배양될수있는세균의항생제내성률이높은것으로조사되었다. 조사된 9종의항생제중반코마이신 (vancomycin), 암피실린 (ampicillin), 린코마이신 (lincomycin), 에리스로마이신 (erythromycin), 세파렉신 (cephalexin) 에대한내성율이높았으며내성율이높다고알려진테트라사이클린 (tetracycline) 의경우내성율이현저히낮게조사된반면, 내성율이낮다고알려진반코마이신의경우 8개지점평균 50% 의높은내성율을나타내었다. 그러나대부분의그람음성균은균특성상반코마이신에내성을가지고있으므로내성율은약 25% 내외가될것으로예측된다. 배지에따른항생제내성율을통계적으로분석한결과, 총세균수측정을위해사용된 MH배지와 NA배지중에서 MH배지에서조사된결과가 EE배지와의연계성이높게나타났다. 높은내성율을보인에리스로마이신의경우, MH배지에서는 EE배지와마찬가지로높은내성율을보이는반코마이신, 린코마이신과유사도를보이는반면, NA배지에서는낮은내성율을보이는테트라사이클린과유사도를보였다. 이와같은결과는환경중에존재하는 Enterobacteriaecea 과 (family) 의항생제내성균과비교하기위한총항생제내성균조사를위해서는, 영양배지로서 MH배지가 NA배지보다는적합하다는것을제시한다. - ii -
항생제내성율과조사된 8개지점의지역적상관관계는발견되지않았지만하천의흐름에따라전주천1, 전주천2, 익산천을비교한결과, 병원하수처리방류수에서총세균수는상대적으로낮으나항생제내성율은타지점시료보다전반적으로높게조사되었다. 따라서항생제사용량과의연관성에의해병원지점이항생제내성균발생에대한점오염원일가능성을제시하고있다. 각지점을대상으로 EE 배지에서선발된전체군집락중반코마이신과린코마이신에대해내성을가진총 1,360개의균주에대해항생제디스크를이용한감수성검사를실시하였다. 그결과, 1개이상의항생제에대해내성을보이는다제내성율이 99.2% 를나타내었다. 최대 14종의조사대상항생제모두에대해내성을보이는균주 ( 린코마이신내성 8개, 반코마이신내성 20개 ) 가 2% 비율로발견되었다. 린코마이신이포함된 EE 배지에서분리된세균은 8종이상의다제내성비율이 81.6% 이며 9종류의항생제에대한다제내성세균의비율이 29.5% 로가장많았다. 반코마이신이포함된 EE 배지에서분리된세균은 9종이상의다제내성비율이 88.7% 이며 10종류의항생제에대한다제내성세균의비율이 33.6% 로가장많았다. 총조사대상 1,360 균주의 88.7% 가 8종이상의항생제에대해내성을나타낸결과는 2003년과 2004년식품의약품안전청에서발표된축산및수산환경중다제내성균검출비율 (5.3-25.9%) 과 2007년식품의약품안전청에서발표된축산분변에존재하는다제내성균검출비율 (58.6-65.1%) 보다높은검출율로서항생제다제내성균주가환경중에높은비율로존재하며점차증가해오고있다는것을제시한다. 항생제내성균의분자생물학적동정을실시하기위하여 16S rrna 유전자를콜로니-중합효소연쇄반응방법으로증폭하여정제한후, 증폭된 DNA상의 V1-V4 지역염기서열을결정하였다. 결정된염기서열은 Ez-Taxon-e 데이터베이스에서배양가능한세균들의분류학적정보와비교하여동정하였다. 균주동정결과, 비록반코마이신이포함된 EE 배지에서배양되어분리되었지만 41% 만 Enterobacteriaceae에속하는균주였으며 30% Pseudomonadaceae, 20% Aeromonadaceae, 3% Neisseriaceae, 2% Rhizobiaceae, 2% Brucellaceae, 1% Shewanellaceae, 1% Xanthomonadaceae로분류되었다. 시료채취지점별로균주분포를조사한결과, 원주천에서는 Enterobacteriaceae 와 Aeromonadaceae가각각 47.6% 씩분포하였고무안과금호강에서는 - iii -
Aeromonadaceae가 44.5% 과 41.7% 로우점하였다. 익산천에서는 Enterobacteriaceae와 Pseudomonadaceae가 36% 와 44% 로유사하게분포하였으며전주천 ( 병원방류수, 하수처리방류수 ) 에서는 Enterobacteriaceae가각각 55.6% 와 77.8% 로우점하였다. 반면, 토양시료인나주와장항의시료에서는 Pseudomonadaceae가 92.9% 와 46.7% 로가장우점하는것으로나타났다. 결론적으로지역과균주분포사이의상관관계는발견되지않았으나하천수에서는 Enterobacteriaecea와 Aeromonadaceae가높은비율로존재하는반면, 토양에서는 Enterobacteriaecea와 Pseudomonadaceae가높은비율로존재함으로서매질에따라서식하는미생물군집의차이점이발견되었다. Enterobacteriaceae 에속하는균주를 속 (genus) 에따라분류한결과, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Kluyvera, Pantoea, Plesiomonas, Raoultella, Shigella 9종의 속 으로분류되었으며 Enterobacter 가 49% 로가장많이분포하고있었다. 지역별로는전주천하수처리방류지점에서 Enterobacteriaceae 에속하는개체수가 42.4% 로가장많이검출되었고이중에서 35.7% 가 Enterobacter 로동정되었다. 특히병원성미생물로분류될수있는 Klebsiella 와 Shigella가 21.4%, 17.9% 검출되었다. 항생제내성전이율에대해녹색형광단백질발현-Enterobacter와분리된 7종의 Enterobacteriaecea (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Shigella, Kluyvera) 세균을이용하여조사하였으나실험에사용된두가지매질인하천수와토양모두에서전이현상이관찰되지않았다. 반면, 항생제에따른내성돌연변이율을조사한결과, 항생제가없는조건에서나타난자연돌연변이변이율에비해저농도의항생제 (0.01, 0.1 1μg/ml) 가스트레스로작용된조건에서는상대적변이율이 17-54배높게관찰되었다. 이와같은결과는환경중의잔류항생제가미생물의돌연변이율을증가시켜항생제내성균으로변이시킴으로서내성균확산의주요원인임을제시한다. - iv -
< 목차 > I. 서론 1 1. 사업배경 1 2. 사업의필요성 10 II. 연구내용및방법 13 1. 환경중잔류항생제잔류실태와내성균에대한자료조사 13 1.1. 국내항생제사용량및잔류특성 13 1.2. 국내 외환경중항생제내성균의검출사례 15 1.3. 환경중항생제내성균검출관련연구동향 24 2. 항생제내성균의환경중분포실태조사 26 2.1. 시료채취지점 26 2.2. 시료채취및보관 32 2.3. 이화학적분석 32 2.4. 총대장균군분포조사 35 2.5. 총세균및항생제내성세균의검출 35 2.6. 항생제감수성검사 36 2.7. 항생제내성균동정 36 2.8. 항생제내성전이율조사 40 2.9. 항생제농도에따른내성변이율조사 40 2.10. 통계분석 41 III. 연구결과 42 1. 이화학적분석 42 2. 총세균및항생제내성균의분포조사 43 3. 항생제감수성조사 74 4. 항생제내성균의동정 77 5. 항생제내성전이율조사 81 6. 항생제농도에따른내성변이율조사 84 IV. 결론 86 - v -
V. 추진체계 88 VI. 활용방안 89 VII. 참고문헌 90 VIII. 부록 97 - vi -
< 표목차 > < 표 1> 대표적인항생제의작용기전 1 < 표 2> 항생제의종류 3 < 표 3> 하수처리장유입수및방류수중항생제검출현황 10 < 표 4> 하천수중항생제검출현황 11 < 표 5> 가축의항생제별대장균내성률 (%) 16 < 표 6> 시험균주의항생제내성패턴 20 < 표 7> 조사대상지점 27 < 표 8> 항생제감수성검사에사용된항생제의종류및계열 39 < 표 9> 하천시료의이화학적분석결과 42 < 표 10> 각배지별항생제내성율연관성에대한 t-검정결과 72 < 표 11> 각지점별선별된린코마이신내성균주의다제내성항생제 75 < 표 12> 각지점별선별된반코마이신내성균주의다제항생제내성 76 < 표 13> 트리메소프림에대한최소성장저지농도조사 82 < 표 14> 겐타마이신에대한최소성장저지농도조사 83 < 표 15> 항생제내성전이율조사 84 < 표 16> 항생제농도에따른내성변이율조사 (Enterobacter, E22) 85 - vii -
< 그림목차 > < 그림 1> 아미노글리코사이드계항생제 4 < 그림 2> 테트라사이클린계항생제 4 < 그림 3> 페니실린계항생제 4 < 그림 4> 세파로스포린계항생제 4 < 그림 5> 마크로라이드계항생제 5 < 그림 6> 폴리펩티드계항생제 5 < 그림 7> 린코스아마이드계항생제 5 < 그림 8> 설폰아마이드계항생제 5 < 그림 9> 플로르퀴놀론계항생제 6 < 그림 10> 국내항생제생산량 8 < 그림 11> 항생제의자연내거동 9 < 그림 12> 국내총의약물질및항생제생산금액 13 < 그림 13> 연도별축산용항생제판매량 14 < 그림 14> 가축에서분리된 E.coli의항생제내성률 14 < 그림 15> 병원임상에서분리된주요균체의항생제내성실태 23 < 그림 16> 항생제내성균분포조사를위한시료채취장소 27 < 그림 17> 한강수계 ( 원주천 ) 28 < 그림 18> 영산강수계 ( 무안 ) 28 < 그림 19> 낙동강수계 ( 금호강 ) 29 < 그림 20> 금강수계 ( 익산천 ) 29 < 그림 21> 하수처리방류 ( 전주천2) 30 < 그림 22> 병원하수처리방류 ( 전북대학교병원, 전주천1) 30 < 그림 23> 장항송림 31 < 그림 24> 나주남평 31 < 그림 25> IC (Ion chromatography) 와음이온, 양이온 Standard Peak 33 < 그림 26> BOD 실험 34 < 그림 27> TOC 분석기기와 standard peak 35 < 그림 28> 도말평판법 36 < 그림 29> 16S rrna 유전자를이용한항생제내성균동정방법 38 < 그림 30> 이화학적분석결과에따른시료별상관성분석 43 < 그림 31> 항생제내성세균의검출및분리 44 - viii -
< 그림 32> 항생제내성균수 (cfu/ml): 원주천, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 45 < 그림 33> 항생제내성률 (%): 원주천, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 45 < 그림 34> 항생제내성균수 (cfu/ml): 원주천, Muller Hinton 배지 46 < 그림 35> 항생제내성률 (%): 원주천, Muller Hinton 배지 46 < 그림 36> 항생제내성균수 (cfu/ml): 원주천, Nutrient agar 배지 47 < 그림 37> 항생제내성률 (%): 원주천, Nutrient agar 배지 47 < 그림 38> 항생제내성균수 (cfu/ml): 무안, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 48 < 그림 39> 항생제내성률 (%): 무안, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 48 < 그림 40> 항생제내성균수 (cfu/ml): 무안, Muller Hinton 배지 49 < 그림 41> 항생제내성률 (%): 무안, Muller Hinton 배지 49 < 그림 42> 항생제내성균수 (cfu/ml): 무안, Nutrient agar 배지 50 < 그림 43> 항생제내성률 (%): 무안, Nutrient agar 배지 50 < 그림 44> 항생제내성균수 (cfu/ml): 금호강, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 51 < 그림 45> 항생제내성률 (%): 금호강, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 51 < 그림 46> 항생제내성균수 (cfu/ml): 금호강, Muller Hinton 배지 52 < 그림 47> 항생제내성률 (%): 금호강, Muller Hinton 배지 52 < 그림 48> 항생제내성균수 (cfu/ml): 금호강, Nutrient agar 배지 53 < 그림 49> 항생제내성률 (%): 금호강, Nutrient agar 배지 53 < 그림 50> 항생제내성균수 (cfu/ml): 익산천, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 54 < 그림 51> 항생제내성률 (%): 익산천, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 54 < 그림 52> 항생제내성균수 (cfu/ml): 익산천, Muller Hinton 배지 55 < 그림 53> 항생제내성률 (%): 익산천, Muller Hinton 배지 55 < 그림 54> 항생제내성균수 (cfu/ml): 익산천, Nutrient agar 배지 56 < 그림 55> 항생제내성률 (%): 익산천, Nutrient agar 배지 56 - ix -
