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Kor. J. Microbiol. Biotechnol. Vol. 38, No. 4, 373 378 (2010) 충청지역누룩에서양조용우수곰팡이의탐색및특성 백성열 1 윤혜주 1 최혜선 1 홍승범 2 구본성 3 여수환 1 * 1 농촌진흥청국립농업과학원농식품자원부, 2 농촌진흥청국립농업과학원농업생물부 3 농촌진흥청국립농업과학원농업생명자원부 Screening and Characteristics of Useful Fungi for Brewing from Commercial Nuruk in Chungcheong Provinces. Baek, Seong Yeol 1, Hye Ju Yun 1, Hye Sun Choi 1, Seung-Beom Hong 2, Bon-Sung Koo 3, and Soo-Hwan Yeo 1 *. 1 Department of Agro-food Resource, National Academy of Agricultural Science, RDA, Suwon 441-853, Korea, 2 Department of Agricultural Biology, National Academy of Agricultural Science, RDA, Suwon 441-853, Korea, 3 Department of Agricultural Biotechnology, National Academy of Agricultural Science, RDA, Suwon 441-853, Korea Studies on standardization and quality upgrade of nuruk which is a basic component in brewing are required to increase the quality level of Korean traditional rice wines and to develop the technology for practical use of it. It is important to isolate best strains, to improve the properties and effectively preserve them for brewing industry. In this study, 16 commercial nuruk samples were obtained from the commercial markets located in Chungcheong areas in Korea. 174 fungal strains were isolated from the samples on DG18 medium using a dilution plating method and then screened for enzyme activity and acid production. The active strains were identified based on the morphological characteristics and ITS sequence analysis. Out of 174 strains, 12 strains showed high amylase activity. Especially, Rhizopus sp. CN084, CN174, Aspergillus sp. CN161 and Mycocladus sp. CN042 showed high saccharogenic power and dextrinogenic enzyme activity on cooked wheat bran medium. On the other hand, Aspergillus sp. CN010, CN161, Rhizopus sp. CN105, CN168 and Rhizomucor sp. CN088 produced high acid production on the same medium. Our results showed that the active strains may be used as microbial sources for nuruk starter with good quality in brewing. Key words: Nuruk, fungi, enzyme activity, preservation, ITS sequence, PCR 서 최근막걸리의국내소비뿐만아니라해외수출도크게늘어나고있는상황에서우리술인막걸리제조방법이한국적이지않다는지적이제기되고있다 [3]. 