동의생리병리학회지제 22 권 6 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(6):1444 1448, 2008 라벤더에탄올추출물이 α-msh 유도멜라닌생성에미치는효과 김호민 장영미 한규수 문대원 문연자 1 우원홍 2 * 원광대학교한의학전문대학원한약자원개발학과, 1 : 원광대학교한의과대학해부학교실, 2 : 원광대학교한국전통의학연구소 Effect of the Ethanol Extract from Lavandula vera on α-msh Induced Melanogenesis Ho Min Kim, Yeong Mi Jang, Kyu Soo Han, Dea Won Moon, Yeun Ja Mun 1, Won Hong Woo 2 * Department of Herbal Resources, Professional Graduate School of Oriental Medicine, 1:Department of Anatomy, College of Oriental Medicine, 2:Research Center of Traditional Korean Medicine, Wonkwang University Down-regulation of melanin synthesis is required for recovery of pigmentary disorders and it is well known that α-msh induced melanin synthesis and dendrite outgrowth on melanocytes. This study was conducted to evaluate the depigmenting properties of ethanol extract from a Lavandula vera. The ethanol extract from Lavandula vera inhibited melanin contents and tyrosinase activity in a dose-dependent manner, compared with untreated group. Treatment of the ethanol extract of Lavandula vera effectively suppressed the α-msh-stimulated melanin formation, tyrosinase activity and dendrite outgrowth. Moreover, the α-msh-induced mrna expression of tyrosinase was significantly attenuated by Lavandula vera treatment. These results suggest that Lavandula vera exerts its depigmenting effects through the suppression of tyrosinase and cytoplasmic dendricity. And it may be a potent depigmetation agent in hyperpigmentation condition. Key words : Lavandula vera, melanin, tyrosinase, α-msh 서론 라벤더는 Lavandula( 라벤더 ) 속 Labiatae( 꿀풀 ) 과로학명은 Lavandula dentata Vera이며, 소염, 살균, 세포성장촉진, 반흔형성, 소독, 피지분비조절의작용으로여드름, 습진, 일광화상에좋은효과가있어서향기요법에서많이응용하는약재이다 1,2). 라벤더는상처치유를촉진시키고흉터를적게남길목적으로사용되어왔으며, 역학조사에서피부소양증, 피부염, 습진등과같은피부질환의증상을완화시키는데효과가있는것으로확인되었다 3). 또한라벤더를피부에국소도포하면알레르기전달통로를부분적으로억제하는효과가있으며, 마우스의피부에국소도포및피하주사후라벤더의농도증가에따라비만세포에의한귀의종창반응의억제효과가큰것으로확인되었다 4). * 교신저자 : 우원홍, 익산시신용동 344-2 원광대학교한의학전문대학원 E-mail : whwoo@wku.ac.kr, Tel : 063-850-6845 접수 : 2008/10/17 수정 : 2008/11/17 채택 : 2008/12/03 디지털카메라와 HD 방송이발전하면서개인의가치를중요시하는현대사회에서는남녀를불문하고외적심미를추구하는미용에대한관심이높아지고있다. 잡티없는새하얀피부를선호하는추세로활발히진행되고있는피부미백작용에대한연구는세포독성이적으면서멜라닌합성을감소시키고동시에 non-mutagenic한피부미백제를찾기위한방향으로진행되고있으며이러한물질의원료로사용할수있는천연물질에대한관심은점차증가되고있는실정이다 5,6). 