< 그림 56> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 하수처리방류 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 57 < 그림 57> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 하수처리방류 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 57 < 그림 58> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 하수처리방류 ), Muller Hinton 배지 58 < 그림 59> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 하수처리방류 ), Muller Hinton 배지 58 < 그림 60> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 하수처리방류 ), Nutrient agar 배지 59 < 그림 61> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 하수처리방류 ), Nutrient agar 배지 59 < 그림 62> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 60 < 그림 63> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 60 < 그림 64> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Muller Hinton 배지 61 < 그림 65> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Muller Hinton 배지 61 < 그림 66> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Nutrient agar 배지 62 < 그림 67> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Nutrient agar 배지 62 < 그림 68> 항생제내성균수 (cfu/ml): 장항송림 ( 토양 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 63 < 그림 69> 항생제내성률 (%): 장항송림 ( 토양 ) Enterobacteriaceae Enrichment 배지 63 < 그림 70> 항생제내성균수 (cfu/ml): 장항송림 ( 토양 ), Muller Hinton 배지 64 < 그림 71> 항생제내성률 (%): 장항송림 ( 토양 ), Muller Hinton 배지 64 < 그림 72> 항생제내성균수 (cfu/ml): 장항송림 ( 토양 ), Nutrient agar 배지 65 < 그림 73> 항생제내성률 (%): 장항송림 ( 토양 ), Nutrient agar 배지 65 - x -
< 그림 74> 항생제내성균수 (cfu/ml): 나주남평 ( 토양 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 66 < 그림 75> 항생제내성률 (%): 나주남평 ( 토양 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 66 < 그림 76> 항생제내성균수 (cfu/ml): 나주남평 ( 토양 ), Muller Hinton 배지 67 < 그림 77> 항생제내성률 (%): 나주남평 ( 토양 ), Muller Hinton 배지 67 < 그림 78> 항생제내성균수 (cfu/ml): 나주남평 ( 토양 ), Nutrient agar 배지 68 < 그림 79> 항생제내성률 (%): 나주남평 ( 토양 ), Nutrient agar 배지 68 < 그림 80> 항생제별세균내성률 (EE 배지 ) 69 < 그림 81> 항생제내성률의배지별상관성분석 70 < 그림 82> 시료채취지점별내성률 (EE 배지 ) 72 < 그림 83> 항생제내성율의지역별상관성분석 73 < 그림 84> 항생제디스크검사 74 < 그림 85> 선발된린코마이신내성균주의다제내성항생제수 75 < 그림 86> 선발된반코마이신내성균주의다제내성항생제수 76 < 그림 87> 동정된 159개분리균전체의 과 계열분포도 78 < 그림 88> 동정된 159개분리균의계통도 79 < 그림 89> 동정된 159개분리균의지역별 과 분포도 79 < 그림 90> 동정된 66개 Enterobacteriaceae 균의 속 계열분포도 80 < 그림 91> 동정된 66개 Enterobacteriaceae 균의계통도 80 < 그림 92> 동정된 66개 Enterobacteriaceae 균의지역별분포도 81 < 그림 93> 녹색형광단백질발현-Enterobacter의트리메소프림에대한농도별생장 82 < 그림 94> Klebsiella(H84) 의젠타마이신에대한농도별생장 83 - xi -
< 부록목차 > < 표부1> 린코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 원주천-한강유역 ) 99 < 표부2> 린코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 무안-영산강유역 ) 102 < 표부3> 린코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 금호강- 낙동강유역 ) 104 < 표부4> 린코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 익산천-금강유역 ) 106 < 표부5> 린코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 전주천-하수처리방류 ) 109 < 표부6> 린코마이신내성균주의항생제감수성분84 ( 전주천-병원하수처리방류 ) 112 < 표부7> 린코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 토양-나주 ) 115 < 표부8> 린코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 토양-영산강유역 ) 118 < 표부9> 반코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 원주천-한강유역 ) 120 < 표부10> 반코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 무안-영산강유역 ) 123 < 표부11> 반코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 금호강-낙동강유역 ) 126 < 표부12> 반코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 익산천-금강유역 ) 128 < 표부13> 반코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 전주천-하수처리방류 ) 131 < 표부14> 반코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 전주천-병원하수처리방류 ) 134 < 표부15> 반코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 토양-나주 ) 137 < 표부16> 반코마이신내성균주의항생제감수성분석 ( 토양-영산강유역 ) 140 < 표부17> Ez-Taxon-e 데이터베이스를이용한분리균유래 16S rrna 유전자의유사도조사 143 - xii -
I. 서론 1. 사업배경 항생제는미생물이분비하여만들어진물질또는인공적으로합성된약물로서다른미생물의생장을저해하는물질이다. 항생제는사람과동물의다양한질병치료및축산업및수산업에서의생산성향상을위해광범위하게사용되고있다. 항생제는작용기전에따라서크게세포벽의합성을억제하는기전, 세포막투과성의변화를유발하는기전, 단백질의합성억제하는기전, 핵산합성을억제하는기전, 엽산합성을억제하는기전으로나눌수있다 ( 표 1). < 표 1> 대표적인항생제의작용기전 작용기전 세포벽합성억제 세포막기능과구조변형 대표항생제베타락탐 (β-lactam) 계열항생제, 반코마이신 (Vancomycin) 폴리펩티드 (polypeptide) 아미노글리코사이드 (Aminoglycoside), 테트라사이클린 (Tetracycline), 단백질합성억제 핵산합성및활성억제 엽산등세포대사방해 마크로라이드 (Macrolides), 클린다마이신 (Clindamycin), 클로로암페니콜 (Chlroamphenicol) 리팜피신 (Rifampicin), 퀴놀론 (Quinolones), 메트로니다졸 (Metronidazole) 설폰아마이드 (Sulfonamides), 트리메소프림 (Trimethoprim) 세균세포는동물세포와달리세포벽으로둘러싸여있어매우높은세균내압 력을유지하며살아갈수있다. 이렇게세균이생존하는데필수적인기능을하는 - 1 -
세포벽의합성을억제하게되면내부의높은삼투압으로인해세균원형질이밖으로빠져나와세균은파괴된다. 세균의세포벽합성을억제하는항생제에는베타락탐계항생제 ( 페니실린, 세팔로스포린등 ) 와반코마이신같은항생제들이포함된다. 세균의세포막은선택적능동수송을수행함으로써세포내부의구성물질을조절하는데, 이러한투과성이변화되면고분자물질이나이온들이세포를빠져나와세포가사멸된다. 세포막에작용하는항생제는세포막의투과성을변화시켜세균으로하여금세포내부와외부의균형을잃게하여사멸하게한다. 세포막기능을억제하는항생제로는폴리믹신, 암포테리신, 케토코나졸, 플루코나졸, 이트라코나졸등이대표적이다. 세균이증식하려면필요한단백질이세포질내에서합성되어야한다. 이단백질합성이억제되면세균이증식할수없게된다. 대부분의항생제가이러한기작을갖는항생제이며여기에는 mrna의 misreading 유발, translocation 억제, peptidyl transferase 억제, aminoacyl trna의결합억제, 단백의알킬화를유발하는물질이있다. 아미노글리코사이드, 테트라사이클린, 마크로라이드, 린코사마이드, 클로람페니콜등이세균의단백질합성을억제하여세균증식을막는대표적인항생제이다. 핵산합성을억제하는항생제는세균증식에서필요한과정인 DNA의전사및 RNA 형성을방해하여항균작용을나타낸다. DNA 의존성 RNA 중합효소와결합하여 RNA 합성을방해하거나 DNA 자이레이즈 (gyrase) 라는효소의 A 소단위체 (subunit) 와결합하여세균성장을억제하게된다. 엽산은핵산합성의중요한전구물질이자 DNA합성에관여하는물질로, 몇몇항생제는엽산의합성억제기전을갖는다. 술포아미드와트리메소프림등이대표적인예이다. 항생제의종류는크게아미노글리코사이드계 ( 그림 1), 테트라사이클린계 ( 그림 2), 페니실린계 ( 그림 3), 세파로스포린계 ( 그림 4), 마크로라이드계 ( 그림 5), 폴리펩티드계 ( 그림 6), 린코스아마이드계 ( 그림 7), 설폰아마이드계 ( 그림 8), 플로르퀴놀론계 ( 그림 9) 등총 9가지로나눌수있다 ( 표 2). - 2 -
< 표 2> 항생제의종류 종류대표항생제작용범위 아미노글리코사이드 (Amoniglycoside) 계테트라사이클린 (Tetracycline) 계페니실린 (Penicilin) 계세파로스포린 (Cephalosporin) 계마크로라이드 (Macrolide) 계폴리펩티드 (Polypeptide) 계린코스아마이드 (Lincosamide) 계설폰아마이드 (Sulfonamide) 계 Streptomycin,Kanamycin, Gentamycin,Amikacin, Sisomycin,Neomycin, Spectinomycin Chlortetracycline, Oxytetracycline, Tetracycline,Minocycline, Doxycycline Ampicilin,Amoxycilin, Methicilin,Oxacilin, Carbenicilin,Penicilin, Cloxacilin Cephalexin,Cefazolin, Cefoxitin,Cephaloridine, Cefuoxime Erythromycin,Spiramycin, Tylosin PolymyxinB,Bacitracin Lincomycin,Clindamycin Sulfadimethoxine, Sulfamerazine, Sulfathiazole,Sulfadiazine 항산성균, 포도상구균, 그람 음성균등에살균작용 단백질 합성을 방해하여 다 양한그람양성및음성세균 에작용 세포벽 합성을 억제하여 거 의 대부분의 그람 양성균에 대해작용 세균 내 조직침투가 우수하 여 Penicilin 의대체항생제 로사용 연쇄상구균속 세균 또는 포 도상구균속 세균 등에 주로 항균작용 독성으로 인해 국소용으로 주로사용 그람양성균 및 혐기성균과 마이코플라즈마 등에 높은 항균작용을나타냄 살균작용보다주로정균작용 을하는항생제 플로르퀴놀론 (Fluoroquinolone) 계 그람양성균및그람음성균과 Ciprofloxacin,Enrofloxacin, 혐기성균등다양한균종에 Ofloxacin,pefloxacin 작용 - 3 -
< 그림 1> 아미노글리코사이드계항생제 < 그림 2> 테트라사이클린계항생제 < 그림 3> 페니실린계항생제 < 그림 4> 세파로스포린계항생제 - 4 -
< 그림 5> 마크로라이드계항생제 < 그림 6> 폴리펩티드계항생제 < 그림 7> 린코스아마이드계항생제 < 그림 8> 설폰아마이드계항생제 - 5 -