오늘날, 약 탁주제조에사용하는발효제는우리고유의전통누룩임에도불구하고일본에서개발한입국과양조용종균을수입하여우리술을제조하고있는현실이다. 이문제를해결하기위해, 정부에서는우리술산업경쟁력강화방안의일환으로전통누룩에서우수양조미생물을발굴 보존하여우리술의품질고급화에노력하고있다 [2]. 전통누룩은고온다습한여름철에자연적으로곡물 ( 밀 ) 에생육하는다양한미생물군 ( 곰팡이, 효모및유산균 ) 을이용하여제조한것으로, 주로밀을원료로만들어지며저온에서장기간에걸쳐다양한미생물군에의해발효되며, 지역에따라옥수수, 보리, 대두, 귀리, 조및백미등의잡곡류 론 *Corresponding author Tel: 82-31-299-0580, Fax: 82-31-299-0554 E-mail: yeobio@korea.kr 가사용되기도한다 [12, 18]. 또한, 누룩곰팡이의전분분해효소작용으로당화효소제로서의역할뿐만아니라효모증식으로알코올을생산하는역할까지수행하는병행복발효로전통발효주에향과맛을낸다 [13]. 누룩미생물연구는누룩에서분리한황곡균의특성 [17, 22], 누룩미생물의문헌적고찰 [23, 24], 한국전통누룩에서분리한유용곰팡이의특성 [11], 한국재래식누룩중의곰팡이의분리및동정 [8], 소곡주공장의공기로부터곰팡이의분리및동정 [19], 효모연구는누룩으로부터분리한야생형효모의청주제조가능성에관한연구 [10], 전통누룩에서분리된 Saccharomyces cerevisiae HA3 을이용한하향주의제조및특성 [9] 등여러연구가보고되고있으나분리균주보존관리가미흡하고, 산업적활용성이낮은상태이다. 농가에서전통방식으로제조한누룩에서곰팡이, 효모및유산균등다양한균총의존재로생산된누룩또한비위생적이고역가가낮은제품들이시중에유통되고있다. 이와같은문제점을해결하기위해, 전통누룩제조법의현대화및품질표준화에대한체계적인연구가절실히요구되고있다. 본연구에서는전통주의품질향상을위하여충청지역누

374 BAEK et al. 룩에서생육하는우수균주를분리 선발하고, 이들균주의미생물학적특성등을검토하였다. 재료및방법 전통누룩의수집충청권역인아산시외 7 개시 군의재래시장에서시판되는누룩과농가에서직접제조한누룩 16 점을수집하였다 (Table 1). Table 1. Collection of commercial Nuruk in Chungchoeng provinces. Sample No. Collected place Form Size (mm) Weight (g) 1 Asan-si 1 Powder - 112 2 Asan-si 2 Powder - 130 3 Asan-si 3 Powder - 1,104 4 Cheongju-si Tube - 782 5 Boeun-gun 1 Round Ø198 35 862 6 Boeun-gun 2 Round Ø186 32 764 7 Jincheon-gun 1 Powder - 486 8 Jincheon-gun 2 Round Ø160 55 823 9 Boeun-gun 3 Powder - 248 10 Chungju-si Round Ø175 53 968 11 Seocheon-gun Round Ø270 34 1,672 12 Gongju-si 1 Round Ø188 39 909 13 Gongju-si 2 Round Ø160 55 726 14 Gongju-si 3 Powder - 93 15 Gongju-si 4 Powder - 132 16 Dangjin-gun Powder - 891 우수곰팡이탐색및분리충청권에서수집한전통누룩 16점을분리원으로사용하였으며, 균분리는직접분리와희석평판분리두가지방법을사용하였다. 균분리는누룩표면의서로다른균을 needle로 Malt extract agar (MEA: Malt extract 3%, Mycological peptone 0.5%, Agar 1.5%) 배지에접종하여 25 o C에서 5일동안배양하여서로다른균사를순수분리하였다. 분쇄한누룩 10 g을 0.1% peptone 90 ml에현탁한후, 단계적으로 10-2 ~10-7 배로희석하였다. 희석액 100 µl를분리용평판배지에도말하여 25 o C에서 5일간배양한후, 나타난곰팡이 colony를순수분리하였다. Dichloran-glycerol agar(dg18 : Peptone 0.5%, Glucose 1%, KH 2 PO 4 0.1%, MgSO 4 7H 2 O 0.05%, Dichloran (0.2% in ethanol) 1.0 ml, Chloramphenicol 0.01%, Agar 1.5%) 배지와 Dichloran rose bengal chloramphenicol agar(drbc: Peptone 0.5%, Glucose 1%, KH 2 PO 4 0.1%, MgSO 4 7H 2 O 0.05%, Dichloran (0.2% in ethanol) 1.0 ml, Rose bengal 0.0025%, Chloramphenicol 0.01%, Agar 1.5%) 배지를사용하였다. 