멜라닌은표피기저층에존재하는멜라닌세포의멜라닌소체 (melanosome) 에서합성되어수지상돌기를통하여표피의각질형성세포로이동되어피부의색을나타내고, 자외선이나외부자극물질들로부터피부를보호하는긍정적인기능이있는반면, 과도한색소침착은기미와주근깨를형성하고피부노화를촉진하는등미용적인면에서부정적인기능을나타내기도한다 7,8). 현재까지멜라닌합성억제효과가알려진물질로는 4-hydroxyanisole, 5-hydroxyindole, hydroquinone와 kojic acid, - 1444 -
라벤더에탄올추출물이 α-msh 유도멜라닌생성에미치는효과 arbutin, oxyresveratrol 등이있으며, 그외에도 stilbene계화합물인 α-viniferin, isoflavonoid류인 ferulic acid가알려져있다 6,7). 이밖에도감초 9,10), 더덕 11), 천화분 12), 백출 13), 사삼 14) 등의식물추출물이멜라닌합성억제효능이있다고보고되었다. 이에저자들은예로부터피부미용과피부질환의치료에이용되어온라벤더의멜라닌합성에미치는영향을알아보고자 B16/F10 세포를이용하여멜라닌자극호르몬인 α-melanocyte stimulating hormone(α-msh) 를처리하여과색소현상을유도한후, 라벤더에탄올추출물의 tyrosinase 활성과멜라닌합성에미치는영향을조사하였다. 재료및방법 1. 시료라벤더는자연사랑영농조합에서구입하였으며 100 g에 ethanol 1 l를가하고밀봉하여 6 시간동안실온에서냉침시킨후거즈로여과하여 1차적으로침전물을걸러내었다. 원심분리를통하여 2차적으로침전물과추출액을분리한후감압농축기 (rotary evaporator) 로상온에서농축하여 14.86 g( 수득률 : 14.86%) 의시료를얻어냉장보관하였으며, 시료는 DMSO에녹여사용하였다. 멜라닌정량은 Hosei 16) 등의방법을변형하여사용하였다. B16/F10 세포를직경 10 cm배양용기에 3 10 5 개씩분주하여부착시킨후, 시료를처리하여 3일동안배양하고각군당 5 10 6 개의세포를수거하여멜라닌을측정하였다. Lysis buffer[5 mm EDTA, 0.1 M sodium phosphate buffer(ph 6.8), 1% triton X-100] 로세포를용해하고원심분리하여얻은세포침전물에알코올을가하여세척한후건조시켰다. 10% DMSO가첨가된 1 N NaOH 용액으로 95 에서 1시간동안멜라닌을용해시키고, 405 nm에서흡광도를측정하였다. 한편멜라닌색소는각군당 5 10 6 개의세포를수거하여육안적으로멜라닌세포의색깔을관찰하였다. 5. DOPA 염색 Chamber slide(nunc) 의각 well에 1 10 4 개의세포를분주하여 24시간배양후교맥 50 μg / ml, 100 μg / ml과 α-msh(100 nm) 을각각처리하였다. 72시간배양한후 5% formylsalin 용액으로고정하고, 세척하고 0.1% L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA, Sigma) 을함유한 0.1 M PBS(pH 7.2) 용액으로 4시간동안실온에서반응시켰다. 10% formylsaline으로재고정하고 50%, 70%, 95%, 100% 알콜로탈수시킨다음봉입하여광학현미경으로관찰하였다. 2. 세포주및세포배양 B16/F10 멜라닌세포주는한국세포주은행에서분양받아 10% fetal bovine serum(fbs) 이첨가된 Dulbecco's modified eagle medium(dmem) 을사용하여 CO 2 배양기 (37, 5% CO 2) 에서배양하였다. 3. B16/F10 세포내 tyrosinase 활성측정세포내 tyrosinase 활성은 Matinez-Esparza 등 15) 의방법으로측정하였다. B16/F10 세포를 6 well 배양용기에 5 10 4 개 /well씩분주하여 24시간동안배양하여세포를부착시킨후, 라벤더 (12.5, 25, 50 μg / ml ) 와 α-msh(20 nm) 를각각처리하고 3일간배양하였다. 배양이끝난세포는 PBS로세척하고 lysis buffer[5 mm EDTA, 0.1 M sodium phosphate buffer(ph 7.0), Triton X-100, 0.1M PMSF] 로세포를용해하였다. 4, 13,000 rpm에서 30분간원심분리를하여얻은상층액을 tyrosinase 활성측정용액으로사용하였고, protein assay 용액 (Bio Rad, USA) 으로 595 nm에서흡광도를측정, 동량의단백질양을계산하였다. 