< 그림 9> 플로르퀴놀론계항생제 미생물의항생제에대한내성은크게자연내성 (intrinsic resistance) 과획득내성 (acquired resistance) 으로나눌수있다. 자연내성의경우균속 (genus) 또는균종 (species) 에따라다르고항생제작용범위는자연내성에의해결정된다. 예를들어반코마이신의경우그람양성세균에대해서는항균력이강하지만그람음성세균에대한항균력은없다. 이것은반코마이신의분자가크고소수성이기때문에그람음성세균의외막을투과할수없기때문이다. 이에비해획득내성은미생물의염색체유전자변이 ( 돌연변이 ) 나플라스미드또는트랜스포존에매개되는내성유전자의획득에의해서생기는것으로일부균주만이항생제내성을갖게된다. Enterococcus faecalis 균주의대부분은반코마이신에감수성이지만 vana 또는 vanb 유전자를획득한일부균주는반코마이신에대한내성을갖고있는것이그예이다. 항생제내성유전자는염색체 (chromosome) 혹은플라스미드 (plasmid) 에존재하고있는것으로알려져있다. 염색체 DNA는안정적이지만플라스미드 DNA는균종내또는균종간, 심지어균속간을손쉽게이동할수있기때문에내성유전자가플라스미드에존재할경우항생제내성전이를유발한다 (Allen 등, 2010; Chen 등, 2010; Heuer 등, 2011). 또한플라스미드는여러가지유전자를동시에지닐수있기때문에여러항생제에대한내성유전자를동시에전달할수있으므로심각한문제가될수있다. 내성유전자는접합 (conjugation) 이나형질도입 (transduction) 또는전환 (transformation) 등의다양한방법을통해전이되며주로플라스미드나트랜스포존에의해매개된다 (Knapp 등, 2008). 미생물중일부는지속적으로항생제에노출됐을경우해당항생제에대한내성정도가증가되는경향을보이는데, 이를유도 (induction) 라한다. Enterobacter 의경우암피실린이나세팔로스포린에노출되면유도에의해 β-lactamase를다량생산하게되고이에의해항생제내성이증가한다 (Nelson, 1999) - 6 -
미생물이항생제에내성을가지게되는기작은효소에의한항생제의불활성화, 표적물질의변화, 세포막의항생제투과성변화, 세포외부로의항생제유출등다양한기작이존재한다. 미생물은이러한기작중한가지또는여러가지기작들이복합적으로작용하여항생제에대한내성을갖게된다. 효소에의한항생제의불활성화기작은 β-lactamase가그대표적인예이다. β -lactamase는 β-lactam환을가수분해하기때문에이러한구조를가진항생제를불활성화시킨다. Staphylococcus aureus 균주의경우 β-lactamase 효소를생성하여페니실린, 암피실린, 피러라실린 (piperacillin) 등에대하여내성을갖는다 (Chanal-Claris, 1997). 이외에항생제가결합하는표적단백질의변성을유발하거나표적단백질을과량생성하여내성을획득하는미생물들이있다. 이것은항생제의표적물질을변화시키는기작으로 Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae 등많은그람양성세균이이기작을통해항생제에대한내성을획득한다. β-lactam 계열항생제의표적은 penicillin-binding protein (PBP) 으로, S. aureus는 β-lactam 항생제와의친화도가낮은새로운 PBP를생성하여메티실린 (methicillin) 에내성을가지게된다. S. pneumoniae는기존의 PBP 변성에의해서 β-lactam 항생제에대한내성을획득한다 (Nagai, 2002). 미생물의 Porin 구조는영양물질과대사산물의출입통로이다. 대부분의항생제는 Porin을통하여세포내로들어가작용한다. 항생제의 Porin 투과도는항생제분자의전하나소수성또는분자량에의해결정되는데, 음성전하의분자가양성전하의분자에비해통과속도가느리다. 소수성분자또는분자량클수록 Porin 투과도가감소한다. 이러한역할을하는 Porin이소실되거나변화되어미생물이항생제에대한내성을갖기도한다 (Yigit, 2002) 세포내로유입된항생제를능동적으로세포외부로유출할수있는미생물도있다. 세포외부로항생제를유출시키는내성기작은주로테트라사이클린, 마크로리드, 퀴놀론에대해내성을갖는미생물에서보여진다. Pseudomonas aeruginosa 균주는세포내의독성성분을세포외로유출할수있는단백질이존재하고이단백질의다량발현에의해시프로프로삭신 (ciprofloxacin), 날리딕스산 (nalidixic acid), 테트라사이클린, 클로로암페니콜 (chloramphenicol) 등의항생제에대해내성을가지고있다 (Furukawa, 2002). 테트라사이클린계항생제는 polycycle 구조를가지고있는물질로테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 클로로테트라사이클린등이포함된다. 테트라사이클린계 - 7 -
항생제에대한내성기작은항생제의세포막투과도감소와세포외부로의유출등을통해이루어진다. 페니실린계항생제의경우에는베타락탐고리와 6-aminopenicillanic acid를기본구조로가지고있는물질이며대표적으로암피실린및페니실린 G 등이존재한다. 페니실린계항생제는 β-lactamase에의한불활성화또는표적단백질의변성을유발하거나세포막투과도감소및능동적인항생제배출등의다양한기작으로내성을얻을수있다. ρ-aminobenzoic acid와유사한구조를갖는설폰아마이드계항생제는유전자변이나플라스미드에의해내성유전자가전달됨으로써내성을획득할수있다. 퀴놀론계항생제의경우에는날리딕스산이변형된것으로, 이에대한내성은 DNA 자이레이즈의변이가일어남으로써얻어진다. 또한린코스아마이드계항생제는아미노당에아미노산이부착된구조이며플라스미드이동에의한유전자전이나항생제를불활성화시키는효소의생성으로인해내성을획득할수있다고알려져있다. 항생제는사람과동물의다양한질병치료및축산업및수산업에서의생산성향상을위해광범위하게사용되고있다. 특히최근산업의발달및의료복지가활발하게이루어짐에따라병원을찾는환자수가증가함으로써항생제의사용량도함께증가하는추세를보이고있다 ( 그림 10). 2007년에발표된식품의약품안전청의 식품의약품통계연보 에따르면항생제를포함하여국내에서생산되는의약품은 2만 3천여종에달하며그생산액은약 10조 6천억원을상회한다고알려져있다. < 그림 10> 국내항생제생산량 - 8 -
항생제는사용대상에따라인체용항생제와동물용항생제로구분할수있다. 사용되는범위가매우넓기때문에사용후항생제를잘못폐기하면잔류항생제들이환경중으로유출되게된다. 항생제는사람에게처방되는제품과가축이나농작물에의해소비되는제품등에따라서환경중으로배출되는경로가매우다양하다. 인체용항생제의경우의약품생산공장에서폐기되거나환자의섭취및배설, 또는가정에서의폐기하는등의경로를통해환경에직접적으로방출된다. 동물용항생제도항생제가포함된사료의폐기및해당사료를섭취한동물의배설등다양한경로를통해환경으로유입되어토양과수질환경의오염을유발할가능성이존재한다 ( 그림 11). 인체와동물에사용된항생제는일부만이대사가되기때문에대사되지않은물질뿐만아니라대사로인해생성된대사산물역시환경에배출되어부정적인영향을미칠수있다 (Golet 등, 2002; Rodriguez-Mozaz and Weinberg, 2010; Zhao 등, 2010). 최근항생제가환경중으로어떠한경로를통해유입되는지, 실제환경내에어느정도의농도로존재하며어떤영향을미치는가에대한관심이모아지며이와관련된연구가증가하는추세이다 (Baquero 등, 2008; Heuer 등, 2007; Hirsch 등, 1999; Kemper 등, 2008; Sanderson 등, 2004). 특히미국이나유럽등의선진국에서수계환경을비롯한생태계에잔류하는항생제에대한조사가활발하게진행되고있다 (Nicholson, 2006). < 그림 11> 항생제의자연내거동 (Ikehata et al., 2006) - 9 -
2. 사업의필요성 항생제는사람이나동물이섭취함으로써항생제를화합물그대로배출하기도하지만일부는체내의대사과정을거쳐새로운형태로바뀐물질이배출되기도한다. 항생제가환경에유입되게되면대부분대사과정을거치면서활성이감소하게되지만현재운영되고있는국내하수처리시설들이항생제를특이적으로정화하기위한목적으로제조되지않았기때문에일반오염물질정화에비해항생제처리가효율적이지는않다. 국내에서는이미한강, 낙동강, 영산강, 금강등주요하천에서항생제가지속적으로검출되고있다. 표 3과 4에서와같이하천뿐만아니라하수처리장유입수, 방류수, 축산폐수처리시설의유입수및유출수에서도여러종류의항생제가검출되었다는보고가있다 ( 국립환경과학원, 2008 2011). < 표 3> 하수처리장유입수및방류수중항생제검출현황 항생제유입수 (ng/ml) 방류수 (ng/ml) Sulfamethoxazole N.D. 12.79 N.D. 0.393 Trimethoprim N.D. 0.067 N.D. 0.061 Lincomycin N.D. 1.4 N.D. 1.175 Tylosin N.D. N.D. Oxytetracycline N.D. N.D. Chlorotetracycline N.D. 12.311 N.D. Ciprofloxacin N.D 0.14 N.D. 0.05 Enrofloxacin N.D. 0.03 N.D. Erythromycin N.D. 0.003 N.D. - 10 -
< 표 4> 하천수중항생제검출현황 항생제 Sulfamethoxazole 하천수 (ng/ml) N.D. 0.224 Trimethoprim N.D. 0.005 Lincomycin N.D. 2.657 Oxytetracycline N.D. 0.239 Chlorotetracycline N.D. Ciprofloxacin N.D 0.14 Enrofloxacin N.D. 0.035 Erythromycin N.D. 0.08 항생제사용이증가함에따라항생제에대한환경생태계중잔류보고 (Kümmerer, 2003; Watanabe 등, 2010) 가지속적으로증가되고있지만잔류물질이항생제내성균의증가에미치는영향에대한연구는전세계적으로미흡하며, 실질적으로수계에서검출되는저농도의항생제가항생제내성미생물의증가에미치는영향에대한연구가필요한실정이다 (Iwane 등, 2001). 특히세균의항생제내성은의료현장을비롯하여공중보건학적으로큰문제를야기하고있다. 항생제내성이특히문제가되고있는주요병원균으로는 Enterococci, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter species들이있다 ( 강철인, 2011). 이중에서 New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) 을생성하는대장균과폐렴간균이보고 (Yong 등, 2009) 되었으며이균주들은카바페넴계열항생제에내성을나타낸다. 인도와파키스탄병원에서진료받은후유럽으로돌아간환자들을통해이균주가영국을포함한유럽국가에전파되었음이보고됨으로써언론의주목을받았고여러언론들은소위슈퍼박테리아라는명칭을사용하였으나 - 11 -
이용어는학술용어가아니며다제내성균이보다적절한표현이다 (Kumarasamy 등, 2010). 현재우리나라에서는여섯가지다제내성균인메티실린내성황색포도상구균 (MRSA), 반코마이신내성장구균 (VRE), 반코마이신내성황색포도상구균 (VRSA), 카바페넴내성장내세균 (CRE), 다제내성아시네토박터 (MRAB), 다제내성녹농균 (MRPA) 이질병관리본부에의무적으로신고해야하는법정의료관련감염병으로지정되어있다 (Kim 등, 2000; Lee 등, 1998; Park 등, 1992; 김미나, 2011). 이와같이환경중에존재하는항생제와항생제내성균의문제점을고려하였을때환경중배출되는항생제의관리방안마련뿐만아니라이미환경내에존재하는다양한항생제내성미생물의실태조사 (Storteboom 등, 2010; Yang 등, 2010) 및유전자전이의상관관계에관한종합적인비교검토는반드시필요한사업이라고판단된다. - 12 -
II. 연구내용및방법 1. 환경중잔류항생제잔류실태와내성균에대한자료조사 1.1. 국내항생제사용량및잔류특성 국내의항생제생산량은 1980년이후매년증가하는추세이며 2001년이후에는생산금액이 1조원을초과하였다. 한국제약협회에서실시한조사에따르면항생제생산금액 ( 약 1조 5,565억원 ) 은총의약물질생산금액중순환계용의약 ( 약 2 조 5,520억원 ), 소화기관용의약 ( 약 1조 7,200억원 ), 중추신경계용의약 ( 약 1조 6,800억원 ) 에이어 4번째로높은금액을차지하고있다 ( 그림 12). 항생제계열별로생산금액을분류하면페니실린계항생제가가장많이생산되었으나 1998년이후부터는세파로스포린계항생제가제일많이생산되었다. < 그림 12> 국내총의약물질및항생제생산금액 우리나라의경우전체적인축산용항생제사용량이다른국가의축산물생산규모에비해약 2배 10배이상높다. 축산업에서의항생제의존성이매우높고수의사의정확한처방에의한치료용보다는성장촉진을위한사료첨가제또는자가치료의용도로농가에서직접구입하여사용되고있다. 항생제내성균의증가문제는 - 13 -
사람뿐만아니라축산분야에서도큰문제가되고있다. 축산분야에서의항생제오남용으로인해동물의항생제내성이증가하고있고내성이증가된축산물을통해항생제내성균이사람으로전달될수도있기때문이다. 축산업에서의항생제사용은연간약 1,000톤이상으로 ( 그림 13), 돼지및닭에서항생제를많이사용하고있고테트라사이클린계항생제가전체항생제소비의약 50% 를차지하고있다. 축산물로부터유래된세균의항생제내성률을평가한결과테트라사이클린과암피실린, 스트렙토마이신에대한내성률이높은것으로나타났다 ( 그림 14). < 그림 13> 연도별축산용항생제판매량 < 그림 14> 가축에서분리된 E.coli 의항생제내성률 - 14 -