분리균의배양분리한곰팡이균주는 MEA 사면배지에보존하였으며, 배양은멸균수 3.5 ml 를첨가한호화밀기울 10 g 에포자현탁액 (1.0 10 9 spores/ml) 300 µl 를각각접종하여 25 o C 에서 5~7 일배양하였다. 분리균의형태학적특성순수분리한균주는 MEA, PDA 또는 OA배지등에접종하여 25 o C에서 10일간배양한후, 균총의형태와색상, 균사의특징등을관찰하였고미세구조는광학현미경 (Karl Zeiss, Axioskop A2) 을사용하여균사및포자의형태등을관찰하였다. 분리균의형태적동정은 The Identification of Fungi(Dugan, 2006)[20], Identification of common Aspergillus species(klich, 2002)[15], Introduction to Food-and Airborne Fungi Seventh Edition(Samson et al., 2004)[7] 및 Atlas of Clinical Fungi(de Hoog et al., 2000)[6] 등의서적을참조로하였다. 게놈 DNA 분리순수분리된균주들을 MEB 배지에균을접종한후 25 o C 에서 5일간진탕배양하여균사체를수확하였다. 1.5 ml microtube에수확한균사체를넣고동결건조하여마쇄한뒤 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany; 69106) 를사용하여 genomic DNA를추출하였다. PCR 증폭과 ITS rdna 염기서열분석 Nuclear rdna 상에존재하는 ITS1-5.8S-ITS2 rdna 의 PCR 증폭을위해, univeral primer pairs 는 ITS1F-ITS4 primer[14] 를사용하였다. PCR 조건은 95 o C 에서 predenaturation 4 분후에 95 o C 에서 denaturation 1 분, 58 o C 에서 annealing 1 분, 72 o C 에서 extension 2 분을설정하여 35 회반복하고최종 72 o C 에서 7 분간 extension 하여약 530~640 bp 의밴드를증폭시켰다. PCR 산물의염기서열분석은 Solutions for Generic Technologies (Solgent) Co. Ltd. 에의뢰하였다. 계통도분석해독한염기서열은 Lasergene 사의 DNASTAR pro software (SeqMan Pro v7.0) 를이용하여 NJ 방법 (MEGA v4.0) 으로 ITS 영역의계통수를작성하였으며 1,000 회의 bootstrap 분석을통해신뢰도를평가하였다 [16]. 충청지역누룩에서분리한균주의분류적위치를검토하기위해, NCBI GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 의염기서열을획득한후, 분리균과의 similarity 를분석하였다.

SCREENING AND CHARACTERISTICS OF FUNGI FROM NURUK 375 조효소액조제액화력 (Dextrinogenic activity units, DU) 측정은배양체 2 g 을 40 mm Na acetate buffer (ph 5.0) 10 ml 에현탁하여 25 o C 에서 1 시간진탕시킨후, 8,000 rpm 에서 10 분간원심분리한상등액을조효소액으로사용하였다. 당화력 (Saccharogenic power, SP) 측정은배양체 1 g 을 1% NaCl 용액 20 ml 에현탁하여 30 o C 에서 3 시간추출한상등액을사용하였다. 효소활성측정액화력 (DU) 은 40 o C 에서 5 분간예열한 1% 가용성전분용액 (0.4 M Na acetate buffer, ph 5.0) 2 ml 를기질용액으로희석효소액 0.1 ml 를넣고 40 o C 에서 30 분간반응시킨후, 효소반응액 0.1 ml 에 0.00025 N 요오드용액 (0.0025 N KI) 10 ml 를가하여 670 nm 에서투과도 (T%) 를측정하여 Wohlgemuth value 으로산출하였다 [21]. 당화력은 2% 가용성전분용액을기질로하여국세청주류분석규정 [22] 및일본국세청주류분석규정 [1] 에따른 glucoamylase 활성을측정하여비교하였다. 