시료 50 μl와 0.1M sodium phosphate buffer 150 μl, 0.1 M catechol 50 μl를분주하여혼합한후 ELISA reader로 37 에서 405 nm의파장으로 1시간동안 10분간격으로흡광도의변화를측정하였다. 활성율은대조군의흡광도를기준으로한백분율로환산하여결과로나타내었다. 6. RT-PCR( 역전사중합효소연쇄반응 ) B16F10 세포를 1 10 6 cells/dish 개씩배양용기에부착후시료를처리하였다. 48시간배양후 total RNA는 total RNA extraction kit(intron Biotechnology) 를사용하여추출하였다. cdna는 2 μg의 RNA와 Maxime RT PreMix Oligo dt primer(intron Biotechnology) 를넣고 45 에서 1시간, 95 에서 5분간반응시킨후급랭시켜합성하였다. i-master mix PCR kit(intron) 에합성된 cdna 2 μl와 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 primer를넣은후중합효소연쇄반응을시행하였다. 94 에서 5 분간 1회반응시킨후 94 에서 20초, 55 에서 10초, 72 에서 50초로총 35회반복하였으며최종적으로 72 에서 5분간 1회반응시켰다. 이를 2% agarose gel에전기영동하여정량하였다. Tyrosinase primer의염기서열은 forward ; 5'-CATTTTTGA TTTGAGTGTTCT-3' 이고 reverse ; 5'-TGTGGTAGTCGTCTT TGTCCC-3' 이다. TRP-1 primer의염기서열은 forward ; 5'-CTTTCTCCCTTCCTTACTGG-3' 이고 reverse ; 5'-TGGCTT CATTCTTGGTGCTT-3' 이다. TRP-2 primer의염기서열은 forward ; 5'-TGAGAAGAAACAAAGTAGGCAGAA-3' 이고 reverse ; 5'-CAACCCCAAGAGCAAGACGAAAGC-3' 이다. 그리고 actin primerdml 염기서열은 forward ; 5'-TCAGAA GGACTCCTATGTGG-3' 이고 reverse ; 5'-TCTCTTTGATGTC AGCACG-3' 이다. Tyrosinase 활성율 (%) = 대조물질의흡광도시료가첨가된용액의흡광도 100 7. 통계처리 실험결과는 One way ANOVA test 를이용하여 p-value 를 4. 멜라닌측정및관찰 구하여유의성을검증하였다. - 1445 -
김호민 장영미 한규수 문대원 문연자 우원홍 결과 1. 멜라닌합성억제효과라벤더에탄올추출물을 α-msh 처리군과함께 12.5 μg / ml및 25 μg / ml의농도로 5일동안처리하고, 각군당 1 10 6 개 /dish 를수집한다음멜라닌양을측정하였다. 라벤더처리군은 12.5 μg / ml및 25 μg / ml농도에서 77±0.9%, 65±1.% 로감소하였다. 한편 α-msh 처리군은 209±12.96% 로대조군에비해약 2 배증가하였고, α-msh와라벤더 12.5 μg / ml처리군은 156±4.87% 로, α-msh와라벤더 25 μg / ml처리군은 79±2.12% 로감소하였다 (Fig. 1). tyrosinase 유전자발현을조절할수있다는가능성을제시한다. 따라서라벤더에탄올추출물이이들유전자의발현을조절하는지조사하기위하여유전자증폭기술을응용한역전사중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 방법으로 tyrosinase 유전자의 primer를이용하여 mrna의발현을분석하였다. B16/F10세포에라벤더에탄올추출물을 12.5, 25 μg / ml농도로처리하고 3일간배양후 tyrosinase 유전자발현을측정한결과, tyrosinase 유전자발현은대조군에비하여유의성있는변화를보이지않았다 (Fig. 4). 그러나 α-msh 처리군은대조군에비하여증가하였으며, α-msh와라벤더병용처리군은 α-msh 단일처리군에비하여 tyrosinase mrna의발현이감소하였음을알수있었다 (Fig. 4). Fig. 1. The effect of Lavandula vera and α-msh on melanin contents. Cells were seeded at 1 10 5 cells/dish. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of Lavandula vera and α-msh, and cultured for 5 days. Then, melanin contents were measured as described in Materials and Methods. Data are means ± S.D. of three experiments performed in triplicate. Fig. 2. The effect of Lavandula vera and α-msh on the tyrosinase activity. The effect on tyrosinase activity was tested with various doses of Lavandula vera and α-msh in B16/F10 cells for 3 days. Data are expressed as percent (%) of control and each column represents the mean ± S.D. of at least three experiments performed in triplicate. * p<0.05: compared with control. 2. Tyrosinase 활성도라벤더에탄올추출물이멜라닌합성에미치는영향을조사하기위하여본연구에서는먼저멜라닌합성의속도조절효소로작용하는 tyrosinase의활성을측정하였다. 라벤더추출물처리시 12.5, 25 μg / ml농도에서각각 108%, 80% 로유의하게 tyrosinase의활성이감소하였고, α-msh 처리시 547±4.7 % 로약 5.4배가량 tyrosinase의활성이증가하였다. 라벤더에탄올추출물과 α-msh 병용투여시에는 12.5, 25 μg / ml농도에서각각 527±11.0%, 378±9.61% 로농도의존적으로유의성있게감소하였다 (Fig. 2). Tyrosinase는 tyrosine을기질로하여 DOPA로전환시키는 tyrosine hydroxylase와 DOPA를 DOPA quinone으로전환시키는 DOPA oxidase로서멜라닌합성의처음두단계반응을촉매한다. 따라서 DOPA 염색을이용하여멜라닌세포의 tyrosinase의활성을관찰한결과, α-msh 처리군은대조군에비하여 tyrosinase의활성이현저히증가하였으며, α-msh와라벤더처리군은 α-msh 단일처리군에비하여 tyrosinase의활성이감소하였음을알수있었다 (Fig. 3). 또한수지상돌기는 α-msh 처리군에서현저히증가하였고, 라벤더병용처리군에서현저히감소하였다 (Fig. 3). 3. Tyrosinase 유전자발현라벤더에탄올추출물의멜라닌생성억제효과는이들이 Fig. 3. Observation of tyrosinase activity by DOPA staining after treatment with Lavandula vera and α-msh. Cells were incubated with Lavandula vera and α-msh. After 5 days, cells were stained with DOPA as described in Materials & Methods. Control, α-msh: α-msh 100 nm, α-msh+lv12.5: α-msh+lavandula vera 12.5 μg / ml, α-msh+lv25: α-msh+lavandula vera 25 μg / ml. ( 200) Fig. 4. The Effect of the ethanol extract of Lavandula vera on the tyrosinase mrna gene expression. B16/F10 cells were treated with several concentrations(0, 12.5 and 25 μg / ml ) of ethanol extract of Lavandula vera for 3 days. Representative RT-PCR analysis densitometric quantification. - 1446 -