1.2. 국내 외환경중항생제내성균의검출사례 잔류의약물질의환경오염이처음보고된것은 1970년대유럽으로, Garrison (1976), Hignite와 Azarnoff(1977) 의조사에서하수처리장으로부터콜레스테롤강하제인 clofibric acid와해열제성분이되는살리실산 (salicylic acid) 이검출되었다. 또한 Richardson과 Bowron(1985) 의연구에서는수질환경으로부터 1 μg/l 의의약물질이검출되었다. 영국이외에 2002년 Kolpin 등의보고를통해미국의지표수에광범위한종류의의약물질등이오염되어있음이보고되었고이후세계적으로환경중의약물질의농도, 거동과생태독성연구가지속적으로이루어지고있으며노출평가및위해성평가가진행되고있다. 우리나라의인체에대한항생제처방율은선진국보다높은수준이다. 2010년도 OECD health data에의하면일일항생제사용량은 1,000명중 27.7명으로항생제처방률이매우높은실정이다. - 종합병원환자의 65-70% 에서메티실린내성황색포도상구균 (MRSA) 이검출되고있다. * 미국 (55%), 영국 (40%), 스페인 (28%), 호주 (9%), 스웨덴 (0.6%) - 반코마이신내성장구균 (VRE) 은종합병원에서약 24% 내성률을보이고있으나, 최근급격히증가하고있는추세이다. 국립수의과학검역원 가축및축산물내주요항생제내성실태조사및평가 (2010) - 동물용항생제실태조사및축산물유래주요항생제내성균분포및특성조사를실시하였다. - 전국 73개의농장에서채취한총 831개의가축분변시료와 64개소의도축장및소매상으로부터채취한총 473개의식육시료에서 E.coli, E.faecium, E.faecalis, Salmonella 를분리하였고, 젠타마이신, 스트랩토마이신, 네오마이신, 암피실린, 아목사실린 / 클라벤닉산, 세팔로틴, 날리딕스산, 시프로플록사신, 트리메토프림 / 설파메톡사졸, 클로람페니콜, 플로로페니콜, 테트라사이클린에대한내성을평가하였다 ( 표 5). - 15 -
< 표 5> 가축의항생제별대장균내성률 (%) ( 국립수의과학검역원, 2010) 한국물환경학회및대한상하수도학회 하수처리장유입 / 유출수의잔류의약물질분석 (2012) - 최근하수처리수의안전성에대한관심이높아지고있는가운데세계적으로항생제를포함한여러의약물질과같은미량오염물질에대한연구가진행중이다. - 의약물질의주요배출원의하나로써하수처리장의방류수가지적되고있으며국내에서도이에대한연구가많이이루어지고있는실정이다. - 잔류의약물질의주요배출원인하수처리장에서의유입수, 유출수의의약물질분포특성을파악하기위해서울특별시에위치한 4곳의하수처리장과경기도에위치한 2곳의하수처리장에서유입수, 유출수시료를채취하여총 62종의잔류의약물질을분석한결과 62종의잔류의약물질중 43종이검출되었고, 이중 atenolol, clarithromycin, sulpiride 등이유입수에서와마찬가지로출수에서도높은농도를보여 40% 이하의낮은제거율을보임을알수있었다. 국내남해안의양식장어류를분석한결과 50% 의어류에서항생제가검출되었 으며페니실린및테트라사이클린에대해 80% 이상의내성세균이검출되었다. - 16 -
( 보건환경연구원, 2005) 노르웨이등유럽에서는수산분야에서항생제를사용하지않는추세로전환 질병관리본부에서실시한 100 개소의표본감시체계를운영하여조사한결과다 제내성균에의한의료기구감염발생빈도가 2011 년에는약 2 만 3 천건에달 하며 2012 년에는상반기에만 2 만 5 천여건에달했다. 세브란스병원이 1988년부터 WHO의항생제내성조사에참여하였으며, 1997 년부터 Korean Nationwide Surveillance of Antimicrobial Resistance Group (KONSAR) 를구성하여매년국내내성률조사시행및시행결과를국내외학술지에보고하고있다. 2007년한국소비자원에서실시한축산환경의내성조사및영향평가연구결과에의하면충북, 경기, 전남등의일반양돈농가에서사용중인돼지의직장및분변에서검출된균의항생제내성조사결과농, 축산에서다량사용된테트라사이클린 (TE) 에대해서 Enterococcus faecalis는 97%, E. coli는 89.5%, Enterococcus faecium은 52.1% 의높은내성률을보이는것으로보고되었다. 2010년농업과학기술개발공동연구사업 작물재배환경에서중금속및항생물질의안전성평가 에서강원도원주지역의계분퇴비화시설인근의농경지토양, 지표수및저질토에대한총 4개계열 10종의항생물질을선정하여영농시기별잔류특성을조사한결과토양시료의경우테트라사이클린계열의항생제가다른계열항생물질과비교하여가장높은농도로검출되었다. 식품의약품안전처 환경중항생제내성균모니터링 (2006) - 4년 (2003-2006) 동안한강 금강 낙동강 영산강유역의시료와하수처리장의축산폐수유입수 유출수, 생활하수유입수 유출수등총 128건에대한실험을수행하였다. - Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium 등의균주가분리되었고, 분리된균주의암피실린, 젠 - 17 -
타마이신, 페니실린 G, 리팜피신, 테트라사이클린, 반코마이신, 아목실린 (amoxicillin)/ 클라브라닉산 (clavulanic acid), 설파메톡사졸 (sulfamethoxazole), 시프로플로사신 (ciprofloxacin), 에리스로마이신, 타이코프라닌 (teicoplanin), 클로르암페니콜 (chloramphenicol), 옥사실린 (oxacillin), 아미카신 (amikacin), 세포페라존 (cefoperazone), 이미페넴 (imipenem) 에대한내성을평가하였다. - 평가항목중 1가지이상의항생제에대해내성을보이는균주는 E.coli의경우 72.5%, S.aureus의경우에는 88.6%, Enterococcus 의경우에는 97.2% 에달했으며 4가지이상의항생제에대해내성을보이는다제내성균주역시 E.coli와 Enterococcus 는각각 35.3%, 33.3% 의높은비율을보였으며 S.aureus도 14.3% 의비율을보였다. - 하천유역에서분리된균주보다하수처리장의축산폐수유입수에서분리된균주가더많은항생제에내성을지니고있음을확인하였다. 환경부 환경중의약물질노출실태조사 (2007) - 한강, 낙동강, 금강, 영산강하천수및하수처리장및축산폐수처리장유입수및방류수등 40지점에대하여의약물질검출여부를조사하였다. - 4대강유역하천수에서조사대상의약물질 17종중설파메톡사졸 ( 동물용항생제 ) 과린코마이신 ( 인체용항생제 ) 등 13종의물질이검출되었다. 특히항생제의경우미국 FDA( 식품의약품안전청 ) 기준치인 1μg /L를초과한물질이린코마이신, 이부프로펜 ( 소염제 ), 설파메타진 ( 동물용항생제 ) 등 3종이나검출되었다. - 의약물질 17종중인체용의약품으로아세트아미노펜 ( 진통 / 해열제 ), 트리메소프림, 린코마이신, 에리스로마이신, 이부프로펜, 디클로페낙 -나트륨, 나프록센등항생제및소염제 7종이검출됐다. 동물용의약품은설파메톡사졸, 설파메타진, 설파티아졸, 옥시테트라이시클린, 엔로플록삭신, 시프로플록삭신등 6종이검출됐다. - 검출농도는이부프로펜이최고 3.528μg /L로가장높았고, 린코마이신 (2.657μg /L), 설파메타진 (1.546μg/L) 순이었다. 2008 년연세대학교에서하수처리장시료로부터다제항생제내성미생물분리 연구를실시하였다. 그결과대표적으로 Bacillus( 눈, 폐질환 ), Vagococcus( 다 양한질병 ), Staphylococcus( 균혈증, 심장내막염 ) 등다수의병원성미생물이 - 18 -
분리되었는데, 항생제에있어서는일반미생물보다는병원성미생물이더내성이강함을보여주는결과였다. 항생제내성미생물오염에있어서하수처리장이강물에미치는영향을계절별로알아본결과, 기온이높을때일수록항생제내성미생물의유해성이컸으며, 전체미생물에대해항생제내성미생물의비율의패턴이하수처리장과강물이같음을발견하였다. 이는하천내존재하는항생제내성미생물에대하여하수처리장이하천에끼치는영향력이크다는것을보여준다. 질병관리본부 2009년연보국가항균제내성정보 (2011) - E. coli에서세파로스포린계열항균제인세포탁심 (cefotaxime) 내성률은 2009 년종합병원, 병원, 의원, 노인요양병원에서각각 21.9%, 28.6%, 9.0%, 48.3% 로나타났으며, K. pneumoniae에서세파로스포린계열의세프타지딤 (ceftazidime) 내성률은 2009년종합병원, 병원, 의원, 노인요양병원에서각각 44.4%, 46.0%, 17.6%, 54.2% 로나타났으며종합병원과의원의경우에 2008년에비해내성률이증가하였다. P. aeruginosa과 A. baumannii 카바페넴계열항균제인이미페넴내성률은모든의료기관급에서매년증가하는양상을보였다. 고양시상수도본부 약수에서검출된대장균의항생제내성양상에관한연구 (2009) - 먹는물공동시설에서총대장균군중대장균검출에의한음용부적합시설발생은연중 9월에가장많이발생하였으며, 하절기인 7-9월에채취한시료에서대부분의대장균을분리할수있었다. - 분리된 245주의대장균에대해항생제내성검사를실시한결과, 한가지이상의약제에중증도이상의내성을지닌균은 168주 (68.6%), 3가지이상의약제에내성을지닌다재내성균은 21주 (8.6%) 였으며최대 12가지항생제에내성을지닌균도 1주검출되었다. 항목별내성률에서가장높은내성률은세파로틴 (cephalothin) 146주 (59.6%) 였고, 다음은테트라사이클린 43주 (17.6%), 암피실린 20주 (8.2%), 스트렙토마이신 19주 (7.8%), 설파메톡사졸 / 트리메소프림 14주 (5.7%) 순이었다. 서울시보건환경연구원 (2010) - 19 -
- 시험균주의 50% 인 25균주는 16종의항생제에대한내성을보이지않았으며, 각항생제에대한내성은암피실린에대한내성이 36% 로가장높았으며, 아목실린 / 클라브라닉산과테트라사이클린의내성이각각 32%, 22% 였다. 이들의내성양상은모두 17가지패턴이었으며, 2제내성을가진 9균주중 8균주가 AM - AMC에내성을보였다 ( 표 6). < 표 6> 시험균주의항생제내성패턴 ( 서울시보건환경연구원, 2010) Multi drug-resistant patterns No. of isolates NA 2 AM 1 GM 1 AMC 1 NA-TC 1 AM-AMC 8 CF-AM-AMC 1 TIC-AM-TC 1 CF-AM-TC 1 S-C-TC 1 S-AM-TC-AMC 1 NA-S-AM-TC-AMC 1 NA-S-AM-TC-FOX-AMC 1 NA-TIC-S-AM-TC-AMC 1 CF-TIC-S-AM-TC-K-AMC 1 NA-CF-TIC-S-C-SXT-AM-TC-K-CIP-AMC 1 NA-CF-TIC-S-SXT-AM-TC-K-CIP-FOX-AMC 1 *NA; nalidixic acid, GM; gentamicin, CF; cephalothin, TIC; ticarcillin, S; streptomycin, C; chloramphenicol, CRO; ceftriaxone, SAM; ampicillin/sulbactam, SXT trimethoprim/sulfamethoxazole, AM; ampicillin, AN; amikacin, TC tetracycline, K; kanamycin, CIP; ciprofloxacin, FOX; cefoxitin, AMC amoxicillin/clavulanic acid - 20 -
의료사고연구소 (2006) - 병원당의사 (10명), 간호사 (10명), 간병인혹은보호자 (10명), 환자 (10명) 의손과비강및화장실벽면 (5곳), 침대높낮이조절대 (5개), 문고리 (5개), 공기 (3 곳 ) 에대해서총 1,274샘플을채취하였다. 추가로의료환경개선에있어문제가될수있다고생각되는의료인키보드 60샘플을채취하였으며, 의료환경에서분리한균과일반인및지역환경에서분리한균의내성률의차이가있는지를알아보기위하여각기다른장소의지역에있는일반인 160명의비강과손과 70개의키보드에서도샘플을채취하였다. 따라서총 1,724개의검체에서목적으로하는균을대상으로각각증균 분리단계를거쳐서최종선택배지에서목적하는집락 3~5개를취한후분리및동정확인시험을수행하였다. - 분리된균의현황을보면 E. faecalis 180균주, E. faecium 135균주, S. aureus 725균주, E. coli 25균주, K. pneumonia 14균주, P. aeruginosa 5균주가검출되었다. - E. faecalis 180균주중 179주 99.4% 가항생제 1종류이상에내성을가지고있고, 4가지계열의서로다른항생제에내성이있는균주인다제내성균은 59주 32.8% 검출되었다. 내성항생제를보면 rifampin(rd) 67.9%, 에리스로마이신 (E) 64.3%, 퀴누프리스틴 (quinupristin)/ 달포프리스틴 (dalfopristin)(qd) 60.7%, 테트라사이클린 (TE) 50% 로이들항생제에내성을많이가지고있었다. - E. faecium은전체분리된 135균주중 125주 92.6% 가항생제 1종류이상에내성을가지고있고, 4가지계열의서로다른항생제에내성이있는균주인다제내성균은 67주 63.2% 검출되었다. 내성이있는항생제는리팜핀 (rifampin, RD) 에 81.5% 로가장많은내성을보였고, 에리스로마이신 (E) 68.5%, 시프로플로사신 (CIP) 45.7%, 페니실린 (P) 과아목실린 / 클라브라닉산 (AMC) 44.6%, 암피실린 (AMP) 42.4%, 젠타마이신 (CN) 40.2%, 설파메톡사졸 / 트리메소페넴 (SXT) 35.9%, 퀴누프리스틴 / 달포프리스틴 (QD) 과테트라사이클린 13% 이고나머지는항생제에는 10% 이하의내성률을보였다. - S. aureus 725균주중 675주 93.1% 가항생제 1종류이상에내성을가지고있고, 4가지계열의서로다른항생제에내성이있는균주인다제내성균은 138주 19% 가검출되었다. 모든분리균은거의페니실린 (P) 에내성을지니고있었다. 페니실린 (P) 91.3%, 암피실린 (AMP) 91.3%, 에리스로마이신 (E) 27.4%, 테트라사 - 21 -