당화력은기질용액을 55 o C 에서 1 시간효소반응시킨후, 생성된환원당의양을 Lane-Eynone 법 [5] 으로측정하여기질의당화율이 15% 되는범위에서당화율에희석배수를곱하여산출하였다. 액화력및당화력의단위는누룩혹은배양체 1 g 의활성으로표시하였으며, 각 sample 은 3 회측정한평균값으로표기하였다. 산생성능분석배양체 1 g 을 1% NaCl 20 ml 에현탁한후, 그상등액을 ph meter 로측정하였고, 총산의측정은현탁액 10 ml 에대해 0.1% phenolphthalein 용액 2~3 방울을떨어뜨려 0.1N NaOH 로선홍색이될때까지적정하였다. 결과및고찰 수집누룩의특성본실험에사용한누룩은충청지역 7 개시군의재래시장과농가에서직접제조한누룩 16 점을수집하여사용하였다. 수집누룩의형태는 Table 1 에서와같이대부분이원형과분쇄형으로시판되고있었으며, 원형누룩은지름이 160 mm 에서 270 mm, 두께는 32 mm 에서 55 mm 로지역에따라크기가다양하였다. 특히, 누룩의크기와두께는발효시영향을미치는데지름이짧거나두께가얇으면수분이빨리발산되어누룩곰팡이및효모생육이충분히이루어지지않아좋은누룩을만들수없다. 제대로발효가안된누룩으로술을빚었을때향미가좋지못하다. 또한두께가너무두꺼우면발효시수분발산이원활하지않아품온조절이어려울뿐만아니라제조된누룩의내부는진한갈색으로썩게되어고품질의좋은누룩을만들수없다 [4]. Table 2. General characterization of commercial Nuruk in Chungchoeng provinces. Sample No. ph Acidity (0.1 N NaOH ml/10 ml) Amino acidity SP (units/g) 1 6.6 0.5 2.5 138 2 6.7 0.4 2.5 293 3 6.8 0.4 3.5 73 4 6.0 1.8 2.5 1,160 5 6.4 0.4 0.4 320 6 6.7 0.3 1.9 155 7 6.1 0.7 2.8 198 8 4.8 2.8 2.8 93 9 6.5 0.4 0.7 148 10 6.2 0.3 0.7 348 11 6.2 0.4 0.6 120 12 6.5 0.2 0.5 340 13 6.3 0.5 2.8 328 14 6.9 0.6 2.3 240 15 7.0 0.4 2.3 113 16 6.7 0.9 3.5 230 Symbols : 1 Asan-si 1, 2 Asan-si 2, 3 Asan-si 3, 4 Cheongju-si, 5 Boeun-gun 1, 6 Boeun-gun 2, 7 Jincheon-gun 1, 8 Jincheon-gun 2, 9 Boeun-gun 3, 10 Chungju-si, 11 Seocheon-gun, 12 Gongju-si 1, 13 Gongju-si 2, 14 Gongju-si 3, 15 Gongju-si 4, 16 Dangjin-gun SP : Saccharogenic power by Lane-Eynone. 수집누룩의일반성분및효소학적특성을 Table 2 에나타내었다. 누룩추출물 ph 는대체로 6~7 로누룩간의차이는없었으며, 산도는대체로 0.2~0.9 정도이나, 청주와진천군 2 에서수집한누룩의산도는 1.8 과 2.8 로높았다. 당화력의경우, 청주에서수집한누룩이외는대체로효소활성이낮았으나, 그중에보은 1, 충주, 공주 1, 2 누룩의당화력는 320 에서 348 로높았다. 4 번청주누룩은외형이튜브형태로당화력이높은점으로보아개량누룩으로판단되어본실험에서제외하였으며, 그외누룩은대부분당화력이낮아제품의품질표준화가요구된다. 분리곰팡의속 (Genus) 동정시판누룩에서분리한균주들을 PDA, MEA 및 OA 배지상에서형태를현미경으로관찰한결과, 일반적으로공기중에높은빈도로존재하는 Aspergillus 와 Rhizopus 속의곰팡이가대부분이었다. 이들균주를대상으로분자생태학적동정을실시하였다. 분리균의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역염기서열을분석하였다. 액화력이우수한균주 (CN084, CN105, CN168 및 CN174) 는계통도에서 Rhizopus sp., CN088 은 Rhizomucor sp., CN032 와 CN042 는 Mycocladus sp. 에위치하였고, CN010, CN041, CN098 및 CN161 은 Aspergillus sp. 으로분류되었다 (Fig. 1). 보다정확한동정을위해, 향후 β-tublin 과 elongation 1-α 등유전자분석과 18S rdna 및 23S rdna 분석이병행되어야할것이다.