라벤더에탄올추출물이 α-msh 유도멜라닌생성에미치는효과 고찰 皮毛는인체의가장외부에위치하며피부 ( 皮膚 ), 한선 ( 汗腺 ), 호모 ( 豪毛 ) 로구성되어있다. 피부를구성하는세포하나하나가각각독립된기관을갖고있으면서주변세포및내부장기와상호유기적체계를갖고있어서, 피부질환의치료는피부자체뿐아니라피부와연관이있는내부장기를함께고려할필요가있다. 黃帝內經素問 < 陰陽應象大論 > 17) 에 肺主皮毛 라하였고, 黃帝內徑 素問 五臟生成篇 17) 에 肺之合은皮也이고其榮은毛也이며其主는心也 라고하였고, 黃帝內經素問 < 至眞要大論 > 17) 에는 諸痛痒瘡은皆屬於心 이라해서피부의생리, 병리가心, 肺와밀접한연관이있음을말하였다. 또한 黃帝內經靈樞 本臟篇 > 18) 에서는 衛氣者는所以溫分肉하고充皮膚하고肥腠理하고司開闔者也라고하여피부의영양공급에肺가중요한역할을함을알수있다. 간은혈액을저장하고혈량을조절하는역할을하므로혈액이 潤臟腑하고濡經脈하며養百骸하고充形體하고實腠理하는영양작용도자연히肝과유관하게된다 19). 또한 太陰人面色靑白者는多無燥證하고面色黃赤黑者는多有燥證하니蓋肝熱肺燥而然也 20) 니라하여肝과肺의기능이피부에영향을미침을알수있다. 이외에도피부는체내여러장기와연관되어있기때문에이러한관점에서피부의氣血순환을고려해야한다. 피부는태양광선으로부터인체를보호하기위하여멜라닌세포에서멜라닌을합성하는데, 생성된멜라닌은각질형성세포로이동하며, 일정시간이지나면각질층의탈락과함께밖으로배출된다. 피부색소침착은피부를구성하고있는각질형성세포, 멜라닌세포, 섬유아세포및염증세포의출현, prostaglandin, 여러가지 cytokine, melanocyte stimulating hormone(msh) 의변화등이서로연관되어종합적으로일어나는현상이다 21-24). 본실험에서라벤더의피부생리활성효능을조사하기위하여먼저미백효과를조사한결과, 라벤더 25 μg / ml농도에서 B16/F10 세포의 tyrosinase 효소활성과멜라닌색소가감소되었다. MSH는 pro-opiomelanocortin(pomc) 의유도체로주로뇌하수체에서생성되나피부를포함한체내다른부위에서도생성되는것으로알려져있으며, 특히피부에서는각질형성세포와멜라닌세포에서생성된다. 표피세포중각질형성세포와멜라닌세포는자외선 (UV) 이나 pro-inflammatory cytokine과같은자극에의해 MSH를생성하며 melanocortin receptors 1(MC1R) 과결합하여표피의멜라닌색소의생성뿐만아니라표피세포의성장과증식에관여하고국소조직의면역조절기능에도관여하는것으로알려져있다 25,26). 따라서본실험에서자외선, pro-inflammatory cytokine 및호르몬과같은여러인자에의해멜라닌색소침착이증가된경우, 라벤더의에탄올추출물의효과를조사하기위하여 α-msh 로 B16/F10 세포의멜라닌합성을유도하였다. α-msh는 B16/F10세포의 tyrosinase 활성을촉진시켰으며멜라닌생성도증가시켰고, 라벤더는 α-msh에의해촉진된 tyrosinase 활성과 멜라닌생성을대조군과유사한수준으로감소시켰다. 또한 tyrosinase mrna 발현에미치는영향을조사하기의하여 RT-PCR을수행한결과, 라벤더추출물단일처리군에서대조군에비해유의성있는변화를보이지않았다. 그러나 α -MSH 처리군은대조군에비하여증가하였으며, α-msh와라벤더병용처리군은 α-msh 단일처리군에비하여 tyrosinase mrna의발현이감소하였음을알수있었다. 멜라닌세포는신경능선 (neural crest) 에서유래한세포로서가지돌기 (dendritic process) 를갖고있으며약 30-40개의각질형성세포와연결되어표피-멜라닌단위 (epidermal-melanin unit) 를형성하고있으며, 이돌기를통하여각질형성세포로멜라닌소체가이동된다 27). 따라서멜라닌세포의돌기형성 (dendricity) 과인접한각질형성세포사이의연결은멜라닌소체의수송에중요한역할을하고있으며, 자외선과 α-msh에의해이러한 epidermalmelanin network가확장된다 27,28). 최근멜라닌소체는 kinesin, dynein, myosin V와같은운동단백질 (motor protein) 과 microtubule, actin filament에의하여가지돌기를따라각질형성세포로이동되는것으로알려져있다 29,30). Busca 등 (1998) 31) 은 camp는 Rac과 Rho를통하여 actin의재배열 (disorganization) 을일으키고, 결과적으로멜라닌세포의가지돌기가증가된다고하였다. 본실험에서멜라닌세포의가지돌기형성 (dendricity) 에미치는라벤더에탄올추출물의영향을관찰한결과, α-msh에의하여 B16/F10세포의수지상가지돌기가증가하였으며, 라벤더에탄올추출물은 α-msh에의한수지상가지돌기의형성을억제하였다. 이상의결과라벤더에탄올추출물은멜라닌세포의 tyrosinase 효소활성감소와수지상가지돌기의형성억제를통하여멜라닌의생성을감소시켰으며, α-msh 유도에의한과색소침착시더욱효과적으로미백효능을나타냈다. 따라서라벤더는자외선이나호르몬등에의한멜라닌합성기능항진시더욱효과적으로미백효과가있을것으로사료된다. 결론 라벤더에탄올추출물이멜라닌합성조절기전에미치는영향을조사하고자, B16/F10 세포에 α-msh를처리하여과색소현상을유도한후 tyrosinase 활성과멜라닌합성및 tyrosinase 유전자발현에미치는영향을조사하였다. 라벤더에탄올추출물은 α-msh에의하여촉진된멜라닌의생성과수지상돌기형성을억제하였다. 라벤더에탄올추출물은 α-msh에의하여증가된 tyrosinase 활성도를효과적으로감소시켰다. 라벤더에탄올추출물이 tyrosinase 유전자발현에미치는영향을조사한결과, α-msh와라벤더병용처리군에서 α-msh 단일처리군에비하여 tyrosinase mrna의발현이감소되었다. 이상의결과라벤더에탄올추출물은멜라닌합성을저해시켰으며 α-msh에의한멜라닌합성기능항진시더욱효과적으로멜라닌생성을억제하였다. - 1447 -