이클린 (TE) 20.6%, 옥사실린 (OX) 19.4%, 시프로플로사신 (CIP) 11.9%, 아미카신 (AK) 10.7%, 클린다마이신 (DA) 10.3% 의내성률을보이고, 내성있는균주가없는반코마이신 (VA) 을제외하고나머지항생제에는 10% 미만의내성률을보인다. - MRSA(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus) 의경우 2003년축산 환경, 2004 년수산환경, 2005 년의료환경중의항생제내성균모니터링의 검출률을비교해보면, 축산환경에선분리한균들에서는 MRSA가한균주도나오지않았고수산환경에서분리된균들에서 2균주 5.1% 가나타났으며금년도에실시한의료환경중에서는 181균주 25% 의높은검출률을보였다. 축산과수산환경에서보다집중적으로항생제를많이사용하고또항생제에많이노출되어있는의료환경에서높은검출률이나타났다. - E. coli은전체분리된 25균주중 23균주 88.5% 가항생제 1종류이상에내성을가지고있었고, 4가지계열의서로다른항생제에내성이있는균주인다제내성균은 18주 72% 로높은다제내성률을보였다. - Klebsiella pneumonia 전체분리된 14균주중 14균주 100% 가항생제 1종류이상에내성을가지고있었고, 4가지계열의서로다른항생제에내성이있는균주인다제내성균은 3주 21.4% 의다제내성률을보였다. 항생제별내성률을보면모든분리균에서암피실린 100%, 클로르암페니콜과피퍼라실린 (piperacillin) 21.4%, 아즈트레남 (aztreonam), 세프타지딤 (ceftazidime) 와테트라사이클린 14.3%, 피퍼라실린 / 타조박탐 (tazobactam) 과세페핌 (cefepime) 7.1% 의항생제내성을지니고있었다. - Pseudomonas aeruginosa 전체분리된 5균주중 5균주 100% 가항생제 1종류이상에내성을가지고있었고, 4가지계열의서로다른항생제에내성이있는균주인다제내성균분리되지않았다. - 일반인비해서는병원에있는의사, 간호사, 환자, 보호자모두가내성률이높으며, 축산, 수산환경에서분리된균의항생제내성률보다의료환경에서분리된균의내성률이높다. 국립보건연구소 (2010) - 전국 13 25 개대학및종합병원에내원한환자의임상검체에서분리된주요 세균을대상으로 2007 2010 년항균제내성실태를조사한결과 ( 그림 4) 전반 - 22 -
적으로그람양성균의항균제내성률은여전히높았고, 일부그람음성균의세포탁심과이미페넴에대한내성률은지속적으로증가하는양상을보였다. - S. aureus : methicillin ( 옥사실린또는세폭시틴 (cefoxitin)) 내성률은 2010년에 72% 로 2009년에비해다소감소하는양상을보였고그외항균제에대한내성률도 2010년에감소하는양상을나타냈다. 한편국내반코마이신내성균주는검출되지않았다. E. faecalis : 암피실린을제외하고는예년과비슷한수준의내성률을나타냈다. E. faecium : 테트라사이클린을제외하고대부분항균제에대한내성률이 2009년에비해감소하였다. S. pneumoniae : 페니실린내성률은 2008년부터증가하는추세로 2010년에 27.0% 였고, 에리스로마이신내성률은연도별큰변동없이 70% 를상회하였다. E. coli : 세파로틴을제외한대부분항균제에대해 2009년과내성률이유사하거나소폭상승하였다. 세포탁심과세프타지딤내성률은각각 23.1% 과 21.1% 였으며이미페넴내성률은 0.3% 로나타났다. K. pneumoniae : 모든항균제에대한내성률이 2009년에비해감소하였다. 세포탁심과세프타지딤에대한내성률은각각 36.5% 과 37.4% 였고이미페넴내성률은 0.5% 였다. E. cloacae : 2010년세포탁심과세프타지딤내성률은 30% 를상회하였고이미페넴내성률은 0.4% 로나타났다. P. aeruginosa : 2008년을정점으로대부분의항균제내성률이감소하는양상을보였고, 최근문제가되고있는카바페넴 (carbapenem) 계열의이미페넴에대한내성률은 29.2% 였다. A. baumannii : 대부분의항균제에내성률이증가하는양상이었고특히이미페넴에대한내성률은 2007년 27.0% 에서 2010년에는 71.7% 로급증하였다. < 그림 15> 병원임상에서분리된주요균체의항생제내성실태 ( 국립보건연구소, 2010) - 23 -
1.3. 환경중항생제내성균검출관련연구동향 국제항생제및항생제내성학회가 1997년설립되어 2년마다개최되고있으며항생제내성과관련된결과를발표하고최신연구동향파악및국제적인정보교류가이루어지고있다. 최근개최된학회에서는주로인체에해를끼칠수있는다제내성그람음성세균과메티실린내성황색포도상구균에대한연구내용이주로발표되었다. 항생제내성균의관리를위해서는항생제내성에대한모니터링이광범위한지역에서지속적으로수행되어야한다. 이미많은국가에서다양한내성균에대해모니터링프로그램을실시하고있다. 그러나각국가별모니터링결과비교를위해서는국제적인표준화가필요한실정이다. 국제기구인 CODEX( 국제식품규격위원회 ) 와 OIE( 국제수역사무국 ) 에서항생제내성균에대한위해평가방법및절차등을제공하고있으며현재는주로미국이나호주등에서위해평가가이루어지고있다. 그러나항생제내성균의위해정도는각나라및지역별로차이가있기때문에적절한위해평가방법개발이필요하다. 인체에많은문제가되고있는 MRSA를비롯한그람음성균에대한내성기작및상관성분석등다양한역학적연구가활발하게진행되고있으며현재몇몇국가들은각국가별특성에맞는모니터링프로그램을개발하고운영중에있다. 항생제잔류가인체에미치는영향에대한연구는세계적인관심사가되고있으며특히일본의경우에는어류양식업이발달되어있어수산식품중항생제잔류에대한연구가활발히진행되고있다. 일본의경우항생제에대해동물용의약품또는사료첨가물의사용기준이법률로제정되어있고어종에따른적정사용량등이설정되어있다. 일본뿐만아니라노르웨이, 덴마크등에서도수산물에대한항생제잔류모니터링를위한연구가활발히진행중에있다 - 24 -
(Ellingsen, 2002). 국내에서도식품에잔류한항생제에대한연구가일부수행중이며대부분축산식품을대상으로진행되고있다. 수산식품에대한연구의경우에는국립수산과학원에서주로진행되어위해요소중점관리기준설정및표준모델개발에관한연구가수행되었다. 다양한국가들로부터항생제에대한내성을지닌병원성세균이보고되어지고있다. 미국에서는식중독원인균인 Salmonella sp. 에대한항생제내성조사를실시하였고검출된항생제내성균 15균주중 12균주가식품으로부터검출되어그심각성이대두되기도하였다. 최근전세계적으로가장문제가되고있는항생제내성균은 MRSA로, 반코마이신에내성을나타낸 MRSA가일본에서처음으로보고된후미국을비롯한다른국가에서도보고가되어졌다. 또한페니실린내성페렴구균이호주와미국에서보고된이후빠른속도로확산되었고, 반코마이신에내성을갖는장구균이프랑스와영국에서분리되어확산되었다. 국내의항생제내성균에관한연구는대형병원및국가기관을통해일부진행되고있으나아직미흡한실정이다. 그러나우리나라는병원으로부터분리된세균의내성율이비교적높은편에속해있고, MRSA의출현율이 1999년에이미 70% 을넘어섰다. 이에대한심각성을인식하고최근식품및환경내의항생제내성균모니터링이실시되고있다. - 25 -
2. 항생제내성균의환경중분포실태조사 2.1. 시료채취지점 2010년부터 2012년까지실시된잔류의약물질분석방법연구및실태조사의결과에따라항생제의검출지역을검토하였다. 항생제의검출농도와검출빈도를고려하여수계별하천수 4지점과토양 2지점을선정하였다. 2차례의조사결과의평균값에의하면한강수계의원주천에서는 0.005μg/L 설파메톡사졸, 0.0085μg/L 설파티아졸, 0.009μg/L 설파메타진, 0.0065μg/L 트리메소프림, 0.042μg/L 린코마이신, 0.067μg/L 클라리트로마이신, 0.005μg/L 반코마이신이검출되어가장많은종류의항생제가검출되었다. 금강수계의익산천에서는 0.0355μg/L 설파티아졸, 0.026μ g/l 설파메타진, 0.0015μg/L 트리메소프림, 0.0335μg/L 린코마이신이검출되어기타금강수계지점보다높은농도의항생제가검출되었다. 낙동강수계의금호강지점에서는 0.0115μg/L 설파메톡사졸, 0.01μg/L 설파티아졸, 0.0125μg/L 설파메타진, 0.008μg/L 트리메소프림, 0.029μg/L 린코마이신, 0.046μg/L 클라리트로마이신이검출되어기타낙동강수계지점보다높은농도의다양한항생제가검출되었다. 영산강수계의무안지점에서는 0.0255μg/L 설파메톡사졸, 0.0025μg/L 설파메라진, 0.017μg/L 트리메소프림, 0.02μg/L 세파렉신, 0.048μg/L 린코마이신, 0.173μ g/l 클라리트로마이신, 0.035μg/L 세프라딘이검출되어기타영산강수계지점보다높은농도의다양한항생제가검출되었다. 토양시료의경우나주지점에서 0.52mg/kg 설파메타진, 0.03mg/kg 설파클로로피리다진이검출되었고장항지점에서 0.025mg/kg 페니실린G가검출되어시료채취지점으로선정하였다. 또한항생제내성균의존재가능성이높은병원하수처리후방류지점과일반하수처리방류지점을고려하였으며같은전주천지점에위치하고있는전북대병원하수처리방류지점과전주시하수처리장방류지점을선정하였다. 전북대병원하수처리방류수가전주천과합류하는지점의하천수를채취하였으며전주시하수처리장방류지점의하류지점에서하천수를채취하였다. 본과제에서선정한지점은 < 표7> 과같으며시료채취지점주변환경은그림 17 그림 24와같다. 시료는모든주소지역에서채취하였으나영산강수계의무안지점은 전라남도무안군상향면옥암리 ( 방조제앞 ) 이었으나하천수를채취할수있는지 - 26 -
점이아니었으므로환경부의수질측정망주소에근거하여인근주소지인 전라남도영암군삼호읍나불리124 영산호국민관광지 ( 전남서부조종면허시험장부근 ) 로변경하였다. 또한나주토양시료의경우기존지점이광남고등학교주차장으로서콘크리트포장되어있었으므로주소지부근논토양을시료로채취하였다. < 표 7> 조사대상지점 번호구분지점명소재지시료코드 1 한강수계원주천강원도원주시호저면주산 1 리 ( 주산교 ) A-1-14 2 금강수계익산천전라북도익산시춘포면용연리 442-1 B-1-8 3 낙동강수계금호강대구시동구효목동 2 가 ( 제 1 아양교 ) C-1-1 4 영산강수계무안 전라남도영암군영산호나불리 124 영산호국민관광지 전남서부 조종면허시험장 인근 D-1-8 5 토양 - 금강장항송림충청남도서천군장항읍송림리 5-427 B-2-7 6 토양 - 영산강나주남평전라남도나주시남평읍교원리 133 부근논토양 D-2-7 7 병원전주천 1 8 하수전주천 2 전라북도전주시덕진구송천동 1가 312-4 인근 ( 전북대학교병원하수처리후직접방류장소와전주천합류지점 ) 전라북도전주시덕진구전미동 2가 1394 인근 ( 전주시하수종말처리장의방류장소하류지점 ) < 그림 16> 항생제내성균분포조사를위한시료채취장소 - 27 -
< 그림 17> 한강수계 ( 원주천 ) < 그림 18> 영산강수계 ( 무안 ) - 28 -
< 그림 19> 낙동강수계 ( 금호강 ) < 그림 20> 금강수계 ( 익산천 ) - 29 -
< 그림 21> 하수처리방류 ( 전주천 2) < 그림 22> 병원하수처리방류 ( 전북대학교병원, 전주천 1) - 30 -
< 그림 23> 장항송림 < 그림 24> 나주남평 - 31 -
2.2. 시료채취및보관 각항목별시료채취시기는 2013 년 9 월 23 일 9 월 26 일사이이다. 우천시실 시하는모니터링결과는평상시의오염물질수준을반영할수가없기때문에 본연구에서는우천의영향이없는날을선택하여시료를채취하였다. 수질시료수질시료는미리완전히멸균된 1L 채수병을사용하여채취하며이때기포가생기지않도록하였다. 채취한시료는현장으로부터아이스박스를이용하여 12시간내에실험실로운반하였으며세균검사및이화학적분석을실시하였다. 토양시료토양시료는멸균된 500mL 갈색병을사용하여채취하였다. 채취한시료는아이스박스를이용하여 12시간내에실험실로운반하였으며세균검사및이화학적분석을실시하였다. 2.3. 이화학적분석 수온, ph, 탁도분석 시료채취현장에서휴대용온도계, ph meter, 탁도계를이용하여측정하여 기록하였으며이외의분석은실험실로운반후아래와같이실시하였다. 양이온 (NH + 4 ), 음이온 (Cl -, NO - 3, PO 3-4 ) 분석양이온과음이온의분석을위해시료를 0.45 µm 실린지필터를이용하여여과한후희석하여 IC (Metrohm 761 Compact IC) 를이용하여각각의항목을측정하였다. 음이온컬럼은 Metrosep A Supp5 (150/4.0mm) 를사용하였으며, Eluent 용액은 0.339g의 Na 2CO 3 와 0.084g의 NaHCO 3 를혼합하여증류수를이용해 1L로제조하였다. 서프레서 Regeneration solution은 50 mm H 2 SO 4 와증류수를사용하였다. 표준용액은각각 Cl - (NaCl), NO - 3 (NaNO 3 ), - 32 -
PO 4 3- (KH 2 PO 4 ) 을 1,000ppm 으로제조하여 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ppm 으로희 석하였다. 양이온분석에사용한컬럼은 Metrosep C4 150 (150/4.0mm) 를이용하였으며, Eluent 용액은 2mM HNO 3 에 10% Acetone을첨가하였다. 또한 NH + 4 표준용액은 NH 4 Cl을 1,000ppm으로제조하여 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ppm으로희석하였다 ( 그림 25). < 그림 25> IC (Ionchromatography) 와음이온, 양이온 StandardPeak BOD (biochemical oxygen demand) 분석 BOD의측정원리는분석하고자하는시료를 20 에서 5일간저장해두었을때, 시료중의호기성미생물의증식과호흡작용에의하여소비되는용존산소의양으로부터 BOD를측정하는방법이다 ( 그림26). 본실험에서수질시료의 BOD 5 측정은수질오염공정시험방법에따라분석을실시하였으며, 수질에용해되어있는 DO (dissolved oxygen) 농도는 DO meter (HI 9146) 를이용하여측정하였다. BOD 측정을위하여완충액 A (K 2 HPO 4, 21.75 g/l; KH 2PO 4, 8.5 g/l; NaH 2PO 4, 44.6 g/l; NH 4Cl, 1.7 g/l), 완충액 B (MgSO 4 7H 2O, g/l), 완충액 C (CaCl 2, 27.5 g/l), 완충액 D (FeCl 3 6H 2O) 을준비하였다. 공기로포화된 D.W. 에완충액 A, B, C, D를각각 1 ml씩첨가하고측정하고자하는시료의농도를 20~40% 농도로조절하여 1 L로맞춘후 300 ml 부피의 BOD 병에분취하고 20 항온기에서 5일간배양하였다. BOD 0 의측정을위하여 1개의 BOD 병은 15분간방치한후 DO meter를이용해 DO 농도 (mg/l) 를측정하고 (D 1), 2개의 BOD 병은 20 에서 5일간배양한후 DO를측정하여 (D 2) 최종적으로수질시료의 BOD 5 농도를계산하였다. - 33 -