376 BAEK et al. Fig 1. Phylogenetic tree of fungi isolated from commercial Nuruk. The tree was constructed from NJ analysis of ITS sequence. The numbers above the nodes represent bootstrap values (out of 1,000 bootstrap replication). 분리균주의효소학적특성충청지역시판누룩에서분리한사상균을대상으로 1 차적으로 amylase 활성이우수한 12 균주를선발하였다 (data not shown). 이들균주의액화력과당화력등의효소활성을 Table 3 에나타내었다. 분리균주의액화력을분석한결과, Rhizopus sp. 3 균주 (CN073, CN084, CN174), Aspergillus sp. 2 균주 (CN041, CN161) 와 Mycocladus sp. 2 균주 (CN032, CN042) 의액화력이양호하였으며, 당화력은 Rhizopus sp. 3 균주 (CN084, CN105, CN174) 와 Aspergillus sp. 1 균주 (CN161), Mycocladus sp. 1 균주 (CN042) 가양호한결과를보였다 (Table 3). 액화력과당화력이모두우수한균주로서는 Rhizopus sp. 의 CN084, CN174, Aspergillus sp. 의 CN161 와 Mycocladus sp. CN042 로나타났다. Rhizopus sp. CN174 는호화밀기울배지에서액화력과당화력이 382 units 및 2,028 units/g, Aspergillus sp. CN161 은 414 units 및 1,400 units/g, Mycocladus sp. CN042 는 397 units 및 1,480 units/g 의효소활성도를나타내었다. Kim 등 [11] 의연구에서분리균의단일배양에따른액화력및당화력에서액화력은 100~735 units/g, 당화력은 342~ 2,610 units/g 의효소활성보고와본연구결과와유사하였다. 효소활성능이우수한 Rhizopus sp. CN084, CN174, Aspergillus sp. CN161 와 Mycocladus sp. CN042 등 4 균주는 Table 2 의당화력보다우수한것으로보아누룩제조용곰팡 Table 3. Dextrinogenic and saccharogenic activity on single culture of selected high amylase producing fungi. Isolated strains DU (units/g) SP (units/g) CN010 Aspergillus sp. 358 760 CN032 Mycocladus sp. 445 1,160 CN041 Aspergillus sp. 421 1,120 CN042 Mycocladus sp. 397 1,480 CN073 Rhizomucor sp. 394 1,600 CN084 Rhizopus sp. 383 1,960 CN088 Rhizomucor sp. 344 880 CN098 Aspergillus sp. 361 880 CN105 Rhizopus sp. 373 1,680 CN161 Aspergillus sp. 414 1,400 CN168 Rhizopus sp. 414 1,320 CN174 Rhizopus sp. 382 2,028 Symbols : DU; Dextrinogenic activity by Wohlgemuth value, SP; Saccharogenic power by Lane-Eynone Each strain was cultivated at 28 o C for 7 days.

SCREENING AND CHARACTERISTICS OF FUNGI FROM NURUK 377 Table 4. Productivity of acid on single culture of selected high amylase producing fungi. Isolated strains ph Acidity (0.1 N NaOH ml/10 ml) CN010 Aspergillus sp. 3.93 4.71 CN032 Mycocladus sp. 5.82 2.09 CN041 Aspergillus sp. 5.68 2.01 CN042 Mycocladus sp. 6.05 1.71 CN073 Rhizomucor sp. 5.64 2.46 CN084 Rhizopus sp. 5.81 2.35 CN088 Rhizomucor sp. 5.20 2.77 CN098 Aspergillus sp. 5.64 1.83 CN105 Rhizopus sp. 5.50 1.57 CN161 Aspergillus sp. 5.31 2.90 CN168 Rhizopus sp. 5.53 2.50 CN174 Rhizopus sp. 5.64 2.49 주 ), Rhizomucor sp.(2 균주 ), Mycocladus sp.(2 균주 ) 으로동정되었다. 밀기울을사용한고체배양에서액화력, 당화력및산생성능을검토한결과, Rhizopus sp. CN084, CN174, Aspergillus sp. CN161 와 Mycocladus sp. CN042 균주가효소활성이높은것으로나타났으며 Aspergillus sp. CN010, CN161, Rhizopus sp. CN105, CN168 균주와 Rhizomucor sp. CN088 균주는산생성능이우수한것으로나타났다. 