김호민 장영미 한규수 문대원 문연자 우원홍 감사의글 본논문은 2006년도원광대학교교내연구비지원에의하여수행되었음. 참고문헌 1. 황미서. 아로마를이용한마사지테크닉, 도서출판예신, 2000. 2. 한의자연요법학회, 향기요법, 진영인쇄, 1996. 3. Anderson, C., Balchin, M.L., Smith, M.K. Evaluation of massage with essential oils on childhood atopic eczema. Phytother. Res. 14: 452-456, 2000. 4. Kim, H.M., Cho, S.H. Lavender Oil inhibits Immediate-type Allergie Reaction in Mice and Rats. J. Pharmacol. 51: 221-226, 1999. 5. Curto, E.V., Kwong, C., Hermersdorfer, H., Glatt, H., Santis, C., Virador, V., Hearing, V.J. and Dooley, P. Inhibitors of mamalian melanocytes tyrosinase: In vitro comparisons of alkyl esters of gentisic acid with other putative inhibitors. Biochemical Pharmacology. 57: 663-672, 1999. 6. Dawley, R.M., Flurkey, W.H. 4-hexylresocinol, a potent inhibitor of mushroom tyrosinase. J. Food Sci. 58: 609-610, 1993. 7. Maeda, K., Fukuda, M. In vivo effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J. Soc. cosmet. Chem. 42: 361-368, 1991. 8. 조미경, 안병상, 문연자, 우원홍. 연교메탄올추출물의멜라닌생성억제효과. 대한한방피부미용학회지 1(1):41-52, 2005. 9. 이주상, 김정아, 조세훈, 손애량, 장태수, 소명숙, 정시련, 이승호. 감초의 tyrosinase 활성억제성분. Kor. J. Pharmacogn. 34(1):33-39, 2003. 10. 문연자, 김진, 임난영, 이승연, 곽섭, 황충연, 우원홍. 감초물추출물의멜라닌형성억제효과. 동의생리병리학회지 16(6):1230-1235, 2002. 11. 이승연, 김진만, 오현철, 임숙정, 황충연, 문연자, 우원홍. 더덕추출물이멜라닌생성에미치는영향. 대한한의학방제학회지 10(2):199-211, 2002. 12. 문연자, 이성원, 임숙정, 송채석, 이관순, 임규상, 우원홍. 천화분수추출물이 B16 흑색종세포의멜라닌생성억제효과. 한국전통의학지 10(2):149-159, 2000. 13. 천현자, 최은영, 윤성찬, 남항우, 백승화, 우원홍. 백출의에탄올추출물에의한 melanin 생성억제효과. 약학회지 45(3):269-275, 2001. 14. 임난영, 권강주, 김윤석, 백순기, 임주락, 문연자, 우원홍. 사삼메탄올추출물의멜라닌생성억제효과. 동의생리병리학회지 18(3):747-753, 2004. 15. Martinez Esparza, M., Jimenez-Cervantes, C., Solano, F., Lozano, J.A., Garcia Borron, J.C. Mechanism of melanogenesis inhibition by tumor necrosis factor alpha in B16/F10 mouse melanoma cells, Eur. J. Biochem. 255: 139-146, 1998. 16. Hosoi, J.E., Suda, T., Kuroki, T. Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1 α,25 dehydroxyvitamin D3 and retinoic acid. Cancer Res. 45: 1474 1478, 1985. 17. 洪元植譯. 校勘直譯黃帝內經素問, 서울, 傳統文化硏究會, p 44, 69, 499, 1993. 18. 田溶敏編. 再編整理黃帝內經靈樞, 서울, 圖書出版東源文化社, p 264, 2002. 19. 정우열. 한방병리학, 원광대학교한의과대학병리학교실, 전주삼진사, p 201 1988. 20. 이제마. 동의수세보원, 서울행림출판, p 114, 1986. 21. Sugai, T. Clinical effects of arbuein in patients with chloasma in Japanese. Hifu. Skin Res. 34: 522-529, 1992. 22. Kim, C.W. Experimental study on the hyperpigmentation of skin graft. Plast Reconstr. Surg. 85: 162, 1990. 23. Mishima, Y., Imokawa, G. Selective aberration and pigment loss in melanosomes of maligment melanoma cells in vitro by glycosylation inhibitors: Premelanosomes as glycoprotein. J. Invest. Dermatol. 81: 106-114, 1983. 24. Imokawa, G., Mishima, Y. Loss of melanogenic properties in tyrosinase induced by glucosylation inhibitors within malignant melanoma cells. Cancer Res. 42: 1994-2002, 1982. 25. De Leeuw, S.M., Smit, N.P., Van Veldhoven, M., Pennings, E.M., Pavel, S., Simons, J.W., Schothorst, A.A. Melanin content of cultured human melanocytes and UV-induced cytotoxicity. J Photochem Photobiol B. 61(3):106-113, 2001. 26. Prota, G. Recent advances in the chemistry of melanogenesis in mammals. J. Invest. Dermatol. 75(122):31-36, 1990. 27. 박경아. 조직학, 서울, 고려의학, pp 405-411, 1999. 28. Provance, D.W., Jr, Wei, M., Ipe, V., Mercer, J.A. Cultured melanocytes from dilute mutant mice exhibit dendritic morphology and altered melanosome distribution. Proc Natl Acad Sci USA 93: 14554-14558, 1996. 29. Hara, M., Yaar, M., Byers, H.R., Goukassian, D., Fine, R.E., Gonsalves, J., Gilchrest, B.A. Kinesin participates in melanosomal movement along melanocyte dendrites. J Invest Dermatol. 114: 438-443, 2000. 30. Wu, X., Bowers, B., Rao, K., Wei, Q., Hammer, J.A. Visualization of melanosome dynamics within wild-type and dilute melanocytes suggests a paradigm for myosin V function In vivo. J Cell Biol. 143: 1899-1918, 1998. 31. Busca, R., Bertolotto, C., Abbe, P., Englaro, W., Ishizaki, T., Narumiya, S., Boquet, P., Ortonne, J.P., Ballotti, R. Inhibition of Rho is required for camp-induced melanoma cell differentiation. Mol. Biol. Cell 9: 1367-1378, 1998. - 1448 -