BOD 농도의계산은다음과같다. BOD (mg/l) = (D 1 - D 2 ) x P D 1: 희석 ( 조제 ) 하고 15 분간방치한후시료의 DO (mg/l) D 2 : 5 일간배양후시료의 DO (mg/l) P: 희석시료중시료의희석배수 ( 희석시료량 / 시료량 ) < 그림 26> BOD 실험 TOC (total organic carbon) 분석 TOC의분석은양이온과음이온분석과같이시료를 0.45 µm 실린지필터를이용하여여과한후희석하여 TOC-V (SHIMADZU Co.) 로분석하였다. standard solution은 potassium hydrogen phthalate 2.125 g을정량하여 105-120 에서 1시간동안건조한후 desiccator에서냉각하였고, 1 L volumetric flask에 3차증류수와냉각시킨 potassium hydrogen phthalate 를용해시켜 1,000 ppm의 stock solution을제조하였으며 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20 ppm으로희석하여검량선을작성하였다 ( 그림 27). - 34 -
< 그림 27> TOC 분석기기와 standardpeak 2.4. 총대장균군분포조사 - 시료를 0.85% saline 용액으로 10-1 10-4 연속희석을실시하여 m-endo agar 배지에도말하였다. - 37 에서 24 시간배양한후금속성광택을띄는적색콜로니를계수하였다. 2.5. 총세균및항생제내성세균의검출 - Nutrient agar 및 Muller Hinton, Enterobacteriaceae Enrichment 고체배지에서선발된항생제를이용하여미생물의분포실태를조사하였다. 본과제에서사용된항생제의종류와농도는다음과같다. 반코마이신 (Vancomycin, 40μg/ml), 암피실린 (Ampicillin, 100μg/ml), 린코마이신 (Lincomycin, 100μg/ml), 카나마이신 (Kanamycin, 50μg/ml), 테트라사이클린 (Tetracycline, 15μg/ml), 에리스로마이신 (Erythromycin, 100μg/ml), 세파렉신 (Cephalexin, 100μg/ml), 설파메속사졸 (Sulfamethoxazole, 512μ g/ml), 시프로프록신 (Ciprofloxin, 4μg/ml) - 시료를 0.85% 생리식염수용액에 10-1 10-4 ( 수질시료 ) 또는 10-2 10-6 ( 토양시료 ) 농도로희석하여고체배지의표면에도말 ( 그림 28) - 25 에서 24시간, 48시간, 72시간배양하여시간별생성된콜로니를측정 - 35 -
< 그림 28> 도말평판법 2.6. 항생제감수성검사 - 항생제감수성검사의측정원리는순수분리된세균배양액을 Nutrient 고체배지에접종한다음디스크를일정간격플레이트에적용하여그균의생장이억제된것을나타내는원의직경을측정하여균에감수성인지를결정 - 항생제감수성검사방법은백톤비비엘센스디스크감수성시험테스트디스크를사용하였음. 암피실린을포함한항생제계열별 14종항생제디스크분배기를이용하여시험하였으며, 농도를포함하여 < 표 8> 와같이총 22가지의항생제에대한감수성검사를실시하였음. - 측정방법은선택배지를사용하여순수배양된균체만사용하며가능한다양한 속 의균주를선택함. - Nutrient 액체배지에순수배양된균체를각각접종하여 16시간 25 에서진탕배양시킴. - 배양액을고체배지 (nutrient agar) 에 50μl 씩일정하게도말한후디스크의중심간간격이최소 20 mm이상이되도록배지위에디스크를배치시킴. 접종된배지는 25 에서 16시간이상정체배양시킴. 평판배지를 25 에서 16-18시간동안배양하여육안으로완전히억제된곳까지만mm단위로생장억지환직경을평판배지에서측정 2.7. 항생제내성균동정 - colony PCR 증폭반응 - 36 -
: 16S rrna 유전자를증폭하기위한 PCR반응은총 50μl의반응액에 1ul의콜로니현탁액과 0.2μM의 16S rrna primer(frank 등, 2008) 인 27F와 1492R universal primer (Cosmogenetech, Korea), 그리고 25μl의 Dr. Taq mastermix(2x) with dye (doctor protein, Korea) 를첨가하여진행하였다. PCR은 95 에서 10분간의 boiling 후에, 95 에서 30초간 denaturation, 각 primer의 annealing 온도에해당하는 55 에서 30초, 72 에서 1분 30초씩 30회증폭후, 최종 extension을 72 에서 7분간실시하였다. PCR은 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystem, USA) 를이용하여수행하였다. Primer Sequence (5 3 ) Tm( ) Amplicon 27 F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 55.47 1492 R GGC TAC CTT GTT ACG ACT T 50.48 1465 bp - 염기서열결정및분석 : PCR 산물은 PCR DNA Purification kit (Doctor protein, Korea) 를이용하여정제하였고, 염기서열분석을위하여정제된 PCR 산물을 cosmogenetech (Seoul, Korea) 에의뢰하였다. 염기서열결정은 27F primer를이용하여 Sanger 방법으로진행하였다. - 염기서열분석 : 결정된염기서열중에서 16S rrna 유전자의 V1 V4 (variable region) 지역을포함하는약 700bp의염기서열 (Claesson 등, 2010) 을가지고배양이가능한미생물의분류학적정보를제공하는 EzTaxon-e database (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) 를이용하여항생제내성균을동정하였다. 16S rrna 유전자사이의유사도분석과분자생물학적계통도의제작은 DNAstar 프로그램과 MEGA5 프로그램을이용하여수행하였다. - 37 -
< 그림 29> 16S rrna 유전자를이용한항생제내성균동정방법 - 38 -
< 표 8> 항생제감수성검사에사용된항생제의종류및계열 계열 항생제 농도 Glycopeptide Vancomycin 5 μg Glycopeptide Vancomycin 30 μg Penicillin Penicillin G 1 IU 1 Penicillin Penicillin G 2 IU 1 Penicillin Penicillin G 10 IU 1 Penicillin Ampicillin 2 μg Penicillin Ampicillin 10 μg Lincosamide Lincomycin 2 μg Lincosamide Lincomycin 15 μg Lincosamide Clindamycin 2 μg Tetracycline Tetracycline 30 μg Aminoglycoside Gentamicin 10 μg Aminoglycoside Gentamicin 30 μg Aminoglycoside Gentamicin 120 μg Aminoglycoside Kanamycin 30 μg Macrolide Erythromycin 15 μg Macrolide Tylosin 30 μg Cephalosporin Cephalexin 30 μg Sulfonamide Sulfamethoxazole 50 μg Sulfonamide Trimethoprim 2.5 μg Sulfonamide Trimethoprim 5 μg Quinolone Ciprofloxacin 5 μg 1, International Unit: 0.0005988 mg 의 penicillin G 에의 한활성 (Humphrey 등, 1953) - 39 -
2.8. 항생제내성전이율조사 - 실험에사용된하천수는만경강에서채수하였고, 토양은상토 ( 도우미, 서울바이오 ) 를사용하였으며두시료모두 121 에서 15분간멸균하여사용하였다. 상토의주요배합소재는코크피트 65~70%, 피트모스 8~12%, 질석 10~14%, 제올라이트 3~5%, 펄라이트 5~8%, 수용성비료로구성되었다. 녹색형광단백질발현-Enterobacter인 2-4 균주와대상균주콜로니를각 125ml flask에있는 30ml LB broth에접종한후, 25 에서 200 rpm으로 14 시간동안 overnight 배양한다. 각균주배양액을 2 ml 씩취하여 2 ml tube에옮긴후 4,000 rpm에서 5분간원심분리하여균을얻고 1X PBS 버퍼 1ml로현탁하여세포를세척하였다. 현탁액은 O.D. 600 =0.8이되도록 1X PBS 버퍼로희석하였다. O.D. 600 =0.8인균주현탁액 2ml을얻어 4,000 rpm, 5분간원심분리후, 상등액을제거하고동일버퍼 0.5ml에두균주를현탁하여 4.5ml 하천수와 5g 토양에접종하였다. 하천수와토양은최종농도가 0.1μg/ml이되도록트리메소프림을첨가하여미리준비하였다. 토양의경우수분공급을위해멸균된증류수 1ml을추가로첨가하였다. 균주를처리한하천수와토양은 25 에서정체배양하였고, 이를 24h, 48h, 72h, 96h 마다 0.5g(ml) 씩채취하여 1X PBS 버퍼에연속희석하여트리메소프림 (10μg/ml) 과젠타마이신 (50μg/ml) 이첨가된 LB plate에스프레딩한후, 25 에서배양하여형성되는콜로니들을관찰하였다. 2.9. 항생제농도에따른내성변이율조사 - 젠타마이신에감수성을보이는 Enterobacter(E22) 균주를대상으로실시하였다. E22 균주는 1μg/ml 이하농도의젠타마이신에서성장하는특성을보였으므로 1μg/ml 이하농도를이용하여항생제농도에따른내성변이율을조사하였다. LB배지에서 14시간동안배양한 E22 균주를 0.01, 0.1, 1μg/ml 농도의젠타마이신이포함된 LB배지에 7 10 6 세포를접종하였다. 그리고 24시간, 48 시간후총균주를 LB 고체배지에서조사하였고동시에 50μg/ml 농도의젠타마이신이포함된 LB 고체배지에서내성을보이는콜로니를계수하였다. 대조구로서는항생제가포함되지않은 LB배지를사용하였다. - 40 -
2.10. 통계분석 - 환경시료의이화학적분석의통계분석과항생제내성균의지역별분포및항생제별분포결과를통계분석하기위해 PAST v3.01 프로그램 (http://folk.uio.no/ohammer/past/) 을사용하였다. - 총대장균수를포함한환경시료의이화학적분석결과를이용하여각시료간의유사도를 Neighbour joining clustering방법으로분석하였으며유사도지표 (similarity index) 는 Gower 지표를사용하였고 outgroup root 방식으로유사계통도를도출하였다. - 항생제내성율의지역별및항생제별상관성분석은 PCA(principal components analysis) 방법으로분포도를도출하였다. - EE, MH, NA 배지사이의신뢰도분석을위해 t-검정 (t-test, p value=0.05) 을실시하였다. - 41 -
Ⅲ. 연구결과 1. 이화학적분석 각수질시료로부터이화학적분석을실시한결과는 ( 표 9) 와같다. 수온과 ph는비교적유사한수치를보였으나생물학적오염도를나타내는 BOD의경우익산천과전주천2( 하수방류 ) 수질시료에서 6.9 mg/l와 5.8 mg/l의높은수치를보였다. 이결과는총대장균군분포조사결과와상관관계를나타낸다. 전 주천 2 의경우 2.1 10 4 cfu/ml 의총대장균이존재하여채취된 6 개의하천수중 에서가장많은분포를보였으며익산천도 3.3 10 3 cfu/ml 의총대장균이존재 하여생물학적오염도가높았다. 또한전주천2( 하수방류 ) 시료에서염소이온의검출농도가다른지점에비해 10배이상높은수치를보였는데, 이것은하수처리장으로부터하수를방류하기전염소소독과정에의한것으로추정된다. 이화학적분석과총대장균군분석을바탕으로시료별통계학적상관성을조사한결과, 시료의지역적상관성은보이지않았고생물학적오염도가높았던익산천과전주천2 시료의수질이유사한것으로나타났다 ( 그림30). < 표 9> 하천시료의이화학적분석결과 Sample name 수온 ph 탁도 (NTU) DO (mg/l) TOC (mg/l) BOD (mg/l) NO 3- (mg/l) PO 4 3- (mg/l) Cl - (mg/l) 총대장균군 원주천 20.0 7.6 2.03 7.7 10.00 0.4 3.06 0.375 32.9 1.2E+03 무안 21.0 7.6 41.70 8.0 12.19 1.6 1.34 0.910 99.6 9.0E+02 금호강 21.0 8.3 4.65 9.1 11.08 1.7 9.02 0.068 43.5 7.5E+02 익산천 20.0 7.8 39.30 7.6 15.55 6.9 1.23 1.073 43.8 3.3E+03 전주천 2 21.0 7.1 13.80 4.6 16.60 5.8 1.60 0.752 303.6 2.1E+04 전주천 1 20.0 8.2 7.50 9.4 9.92 2.8 0.74 0.111 15.3 6.0E+02-42 -