따라서이들균주가양조를위한누룩의원료균주로서사용될경우단일누룩제조가가능할것으로판단되었다. 감사의글 본연구는농촌진흥청국가연구개발사업 ( 과제번호 : PJ006764) 의지원에의해이루어진결과의일부로서이에감사드립니다. 이로적합하다고사료된다. 분리균주의산생성능일반적으로누룩을사용하는발효과정에서이상발효및잡균의오염방지를위해, 산생성능이높은곰팡이가필요하다. 충청지역에서분리한 12 균주의산생성능을조사하였다. 시판누룩의 ph 는 6.0~7.0 정도인점을고려할때, Table 4 에서와같이 Aspergillus sp. CN010 과 CN161 균주의산도는각각 4.71, 2.9 이었으며, Rhizopus sp. CN105 와 CN168 균주는 1.57, 2.5, Rhizomucor sp. CN088 균주는 2.77 의산도를나타내었다. Kim 등 [11] 의연구에서산생성능이우수한 Aspergillus sp. 에서는 2.0 에서 8.4 사이, Rhizopus sp. 에서는 5.0 으로보고되어있어몇몇균주를제외하고는본연구결과와유사한경향을나타내었다. 요 우리술의주질개선및현장실용화기술을개발하기위해술담금의기본재료인누룩의규격화및품질향상연구가필요하다. 이와같은요구에부응하기위해, 누룩에생육하는우수양조미생물의분리 발굴, 균주개량및보존관리등우리고유의양조미생물자원을확보하고활용함으로써다양한종류의누룩제조가가능할것으로여겨진다. 따라서, 본연구는충청지역에서시판되고있는누룩을수집하여희석평판배양법으로 174 개균주를분리하여효소활성검정을통하여효소활성이높은균주를다수분리하였다. 분리된곰팡이를대상으로액화력및당화력등의효소학적특성을조사하였고, 선발된활성균주의동정을위해 genomic DNA 상의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 부위의염기서열을분석한결과 Aspergillus sp.(4 균주 ), Rhizopus sp.(4 균 약 REFERENCES 1. 국세청기술연구소. 2008. 주류분석규정 (7 차개정 ), 서울, pp. 12-15. 2. 김종실. 2009. 우리술산업경쟁력강화방안. 전통주산업진흥및명품화전략을위한세미나. 한국전통주진흥협회. pp. 5-24. 3. 박록담. 2009. 만인의술이라야. 전통주산업진흥및명품화전략을위한세미나. 한국전통주진흥협회. pp. 25-33. 4. 박록담, 전경례, 안계희, 심유미, 김소현, 김유미, 최원. 2005. 한국의전통명주 4 버선발로디딘누룩. 코리아쇼케이스. pp. 26-28. 5. 주현규, 조광연, 박충균, 조규성, 채수규, 마상조. 1995. 식품분석법. pp. 290-293. 6. de Hoog, G., S. J. Guarro, J. Gene, and M. J. Figueras. 2000. Atlas of clinical fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands. 7. Dugan, F. M. 2006. The Identification of fungi; an illustrated introduction with keys, glossary and guide to literature. APS Press, St. Paul. Minnesota, U.S.A. 8. Jo, G. Y. and C. W. Lee. 1997. Isolation and identification of the fungi from Nuruk. J. Korean Soc. Food Nutr. 26: 759-766 9. Jung, H. K., C. D. Park, H. H. Park, G. D. Lee, I. S. Lee, and J. H. Hong. 2006. Manufacturing and characteristics of Korean traditional liquor, Hahyangju prepared by Saccharomyces cerevisiae HA3 isolated from traditional Nuruk. Korean. J. Food Sci. Technol. 38: 659-667 10. Kim, H. S., J. S. Hyun, J. Kim, H. P. Ha, and T. S. Yu. 1997. Characteristics of useful fungi isolated from traditional Korean Nuruk. J. Korean Soc. Food Nutr. 26: 767-774 11. Kim, I. H. and W. S. Park. 1996. Comparison of fermentation characteristics of Korean traditional alcoholic beverage with different input step and treatment of rice and Nuruk Korean-style bran koji. Korean J. Dietary Culture. 11: 339-348 12. Kim, M. J. 2002. The study about traditional Nuruk. Korean,

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