< 그림 30> 이화학적분석결과에따른시료별상관성분석 2. 총세균및항생제내성균의분포조사 채취된시료의배양가능한총세균수를조사하기위해영양배지로서 Nutrient agar(na) 배지와항생제감수성조사에서일반적으로사용되는 Muller-Hinton(MH) 배지를사용하였으며 Enterobacteriaecea 에속하는세균을선택배양하기위해 Enterobacteriaecea Enrichment(EE) 배지를사용하였다 ( 그림 31). MH 배지는배양이까다롭지않은세균의항생제감수성검사에일반적으로사용되는배지 (Pollock 등, 1986) 이며 National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS, 2000년 ) 에표준배지로지정이되어있다. 장점으로는항생제감수성검사에서재현성이좋고설폰아마이드, 트리메소프림, 테트라사이클린감수성결과에영향을주는억제제의함량이낮고대부분의병인균 (pathogen) 증식이잘되며이배지를이용한감수성검사자료가존재한다는것이다 (2010 항생제내성균검사표준시험법 ). 또한미생물제제의생균수측정과항생제내성시험을위해서 NA 배지를사용한연구도발표되었다 ( 최정은과이은영, 2009). 이외에도환경중의유기물함량을고려하여저영양성상태의조건을맞추기위해 Luria-Bertani(LB) 배지를희석하여사용하거나 R2A 배지를사용한연구가보고된바있다 ( 박준홍, 2008). 세균을포함한미생물은생물학적다양성으로인해배양배지성분에따라 - 43 -
성장여부가결정된다. 따라서영양배지와저영양배지를포함하여특정배지가환경중미생물의분포조사에적합하다고판단하기는어렵다. 따라서본연구에서는가장일반적으로사용되는상기의 NA 배지와 MH 배지를총세균의배양을위한영양배지로선택하였으며 Enterobacteriaecea에속하는세균의선택배양을위해 EE 배지를사용하였다. 그결과 ( 그림 32 그림 79), 대부분의시료에서항생제가첨가되지않은 NA 배지에서 MH 배지에서보다많은수의총세균이검출되었다 : EE 배지를기준으로무안 (MH 배지 3배, NA 배지 10배 ), 금호강 (MH 배지 3.5배, NA 배지 13.9배 ), 원주천 (MH 배지 2.9배, NA 배지 13.2배 ), 전주천1(MH 배지 2.1배, NA 배지 11.8배 ), 전주천2(MH 배지 8.9배, NA 배지 17.2배 ), 익산천 (MH 배지 17.5배, NA 배지 50.1배 ), 나주 (MH 배지 27.9배, NA 배지 20.3배 ), 장항 (MH 배지 25.4배, NA 배지 40.4배 ). 그리고총대장균수를포함한이화학적분석 ( 표9, 그림30) 에서와마찬가지로생물학적오염도가가장높았던전주천2와익산천시료에서는 EE, MH, NA 배지모두에서타지역하천시료에비해높은총세균수가검출되었다 : 익산천 (EE 배지 ; 무안시료의 15.2배, 금호강시료의 36.2배, 원주천시료의 9.4배, 전주천1 시료의 11배 ), 익산천 (MH 배지 ; 무안시료의 89.1배, 금호강시료의 179.5배, 원주천시료의 57.2배, 전주천1 시료의 9배 ), 익산천 (NA 배지 ; 무안시료의 76.6배, 금호강시료의 131배, 원주천시료의 35.7배, 전주천1 시료의 47배 ), 전주천2(EE 배지 ; 무안시료의 57.5배, 금호강시료의 136.7배, 원주천시료의 35.4배, 전주천1 시료의 41.7배 ), 전주천2(MH 배지 ; 무안시료의 172.1 배, 금호강시료의 346.6배, 원주천시료의 110.5배, 전주천1 시료의 175.7배 ), 전주천2(NA 배지 ; 무안시료의 99배, 금호강시료의 169.3배, 원주천시료의 46.1배, 전주천1 시료의 60.8배 ). < 그림 31> 항생제내성세균의검출및분리. 좌, Nutrient agar 배지 ; 중, Muller-Hinton 배지 ; 우, Enterobacteriaecea Enrichment 배지 - 44 -
< 그림 32> 항생제내성균수 (cfu/ml): 원주천, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 < 그림 33> 항생제내성률 (%): 원주천, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 - 45 -
< 그림 34> 항생제내성균수 (cfu/ml): 원주천, Muller Hinton 배지 < 그림 35> 항생제내성률 (%): 원주천, Muller Hinton 배지 - 46 -
< 그림 36> 항생제내성균수 (cfu/ml): 원주천, Nutrient agar 배지 < 그림 37> 항생제내성률 (%): 원주천, Nutrient agar 배지 - 47 -
< 그림 38> 항생제내성균수 (cfu/ml): 무안, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 < 그림 39> 항생제내성률 (%): 무안, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 - 48 -
< 그림 40> 항생제내성균수 (cfu/ml): 무안, Muller Hinton 배지 < 그림 41> 항생제내성률 (%): 무안, Muller Hinton 배지 - 49 -
< 그림 42> 항생제내성균수 (cfu/ml): 무안, Nutrient agar 배지 < 그림 43> 항생제내성률 (%): 무안, Nutrient agar 배지 - 50 -
< 그림 44> 항생제내성균수 (cfu/ml): 금호강, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 < 그림 45> 항생제내성률 (%): 금호강, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 - 51 -
< 그림 46> 항생제내성균수 (cfu/ml): 금호강, Muller Hinton 배지 < 그림 47> 항생제내성률 (%): 금호강, Muller Hinton 배지 - 52 -
< 그림 48> 항생제내성균수 (cfu/ml): 금호강, Nutrient agar 배지 < 그림 49> 항생제내성률 (%): 금호강, Nutrient agar 배지 - 53 -
< 그림 50> 항생제내성균수 (cfu/ml): 익산천, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 < 그림 51> 항생제내성률 (%): 익산천, Enterobacteriaceae Enrichment 배지 - 54 -
< 그림 52> 항생제내성균수 (cfu/ml): 익산천, Muller Hinton 배지 < 그림 53> 항생제내성률 (%): 익산천, Muller Hinton 배지 - 55 -
< 그림 54> 항생제내성균수 (cfu/ml): 익산천, Nutrient agar 배지 < 그림 55> 항생제내성률 (%): 익산천, Nutrient agar 배지 - 56 -
< 그림 56> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 하수처리방류 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 < 그림 57> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 하수처리방류 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 - 57 -
< 그림 58> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 하수처리방류 ), Muller Hinton 배지 < 그림 59> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 하수처리방류 ), Muller Hinton 배지 - 58 -
< 그림 60> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 하수처리방류 ), Nutrient agar 배지 < 그림 61> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 하수처리방류 ), Nutrient agar 배지 - 59 -
< 그림 62> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 < 그림 63> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 병원하수처리방류 ),Enterobacteriaceae Enrichment 배지 - 60 -
< 그림 64> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Muller Hinton 배지 < 그림 65> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Muller Hinton 배지 - 61 -
< 그림 66> 항생제내성균수 (cfu/ml): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Nutrient agar 배지 < 그림 67> 항생제내성률 (%): 전주천 ( 병원하수처리방류 ), Nutrient agar 배지 - 62 -
< 그림 68> 항생제내성균수 (cfu/ml): 장항송림 ( 토양 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 < 그림 69> 항생제내성률 (%): 장항송림 ( 토양 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 - 63 -
< 그림 70> 항생제내성균수 (cfu/ml): 장항송림 ( 토양 ), Muller Hinton 배지 < 그림 71> 항생제내성률 (%): 장항송림 ( 토양 ), Muller Hinton 배지 - 64 -
< 그림 72> 항생제내성균수 (cfu/ml): 장항송림 ( 토양 ), Nutrient agar 배지 < 그림 73> 항생제내성률 (%): 장항송림 ( 토양 ), Nutrient agar 배지 - 65 -
< 그림 74> 항생제내성균수 (cfu/ml): 나주남평 ( 토양 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 < 그림 75> 항생제내성률 (%): 나주남평 ( 토양 ), Enterobacteriaceae Enrichment 배지 - 66 -
< 그림 76> 항생제내성균수 (cfu/ml): 나주남평 ( 토양 ), Muller Hinton 배지 < 그림 77> 항생제내성률 (%): 나주남평 ( 토양 ), Muller Hinton 배지 - 67 -
< 그림 78> 항생제내성균수 (cfu/ml): 나주남평 ( 토양 ), Nutrient agar 배지 < 그림 79> 항생제내성률 (%): 나주남평 ( 토양 ), Nutrient agar 배지 - 68 -
이상의항생제내성균의분포를분석한결과, 시료의하천수와토양매질간에배지에따른차이점이나타났다. 하천수의경우, MH 배지에서조사된항생제내성균의항생제내성율이 EE 배지에서조사된항생제내성균의항생제내성율과유사하게나타났다. 그러나토양의경우, MH 배지에서조사된항생제내성균의항생제내성율이 NA 배지에서조사된항생제내성균의항생제내성율과유사하게나타났다. 이것은하천수와토양에서식하는미생물군집의분포가다르다는것을제시한다. 또한영양배지 (NA 배지, MH 배지 ) 를이용하여분석된환경중총세균에비해 EE 배지에서배양된세균의항생제내성율 ( 그림 80) 이높게조사되었다. 사용된 9종의항생제중반코마이신, 암피실린, 린코마이신, 에리스로마이신, 세파렉신에대한내성율이높았으며내성율이높다고알려진테트라사이클린의경우내성율이현저히낮게조사된반면, 내성율이낮다고알려진반코마이신의경우 8개지점평균 50% 의높은내성율을나타내었다. 그러나대부분의그람음성균은균특성상반코마이신에내성을가지고있으므로내성율은약 25% 내외가될것으로예측된다. < 그림 80> 항생제별세균내성률 (EE 배지 ) - 69 -
< 그림 81> 항생제내성율의배지별상관성분석 - 70 -
배지에따른항생제내성율을통계적분산분포로분석한결과는그림 81과같다. 총세균수측정을위해사용된 MH배지와 NA배지사이에서는높은유사도가나타나지않았으나린코마이신과반코마이신내성균의경우에는같은그룹으로서유사도가매우높게나타났다. 반면 EE배지에서높은내성율을보인세파렉신의경우 MH배지와 NA배지에서는내성율이낮게조사되었다. 이러한결과는영양배지의구성성분에따라성장할수있는세균의종류가다르다는것을제시한다. 그리고총세균수측정을위해사용된 MH배지와 NA배지중에서 MH배지에서조사된결과가 EE배지와의연계성이높게나타났다. 높은내성율을보인에리스로마이신의경우, MH배지에서는 EE배지와마찬가지로높은내성율을보이는반코마이신, 린코마이신과유사도를보이는반면, NA배지에서는낮은내성율을보이는테트라사이클린과유사도를보였다. 따라서환경중에존재하는 Enterobacteriaecea 과 (family) 의항생제내성균과비교하기위한총항생제내성균조사를위해서는, 영양배지로서 MH배지가 NA배지보다는적합하다는것을제시한다. 분산분석을검증하기위해배지별항생제내성율의연관성에대한 t-검정을실시한결과는표 10과같다. EE 배지와 MH 배지사이에서는모든항생제에대해 p 값이 0.05보다높게분석됨으로서통계적으로유사하다는것을나타낸다. 반면 EE 배지와 NA 배지사이에서는 4종류의항생제에대한내성율에서만통계적유사값을나타냈다. 이결과들은환경중에존재하는 Enterobacteriaecea 과 의항생제내성균분포조사를위해서는영양배지로서 NA 배지보다 MH 배지의선택이보다적합하다는것을제시한다. 그리고 EE 배지에서조사된항생제내성율과지역적상관관계는발견되지않았다 ( 그림 82). 하지만병원하수처리방류수 ( 전주천1) 에서총세균수는타시료에비해상대적으로낮으나항생제내성율은반코마이신 71.4%, 암피실린 52.9%, 린코마이신 82%, 에리스로마이신 45.7%, 세파렉신 81.3% 로타시료에비해전반적으로높게조사되었다. 따라서병원지점은항생제사용량과의연관성으로인한항생제내성균발생의점오염원일가능성을제시하고있다 ( 그림 32 그림 79). EE 배지이외에 MH 배지와 NA 배지에서조사된지역별항생제내성율의통계적분산분포결과는그림 83과같다. 분산분포에서각지점의항생제내성율이폭넓게분포한다는것은지역간항생제내성율사이에서는상관관계가존재하지않는다는것을의미한다. - 71 -
< 표 10> 각배지별항생제내성율연관성에대한 t- 검정결과 (p value=0.05, 붉은색으로표시된칸의이하값은통계적으로결과가다르다는것을의미함 ) 항생제 배지별 t- 검정결과 EE-MH EE-NA MH-NA Vancomycin 0.12619 0.00013 0.01635 Ampicillin 0.06675 0.00960 0.14397 Lincomycin 0.07223 0.00061 0.00932 Tetracycline 0.41410 0.25344 0.27025 Kanamycin 0.35596 0.06975 0.02125 Erythromycin 0.37179 0.00432 0.00249 Cephalexin 0.64245 0.00039 0.00357 Sulfamethoxazole 0.47793 0.08005 0.05123 Ciprofloxin 0.34588 0.43427 0.08998 < 그림 82> 시료채취지점별항생제내성률 (EE 배지 ) - 72 -
< 그림 83> 항생제내성율의지역별상관성분석 - 73 -
3. 항생제감수성검사 각지점을대상으로 EE 배지에서선발된전체군집락중반코마이신과린코마이신에대해내성을가진균주총 1,360개를선발하여항생제디스크를이용한감수성검사를그림 84와같이실시하였다. 표 8에서와같이사용된 22종의항생제디스크중에서동일종의다른농도디스크로실험을실시한반코마이신, 페니실린 G, 암피실린, 린코마이신, 겐타마이신, 트리메소프림의경우농도에따른감수성차이가보이지않았으므로단일항목으로표시하였다. 그결과 ( 그림85, 86), 11개균주이외의모든균주들이 1개이상의항생제에대해내성을보이는다제내성특징을보여다제내성율이 99.2% 로조사되었다. 그리고 14개의조사대상항생제모두에대해내성을보이는 28개의균주 ( 린코마이신내성 8개, 반코마이신내성 20개 ) 가전주천2( 하수방류 ), 익산천, 장항송림토양에서분리되어그비율이 2% 를차지하였다 ( 표11, 12). 린코마이신내성분리균들에서는 9개의항생제에내성을보이는내성균들이 29.5% 비율로가장우점하였으며 8-10개의항생제에내성을보이는내성균들의분포가 72.9% 를차지하였다. 반코마이신내성분리균들에서는 10개의항생제에내성을보이는내성균들이 33.6% 비율로가장우점하였으며 9-11개의항생제에내성을보이는내성균들의분포가 80.1% 를차지하였다. 총조사대상 1360 균주의 88.7% 가 8종이상의항생제에대해내성을나타낸결과는현재환경중에존재하는항생제내성균의분포실태가지역적상관관계없이매우높다는것을제시한다. < 그림 84> 항생제디스크검사 - 74 -
< 표 11> 각지점별선별된린코마이신내성균주의다제내성항생제 지점 원주천 ( 한강수계 ) 금호강 ( 낙동강수계 ) 무안 ( 영산강수계 ) 익산천 ( 금강수계 ) 전주천2 ( 하수방류 ) 전주천1 ( 병원방류 ) 장항송림 ( 금강유역토양 ) 나주남평 ( 영산강유역토양 ) 다제내성항생제수 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 1 2 1 6 55 22 1 3 2 1 2 10 2 1 7 28 1 1 3 2 3 32 8 2 1 1 3 11 2 4 21 39 1 6 2 1 4 4 13 31 20 4 8 1 1 1 1 3 5 4 18 10 34 2 1 1 6 2 4 3 4 4 9 5 18 7 1 1 1 2 47 23 5 Total cfu 597 < 그림 85> 선발된린코마이신내성균주의다제내성항생제수 - 75 -
< 표 12> 각지점별선별된반코마이신내성균주의다제항생제내성 지점 원주천 ( 한강수계 ) 금호강 ( 낙동강수계 ) 무안 ( 영산강수계 ) 익산천 ( 금강수계 ) 전주천2 ( 하수방류 ) 전주천1 ( 병원방류 ) 장항송림 ( 금강유역토양 ) 나주남평 ( 영산강유역토양 ) 다제내성항생제수 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 6 26 31 33 3 1 5 11 19 28 7 1 1 2 4 8 61 18 2 1 4 4 3 13 42 10 11 12 4 6 14 35 15 18 7 1 1 2 1 9 40 32 10 1 9 11 3 17 52 7 1 12 62 25 Total cfu 763 < 그림 86> 선발된반코마이신내성균주의다제내성항생제수 - 76 -
4. 항생제내성균의동정 내성균동정을위하여다음과같은기준으로분리균들을선별하였다. 반코마이신이포함된 EE 배지에서배양된 763개의내성균에대해반코마이신이외의 13개항생제에대한내성조사결과를분석하였다 ( 표부1-부8). 내성특징이다르게나타나며고체배지상에서군집락의형태와색이다른 159개의세균을선정하였다. 이들에대한분자생물학적동정을실시하기위하여 16S rrna 유전자를 colony PCR 방법으로증폭하여정제한후, 염기서열을결정하였다. 결정된염기서열은 Ez-Taxon-e 데이터베이스에서배양가능한세균들의분류학적정보와비교하여동정하였으며그결과는표부9와같다. 붉은색은 Enterobacteriaceae 과 에속하는균주들을표시한다. 균주들의동정분석에서는조사된 159균주모두데이터베이스와 98% 이상의유사도를보임으로서표에제시된균주의 속 으로분류하였다. 비록 종 명 (species) 도제시되어있지만 16S rrna의부분염기서열만으로 종 명까지동정하는것은오류의가능성이많으므로 속 명까지만분류하는것이유의미하다고판단된다. 최근미생물군집분석에서많이사용되고있는차세대염기서열법 (Next-Generation Sequencing, NGS) 에서도분석기기에따라 V3 또는 V4 지역의염기서열차이로분석을실시하여 속 명까지의분석을실시하고있다 (Frank 등, 2008). 비록 EE 배지에서배양되어분리되었지만균주동정결과, 그림 87와 88 처럼 41% 만 Enterobacteriaceae에속하는균주였으며 30% Pseudomonadaceae, 20% Aeromonadaceae, 3% Neisseriaceae, 2% Rhizobiaceae, 2% Brucellaceae, 1% Shewanellaceae, 1% Xanthomonadaceae로분류되었다. Pseudomonadaceae와 Aeromonadaceae 의두 과 는환경중에가장많이분포한다고알려져있는균주들이다. 시료채취지점별로균주분포를조사한결과 ( 그림 89), 지역과균주분포사이의상관관계는나타나지않았으나매질 ( 토양과하천수 ) 에따라균주분포도에차이를발견할수있었다. 토양시료인나주와장항의시료에서는 Pseudomonadaceae가 92.9% 와 46.7% 로가장우점하는것으로나타난반면, 원주천에서는 Enterobacteriaceae와 Aeromonadaceae가각각 47.6% 씩분포 - 77 -
하였고무안과금호강에서는 Aeromonadaceae가 44.5% 과 41.7% 로우점하였다. 익산천에서는 Enterobacteriaceae와 Pseudomonadaceae가 36% 와 44% 로유사하게분포한반면, 전주천 ( 병원방류수, 하수처리방류수 ) 에서는 Enterobacteriaceae가각각 55.6% 와 77.8% 로우점하였다. Enterobacteriaceae 에속하는 41% 의 66개균주를 속 에따라분류한결과는그림 90, 91과같다. Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Kluyvera, Pantoea, Plesiomonas, Raoultella, Shigella 9개의종으로분류되었으며 Enterobacter 가 49% 로가장많이분포하고있었다. 지역별로는전주천하수처리방류지점 ( 전주천2) 에서 Enterobacteriaceae 에속하는개체수가 42.4% 로가장많이검출되었고이중에서 35.7% 가 Enterobacter 로동정되었다 ( 그림 92). 특히병원성미생물로분류될수있는 Klebsiella 와 Shigella가 21.4%, 17.9% 검출되었다. < 그림 87> 동정된 159 개분리균전체의 과 계열분포도 - 78 -
< 그림 88> 동정된 159 개분리균의계통도 < 그림 89> 동정된 159 개분리균의지역별 과 분포도 - 79 -
< 그림 90> 동정된 66 개 Enterobacteriaceae 균의 속 계열분포도 < 그림 91> 동정된 66 개 Enterobacteriaceae 균의계통도 - 80 -
< 그림 92> 동정된 66 개 Enterobacteriaceae 균의지역별분포도 5. 항생제내성전이율조사 전이율조사를실시하기위해항생제로서트리메소프림과젠타마이신을선정하였다. 항생제농도에따른균성장을알아보고자연속희석된항생제가포함된 LB배지에균주를접종하여 24시간동안 25 에서 180rpm으로진탕배양하였다. 그림 93과표 13 같이녹색형광단백질발현-Enterobacter는 0.1 μ g/ml 이하농도의트리메소프림이함유된배지에서만성장을하였으며대상균주들 (E3, E22, E23, H84) 은 10 μg/ml 농도에서도성장을하였다. 반면녹색형광단백질발현-Enterobacter는 50 μg/ml 농도의젠타마이신이함유된배지에서는성장을하였으나대상균주들 (E3, E22, E23, H84) 은 1 μg/ml 이하농도의젠타마이신이함유된배지에서만성장을하였고 ( 그림 94과표 14, H84 균주를이용한 sublethal test) 대상균주 Escherichia(C12, E45) - 81 -
는 10 μg/ml 이하농도의젠타마이신이함유된배지에서만성장을하였다. 녹색형광단백질발현-Enterobacter는 10 μg/ml 트리메소프림과 50 μ g/ml 젠타마이신에대해각각감수성과내성을보이는반면대상균주로선발된 Enterobacter(E22), Escherichia(C12, E45), Klebsiella(E3, H84), Shigella(E23), Kluyvera(E48) 균주들은 10 μg/ml 트리메소프림과 50 μg/ml 젠타마이신에대해각각내성과감수성을보였다. 따라서대상균주로부터트리메소프림내성유전자가전이되면 10 μg/ml 트리메소프림과 50 μg/ml 젠타마이신에대해모두내성을보이며 UV하에서형광을나타내므로두가지항생제가모두함유된 LB배지에도말하여형성된콜로니수를측정하였다. < 그림 93> 녹색형광단백질발현 -Enterobacter 의트리메소프림에대한농도별 생장 < 표 13> 트리메소프림에대한최소성장저지농도조사 균주 Trimethoprim (ug/ml) 10 5 1 0.1 0.01 0.001 gfp2-4 (Enterobacter) - - - + + + C12 (Escherichia) + + + + + + E3 (Klebsiella) + + + + + + E22 (Enterobacter) + + + + + + E23 (Shigella) + + + + + + E45 (Escherichia) + + + + + + E48 (Kluyvera) + + + + + + H84 (Klebsiella) + + + + + + - 82 -
< 그림 94> Klebsiella(H84) 의젠타마이신에대한농도별생장 < 표 14> 젠타마이신에대한최소성장저지농도조사 균주 Gentamycin (ug/ml) 50 30 10 1 0.1 0.01 0.001 gfp2-4 (Enterobacter) + + + + + + + C12 (Escherichia) - - + + + + + E3 (Klebsiella) - - - + + + + E22 (Enterobacter) - - - + + + + E23 (Shigella) - - - + + + + E45 (Escherichia) - - + + + + + E48 (Kluyvera) - - - + + + + H84 (Klebsiella) - - - + + + + 환경매질에따른전이율을조사하기위하여하천수는만경강에서채취해멸균후사용하였으며토양은조성비를알고있는상토를구입하여멸균후토양시료로사용하였다. 수용균인녹색형광단백질발현-Enterobacter와공여균인대상균주모두성장에영향을주지않는 0.1 μg/ml 농도의트리메소프림을항생제스트레스인자로하천수와토양에적용시켰다. 두균주들을하천수와토양에접종한후 2일간배양시키며 1일간격으로접합세균수를계수한결과, 7종의대상균주로부터트리메소프림에대한내성이녹색형광단백질발현 -Enterobacter로전이되지않았다 ( 표 15). 이결과는실제환경에서항생제내성균확산의주요인이항생제내성유전자전이보다는잔류항생제에의한돌연변이일가능성을제시해준다. - 83 -